CN102604849B - 一株高效利用乳糖生产燃料乙醇的酿酒酵母工程菌 - Google Patents
一株高效利用乳糖生产燃料乙醇的酿酒酵母工程菌 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102604849B CN102604849B CN2012100802323A CN201210080232A CN102604849B CN 102604849 B CN102604849 B CN 102604849B CN 2012100802323 A CN2012100802323 A CN 2012100802323A CN 201210080232 A CN201210080232 A CN 201210080232A CN 102604849 B CN102604849 B CN 102604849B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lactose
- saccharomyces cerevisiae
- ethanol
- glucose
- bacterium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 75
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 51
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 title claims abstract description 51
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 title claims abstract description 42
- 239000008101 lactose Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 239000000446 fuel Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title abstract description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 34
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 abstract description 25
- 239000005862 Whey Substances 0.000 abstract description 24
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 abstract description 24
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 abstract description 24
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 abstract description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 abstract description 15
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 9
- 230000012666 negative regulation of transcription by glucose Effects 0.000 abstract description 9
- 101000579123 Homo sapiens Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 abstract description 8
- KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N PGK1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](CCCCCCC(O)=O)C(=O)CC1=O KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N 0.000 abstract description 8
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 abstract description 8
- 102100021710 Endonuclease III-like protein 1 Human genes 0.000 abstract description 6
- 101150017243 LAC12 gene Proteins 0.000 abstract description 6
- 101150022713 LAC4 gene Proteins 0.000 abstract description 6
- 101000970385 Homo sapiens Endonuclease III-like protein 1 Proteins 0.000 abstract description 5
- 108010060845 lactose permease Proteins 0.000 abstract description 5
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 abstract description 4
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 2
- 101100074137 Arabidopsis thaliana IRX12 gene Proteins 0.000 abstract 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 abstract 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 abstract 1
- 238000003466 welding Methods 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 12
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101150028530 MIG1 gene Proteins 0.000 description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 4
- 102100035086 Vacuolar protein sorting-associated protein 4B Human genes 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 101100263876 Homo sapiens VPS4B gene Proteins 0.000 description 3
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101150080490 NTH1 gene Proteins 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150038738 ble gene Proteins 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150040422 NTH2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000679327 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) Cytosolic neutral trehalase Proteins 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一株高效利用乳糖生产产燃料乙醇的酿酒酵母工程菌。本发明提供的酿酒酵母菌，是选用强启动子PGK1分别表达乳糖分解酶基因LAC4及乳糖通透酶基因LAC12，同时敲除MIG1及NTH1基因，缓解葡萄糖阻遏现象，得到一株具有高耐性的高效利用乳糖产乙醇酿酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiae AY5-10B24M，保藏号为CGMCC No5843。该菌在其它发酵性能不受影响的情况下与受体菌株（Saccharomyces cerevisiae CGMCC No2.1364）相比：能够在乳清浓度为100g/L（乳糖含量约为50g/L）的培养基中生长、发酵产乙醇；发酵周期为120h，乳清中乳糖利用率为97.65%；乳糖对无水乙醇得率为为46.4%（相当于理论得率的86.24%）；同时缓解了葡萄糖对半乳糖的阻遏，使葡萄糖和半乳糖可以同时利用；在含有19%（v/v）乙醇，或者环境温度为39°C时可以正常发酵。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一株缓解葡萄糖阻遏又提高了抗逆性的高效利用乳糖的酿酒酵母工程菌。
背景技术
乳清是指在制造干酪或干酪素时，分离出絮凝物后剩下的极稀薄的液体，是工业生产干酪及干酪素的副产品，每生产1t的干酪产生9t乳清，含有牛奶中55%的营养，但是由于乳清具有很高的BOD（生物耗氧量）和COD（化学耗氧量），所以对环境造成很大的负担。目前，全球乳清产量约为16亿吨，而只有其中的50%得到处理，用于食品、饲料等方面，剩下的约8亿吨没有得到有效利用，被排泄到自然界中，不但造成环境的污染，而且还造成该资源的巨大浪费。乳清中除了含有20%乳品蛋白外，含量最多的是乳糖，约占乳清5%左右，是产生高BOD和COD的主要原因。
如何利用乳清中的乳糖，从而减低乳清对环境的污染一直是乳制品行业关注的问题。乳清的利用主要有以下几个方向：用于食品行业、用于饲料行业、用于医药行业。但是随着全球能源危机的加剧，以及世界粮食安全问题等因素，乳清成为新的生产燃料乙醇的主要原料，也使得利用乳清生产燃料乙醇成为一个全新的热点。
目前国外利用乳清生产燃料乙醇已有40多年的历史，所使用的菌种主要有克鲁维酵母和酿酒酵母。克鲁维酵母虽然能够利用乳糖，但是该属酵母酒精产率低，抗逆性差，菌体生长量大，不适用于生产乙醇。酿酒酵母虽然是生产乙醇的最佳首选，但是野生型酿酒酵母不能够利用乳糖为唯一碳源，所以如何改造酿酒酵母，使其可以发酵乳糖产乙醇，一直是科研人员的研究热点。目前国外的解决方法主要分为以下几种：一、是利用原生质体融合技术，对酿酒酵母及克鲁维酵母进行融合，筛选即可以利用乳糖又能高效产乙醇的突变株；二、是采用基因工程手段，把外源基因导入到酿酒酵母体内，使得酿酒酵母具有分解乳糖的能力，从而解决其不能利用乳糖的问题。目前导入最多的外源的基因为克鲁维酵母的LAC4基因（编码乳糖分解酶）和LAC12基因（编码乳糖通透酶）。但是上述两种方法均存在生长缓慢，酒精耐性低等问题。
在酿酒酵母中，胞内海藻糖含量的提高可以改善其抗逆性，胞内海藻糖在中性海藻糖分解酶作用下分解，因此阻断或敲除中性海藻糖酶基因可以提高胞内海藻糖含量。又因为乳糖在乳糖分解酶作用下首先分解成为半乳糖和葡萄糖，在酿酒酵母中，葡萄糖的存在会严重抑制半乳糖的利用，该现象被称为葡萄糖阻遏。葡萄糖存在时，会激活葡萄糖阻遏蛋白复合物，复合物会抑制半乳糖利用所需酶基因的转录。因此，阻断葡萄糖阻遏蛋白复合物的合成可以降低葡萄糖阻遏现象。
在酿酒酵母中中性海藻糖分解酶是由NTH1和NTH2基因编码，其中起主要作用的是NTH1编码的蛋白。而葡萄糖阻遏蛋白复合物是由三个蛋白组成的复合物，其中只有由MIG1编码的Mig1蛋白同半乳糖利用所需酶基因结合，抑制其转录。目前，国内外还未见有过表达LAC4和LAC12基因同时敲除NTH1和MIG1基因的报道。
发明内容
本发明的目的是解决野生型酿酒酵母不能够利用乳糖为唯一碳源，而经基因工程改造的酿酒酵母存在生长抑制和抗逆性低的问题，提供一株能够高效利用乳糖生产燃料乙醇的酿酒酵母工程菌株。
本发明首先提供了一株可以利用乳糖的酿酒酵母工程菌Saccjaromyces cerevisiaeAY5-10B24M，该菌株于2012年03月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，菌种保藏号CGMCC No5843。
本发明所述利用乳糖酿酒酵母工程菌株的构建如下：
1）将PGK1（磷酸甘油酸激酶）启动子和终止子与pUC19质粒连接得到pUC-PGK1；
2）将来源于酿酒酵母的同源片段NTH1连接到第1步得到的pUC-PGK1上，得到pUC-PGK1-NTH1；
3）将编码乳糖分解酶LAC4基因插入到第2步得到的质粒中的PGK1启动子和终止子之间，得到pUC-PGK1-NTH1-LAC4；
4）将sh ble基因连接到第3步得到的pUC-PGK1-NTH1-LAC4上，得到质粒pUC-PGK1-NTH1-LAC4-sh ble；
5）将来源于酿酒酵母的同源片段MIG1连接到第1步得到的pUC-PGK1上，得到pUC-PGK1-MIG1；
6）将编码乳糖通透酶LAC12基因插入到第5步得到的质粒中的PGK1启动子和终止子之间，得到pUC-PGK1-MIG1-LAC12；
7）将kan基因连接到第6步得到的pUC-PGK1-MIG1-LAC12上，得到重组质粒pUC-PGK1-MIG1-LAC12-kan；
8）将构建的两个过表达质粒pUC-PGK1-NTH1-LAC4-sh ble以及pUC-PGK1-MIG1-LAC12-kan分别用NsiI、NheI酶切，用醋酸锂转化法将两个质粒共同插入酿酒酵母a型和α型单倍体，得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株；
9）将纯化后的酿酒酵母a型和α型重组单倍体进行融合，通过抗性平板和生孢实验筛选得到可以利用乳糖的工程菌（双倍体）。
本发明同时提供了一段专门用于鉴定所述利用乳糖的酿酒酵母工程菌的特异性基因序列，该基因序列是以L4-U和L4-D为引物，以所述利用乳糖酿酒酵母工程菌菌株基因组为模板，扩增片段测序为一特异性序列，如序列表序列1所示。
乳清发酵：将以上构建的利用乳糖酿酒酵母工程菌接入20mL葡萄糖培养液中，30℃过夜培养12h；将菌液全部转至200mL乳清培养液中，30℃静置培养发酵。发酵期间每隔24h震荡取样，并记录失重；发酵结束后，停止培养并称重；测定发酵液的残糖浓度、酒精浓度和菌体干重表征其综合性能，结果见表1。
本发明的优点和积极效果：
本发明选用强启动子PGK1过表达编码乳糖通透酶的LAC12基因以及编码乳糖分解酶的LAC4基因，同时敲除MIG1和NTH1基因，获得了一株去除了葡萄糖阻遏、具有高耐性的高效利用乳糖的酿酒酵母工程菌AY5-10B24M(CGMCC No5843)。
本发明所获得的可以利用乳糖的酿酒酵母工程菌Saccjaromyces cerevisiaeAY5-10B24M（保藏号CGMCC No5843）与初始的酿酒酵母菌（受体菌Saccharomycescerevisiae CGMCC No2.1364）相比：能够在乳清浓度为120g/L（乳糖含量为60g/L）的培养基中生长、发酵产乙醇；发酵周期为168h，乳清中乳糖利用率为99.7%；乳糖对无水乙醇得率为35.7%（相当于理论得率的69.9%）；同时缓解了葡萄糖对半乳糖的阻遏，使葡萄糖和半乳糖可以同时利用。
附图说明
图1是质粒pUC-PNLZ和pPMLK的验证电泳图。
图2是阳性重组酿酒酵母单倍体的验证。
图3是乳糖利用型酿酒酵母工程菌的构建路线图。
图4是工程菌与亲本双糖中发酵情况比较，其中（A）受体菌，（B）为工程菌。
本发明所述的乳糖利用型酿酒酵母工程菌（Saccharomyces cerevisiae）具体为AY5-10B24M，已于2012年03月05日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院），保藏号为CGMCC No5843。
具体实施方式
本发明所使用的酿酒酵母双倍体菌体是可以采用任何来源的酿酒酵母双倍体菌株。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1：高效利用乳清生产燃料乙醇的酿酒酵母基因工程菌的构建
（1）基因工程菌株的构建
1）将PGK1启动子和终止子与pUC19质粒连接得到pUC-PGK1；
2）将来源于酿酒酵母的同源片段NTH1连接到第1步得到的pUC-PGK1上，得到pUC-PGK1-NTH1；
3）将编码乳糖分解酶LAC4基因插入到第2步得到的质粒中的PGK1启动子和终止子之间，得到pUC-PGK1-NTH1-LAC4；
4）将sh ble基因连接到第3步得到的pUC-PGK1-NTH1-LAC4上，得到质粒pUC-PGK1-NTH1-LAC4-sh ble；
5）将来源于酿酒酵母的同源片段MIG1连接到第1步得到的pUC-PGK1上，得到pUC-PGK1-MIG1；
6）将编码乳糖通透酶LAC12基因插入到第5步得到的质粒中的PGK1启动子和终止子之间，得到pUC-PGK1-MIG1-LAC12；
7）将kan基因连接到第6步得到的pUC-PGK1-MIG1-LAC12上，得到重组质粒pUC-PGK1-MIG1-LAC12-kan；
图1为pUC-PNLZ和pUC-PMLK质粒的验证电泳图：其中泳道1为1kb DNA LadderMarker；泳道2为pUC-PNLZ质粒；泳道3为pUC-PMLK质粒；泳道4为pUC-PNLZ单酶切线性化结果；泳道5为pUC-PMLK质粒单酶切线性化结果。
8）NsiI、NheI分别酶切质粒pUC-PNLZ和pUC-PMLK；用醋酸锂转化法分别将其插入到受体菌（Saccharomyces cerevisiae CGMCC No2.1364）的a型和α型单倍体，得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株。图2为a和α型阳性重组单倍体PCR验证结果。其中泳道1为5000bp DNA Ladder Marker，泳道2为a型重组单倍体下游PCR产物；泳道3为α型重组单倍体下游PCR产物，泳道4为受体菌a/α型单倍体上游PCR阴性对照；泳道5为a型重组单倍体上游PCR产物；泳道6为α型重组单倍体上游PCR产物；泳道7为受体菌a/α型单倍体下游PCR阴性对照。
9）将纯化后的酿酒酵母a型和α型重组单倍体进行融合，通过抗性平板和生孢实验筛选得到可以利用乳糖的酿酒酵母工程菌（双倍体）。图3为利用乳糖酿酒酵母工程菌的构建过程。
（2）基因工程菌株的特异性序列
获得的基因工程菌株AY5-10B24M(CGMCC No5843)染色体中含有一段特异性序列，可通过PCR扩增测序后进行菌株鉴定，而受体菌中不存在该片段。
特异性片段扩增的引物序列分别为：
L4-U:5’-GCTGTAGGTATCTCAGTTCGGT-3’
L4-D:5’-TGAATCCGACTGAGAAATGG-3’
特异性片段的基因序列见序列表1。
实施例2：利用乳清产燃料乙醇工程菌发酵性能的研究
将工程菌AY5-10B24M(CGMCC No5843)接入20mL葡萄糖培养液中，30℃过夜培养12h；将菌液全部转至200mL乳清培养液中，30℃静置培养发酵。乳清培养基为：乳清粉10%，(NH4)2SO40.5%，MgSO4·7H2O0.1%。发酵期间每隔24h震荡取样，并记录失重；发酵结束后，停止培养并称重；测定发酵液的残糖浓度、酒精浓度和菌体干重表征其综合性能，结果见表1。
表1酿酒酵母受体菌和工程菌在乳清中发酵性能
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。
实施例3：乳糖利用型酿酒酵母工程菌与出发菌株葡萄糖阻遏现象研究
分别将工程菌和受体菌接种至20mL YEPD培养液中，30℃培养24h。配置葡萄糖与半乳糖1:1混合培养基：葡萄糖3g，半乳糖3g，(NH4)2SO40.5g，MgSO4·7H2O0.1g，酵母粉0.2g，蛋白胨0.1g，KH2PO40.3g。按10%接种量将两株菌各自接种到混合培养基中，30℃静置培养。发酵期间不同时间振荡取样，测不同糖浓度，从图4可以看出，受体菌中，葡萄糖和半乳糖的利用是有顺序的，只有葡萄糖被完全利用之后，半乳糖才开始利用；而在工程菌中，葡萄糖和半乳糖是同时利用的，当葡萄糖被完全消耗时，已经有16.5%被利用，结果见图4，其中（A）为受体菌，（B）为工程菌。
实施例4：工程菌与受体菌耐性比较
将工程菌与受体菌分别接于6mLYEPD/管进行一级培养，30°C静置培养24h后取种子液0.5mL接于不同酒精浓度的YEPD培养基中，30°C静置培养观察产气情况。温度耐性实验为取种子液0.5mL接于YEPD培养基中，在不同温度中培养，观察其产气情况。酒精耐性及温度耐性见表3。具体培养基成分含量见表2。
表2不同酒精浓度培养基成分含量
表3工程菌与受体菌酒精耐性、温度耐性比较
注：“＋”为生长，“－”为不长；所示结果为三个平行实验平均结果
Claims (1)
1.一株高效利用乳糖生产燃料乙醇的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）工程菌AY5-10B24M，保藏号为CGMCC No5843。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012100802323A CN102604849B (zh) | 2012-03-23 | 2012-03-23 | 一株高效利用乳糖生产燃料乙醇的酿酒酵母工程菌 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012100802323A CN102604849B (zh) | 2012-03-23 | 2012-03-23 | 一株高效利用乳糖生产燃料乙醇的酿酒酵母工程菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102604849A CN102604849A (zh) | 2012-07-25 |
| CN102604849B true CN102604849B (zh) | 2013-08-14 |
Family
ID=46522626
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012100802323A Expired - Fee Related CN102604849B (zh) | 2012-03-23 | 2012-03-23 | 一株高效利用乳糖生产燃料乙醇的酿酒酵母工程菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102604849B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105199975A (zh) * | 2015-09-29 | 2015-12-30 | 河北科技师范学院 | 一株高效利用乳清产乙醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103122323A (zh) * | 2012-12-03 | 2013-05-29 | 天津科技大学 | 一株快速发酵面包酵母菌种及其选育方法 |
| RU2021109889A (ru) * | 2014-11-14 | 2021-05-06 | Инбиос Н.В. | Мутантные микроорганизмы, устойчивые к гибели под действием лактозы |
| CN105602862B (zh) * | 2016-03-22 | 2019-11-26 | 南京工业大学 | 一株高乙醇耐受性基因工程菌及其构建方法与应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101440352A (zh) * | 2008-11-17 | 2009-05-27 | 天津科技大学 | 高耐性酿酒酵母工程菌及其构建方法 |
-
2012
- 2012-03-23 CN CN2012100802323A patent/CN102604849B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101440352A (zh) * | 2008-11-17 | 2009-05-27 | 天津科技大学 | 高耐性酿酒酵母工程菌及其构建方法 |
Non-Patent Citations (14)
| Title |
|---|
| ´ |
| A. Teixeira.Alcohol Production from Cheese Whey Permeate Using Genetically Modified Flocculent Yeast Cells.《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》.2001,第72卷(第5期), |
| Alcohol Production from Cheese Whey Permeate Using Genetically Modified Flocculent Yeast Cells;Lucı´lia Domingues, Nelson Lima, Jose´ A. Teixeira;《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》;20010305;第72卷(第5期);507-514 * |
| Alleviation of glucose repression of maltose metabolism by MIG1 disruption in Saccharomyces cerevisiae.;C J Klein et al.;《Appl. Environ. Microbiol.》;19961231;第62卷(第12期);4441-4449 * |
| Birgitte Rø |
| C J Klein et al..Alleviation of glucose repression of maltose metabolism by MIG1 disruption in Saccharomyces cerevisiae..《Appl. Environ. Microbiol.》.1996,第62卷(第12期), |
| Construction of a flocculent Saccharomyces cerevisiae fermenting lactose;L. Domingues, J. A. Teixeira and N. Lima;《Appl Microbiol Biotechnol》;19990531;第51卷(第5期);621-624 * |
| Derepression of galactose metabolism in melibiase producing bakers’ and distillers’ yeast;Birgitte Rønnow et al.;《Journal of Biotechnology》;19990702;第72卷(第2期);213-225 * |
| L. Domingues, J. A. Teixeira and N. Lima.Construction of a flocculent Saccharomyces cerevisiae fermenting lactose.《Appl Microbiol Biotechnol》.1999,第51卷(第5期), |
| Lactose utilization by Saccharomyces cerevisiae strains expressing Kluyveromyces lactis LAC genes;Marta Rubio-Texeira et al.;《Journal of Biotechnology》;20001130;第84卷(第2期);97-106 * |
| lia Domingues, Nelson Lima, Jose´ |
| Lucı |
| Marta Rubio-Texeira et al..Lactose utilization by Saccharomyces cerevisiae strains expressing Kluyveromyces lactis LAC genes.《Journal of Biotechnology》.2000,第84卷(第2期), |
| nnow et al..Derepression of galactose metabolism in melibiase producing bakers’ and distillers’ yeast.《Journal of Biotechnology》.1999,第72卷(第2期), |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105199975A (zh) * | 2015-09-29 | 2015-12-30 | 河北科技师范学院 | 一株高效利用乳清产乙醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法 |
| CN105199975B (zh) * | 2015-09-29 | 2018-12-07 | 河北科技师范学院 | 一株高效利用乳清产乙醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102604849A (zh) | 2012-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2373397T3 (es) | Cepas de saccharomyces no recombinantes que crecen en xilosa. | |
| Pongcharoen et al. | High temperature alcoholic fermentation by new thermotolerant yeast strains Pichia kudriavzevii isolated from sugarcane field soil | |
| CN103849576B (zh) | 一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株 | |
| MURATA et al. | High-temperature fermentation technology for low-cost bioethanol | |
| CN102604849B (zh) | 一株高效利用乳糖生产燃料乙醇的酿酒酵母工程菌 | |
| CN103820346B (zh) | 一株酿酒酵母及其在发酵产乙醇中的应用 | |
| CN101631864A (zh) | 使用酵母菌通过丁酰-CoA作为中间体制备丁醇的方法 | |
| Balia et al. | Selection of mozzarella cheese whey native yeasts with ethanol and glucose tolerance ability | |
| CN105874056B (zh) | 用于生产第一代乙醇的酵母菌株 | |
| CN103820347B (zh) | 一株具有乙酸耐受性的工业酿酒酵母菌株 | |
| CN104673712A (zh) | 一株同步利用葡萄糖与木糖生产醇类燃料的菌株及其应用 | |
| Buakhiaw et al. | Effect of media on acetone-butanol-ethanol fermentation by isolated Clostridium spp. | |
| CN105624051A (zh) | 基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株及构建方法 | |
| Krishnamoorthy et al. | Intergeneric protoplast fusion of yeast for high ethanol production from cheese industry waste–Whey | |
| CN102199614A (zh) | 一种稳定联产异丙醇和丁醇的工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN102226163B (zh) | 一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其应用 | |
| Naumova et al. | Molecular genetic characteristics of Saccharomyces cerevisiae distillers’ yeasts | |
| CN105199975B (zh) | 一株高效利用乳清产乙醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法 | |
| CN103667274A (zh) | 一种多形汉逊酵母遗传操作策略及其应用 | |
| CN103289905B (zh) | 一种低阶煤降解菌及其在褐煤液化中的应用 | |
| Cimpeanu et al. | Bioethanol production by new thermotolerant Romanian yeast strains | |
| CN103562216A (zh) | 纤维糊精和β-D-葡萄糖的增强型发酵 | |
| Liu et al. | Control of Lactobacillus plantarum contamination in bioethanol fermentation by adding plantaricins | |
| Utama et al. | Species identification of stress resistance yeasts isolated from banana waste for ethanol production | |
| CN104109640A (zh) | 一株产酯生香的固态发酵酵母及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130814 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |