CN114752515B - 一种具有多重耐受性的酿酒酵母及其分离方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有多重耐受性的酿酒酵母及其分离方法、应用，属于酿酒酵母领域。本发明从大曲中分离得到一株兼具耐高温、耐酸、耐乙醇的高发酵力酿酒酵母S.cerevisiae NJ002。使用响应面法优化该酵母的培养条件后，其生长和发酵力均显著提高。将该酵母菌用于制作强化大曲，可显著提高大曲的发酵力。本发明在提升大曲发酵力、节约粮食、提高效率、节能减排等方面具有重要价值，在企业应用可增加企业和社会效益。

Description

一种具有多重耐受性的酿酒酵母及其分离方法、应用
技术领域
本发明涉及酿酒酵母领域，具体是一种具有多重耐受性的酿酒酵母及其分离方法、应用。
背景技术
白酒是中国传统饮料，白酒企业每年要消耗大量的粮食和能源。提高生产效率、降低粮食和能源消耗，对企业和社会均具有重要价值。大曲含有大量功能微生物，是酿造白酒的重要材料，其发酵力直接决定了白酒的出酒率及粮食利用率。开发高发酵力酵母菌并将其用于制作大曲，可提高大曲发酵力，从而节约粮食、降低能耗，增加企业和社会效益。
大曲制作及白酒酿造的过程往往具有较苛刻的环境条件，如高温、低pH、高乙醇等。这些环境条件可严重影响酵母菌的生长及生存，从而影响酵母菌的应用效果。一株酵母菌很难同时兼具高发酵力、耐高温、耐酸、耐乙醇等特点。因此，开发可同时满足上述条件的优良酵母菌仍是一个重要研究方向。
此外，不同的地域、原料、生产工艺等因素，也会影响酵母菌的应用效果。丰富微生物资源库，增加可供企业选择的优良酵母菌资源，对于解决这些问题也具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有多重耐受性的酿酒酵母及其分离方法、应用，以解决现有技术酿酒酵母菌存在的发酵力、适应性不足的问题。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种具有多重耐受性的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，所述酿酒酵母为菌株S.cerevisiae NJ002，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.24735。
所述菌株S.cerevisiae NJ002在25-60℃的条件下良好生长。
所述菌株S.cerevisiae NJ002在pH为2-9的条件下良好生长。
所述菌株S.cerevisiae NJ002在乙醇含量为0-12％vol的条件下良好生长。
所述菌株S.cerevisiae NJ002的培养条件通过响应面法进行优化。
进一步的，经响应面法优化确定，所述菌株S.cerevisiae NJ002在葡萄糖15.24％、氮源物质5.09％、乙醇0.83％vol的条件下其生长和发酵力显著提高。
一种具有多重耐受性的酿酒酵母的分离方法，包括以下步骤：
步骤1、从高发酵力大曲中分离、纯化酵母菌；
步骤2、检测步骤1得到的酵母菌的发酵力，基于检测结果筛选得到具有高发酵力的酿酒酵母菌株。
步骤3、检测步骤2得到的酿酒酵母的耐受性，基于检测结果筛选得到所述具有多重耐受性的酿酒酵母菌株。
一种具有多重耐受性的酿酒酵母在酒类生产中的应用，以提高酒类原料的发酵力。
一种提高大曲发酵力的方法，将所述的具有多重耐受性的酿酒酵母，加入大曲原料中以提高大曲发酵力。
与现有技术相比，本发明的优点为：
本发明提供了一种具有耐高温、耐酸、耐乙醇且发酵力高等多重优良特性的酿酒酵母及其分离方法和培养条件优化方法，本发明的酿酒酵母可应用于酒类尤其是大曲，能够提高发酵力。本发明在节约粮食、提高效率、节能减排等方面具有重要价值。
附图说明
图1为酵母菌发酵力对比图。其中：CK，对照酵母(安琪酵母股份有限公司生产的白酒专用耐高温型酿酒高活性干酵母)；小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)；图中数值均重复3次以上。
图2为PCR扩增ITS1-5.8S-ITS2的琼脂糖凝胶电泳图。其中：A，NJ001对应的电泳条带；B，NJ002和NJ003对应的电泳条带。
图3为系统发育树图。
图4为酵母菌的生长曲线图。其中：A，NJ001；B，NJ002；C，NJ003；D，对照酵母。OD600为菌液稀释5倍后的检测值；图4中数值均重复3次以上。
图5为四株酵母菌在不同温度下的生长情况对比图。其中：CK，对照酵母；OD600为菌液稀释5倍后的检测值；小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)；图中数值均重复3次以上。
图6为四株酵母菌在不同pH下的生长情况对比图。其中：CK，对照酵母；OD600为菌液稀释5倍后的检测值；小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)；图中数值均重复3次以上。
图7为四株酵母菌在不同乙醇含量下的生长情况对比图。其中：CK，对照酵母；OD600为菌液稀释5倍后的检测值；小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)；图中数值均重复3次以上。
图8为葡萄糖含量对NJ002生长的影响曲线图。其中：OD600为菌液稀释5倍后的检测值；图中数值均重复3次以上。
图9为氮源物质含量对NJ002生长的影响曲线图。其中：OD600为菌液稀释5倍后的检测值；图中数值均重复3次以上。
图10为乙醇含量对NJ002生长的影响曲线图。其中：OD600为菌液稀释5倍后的检测值；图中数值均重复3次以上。
图11为各因素之间相互作用的曲面图和等高线图。其中：A，葡萄糖和氮源物质相互作用的曲面图(i)和等高线图(ii)；B，葡萄糖和乙醇含量相互作用的曲面图(i)和等高线图(ii)；C，氮源物质和乙醇含量相互作用的曲面图(i)和等高线图(ii)。
图12为优化前与优化后NJ002的生长情况对比曲线图。其中：OD600为菌液稀释5倍后的检测值；“***”：p<0.001；图中数值均重复3次以上。
图13为优化前与优化后NJ002的发酵力对比曲线图。其中：图中数值均重复3次以上。
图14为强化大曲的温度变化曲线图。其中：CK1，常规大曲；CK2，添加2L对照酵母的强化大曲；NJ002，添加2L NJ002的强化大曲；NJ002*2，添加4LNJ002的强化大曲。
图15为每块大曲的取样区域示意图。其中：阴影部分为大曲取样区域。
图16为强化大曲的发酵力对比曲线图。其中：CK1，常规大曲；CK2，添加2L对照酵母的强化大曲；NJ002，添加2L NJ002的强化大曲；NJ002*2，添加4L NJ002的强化大曲；图中数值均重复3次以上。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例1高发酵力酵母菌的分离鉴定
1.高发酵力大曲的筛选
实验室拥有5种不同来源的浓香型大曲，将其分别编号为DQ1、DQ2、DQ3、DQ4、DQ5。分别检测5种大曲的发酵力，并计算乙醇转换率，结果如表1所示。大曲DQ1的发酵力最高，3天和14天乙醇转化率分别为12.38％和90.40％。其次为大曲DQ4，在3天和14天乙醇转化率为4.44％和70.88％。因此在后续高发酵力酵母菌筛选时主要从大曲DQ1、DQ4中分离。
表1大曲的发酵力及乙醇转化率
2.菌株的分离纯化
从大曲中多次平板划线分离、纯化菌株。
3.高发酵力菌株的筛选
通过CO2失重法检测酵母菌发酵力。先用50mL离心管初筛，再使用发酵栓复筛。经过大量实验，最终得到3株发酵力较高的菌株NJ001、NJ002、NJ003，其发酵力如图1所示。这3株菌株前6天发酵力不低于对照酵母(安琪酵母股份有限公司生产的白酒专用耐高温型酿酒高活性干酵母)(后文所述的对照酵母均为该对照酵母)，随着发酵时间的延长，NJ001、NJ002、NJ003的发酵力均显著高于对照菌株，尤其是NJ002在第12天时比对照酵母高6.67％。综上，本研究分离得到的3株菌株，其发酵力在发酵后期均高于对照酵母。
4.高发酵力菌株的鉴定
4.1菌株基因组DNA的提取
使用TIANGEN酵母基因组DNA抽提试剂盒提取NJ001、NJ002和NJ003的基因组DNA。
4.2PCR扩增
以基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用通用引物ITS1/ITS4对其ITS1-5.8S-ITS2区DNA片段区进行PCR扩增。PCR反应体系见表2。PCR扩增程序为：96℃10min；96℃30s，53℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。
表2 PCR扩增体系(30μL)
4.3扩增产物凝胶电泳检测
取3μL扩增产物，加入1μL Loading Buffer，混匀后，在1％琼脂糖凝胶中进行电泳。结果如图2所示，三株菌的扩增条带均较单一，长度均在750～1000bp(图2)，表明PCR扩增成功。
4.4DNA测序及序列比对
将纯化后的PCR产物送至上海华大基因科技有限公司进行测序，获得NJ001、NJ002、NJ003的ITS1-5.8S-ITS2序列，其序列信息如下。
>NJ001的ITS1-5.8S-ITS2序列：
CTTCCGTAGGGGGTGGCTGCGGAAGGATCATTAAAGAAATTTAATAATTTTGAAAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAAGAGCCGAAGAAA
>NJ002的ITS1-5.8S-ITS2序列：
CATATCCGTAGATGACCTTGCGGCTTTTAGCGCGACCAAGTCGTGGAGTTTACTCATCCAGTACGAATCTGTTGACAAACTTAAGATAAATATGTTGTTGTACCTTGCCGATGCTCGATGCCCAAGAAAAGTGGCAAAAATTGAATTCCACAGTGTGTGTATGACGTTTTATTCCTATACCAAAGCACAAATTCTCTCACGTGAAAGCAGAAGAAACTACAGCCTAGCAGACCGCGAATAGCGCAGCCGGCGACTCTCCATCTCTGTCTCTGCCCAGTAAAAGCTCTCATGCTCTGCCAAAACAAAAAAATCCATTTCAAAGTTGTTAAATTCTTTAATGATCCCTCCTTCCGGTAGGGTGACATGCGGAAGGATCATTAAAGAAATTTAATAATTTTGAAAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTGACCTCAAATCAGGTAGGATGCCCAATTA
>NJ003的ITS1-5.8S-ITS2序列：
CCTTGCGGCTTTTAGCGCGACCAAGTCGTGGAGTTTACTCATCCAGTACGAATCTGTTGACAAACTTAAGATAAATATGTTGTTGTACCTTGCCGATGCTCGATGCCCAAGAAAAGTGGCAAAAATTGAATTCCACAGTGTGTGTATGACGTTTTATTCCTATACCAAAGCACAAATTCTCTCACGTGAAAGCAGAAGAAACTACAGCCTAGCAGACCGCGAATAGCGCAGCCGGCGACTCTCCATCTCTGTCTCTGCCCAGTAAAAGCTCTCATGCTCTGCCAAAACAAAAAAATCCATTTCAAAGTTGTTAAATTCTTTAATGATCCCTCCTTCCGGTAGGGTGACATGCGGAAGGATCATTAAAGAAATTTAATAATTTTGAAAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAA
将上述序列提交NCBI数据库比对，三株酵母菌均为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，将其分别命名为S.cerevisiae NJ001、S.cerevisiae NJ002、S.cerevisiaeNJ003。根据它们的序列构建系统发育树(图3)。
实施例2高发酵力酵母菌的耐受性检测及培养条件优化
1.酵母菌生长曲线的绘制
以1％v/v的接种量将培养24h的酵母菌悬液接种于50mL YPD培养基中，30℃、220rpm培养。每3h取样一次(200μL)。向所取样品中加入1mL无菌水，12000rpm离心10min，去上清；重复两次，烘干；向样品中加入1mL无菌水，震荡均匀。以无菌水作为空白对照，使用高端酶标仪检测稀释5倍后样品的OD600，绘制生长曲线(图4)。实验酵母和对照酵母均在生长24h时趋于稳定，因此在后续耐受性检测时均以24h为测定时间。
2.酵母菌的耐受性检测
2.1耐高温性
以1％v/v的接种量将经过活化的酵母菌悬液接种于YPD培养基中。分别放置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的摇床中220rpm培养，24h后取样(200μL)检测OD600。如图5所示，NJ001、NJ002、NJ003和对照酵母的OD600均在40℃和45℃时骤然下降。当培养温度为40℃到55℃时，NJ001、NJ002、NJ003的OD600均显著高于对照酵母；当培养温度达到60℃时，NJ002和NJ003的菌浓仍显著高于对照酵母，此时它们的OD600分别是对照酵母的1.96倍、1.70倍。综上所述，与对照酵母相比，NJ001、NJ002、NJ003均具有更强的耐高温性，尤其是NJ002对高温的耐受性最强。
2.2耐酸性
以1％v/v的接种量将经过活化的酵母菌悬液接种于pH为2、3、5、7、9的YPD培养基中。30℃、220rpm培养，24h后取样(200μL)检测OD600。如图6所示。在pH为5时，NJ001、NJ002、NJ003和对照酵母的OD600并无显著差异。当pH向极端值变化时，各个酵母菌展现出差异。NJ002和NJ003与对照酵母相比均具有更强的耐酸性，它们更能适应酿酒中的酸性环境。尤其当pH为2时，NJ002的OD600是对照酵母的3.31倍。
2.3耐乙醇性
以1％v/v的接种量将经过活化的酵母菌悬液接种于乙醇含量为0％vol、3％vol、6％vol、9％vol、12％vol的YPD培养基中。30℃、220rpm培养，24h后取样(200μL)检测OD600。结果如图7所示，在培养基不含乙醇时，对照酵母的菌浓高于分离的三株酵母菌；随着乙醇含量的增加，三株酵母菌逐渐显示出对乙醇具有更好的耐受性；当培养基中乙醇含量达到12％vol时，三株酵母菌的菌浓均显著高于对照酵母，即NJ001、NJ002和NJ003与对照酵母相比均拥有更强的乙醇耐受性。此外，实验结果显示，适量的乙醇能够促进酵母菌的生长。
根据以上酵母菌的耐高温性、耐酸性、耐乙醇性及发酵力数据，发现酵母菌NJ002在各方面均比较优秀，因此挑选其作为后续优化及应用的菌株。本发明中的酵母菌NJ002保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏名称为Saccharomyces cerevisiae NJ002，保藏编号为CGMCCNo.24735，保藏日期为2022年4月21日。
3.响应面法优化酵母菌NJ002的培养条件
3.1单因素实验
检测了YPD培养基中不同葡萄糖含量、氮源物质(蛋白胨和酵母粉的比例不变)含量、乙醇含量对酵母菌OD600的影响(图8-图10)。这3个单因素均显著影响NJ002的生长，因此，将它们作为后续响应面优化的因素。
3.2影响因子的Box-Behnken实验
按照中心组合设计原理，设计了三因素、三水平的Box-Behnken实验。以葡萄糖、氮源物质、乙醇作为自变量，实验因素编码水平如表3所示。
表3响应面分析法的因素与水平
实验设计共17个实验点，以培养24h的OD600(稀释5倍)为响应Y值，实验结果见表4。
表4 Box-Behnken实验结果
对以上结果进行多元回归分析得到如下方程式：
Y＝1.17-0.26X1-0.14X2-0.24X3+4.25×10-3X1X2-0.093X1X3-7.25×10-3X2X3-0.38X1 2-0.23X2 2-0.15X3 2
对该模型进行方差分析，结果如表5所示。模型F＝740.48、P＜0.01，说明该模型是极显著的；失拟项型P＝0.0622＞0.05，模型失拟不显著，表明实验误差主要是由随机误差导致的。
模型的决定系数R2＝0.9990，调整系数R2(adj)＝0.9976，说明模型能解释NJ002菌浓99.76％的变化。信噪比(Adeq Precision＝80.321)大于4，因而拟合度和可信度较好，可用模型对酵母菌NJ002的OD600进行分析和预测。
其中CV值(Y的变异系数)表示了实验准确度，CV值越小，实验越具有可靠性。本实验的CV值为2.25％，表明实验结果较可靠，具有一定实践指导意义。
表5回归模型方差分析结果
使一个实验变量为零，绘制另外两个实验变量对于响应面的影响。根据模型绘制了三维曲面图和等高线图(图11)。它们可以直观地展示任意两个因素与响应值Y之间的关系。预测结果表明响应值Y存在极值点，即OD600(稀释5倍)为1.310，此时三个自变量对应值分别为葡萄糖15.24％、氮源物质5.09％、乙醇0.83％。
3.3模型验证
为了验证优化后NJ002的OD600是否符合预测结果，采用预测条件培养酵母菌并检测OD600(稀释5倍)。结果如图12所示，优化前NJ002的OD600为0.873；优化后为1.287，相比优化前提高了47.42％。OD600的模型预测值为1.310，实际值与预测值相差仅1.76％，表明模型具有可靠性。
此外，对优化前、优化后NJ002的发酵力进行了检测。如图13所示，优化后NJ002的发酵力始终高于优化前。3天时，优化前和优化后的发酵力分别为0.23g/mL菌液和0.36g/mL菌液，后者是前者的1.56倍；到第18天时，优化前和优化后的发酵力分别为0.59g/mL菌液和1.29g/mL菌液，后者是前者的2.19倍。
实施例3优质酵母菌在大曲制作中的应用
1.大曲制作
将优化后的酵母菌菌液与酒糟混合均匀后，加入制曲原料中用于制作偏高温大曲。菌液添加方案如表6所示。本实验共制作4房大曲，每一种方案制作1房大曲，每房大曲2300块。
表6菌液添加方案
注：a表示在常规大曲的基础上添加菌液制作而成
2.大曲的温度监测
大曲入房摆放完成后，每日上午8:00记录大曲品温，直至28天后大曲出房。大曲温度曲线如图14所示。4房大曲的温度变化基本一致，表明大曲培养过程中的管理是稳定的。
3.大曲样品的选取
每房大曲采取5点取样(每点取1块大曲)的方式选取5块大曲。每块大曲的取样方式如图15所示，两侧边缘2cm处取1cm厚的样品，大曲中心取2cm厚的样品，即每块大曲取3块样，厚度合计4cm。将所获得的同一房大曲样品研磨粉碎、混合均匀后用于后续实验。
4.大曲发酵力检测
为了确定酵母菌NJ002的应用效果，使用发酵栓对4种大曲的发酵力进行了检测，其发酵力结果如图16所示。发酵3天时，大曲CK1、大曲CK2、大曲NJ002、大曲NJ002*2的发酵力分别为0.20g/g、0.21g/g、0.32g/g和0.38g/g。大曲NJ002的发酵力相比于CK1和CK2分别提高了60.00％和55.00％，大曲NJ002*2的发酵力相比于CK1和CK2分别提高了90.00％和80.95％。第18天时，大曲CK1、大曲CK2、大曲NJ002、大曲NJ002*2的发酵力分别为1.20g/g、1.51g/g、2.09g/g和2.60g/g。大曲NJ002的发酵力相比于CK1和CK2分别提高了74.17％和38.41％，大曲NJ002*2的发酵力相比于CK1和CK2分别提高了116.67％和72.19％。因此，添加NJ002的效果明显优于添加对照酵母(大曲CK2)；添加NJ002能够显著提高大曲的发酵力，且添加量对发酵力的提高具有梯度效应。
本发明选取高发酵力大曲，从大曲中分离得到3株高发酵力菌株，经分子生物学鉴定后确定为酿酒酵母(S.cerevisiae)，分别命名为S.cerevisiae NJ001、S.cerevisiaeNJ002、S.cerevisiae NJ003。通过检测耐高温性、耐酸性和耐乙醇性，得到兼具耐高温性、耐酸性和耐乙醇性的高发酵力酵母菌NJ002。利用响应面法对NJ002的培养条件进行优化，当培养基中葡萄糖15.24％、氮源物质5.09％、乙醇0.83％时，NJ002在30℃培养24h的OD600(稀释5倍)为1.29，相较优化前提高了47.42％。优化培养后，3天时发酵力为0.36g/mL菌液，是优化前的1.56倍；第18天，发酵力达1.29g/mL菌液，是优化前的2.19倍。将其应用于大曲制作，可显著提高大曲发酵力，且添加量对发酵力的提高具有梯度效应。每房大曲添加2L NJ002和4L NJ002，可使大曲3天发酵力达0.32g/g和0.38g/g，较常大曲分别提高60.00％和90.00％，18天发酵力达2.09g/g和2.60g/g，较常规大曲分别提高74.17％和116.67％。
综上所述，本研究分离得到一株兼具耐高温、耐酸和耐乙醇的高发酵力酿酒酵母S.cerevisiae NJ002。对其培养条件进行优化并将其应用于制作强化大曲，可显著提高大曲发酵力。本发明在节约粮食、提高效率、节能减排等方面具有重要价值，在企业应用可增加企业和社会效益。
本发明的酿酒酵母S.cerevisiae NJ002保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.24735，保藏日期为：2022年4月21日。
本发明所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行的描述，并非对本发明构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。。
序列表
<110> 安徽大学
<120> 一种具有多重耐受性的酿酒酵母及其分离方法、应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 847
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeNJ001)
<400> 1
cttccgtagg gggtggctgc ggaaggatca ttaaagaaat ttaataattt tgaaaatgga 60
tttttttgtt ttggcaagag catgagagct tttactgggc aagaagacaa gagatggaga 120
gtccagccgg gcctgcgctt aagtgcgcgg tcttgctagg cttgtaagtt tctttcttgc 180
tattccaaac ggtgagagat ttctgtgctt ttgttatagg acaattaaaa ccgtttcaat 240
acaacacact gtggagtttt catatctttg caactttttc tttgggcatt cgagcaatcg 300
gggcccagag gtaacaaaca caaacaattt tatttattca ttaaattttt gtcaaaaaca 360
agaattttcg taactggaaa ttttaaaata ttaaaaactt tcaacaacgg atctcttggt 420
tctcgcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgatacgtaa tgtgaattgc agaattccgt 480
gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg ccccttggta ttccaggggg catgcctgtt 540
tgagcgtcat ttccttctca aacattctgt ttggtagtga gtgatactct ttggagttaa 600
cttgaaattg ctggcctttt cattggatgt tttttttcca aagagaggtt tctctgcgtg 660
cttgaggtat aatgcaagta cggtcgtttt aggttttacc aactgcggct aatctttttt 720
atactgagcg tattggaacg ttatcgataa gaagagagcg tctaggcgaa caatgttctt 780
aaagtttgac ctcaaatcag gtaggagtac ccgctgaact taagcatatc aaaaagagcc 840
gaagaaa 847
<210> 2
<211> 1162
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeNJ002)
<400> 2
catatccgta gatgaccttg cggcttttag cgcgaccaag tcgtggagtt tactcatcca 60
gtacgaatct gttgacaaac ttaagataaa tatgttgttg taccttgccg atgctcgatg 120
cccaagaaaa gtggcaaaaa ttgaattcca cagtgtgtgt atgacgtttt attcctatac 180
caaagcacaa attctctcac gtgaaagcag aagaaactac agcctagcag accgcgaata 240
gcgcagccgg cgactctcca tctctgtctc tgcccagtaa aagctctcat gctctgccaa 300
aacaaaaaaa tccatttcaa agttgttaaa ttctttaatg atccctcctt ccggtagggt 360
gacatgcgga aggatcatta aagaaattta ataattttga aaatggattt ttttgttttg 420
gcaagagcat gagagctttt actgggcaag aagacaagag atggagagtc cagccgggcc 480
tgcgcttaag tgcgcggtct tgctaggctt gtaagtttct ttcttgctat tccaaacggt 540
gagagatttc tgtgcttttg ttataggaca attaaaaccg tttcaataca acacactgtg 600
gagttttcat atctttgcaa ctttttcttt gggcattcga gcaatcgggg cccagaggta 660
acaaacacaa acaattttat ttattcatta aatttttgtc aaaaacaaga attttcgtaa 720
ctggaaattt taaaatatta aaaactttca acaacggatc tcttggttct cgcatcgatg 780
aagaacgcag cgaaatgcga tacgtaatgt gaattgcaga attccgtgaa tcatcgaatc 840
tttgaacgca cattgcgccc cttggtattc cagggggcat gcctgtttga gcgtcatttc 900
cttctcaaac attctgtttg gtagtgagtg atactctttg gagttaactt gaaattgctg 960
gccttttcat tggatgtttt ttttccaaag agaggtttct ctgcgtgctt gaggtataat 1020
gcaagtacgg tcgttttagg ttttaccaac tgcggctaat cttttttata ctgagcgtat 1080
tggaacgtta tcgataagaa gagagcgtct aggcgaacaa tgttcttaaa gttgacctca 1140
aatcaggtag gatgcccaat ta 1162
<210> 3
<211> 1114
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeNJ003)
<400> 3
ccttgcggct tttagcgcga ccaagtcgtg gagtttactc atccagtacg aatctgttga 60
caaacttaag ataaatatgt tgttgtacct tgccgatgct cgatgcccaa gaaaagtggc 120
aaaaattgaa ttccacagtg tgtgtatgac gttttattcc tataccaaag cacaaattct 180
ctcacgtgaa agcagaagaa actacagcct agcagaccgc gaatagcgca gccggcgact 240
ctccatctct gtctctgccc agtaaaagct ctcatgctct gccaaaacaa aaaaatccat 300
ttcaaagttg ttaaattctt taatgatccc tccttccggt agggtgacat gcggaaggat 360
cattaaagaa atttaataat tttgaaaatg gatttttttg ttttggcaag agcatgagag 420
cttttactgg gcaagaagac aagagatgga gagtccagcc gggcctgcgc ttaagtgcgc 480
ggtcttgcta ggcttgtaag tttctttctt gctattccaa acggtgagag atttctgtgc 540
ttttgttata ggacaattaa aaccgtttca atacaacaca ctgtggagtt ttcatatctt 600
tgcaactttt tctttgggca ttcgagcaat cggggcccag aggtaacaaa cacaaacaat 660
tttatttatt cattaaattt ttgtcaaaaa caagaatttt cgtaactgga aattttaaaa 720
tattaaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaaa 780
tgcgatacgt aatgtgaatt gcagaattcc gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg 840
cgccccttgg tattccaggg ggcatgcctg tttgagcgtc atttccttct caaacattct 900
gtttggtagt gagtgatact ctttggagtt aacttgaaat tgctggcctt ttcattggat 960
gttttttttc caaagagagg tttctctgcg tgcttgaggt ataatgcaag tacggtcgtt 1020
ttaggtttta ccaactgcgg ctaatctttt ttatactgag cgtattggaa cgttatcgat 1080
aagaagagag cgtctaggcg aacaatgttc ttaa 1114

Claims (3)

1.一种具有多重耐受性的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），其特征在于，所述酿酒酵母为菌株S. cerevisiae NJ002，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 24735。
2.一种如权利要求1所述具有多重耐受性的酿酒酵母在大曲发酵酒类生产中的应用。
3.一种提高大曲发酵力的方法，其特征在于，将权利要求1所述的具有多重耐受性的酿酒酵母，加入大曲原料中以提高大曲发酵力。
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高耐受酿酒酵母的筛选及酵母曲制备工艺的优化;李晓欢等;酿酒科技(第2期);第110-115、120页 *

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