CN107177518B - 一种耐高温、耐酸接合酵母菌株及其应用 - Google Patents

一种耐高温、耐酸接合酵母菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及酿酒微生物技术领域，具体涉及一种耐高温、耐酸接合酵母菌株及其应用。本发明接合酵母（Zygosaccharomyces sp）菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14070。本发明接合酵母新菌株的同时具有耐高温、高酸的能力，耐受最高温度为58℃，耐受最低pH值为2.2，并能在环境温度为48℃，pH为2.2的条件下正常发酵，产乙醇量为2.59%，可维持夏季正常生产，可减少污染生酸，具有广阔的应用前景和极大的应用价值。

Description

一种耐高温、耐酸接合酵母菌株及其应用
技术领域
本发明涉及酿酒微生物技术领域，具体涉及一种耐高温、耐酸接合酵母菌株及其应用。
背景技术
乙醇是酿造酒中最重要也是最主要的成分之一，中国白酒中乙醇含量高达40％～55％(v/v)；黄酒中为14％～20％；啤酒中为2％～5％。酵母是产生乙醇的主要微生物，也是酿造酒工业中不可缺少的微生物。
白酒不同产区特定的气候环境是影响白酒酿造微生物群系及其代谢的关键因素。微生物群系是贯穿影响白酒酿造“一曲、二泥、三发酵”三方面的主体因素，而特定多样的自然环境又影响了微生物群系的构架、代谢及其风味物质的形成。所以，气候环境是影响白酒品质的关键因素之一。
尤其是在夏季，由于夏季气温高和现有设备条件的限制，入窖温度无法控制，有害微生物迅速繁殖，因而升温过猛，酸度大幅度上升，酵母发酵力低下，导致产酒率低、酒质差等问题。因此现有酿酒工艺中，夏季气温达到32℃以上，则入池温度达可到27-30℃，顶温最高可达35℃，这时生产的酒水味道苦，出酒率下降，酒醅酸度高，下次发酵就会掉排，就只能停产。
而现有的降温控酸的方法均治标不治本，无法达到理想的效果，且会增加生产成本，因此，寻找一种能够耐高温、耐酸的酿酒微生物，是亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够耐高温、耐酸的白酒发酵接合酵母。
本发明一种耐高温、耐酸接合酵母菌株，是由四川剑南春集团有限责任公司的酒曲中分离得到的接合酵母新菌株，该接合酵母(Zygosaccharomyces sp)菌株已于2017年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏号为CGMCC No.14070。
上述一种耐高温、耐酸接合酵母菌株，所述菌株的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
上述耐高温、耐酸接合酵母菌株，该菌株的细胞学特征为：菌体为圆形；菌落呈奶白色，不透明，表面湿润光滑，边缘整齐不扩散。
上述耐高温、耐酸接合酵母菌株，该菌株生理生化特征为：能发酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、蜜二糖五种糖；不能利用硝酸钾和硫酸铵氮源；不能代谢产生类淀粉化合物；具有产酯功能；不能分泌脲酶，不能分解环境中的尿素。
上述耐高温、耐酸接合酵母菌株，所述菌株耐受最高温度为58℃，耐受最低pH值为2.2，并能在环境温度为48℃，pH为2.2的条件下正常发酵，产乙醇量为2.59％。
本发明还提供一种酒曲，所述酒曲含有上述耐高温、耐酸接合酵母菌株。
上述耐高温、耐酸接合酵母菌株在夏季酿酒生产中的应用。
进一步的，上述耐高温、耐酸接合酵母菌株在夏季酿酒生产中的应用，是指在夏季高温、高酸环境下酿造白酒生产中的应用。
上述酒曲在夏季酿酒生产中的应用。
进一步的，上述酒曲在夏季酿酒生产中的应用，是指在夏季高温、高酸环境下酿造白酒生产中的应用。
本发明的有益效果是：本发明接合酵母新菌株的同时具有耐高温、高酸的能力，耐受最高温度为58℃，耐受最低pH值为2.2，并能在环境温度为48℃，pH为2.2的条件下正常发酵，产乙醇量为2.59％，是一株能在高温、高酸环境下产乙醇的新菌株，本发明为解决夏季白酒生产中因环境温度高、窖池酸度高、酵母发酵力低下而导致产酒率低、酒质差的问题提供了一种新的选择，其可维持夏季正常生产，可减少污染生酸，具有广阔的应用前景和极大的应用价值。
附图说明
图1为本发明接合酵母(Zygosaccharomyces sp)菌株形态图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1 菌株筛选
1、菌株的初筛
材料：四川剑南春(集团)有限责任公司使用的酒曲
培养基：
麦芽汁培养基：取大麦芽一定量，粉碎，加4倍于麦芽量的水，在55～60℃水浴中保温糖化，不断搅拌，经3～4h后，至糖化液与碘液反应不显蓝色为止。煮沸后过滤，将滤液稀释至6°Bé，备用。
麦芽汁琼脂培养基：将麦芽汁培养基加入2％琼脂，于115℃灭菌20min，制成麦芽汁琼脂培养基。
YPD：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，蒸馏水配制，自然pH，121℃高压灭菌20min。
YEPD：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，琼脂2％，蒸馏水配制，自然pH，121℃高压灭菌20min。
试验方法：
称取一定量发酵了24h的酒曲，置于装有150mL麦芽汁培养基的三角瓶中，28℃，200rpm富集培养24h。将培养液10倍稀释至10-6，取10-6的稀释液1mL，麦芽汁琼脂培养基倾注平板，28℃培养24h，待菌落长出后，挑取菌落形态不一的疑似酵母单菌落于YEPD培养基中，编号并划线纯化，重复纯化2～3次，直至平板上的菌落都为同一形态。挑去单一菌落制成水浸片，于电子显微镜下观察菌体细胞形态，酒曲酵母分离纯化完成。共分离纯化出四株不同形态的酵母菌，编号为1#、2#、3#、4#。
2、耐高温酵母的筛选
(1)用接种环分别将1#、2#、3#、4#四株酵母按相同的接种量接种到装有100mL麦芽汁培养基的250mL三角瓶中，置于摇床，28℃，200rpm培养过夜，进行活化。
(3)对活化后的菌液进行镜检确认无污染后，将1#、2#、3#、4#的菌液用无菌水稀释10倍，分别取200μL稀释液接种到2mL的YPD培养基中，接种后四株菌分别在55℃、58℃的水浴锅中培养5h。
(4)用无菌水将高温培养过的酵母进行梯度稀释，分别取100μL原液、10-1、10-2、10-3稀释液，涂布于YEPD平板，28℃培养1～2d。待单菌落长出后计数。结果如表1所示。
表1耐高温酵母筛选实验结果
Figure BDA0001315644350000031
注：表中“多”表示“多不可计”。
由表1可知，1#、2#、3#菌株均能耐受的最高温度为58℃，且在此高温条件下长势良好，致死温度为59℃。4#菌株能耐受的最高温度低于55℃，其耐高温能力明显低于1#、2#、3#。
因此，选择1#、2#、3#菌株进行后续试验。
3、耐酸酵母的筛选
(1)用乳酸调节YPD培养基的酸度，获得pH分别2.0、2.1、2.2、2.6、3.3、3.5的YPD培养基，将经高温初筛后的1#、2#、3#菌株进行活化后，按相同接种量分别接种于上述YED培养基中，于28℃培养2～3天。
(2)将培养的菌液按10倍梯度稀释到10-4，取稀释度为10-2、10-4、及原液各100μL的稀释液，分别涂布于YEPD平板上，28℃培养2～3d，待菌落长出后计数，筛选耐酸能力最强的菌株。结果如表2所示。
表2耐酸、耐高温酵母筛选实验结果
Figure BDA0001315644350000041
注：表中“多”表示“多不可计”。
由表2可知，1#菌株耐酸能力最强，其次是2#菌株，均可耐受pH为2.2的酸度，但1#菌株的耐受能力明显高于2#；最后是3#菌株，可耐受pH为2.6的酸度，且在此酸度条件下其长势较好，耐受性较强。其中1#、2#的致死pH为2.1。
因此，根据耐高温和耐酸实验选育出的1#、2#菌株为耐酸、耐高温能力强的菌株。
4、目标菌株产乙醇能力测定
4.1目标菌株正常发酵最低pH
用乳酸调节麦芽汁培养基的酸度，获得pH分别2.2、2.4、2.5、2.6、2.8、3.5的麦芽汁培养基，分装于250ml三角瓶中，每个瓶子装100ml，115℃灭菌20min。将经高温、高酸初筛后的1#、2#菌株进行活化后，按相同的的接种量分别接种于上述麦芽汁培养基中，塞上发酵栓，于28℃培养72h。发酵前称瓶子重量并做记录，称发酵后瓶子重量，计算每个瓶子发酵前后重量差。取发酵液利用液相测定其中乙醇含量。实验结果如表3所示。
表3菌株正常发酵最低pH实验结果
Figure BDA0001315644350000042
Figure BDA0001315644350000051
由表3可知，在培养基pH为3.5，发酵温度为28℃的正常条件下，1#菌株的发酵力明显高于2#菌株。随着发酵pH值的降低，1#菌株重量差的变化及乙醇的产生量有所减少，但差异不显著，因此，1#菌株在pH值为2.2(文献报道最高发酵酸度的pH值为2.5)的高酸环境下仍能正常发酵，环境酸度的变化对其发酵力的影响不大。而2#菌株随着pH值的降低，发酵力显著降低，当pH值为2.2时发酵力几乎可以忽略不计，因此2#菌株虽然能耐受pH为2.2的高酸，但不能在高酸环境中正常发酵。
4.2目标菌株正常发酵最高温度
根据4.1的实验结果，选择1#菌株进行后续实验。
用乳酸调节麦芽汁培养基的酸度，获得pH分别2.2培养基，分装于250ml三角瓶中，每个瓶子装100ml，115℃灭菌20min。将1#菌株进行活化后，按相同的的接种量分别接种于上述麦芽汁培养基中，塞上发酵栓，分别于28℃、35℃、40℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃培养72h。发酵前称瓶子重量并做记录，称发酵后瓶子重量，计算每个瓶子发酵前后重量差。取发酵液利用液相测定其中乙醇含量。实验结果如表4所示
表4菌株正常发酵最高温度实验结果
由表4可知，当温度≦48℃时，随着温度的升高，1#菌株的发酵力有所降低，但变化不显著；当温度﹥48℃时，1#菌株发酵力明显降低。因此1#菌株的所能耐受的最高温度为58℃，但在酸度pH为2.2的条件下的正常发酵温度为48℃(高于文献报道的最高正常发酵温度45℃)。
综上所述，1#菌株为一株耐高温、耐酸能力强的菌株，且在高温、高酸的条件下有很强的产乙醇能力。耐受最高温度为58℃，耐受最低pH值为2.2，并能在环境温度为48℃，pH为2.2的条件下正常发酵，产乙醇量为2.59％。
实施例2 目标菌株的鉴定
自动微生物鉴定议鉴定
利用美国Biolog公司全自动微生物鉴定仪，Biolog公司独创的碳源利用方法，利用微生物对不同碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选95种不同碳源，配合四唑类显色物质(如TTC、TV)，固定于96孔板上(A1孔为阴性对照)，接种菌悬液后培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质发生反应而导致的颜色变化(吸光度)以及由于微生物生长造成的浊度差异(浊度)，与标准菌株数据库进行比对，即可得出最终鉴定结果。
测试步骤：
①、在BUY培养基上，26℃培养待鉴定的酵母菌(即耐高温又耐酸的菌株)。
②、样品准备及观察特征，利用湿法制备(水片法)或革兰氏染色来确认待鉴定菌株是酵母菌。
③、接种准备
以装有空白无菌水玻璃管调100％T透光率，用标准比浊管校正，制备特定浓度菌悬液，调为47％T，接种到YT微平板，每孔100ul菌悬液。
④、微平板培养
于26℃培养鉴定板，将板放入一个密闭的塑料袋或其他盒中，加入浸湿的纸团或毛巾，用以保持湿度，避免在培养过程中使鉴定板中菌悬液因蒸发而减少影响结果。培养鉴定板24，48或72h，直到得到鉴定结果。
该菌株的碳源同化试验结果如表5所示。
表5本发明1#新菌株的碳源同化试验结果
Figure BDA0001315644350000061
Figure BDA0001315644350000071
注：“+”为阳性，“－”为阴性。
该菌株鉴定结果如表6所示。
表6筛选的酵母菌鉴定结果
英文名 参考中文名 可能性 相似性 位距
Zygosaccharomyces sp 接合酵母 100％ 0.882 1.75
经NCBI数据库比对鉴定，筛选得到的耐酸、耐高温能力最强的菌株为接合酵母(Zygosaccharomyces sp)新菌株，其信息包括耐受最高温度为58℃，耐受最低pH值为2.2，并能在环境温度为48℃，pH为2.2的条件下正常发酵，产乙醇量为2.59％。
实施例3 本发明接合酵母菌株的形态特征及生物学特性鉴定
下述各试验中均要用到新活化的菌体，挑取少量菌体接种于麦芽汁固体培养基中，28℃培养1～2d。
1、菌落及菌体形态观察
将经活化的接合酵母菌株用接种环划线接种于麦芽汁琼脂平板培养基上，28℃培养1～2d，观察菌落形态；用接种针挑取少许菌体，利用超高放大倍率视频显微镜观察菌体形态。
菌落观察结果：菌落呈奶白色、不透明，表面光滑湿润，菌落边缘整齐不扩散。
菌体观察结果：菌体呈圆形，出芽方式繁殖。如附图1所示。
2、糖类发酵试验
培养基：12.5％豆芽汁黄豆芽125g，加水1L，煮沸30min，过滤后补足水至1L.。
测试糖溶液：分别称取适量的葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、蜜二糖，用无菌水配制成10％的糖溶液，煮沸15min，冷却，备用。
12.5％的豆芽汁中分装于无菌的杜氏管中，分别用无菌移液管加入待测试糖溶液，混合均匀，接入已活化的接合酵母，置28℃下培养2-3d，每天观察产气情况，有气体产生，表明接合酵母可以发酵此类糖，试验为阳性，否则为阴性。结果见表7。
3、氮源同化试验
培养基——同化氮源基础培养基：葡萄糖2％，KH2PO4 0.1％，MgSO4.7H2O，酵母膏0.02％，水洗琼脂2％。用蒸馏水配制，过滤后装试管，每管5mL。
取出4根试管，一根加入适量的硝酸盐，另一根加入适量的铵盐，剩余2根不加，115℃灭菌20min，制成斜面，将活化的接合酵母接入到4根试管中，置于28℃下恒温培养一周，观察生长情况。若加氮源的试管有长出菌落，对照试管没有，表明接合酵母可以利用这种氮源，试验为阳性，否则为阴性。结果见表7。
4、类淀粉化合物形成的测定试验
培养基:(NH4)2SO4 0.1％，KH2PO4 0.1％，MgSO4.7H2O 0.05％,葡萄糖1％，水洗琼脂2.5％。pH 4.5，115℃灭菌20min。
将灭菌的培养基制成平板，在其上接入已活化的接合酵母，置于28℃条件下培养一周后，在表面上滴1-2滴的路哥氏碘液，观察酵母菌落的周围培养基的颜色变化，若菌落周围呈现蓝色，表明接合酵母可以产生类淀粉类化合物，试验为阳性，否则为阴性。结果见表7。
5、产酯试验
培养基：葡萄糖5g，10％豆芽汁100ml，分装于100ml的三角瓶中，每瓶装20ml，115℃灭菌20min。
用接种环将活化的接合酵母接入到三角瓶中，28℃条件培养5d，用嗅觉检查酯类的生成与否。若有酯香味产生，表明接合酵母有产酯功能，试验为阳性，否则为阴性。结果见表7。
6、尿素分解试验
培养基：蛋白胨0.1g，NaCl 0.5g，KH2PO4 0.2g，酚红0.0012g，蒸馏水100ml，琼脂2g，调整pH至6.8。
将配好的培养基分装于试管中，每根试管装2.7ml，再向试管中加入0.3ml的20％的尿素溶液，混匀后115℃灭菌20min，搁置制成斜面。将活化的接合酵母接入斜面上，28℃条件培养4-5d，，每天观察生长情况。若斜面呈淡红色，则表明接合酵母可以产生脲酶，分解尿素，试验为阳性，否则为阴性。结果见表7。
表7接合酵母菌株的生理生化特征
综上可知：本发明接合酵母(Zygosaccharomyces sp)菌株的细胞学特征为：菌体为圆形；菌落呈奶白色，不透明，表面湿润光滑，边缘整齐不扩散。生理生化特征为：能发酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、蜜二糖五种糖；不能利用硝酸钾和硫酸铵氮源；不能代谢产生类淀粉化合物；具有产酯功能；不能分泌脲酶，分解环境中的尿素。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
<110> 四川剑南春（集团）有限责任公司
<120>一种耐高温、耐酸接合酵母菌株及其应用
<160> 1
<210> 1
<211>600
<212> DNA
<213>接合酵母菌（Zygosaccharomyces sp）
<400> 1
tcctgaagat ttattagaag atggtcaatt aagattatta gatactgata cttctatagt 60
tgtacctgtt gatactcata ttaaacatgg acaaactatt gaaattattt gaactatttt 120
tccagctgta gtattattaa caactgcata atagtcagct gaaatttgga atgtattcct 180
gctgggtacg cagggtcatt aggttatgaa gacatggacg ctgccacttt tgccagctgg 240
gatgtcgatt atttgaaata cgataattgc tacaataaag gtgagttcgg gacaccagaa 300
atatcttata agagatacaa ggctatgtct gatgcactga ataaaactgg ccgtcccata 360
ttttactcat tatgtaactg gggtcaggat ttaacttttt attggggatc cgccatctct 420
aactcatgga gaatgagtgg cgatgtttac cctcaatttg acaggcctga cagtagatgt 480
ccttgctcag gcgatgaata tgactgctct taccctggat tccactgctc cataatgaat 540
atcctaaata aagcagctcc aatgggtcaa aatgctgcac ctggtggttg gaatgattta 600

Claims (6)

1. 一种耐高温、耐酸接合酵母菌株，其特征在于，所述接合酵母（Zygosaccharomycessp）菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.14070。
2.一种酒曲，其特征在于，所述酒曲含有权利要求1所述耐高温、耐酸接合酵母菌株。
3.权利要求1所述耐高温、耐酸接合酵母菌株在夏季酿酒生产中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于：所述夏季酿酒为夏季酿造白酒。
5.权利要求2所述的酒曲在夏季酿酒生产中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：所述夏季酿酒为夏季酿造白酒。
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