CN109486691B - 强抗逆性酿酒酵母及其用途 - Google Patents

强抗逆性酿酒酵母及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于酿酒微生物技术领域，具体涉及一种抗逆性强的酿酒酵母及其用途。针对现有缺乏一种能够耐受强酸、高温条件，抗逆性强的酿酒微生物的问题，本发明提供一种强抗逆性酿酒酵母，该酵母已在CGMCC中心保藏，保藏编号为CGMCC No.16509。本发明酿酒酵母可耐受48℃高温，耐受最低pH值为2.0，并能在pH为2.2条件下正常发酵，产乙醇量为2.01％，同时具有高耐盐、耐酒精能力。本发明的酿酒酵母可应用于白酒酿造中，维持多粮浓香型窖池高酸正常生产，具有广阔的应用前景和极大的应用价值。

Description

强抗逆性酿酒酵母及其用途
技术领域
本发明属于酿酒微生物技术领域，具体涉及一种强抗逆性酿酒酵母及其用途。
背景技术
酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)在分类学上属于真核生物原界、真菌界、子囊菌门、酵母亚门、半子囊菌纲、酵母目、酵母科、酵母属。酿酒酵母菌落呈圆形，有光泽，平坦，边缘整齐，在麦芽汁中培养细胞呈小圆形或卵圆形。适宜生长温度为28℃～30℃，最适pH值为4～5。酿酒酵母是发酵中最常用的生物种类，其细胞为球形或者卵形，直径5～10μm。其繁殖的方法为出芽生殖。
乙醇是酿造酒中最重要也是最主要的成分之一，中国白酒中乙醇含量高达40％～55％(v/v)；酵母是产生乙醇的主要微生物，也是酿造酒工业中不可缺少的微生物。
白酒不同产区特定的气候环境是影响白酒酿造微生物群系及其代谢的关键因素。微生物群系是贯穿影响白酒酿造“一曲、二泥、三发酵”三方面的主体因素，而特定多样的自然环境又影响了微生物群系的构架、代谢及其风味物质的形成。所以，气候环境是影响白酒品质的关键因素之一。尤其是在夏季，由于夏季气温高和现有设备条件的限制，入窖温度无法控制，有害微生物迅速繁殖，因而升温过猛，酸度大幅度上升，酵母发酵力低下，导致产酒率低、酒质差等问题。因此现有酿酒工艺中，夏季气温达到32℃以上，则入池温度达可到27～30℃，顶温最高可达35℃，这时生产的酒水味道苦，出酒率下降，酒窖酸度高，下次发酵就会掉排，就只能停产。
而现有的降温控酸的方法均治标不治本，无法达到理想的效果，且会增加生产成本，因此，寻找一种能够在高温正常发酵，抗逆性能强的酿酒微生物，是函待解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：现有缺乏一种能够耐受强酸、高温条件，抗逆性强的酿酒微生物的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种强抗逆性酿酒酵母。该酿酒酵母保藏编号为CGMCC No.16509。保藏时间为2018年9月20日，保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
其中，上述强抗逆性酿酒酵母的ITS序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO:1强抗逆性酿酒酵母的ITS核苷酸序列
aaccgggattgccttagtaacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgt。
其中，上述强抗逆性酿酒酵母的形态学特征为：菌体为圆形；菌落呈黄白色，不透明，表面湿润光滑，边缘整齐不扩散。
其中，上述强抗逆性酿酒酵母的生物学特征为：能利用葡萄糖、D-半乳糖、α-甲基-D-葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖和棉子糖发酵；不能利用L-阿拉伯糖、D-木糖、N-乙酰氨基葡萄糖、纤维二糖、乳糖和松三糖发酵；不可利用醇类。
其中，上述强抗逆性酿酒酵母的温度耐受力≤48℃。
其中，上述强抗逆性酿酒酵母的pH耐受力为2.0～5.0。
其中，上述强抗逆性酿酒酵母的盐耐受浓度为≤13％(g/v)。
其中，上述强抗逆性酿酒酵母的耐受酒精度为≤18％(v/v)。
本发明还提供了一种上述强抗逆性酿酒酵母在浓香型白酒酿造中的用途。
本发明的有益效果为：
本发明首次从酒醅中分离出了一种抗逆性强的酿酒酵母新菌株，具有较强的耐酸、耐高温、耐盐能力。能够耐受48℃高温，耐受pH值为2.0，并能在pH为2.2的条件下正常发酵，产乙醇量为2.01％；耐受Nacl浓度为13％(g/v)；耐受酒精度为18％(v/v)。本发明为解决夏季白酒生产中因环境温度高、窖池酸度高、酵母发酵力低下而导致产酒率低、酒质差的问题提供了一种新选择，其可维持夏季正常生产，减少污染生酸，具有广阔的应用前景和极大的应用价值。
本发明提供的强抗逆性酿酒酵母于2018年9月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCC No.16509，生物学分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae。
附图说明
图1为本发明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株显微形态图；
图2为本发明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株菌落形态图；
图3为本发明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和标准菌株不同温度生长对比情况；
图4为本发明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和标准菌株不同乙醇浓度生长对比情况；
图5为本发明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和标准菌株不同Nacl浓度生长对比情况。
具体实施方式
本发明提供了一种强抗逆性酿酒酵母，保藏编号为CGMCC No.16509。保藏时间为2018年9月20日，保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
本发明的菌株是从宜宾五粮液股份有限公司酒醅中分离获得。
其中，上述强抗逆性酿酒酵母的ITS序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
其中，上述强抗逆性酿酒酵母的温度耐受力≤48℃，pH耐受力为2.0～5.0。
其中，上述强抗逆性酿酒酵母的盐耐受浓度为≤13％(g/v)；耐受酒精度为≤18％(v/v)。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1强抗逆性酿酒酵母菌株的筛选和鉴定
1、菌株的初筛
材料：四川五粮液股份有限公司窖池发酵过程中的酒醅。
培养基：
麦芽汁培养基：商业合成培养基；组成包括：麦芽膏粉13％，氯霉素0.01％。
麦芽汁琼脂培养基：商业合成培养基；组成包括：麦芽膏粉13％，琼脂1.5％，氯霉素0.01％。
YPD培养基：组成包括：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，蒸馏水配制，pH自然，115℃高压灭菌20min。
YEPD培养基：组成包括：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，琼脂2％，蒸馏水配制，pH自然，115℃高压灭菌20min。
试验方法：
称取10g酒醅样品至装有玻璃珠和90mL无菌生理盐水的三角瓶中，160r/min振荡30min备用。无菌条件下取上清液进行梯度稀释，选取梯度为10～3、10～4、10～5、10～6的稀释液100ul，均匀的涂布于麦芽汁平板上，每个稀释梯度涂两个平行，28℃倒置培养3～4d，每12h观察菌落的生长情况；待菌落长出后，挑选菌落形态不同的疑似酵母单菌落于麦芽汁琼脂培养基中，编号并划线纯化，重复纯化2～3次，直至平板上的菌落都为同一形态。挑取单菌落制成水浸片，于显微镜下观察菌体细胞形态，酒醅酵母分离纯化完成。共分离纯化出8株不同形态的酵母菌，编号为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#。
2、耐酸酵母的筛选
(1)用接种环分别将1～8#酵母按相同的接种量接种到装有50mL麦芽汁培养基的100mL三角瓶中，摇床28℃，120rpm培养24h，进行活化。
(2)用乳酸调节YPD培养基的酸度，获得pH分别为2.0、2.2、2.5、3.0、3.5、4.0的YPD培养基，灭菌后备用。
(3)对活化后的菌液进行镜检确认无污染后，按相同接种量分别接种于上述YPD培养液中，于28℃培养48h。
(4)通过观察培养液浑浊度判断菌株长势情况。最终选定6株耐酸性能比较好的菌株进行下一步试验。
实施例2耐酸酵母菌株在低pH环境中产乙醇能力试验
分别测定实施例1选定的8株耐酸酵母菌株在不同pH培养48d后发酵液产乙醇能力，以标准菌株1964作为对比，8株耐酸酵母菌在pH≤3.0条件下产乙醇结果如表1所示。
表1耐酸酵母菌产乙醇(％)能力
1# 2# 3# 4# 5# 6# 1964
pH＝3.0 4.33 4.25 4.49 4.2 4.42 4.12 4.33
pH＝2.5 4.12 3.87 4.21 3.25 3.79 3.06 2.02
pH＝2.2 2.08 0.15 2.01 0.5 0.25 0.09 0.33
pH＝2.0 0.07 ～ 0.15 ～ ～ ～
注：表中“～”表示没有测出。
由表1结果可知，酿酒酵母菌株1#和3#耐酸性能最好，在pH 2.2时能够正常发酵产乙醇，产乙醇量分别达到2.08％和2.01％。
实施例3耐高温酵母的筛选
将实施例2筛选后的1#、3#菌株进行活化确认无污染后，按相同接种量接种于YPD培养基中，于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃培养48h。测定接种后培养0h和48h发酵液OD600，比较其生长情况。结果如表2所示。
表2不同温度下酿酒酵母的生长情况表
Figure BDA0001882050550000041
Figure BDA0001882050550000051
由表2可以看出，3#酵母菌株可耐受45℃，高于1#酵母菌株的耐受温度40℃，说明3#酵母菌株的抗逆性较1#酵母菌株更强。
特将3#菌株命名为Z28～2作为目标菌株继续研究。
实施例4目标菌株的鉴定
1、梅里埃生理生化鉴定试剂盒鉴定
API 20C AUX实验条是由19个同化测定的干粉底物的20个小杯所组成。小杯内含半固体微量培养基供接种，只有能以该底物为碳源的酵母菌才能生长。测定结果是以与对照生长物的比较而得；鉴定结果参照分析图谱索引或鉴定软件。
测试步骤：
①形态学试验
加1滴菌悬液到RAT medium上，如检测到菌丝或假菌丝，记为阳性。该试验组成试条的第21个试验。
②准备试条和接种物
③试条接种
将上述混合悬液注入试条每个试孔中，将吸管的顶部靠在杯内缘加液体，以避免形成气泡。小心注入，表面呈平或稍凸。盖上培养盒，于28℃培养48～72h。
④判读试条
28℃培养48或72h后，每个杯内生长反应情况与0杯(阴性对照)比较，比阴性对照更浑浊者，记为阳性。
该菌株的碳源同化试验结果如表3所示。
表3本发明Z28～2新菌株的生理生化试验结果
Figure BDA0001882050550000052
Figure BDA0001882050550000061
注：“+”为阳性，“-”为阴性。
2、分子鉴定：提取菌株基因组DNA，用酵母ITS通用引物对正向引物ITS1(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)、反向引物ITS4(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)扩增基因组DNA，反应条件为：94℃预变性5min后进入以下循环：94℃变性45s，55℃退火40s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果良好。将PCR扩增产物寄送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果在NCBI数据库上进行BLAST序列比对，确定为酿酒酵母，并命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Z28～2。该菌已于2018年9月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.16509，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
SEQ ID NO:2正向引物ITS1的核苷酸序列
tccgtaggtgaacctgcgg。
SEQ ID NO:3反向引物ITS4的核苷酸序列
tcctccgcttattgatatgc。
实施例5本发明酿酒酵母菌株的形态特征及生物学特性鉴定
下述各试验中均要用到新活化的菌体，挑取少量菌体接种于麦芽汁固体培养基中，28℃培养1～2d。
菌落及菌体形态观察：
将经活化的酿酒酵母菌株用接种环划线接种于麦芽汁琼脂平板培养基上，28℃培养1～2d，观察菌落形态；用接种针挑取少量菌体，利用显微镜观察菌体形态。菌体观察结果：菌体呈圆形，多核，出芽方式繁殖。如图1所示。菌落观察结果：菌落呈黄白色，不透明，表面湿润光滑，边缘整齐不扩散。如图2所示。
综上可知：本发明酿酒酵母菌株的细胞学特征为：菌体呈圆形或椭圆形；菌落呈黄白色，不透明，表面湿润光滑，边缘整齐不扩散。生理生化特征为：能发酵葡萄糖、D-半乳糖、α-甲基-D-葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖和棉子糖；不能利用甘油、2-酮基-葡萄糖酸盐、L-阿拉伯糖、D-木糖、侧金盏花醇、木糖醇、肌醇、山梨醇、N-乙酰氨基葡萄糖、纤维二糖、乳糖和松三糖。
实施例6本发明酿酒酵母温度耐受力测定
将菌株进行活化确认无污染后，按相同接种量接种于YPD培养基中，于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃培养48h。测定接种后培养0h和48h发酵液OD600，比较其生长情况。结果如表2所示。
将Z28～2新菌株进行活化确认无污染后，按相同接种量接种于YPD培养基中，以标准菌株1964作为对比，于46℃、47℃、48℃、49℃培养48h。测定接种后培养0h和48h发酵液OD600值，Z28～2新菌株温度最终显示：耐受最高温度为48℃，48℃以下生长良好。结果如图3所示。
实施例7本发明酿酒酵母酒精耐受力测定
以标准菌株1964作为对比，分别设置初始酒精度(％v/v)为0、5、10、15、20、25，将Z28～2新菌株以5％接种量接种于12°Bx麦芽汁中，28℃培养48h，用紫外分光光度计测定接种后培养0h和48h发酵液OD600值，最后计算OD600的差值。Z28～2新菌株耐受酒精度初筛显示：20％v/v时，酵母生长受到抑制，15％v/v时，生长状态良好。复筛耐受最高酒精度：方法同上，设置初始酒精度(％v/v)为15、16、17、18、19、20培养48h。用紫外分光光度计测定接种后培养0h和48h发酵液OD600值，最后计算OD600的差值。Z28～2新菌株酒精度耐受最终显示：目标菌株Z28～2酒精度高于19％v/v时，酵母生长受到抑制。由此可知，此酿酒酵母菌株耐受最高酒精度为18％v/v，而标准菌株1964耐受最高酒精度为16％v/v。如图4所示。
实施例8本发明酿酒酵母Nacl耐受力测定
以标准菌株1964作为对比，分别设置初始Nacl浓度(％g/v)为0、5、10、15、20，将Z28～2新菌株以5％接种量接种于12°Bx麦芽汁中，28℃培养48h，用紫外分光光度计在600nm测定吸光值，最后计算OD600的差值。Z28～2新菌株耐受Nacl浓度初筛显示：15％g/v时，酵母生长受到抑制，10％g/v时，生长状态良好。复筛耐受最高Nacl浓度：方法同上，设置初始Nacl浓度(％g/v)为11、12、13、14、15培养48h。用紫外分光光度计测定接种后培养0h和48h发酵液OD600值，最后计算OD600的差值。Z28～2新菌株Nacl浓度耐受最终显示：Z28～2新菌株Nacl浓度高于14％g/v时，酵母生长受到抑制。因此，此酿酒酵母菌株耐受最高Nacl浓度为13％g/v，而标准菌株1964耐受最高Nacl浓度为11％g/v。结果如图5所示。
由实施例结果可知：本发明分离鉴定出一株抗逆性强的酿酒酵母新菌株，能够耐受最低pH值为2.0，并且在pH2.2条件下能够正常发酵，产乙醇量可达2.01％。同时，本发明的强抗逆性酵母菌株还具有很好的耐高温、耐盐和耐酒精能力，解决了白酒生产中因环境温度高、窖池酸度高、酵母发酵力低下而导致产酒率低、酒质差的问题，具有极高的应用价值。
序列表
<110> 宜宾五粮液股份有限公司
<120> 强抗逆性酿酒酵母及其用途
<130> A181255K
<141> 2018-11-27
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 571
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaccgggatt gccttagtaa cggcgagtga agcggcaaaa gctcaaattt gaaatctggt 60
accttcggtg cccgagttgt aatttggaga gggcaacttt ggggccgttc cttgtctatg 120
ttccttggaa caggacgtca tagagggtga gaatcccgtg tggcgaggag tgcggttctt 180
tgtaaagtgc cttcgaagag tcgagttgtt tgggaatgca gctctaagtg ggtggtaaat 240
tccatctaaa gctaaatatt ggcgagagac cgatagcgaa caagtacagt gatggaaaga 300
tgaaaagaac tttgaaaaga gagtgaaaaa gtacgtgaaa ttgttgaaag ggaagggcat 360
ttgatcagac atggtgtttt gtgccctctg ctccttgtgg gtaggggaat ctcgcatttc 420
actgggccag catcagtttt ggtggcagga taaatccata ggaatgtagc ttgcctcggt 480
aagtattata gcctgtggga atactgccag ctgggactga ggactgcgac gtaagtcaag 540
gatgctggca taatggttat atgccgcccg t 571
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (2)

1.强抗逆性酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其特征在于：所述酿酒酵母保藏编号为CGMCC No.16509。
2.权利要求1所述的强抗逆性酿酒酵母在浓香型白酒酿造中的用途。
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