CN102604849B - 一株高效利用乳糖生产燃料乙醇的酿酒酵母工程菌 - Google Patents
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Abstract
一株高效利用乳糖生产产燃料乙醇的酿酒酵母工程菌。本发明提供的酿酒酵母菌，是选用强启动子PGK1分别表达乳糖分解酶基因LAC4及乳糖通透酶基因LAC12，同时敲除MIG1及NTH1基因，缓解葡萄糖阻遏现象，得到一株具有高耐性的高效利用乳糖产乙醇酿酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiae AY5-10B24M，保藏号为CGMCC No5843。该菌在其它发酵性能不受影响的情况下与受体菌株（Saccharomyces cerevisiae CGMCC No2.1364）相比：能够在乳清浓度为100g/L（乳糖含量约为50g/L）的培养基中生长、发酵产乙醇；发酵周期为120h，乳清中乳糖利用率为97.65%；乳糖对无水乙醇得率为为46.4%（相当于理论得率的86.24%）；同时缓解了葡萄糖对半乳糖的阻遏，使葡萄糖和半乳糖可以同时利用；在含有19%（v/v）乙醇，或者环境温度为39°C时可以正常发酵。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一株缓解葡萄糖阻遏又提高了抗逆性的高效利用乳糖的酿酒酵母工程菌。
背景技术
乳清是指在制造干酪或干酪素时，分离出絮凝物后剩下的极稀薄的液体，是工业生产干酪及干酪素的副产品，每生产1t的干酪产生9t乳清，含有牛奶中55%的营养，但是由于乳清具有很高的BOD（生物耗氧量）和COD（化学耗氧量），所以对环境造成很大的负担。目前，全球乳清产量约为16亿吨，而只有其中的50%得到处理，用于食品、饲料等方面，剩下的约8亿吨没有得到有效利用，被排泄到自然界中，不但造成环境的污染，而且还造成该资源的巨大浪费。乳清中除了含有20%乳品蛋白外，含量最多的是乳糖，约占乳清5%左右，是产生高BOD和COD的主要原因。
如何利用乳清中的乳糖，从而减低乳清对环境的污染一直是乳制品行业关注的问题。乳清的利用主要有以下几个方向：用于食品行业、用于饲料行业、用于医药行业。但是随着全球能源危机的加剧，以及世界粮食安全问题等因素，乳清成为新的生产燃料乙醇的主要原料，也使得利用乳清生产燃料乙醇成为一个全新的热点。
目前国外利用乳清生产燃料乙醇已有40多年的历史，所使用的菌种主要有克鲁维酵母和酿酒酵母。克鲁维酵母虽然能够利用乳糖，但是该属酵母酒精产率低，抗逆性差，菌体生长量大，不适用于生产乙醇。酿酒酵母虽然是生产乙醇的最佳首选，但是野生型酿酒酵母不能够利用乳糖为唯一碳源，所以如何改造酿酒酵母，使其可以发酵乳糖产乙醇，一直是科研人员的研究热点。目前国外的解决方法主要分为以下几种：一、是利用原生质体融合技术，对酿酒酵母及克鲁维酵母进行融合，筛选即可以利用乳糖又能高效产乙醇的突变株；二、是采用基因工程手段，把外源基因导入到酿酒酵母体内，使得酿酒酵母具有分解乳糖的能力，从而解决其不能利用乳糖的问题。目前导入最多的外源的基因为克鲁维酵母的LAC4基因（编码乳糖分解酶）和LAC12基因（编码乳糖通透酶）。但是上述两种方法均存在生长缓慢，酒精耐性低等问题。
在酿酒酵母中，胞内海藻糖含量的提高可以改善其抗逆性，胞内海藻糖在中性海藻糖分解酶作用下分解，因此阻断或敲除中性海藻糖酶基因可以提高胞内海藻糖含量。又因为乳糖在乳糖分解酶作用下首先分解成为半乳糖和葡萄糖，在酿酒酵母中，葡萄糖的存在会严重抑制半乳糖的利用，该现象被称为葡萄糖阻遏。葡萄糖存在时，会激活葡萄糖阻遏蛋白复合物，复合物会抑制半乳糖利用所需酶基因的转录。因此，阻断葡萄糖阻遏蛋白复合物的合成可以降低葡萄糖阻遏现象。
在酿酒酵母中中性海藻糖分解酶是由NTH1和NTH2基因编码，其中起主要作用的是NTH1编码的蛋白。而葡萄糖阻遏蛋白复合物是由三个蛋白组成的复合物，其中只有由MIG1编码的Mig1蛋白同半乳糖利用所需酶基因结合，抑制其转录。目前，国内外还未见有过表达LAC4和LAC12基因同时敲除NTH1和MIG1基因的报道。
发明内容
本发明的目的是解决野生型酿酒酵母不能够利用乳糖为唯一碳源，而经基因工程改造的酿酒酵母存在生长抑制和抗逆性低的问题，提供一株能够高效利用乳糖生产燃料乙醇的酿酒酵母工程菌株。
本发明首先提供了一株可以利用乳糖的酿酒酵母工程菌Saccjaromyces cerevisiaeAY5-10B24M，该菌株于2012年03月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，菌种保藏号CGMCC No5843。
本发明所述利用乳糖酿酒酵母工程菌株的构建如下：
1）将PGK1（磷酸甘油酸激酶）启动子和终止子与pUC19质粒连接得到pUC-PGK1；
2）将来源于酿酒酵母的同源片段NTH1连接到第1步得到的pUC-PGK1上，得到pUC-PGK1-NTH1；
3）将编码乳糖分解酶LAC4基因插入到第2步得到的质粒中的PGK1启动子和终止子之间，得到pUC-PGK1-NTH1-LAC4；
4）将sh ble基因连接到第3步得到的pUC-PGK1-NTH1-LAC4上，得到质粒pUC-PGK1-NTH1-LAC4-sh ble；
5）将来源于酿酒酵母的同源片段MIG1连接到第1步得到的pUC-PGK1上，得到pUC-PGK1-MIG1；
6）将编码乳糖通透酶LAC12基因插入到第5步得到的质粒中的PGK1启动子和终止子之间，得到pUC-PGK1-MIG1-LAC12；
7）将kan基因连接到第6步得到的pUC-PGK1-MIG1-LAC12上，得到重组质粒pUC-PGK1-MIG1-LAC12-kan；
8）将构建的两个过表达质粒pUC-PGK1-NTH1-LAC4-sh ble以及pUC-PGK1-MIG1-LAC12-kan分别用NsiI、NheI酶切，用醋酸锂转化法将两个质粒共同插入酿酒酵母a型和α型单倍体，得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株；
9）将纯化后的酿酒酵母a型和α型重组单倍体进行融合，通过抗性平板和生孢实验筛选得到可以利用乳糖的工程菌（双倍体）。
本发明同时提供了一段专门用于鉴定所述利用乳糖的酿酒酵母工程菌的特异性基因序列，该基因序列是以L4-U和L4-D为引物，以所述利用乳糖酿酒酵母工程菌菌株基因组为模板，扩增片段测序为一特异性序列，如序列表序列1所示。
乳清发酵：将以上构建的利用乳糖酿酒酵母工程菌接入20mL葡萄糖培养液中，30℃过夜培养12h；将菌液全部转至200mL乳清培养液中，30℃静置培养发酵。发酵期间每隔24h震荡取样，并记录失重；发酵结束后，停止培养并称重；测定发酵液的残糖浓度、酒精浓度和菌体干重表征其综合性能，结果见表1。
本发明的优点和积极效果：
本发明选用强启动子PGK1过表达编码乳糖通透酶的LAC12基因以及编码乳糖分解酶的LAC4基因，同时敲除MIG1和NTH1基因，获得了一株去除了葡萄糖阻遏、具有高耐性的高效利用乳糖的酿酒酵母工程菌AY5-10B24M(CGMCC No5843)。
本发明所获得的可以利用乳糖的酿酒酵母工程菌Saccjaromyces cerevisiaeAY5-10B24M（保藏号CGMCC No5843）与初始的酿酒酵母菌（受体菌Saccharomycescerevisiae CGMCC No2.1364）相比：能够在乳清浓度为120g/L（乳糖含量为60g/L）的培养基中生长、发酵产乙醇；发酵周期为168h，乳清中乳糖利用率为99.7%；乳糖对无水乙醇得率为35.7%（相当于理论得率的69.9%）；同时缓解了葡萄糖对半乳糖的阻遏，使葡萄糖和半乳糖可以同时利用。
附图说明
图1是质粒pUC-PNLZ和pPMLK的验证电泳图。
图2是阳性重组酿酒酵母单倍体的验证。
图3是乳糖利用型酿酒酵母工程菌的构建路线图。
图4是工程菌与亲本双糖中发酵情况比较，其中（A）受体菌，（B）为工程菌。
本发明所述的乳糖利用型酿酒酵母工程菌（Saccharomyces cerevisiae）具体为AY5-10B24M，已于2012年03月05日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院），保藏号为CGMCC No5843。
具体实施方式
本发明所使用的酿酒酵母双倍体菌体是可以采用任何来源的酿酒酵母双倍体菌株。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1：高效利用乳清生产燃料乙醇的酿酒酵母基因工程菌的构建
（1）基因工程菌株的构建
1）将PGK1启动子和终止子与pUC19质粒连接得到pUC-PGK1；
2）将来源于酿酒酵母的同源片段NTH1连接到第1步得到的pUC-PGK1上，得到pUC-PGK1-NTH1；
3）将编码乳糖分解酶LAC4基因插入到第2步得到的质粒中的PGK1启动子和终止子之间，得到pUC-PGK1-NTH1-LAC4；
4）将sh ble基因连接到第3步得到的pUC-PGK1-NTH1-LAC4上，得到质粒pUC-PGK1-NTH1-LAC4-sh ble；
5）将来源于酿酒酵母的同源片段MIG1连接到第1步得到的pUC-PGK1上，得到pUC-PGK1-MIG1；
6）将编码乳糖通透酶LAC12基因插入到第5步得到的质粒中的PGK1启动子和终止子之间，得到pUC-PGK1-MIG1-LAC12；
7）将kan基因连接到第6步得到的pUC-PGK1-MIG1-LAC12上，得到重组质粒pUC-PGK1-MIG1-LAC12-kan；
图1为pUC-PNLZ和pUC-PMLK质粒的验证电泳图：其中泳道1为1kb DNA LadderMarker；泳道2为pUC-PNLZ质粒；泳道3为pUC-PMLK质粒；泳道4为pUC-PNLZ单酶切线性化结果；泳道5为pUC-PMLK质粒单酶切线性化结果。
8）NsiI、NheI分别酶切质粒pUC-PNLZ和pUC-PMLK；用醋酸锂转化法分别将其插入到受体菌（Saccharomyces cerevisiae CGMCC No2.1364）的a型和α型单倍体，得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株。图2为a和α型阳性重组单倍体PCR验证结果。其中泳道1为5000bp DNA Ladder Marker，泳道2为a型重组单倍体下游PCR产物；泳道3为α型重组单倍体下游PCR产物，泳道4为受体菌a/α型单倍体上游PCR阴性对照；泳道5为a型重组单倍体上游PCR产物；泳道6为α型重组单倍体上游PCR产物；泳道7为受体菌a/α型单倍体下游PCR阴性对照。
9）将纯化后的酿酒酵母a型和α型重组单倍体进行融合，通过抗性平板和生孢实验筛选得到可以利用乳糖的酿酒酵母工程菌（双倍体）。图3为利用乳糖酿酒酵母工程菌的构建过程。
（2）基因工程菌株的特异性序列
获得的基因工程菌株AY5-10B24M(CGMCC No5843)染色体中含有一段特异性序列，可通过PCR扩增测序后进行菌株鉴定，而受体菌中不存在该片段。
特异性片段扩增的引物序列分别为：
L4-U:5’-GCTGTAGGTATCTCAGTTCGGT-3’
L4-D:5’-TGAATCCGACTGAGAAATGG-3’
特异性片段的基因序列见序列表1。
实施例2：利用乳清产燃料乙醇工程菌发酵性能的研究
将工程菌AY5-10B24M(CGMCC No5843)接入20mL葡萄糖培养液中，30℃过夜培养12h；将菌液全部转至200mL乳清培养液中，30℃静置培养发酵。乳清培养基为：乳清粉10%，(NH4)2SO40.5%，MgSO4·7H2O0.1%。发酵期间每隔24h震荡取样，并记录失重；发酵结束后，停止培养并称重；测定发酵液的残糖浓度、酒精浓度和菌体干重表征其综合性能，结果见表1。
表1酿酒酵母受体菌和工程菌在乳清中发酵性能
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。
实施例3：乳糖利用型酿酒酵母工程菌与出发菌株葡萄糖阻遏现象研究
分别将工程菌和受体菌接种至20mL YEPD培养液中，30℃培养24h。配置葡萄糖与半乳糖1:1混合培养基：葡萄糖3g，半乳糖3g，(NH4)2SO40.5g，MgSO4·7H2O0.1g，酵母粉0.2g，蛋白胨0.1g，KH2PO40.3g。按10%接种量将两株菌各自接种到混合培养基中，30℃静置培养。发酵期间不同时间振荡取样，测不同糖浓度，从图4可以看出，受体菌中，葡萄糖和半乳糖的利用是有顺序的，只有葡萄糖被完全利用之后，半乳糖才开始利用；而在工程菌中，葡萄糖和半乳糖是同时利用的，当葡萄糖被完全消耗时，已经有16.5%被利用，结果见图4，其中（A）为受体菌，（B）为工程菌。
实施例4：工程菌与受体菌耐性比较
将工程菌与受体菌分别接于6mLYEPD/管进行一级培养，30°C静置培养24h后取种子液0.5mL接于不同酒精浓度的YEPD培养基中，30°C静置培养观察产气情况。温度耐性实验为取种子液0.5mL接于YEPD培养基中，在不同温度中培养，观察其产气情况。酒精耐性及温度耐性见表3。具体培养基成分含量见表2。
表2不同酒精浓度培养基成分含量
表3工程菌与受体菌酒精耐性、温度耐性比较
注：“＋”为生长，“－”为不长；所示结果为三个平行实验平均结果
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1.一株高效利用乳糖生产燃料乙醇的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）工程菌AY5-10B24M，保藏号为CGMCC No5843。
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