CN103849576B

CN103849576B - 一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株

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Publication number: CN103849576B
Application number: CN201410103468.3A
Authority: CN
Inventors: 赵心清; 张明明; 白凤武
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2014-03-19
Filing date: 2014-03-19
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2034-03-19
Also published as: CN103849576A

Abstract

一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株（4126-SET5），属于微生物技术领域。该菌株分类命名为Saccharomyces cerevisiae，菌株的登记入册编号为CGMCC No.8724，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年1月15日。本发明公开了重组菌株4126-SET5的基因工程构建方法，包括基因的获得、染色体整合载体的构建，以及菌株在各种环境胁迫条件下，包括在含有较高浓度乙酸、过氧化氢、乙醇的平板上和在高温条件下的生长情况。与整合空载体的对照菌株相比，重组酿酒菌株4126-SET5可以在5g/L乙酸条件下进行快速发酵，这不仅可以为进一步研究酿酒酵母耐受性机理提供理论支持，还可以作为纤维素乙醇发酵的良好菌株。

Description

一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株

技术领域

本发明涉及一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株（4126-SET5），属于微生物技术领域。

背景技术

酿酒酵母广泛应用于食品、酿造及生物能源生产等不同领域，良好的细胞活性有利于增加生物量的积累，促进细胞循环使用，提高发酵效率，但酿酒酵母在生长和发酵过程中，尤其是在工业生产条件下，经常受到高浓度乙醇、极端温度（冷冻或高温等），低pH及高渗透压等环境胁迫因素的影响，这些环境胁迫条件抑制细胞生长及代谢，从而影响了生产效率（Journal ofBiotechnology，2009，144：23-30）。因此，酿酒酵母细胞对环境胁迫因素的反应和耐受性机制一直是国内外学者研究的重点。

随着经济的快速发展，我国能源短缺问题不断突出。第二代生物乙醇以纤维素原材料，包括农作物秸秆，林业废弃物等发酵生产乙醇。与第一代生物乙醇不同之处在于，纤维素乙醇避免了与人争粮，与粮征地的弊端。在纤维素乙醇生产中，原料预处理过程中产生的弱酸类﹑醛类和酚类等抑制物对细胞的生长和发酵具有抑制作用（Biotechnology for Biofuels，2009，2：1-11）。为减小抑制剂的影响所采取的一些脱毒策略往往造成糖的损失和生产成本的增加,这在实际生产与经济上是不可行的，因而具有高耐受性的菌株的选育成为必要。近年来,通过细胞全局基因表达分析和各种组学数据分析（Antonie vanLeeuwenhoek，2013，103：1281-1295）,以及对单基因敲除的所有突变体的表型组研究（Microbial Cell Factories，2010，9：79），对酿酒酵母乙酸耐性的分子机制有了更多新的认识,揭示了很多新的与乙酸毒性的适应性反应和乙酸耐性提高相关的基因。本发明得到的重组酿酒酿酒酵母就是以此获得，且本菌株具有较强的乙酸耐受性。

纤维素预处理的现在多通过物理、化学和生物方法实现，但是通过化学、物理方法的预处理需要消耗太多的能源且处理的过程中产生大量的污染物。生物酶解的过程比较温和，这一过程需要多种酶的参与，通过内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶把纤维素酶解成酵母细胞能够利用的糖类。此过程比较复杂，更重要的是水解产生的糖类对生物酶的活性有明显的抑制作用，因而同步糖化发酵（SSF）是必然的一种趋势，此过程可以减少纤维素乙醇发酵中的能耗，并且降低菌体污染的可能性。然而在较低的温度下，纤维素酶的水解效率会非常低，综合考虑水解和发酵过程（Biotechnology Advances，2012，30：1207–1218），耐高温酵母是一种必然的需求。本发明得到的重组酿酒酵母菌株能在较高温度下良好生长，可用于高温发酵。

发明内容

本发明的目的在于构建一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株，能在分别含有高浓度乙酸、过氧化氢、乙醇和高温等环境胁迫条件下良好生长，并能在较强的环境胁迫条件下，比如高浓度乙酸条件下具有较高的乙醇发酵效率。

本发明涉及一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株（4126-SET5），该菌株分类命名为Saccharomyces cerevisiae，菌株的登记入册编号为CGMCC No.8724，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年01月15日。

所述菌株SET5基因来源于实验室模式酿酒酵母S288c，将PCR扩增得到的SET5基因连接到pHO组成型整合表达载体（Applied Energy,2012,110：33-40），线性化后转入工业酿酒酵母，实现整合表达。

所述具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株（4126-SET5）根据已有的转录组分析结果，选择变化显著的靶点SET5基因，该基因序列的GenBank登录号为NC_001140.6。PGK1启动子序列GenBank登录号为FJ415226.1，CYC1终止子序列GenBank登录号为EF210198.1。通过基因工程手段在酵母的HO整合载体（NCBI：#AF324728，美国Utah大学David J.Stillman惠赠；Nucleic acidsresearch，2001,29：e59）的基础上连接PGK1强启动子和CYC1终止子构成pHO组成型表达载体。然后把PCR扩增获得的SET5基因连接在PGK1启动子和CYC1终止子之间，线性化后电转导入工业酿酒酵母4126中，进行过表达。导入的质粒会在酿酒酵母基因组的HO基因位点（Yeast,1997,13：1563-1573）整合表达。

本发明采用酿酒酵母的pHO组成型表达载体进行重组菌株的整合表达，pHO组成型表达载体可以通过同源重组的方式在酿酒酵母的HO基因位点进行整合表达，该载体通过基因工程手段在质粒的多克隆位点插入PGK1启动子和CYC1终止子，用于组成型整合表达，根据载体含有的遗传霉素G418抗性进行抗生素筛选。

本发明的有益成果是：本发明的重组酿酒酵母4126-SET5能在分别含有高浓度乙酸、过氧化氢、乙醇和高温等环境胁迫条件下良好生长。并能在较强的环境胁迫条件下，比如高浓度乙酸条件下具有较高的乙醇发酵效率。

附图说明

图1是SET5基因片段的PCR扩增。

图2是载体构建。

图3是阳性转化子PCR鉴定。

图4是重组空载酵母4126-HO对照菌株和重组酿酒酵母4126-SET5在含有不同胁迫因素的平板中生长比较。

图5是重组空载酵母4126-HO对照菌株和重组酿酒酵母4126-SET5在5g/L乙酸中的生长结果。

图6是重组空载酵母4126-HO对照菌株和重组酿酒酵母4126-SET5在5g/L乙酸中的发酵结果。

具体实施方式

实施例1：含组蛋白甲基化酶编码基因SET5的重组酿酒酵母的构建和转化

本发明涉及的组蛋白甲基化酶编码基因SET5序列来自于NCBI公共数据库，该基因的GenBank登录号为NC_001140.6。基因的启动子用PGK1启动子，用CYC1终止子作为终止子，以酶切连接的方式在PGK1启动子和CYC1终止子之间插入SET5基因。然后通过酶切位点NotI把构建的质粒酶切成线性，转化到工业酿酒酵母4126中表达。

1.1酿酒酵母基因组DNA提取

（1）将过夜培养的酵母菌液离心，12000rpm，2min，去上清；

（2）向沉淀加入480μL TE溶液（pH8.0），20μL溶菌酶溶液（2mg/mL），震荡混匀后放入37℃摇床1.5小时；

（3）加入适量RNase A，再次放入37℃摇床0.5小时；

（4）从摇床中拿出，加入50μL20%SDS溶液，5μL蛋白酶K（PK浓度为20μg/mL）混合震荡，55℃水浴锅中放置1h以上；

（5）离心将管盖上附着的液体收集到管底；加入500μL苯酚:氯仿:乙戊醇（25:24:1），震荡混匀后，12000rpm离心10分钟，取上清液，转新管；

（6）加入等体积异丙醇，放入-20℃冰箱1小时以上，沉淀DNA；

（7）12000rpm离心10分钟，去上清液,加入1mL70%乙醇，洗沉淀1—2次，12000rpm离心8分钟,弃上清；

（8）37℃干燥后加入TE（pH8.0）50μL溶解DNA，-20℃保存备用。

1.2PCR扩增目标基因条带

以实验室酵母S.cerevisiae S288c DNA作为模板扩增基因SET5。引物序列如下：

表1.2-1基因扩增引物信息

PCR反应体系如下（25μL）：

PCR反应程序设置：

PCR结束后，产物用琼脂糖凝胶电泳检测片断大小符合（图1）。

1.3目标片段酶切

将PCR产物用DNA纯化试剂盒进行纯化，然后酶切。酶切反应体系如下：

37℃温育反应2h。

凝胶回收试剂盒回收目的DNA片段，-20℃冻存备用。

1.4与载体连接（25μL）

将制备好的目的片段与酶切回收后的载体进行连接。

反应体系如下：

在连接仪中反应时间2-8小时，反应温度为16℃（构建的载体见图2）。

1.5连接产物在大肠杆菌DH5α中转化

1.5.1大肠杆菌感受态细胞制备

（1）接种大肠杆菌DH5α于10mL LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜；（2）按1:100的比例转接过夜培养的菌液至50mL新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm培养3-4h，至OD₆₀₀约等于0.6；

（3）将菌液转入在冰上预冷的50mL离心管中，冰上放置30min，4℃，4000rpm离心5min；

（4）弃上清，用预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液15mL悬浮细胞，冰上放置30min，4℃，4000rpm离心5min；

（5）重复上述步骤；

（6）用预冷的0.1mol/L CaCl2溶液2mL悬浮细胞，加入2mL预冷的30%甘油，轻轻混匀，分装成200μL的小份，-76℃冻存。

1.5.2连接产物的转化

（1）从-76℃冰箱中取200μL感受态细胞，冰上融化；

（2）将10μL连接产物加入感受态细胞中，用移液枪轻轻混匀,冰上放置30min；

（3）将感受态细胞置于42℃水浴锅中热激90秒，然后迅速置于冰浴中冷却2min；

（4）向管中加入800μL LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养1小时；

（5）4000rpm离心5min，去上清，将剩余溶液涂布于含相应抗生素的筛选平板上（氨苄青霉素终浓度100mg/mL），正面向上放置半小时，待菌液完全晾干后倒置培养皿，37℃培养12-16小时；

（6）挑菌落进行鉴定。

1.5.3转化子质粒提取（所用溶液配制方法来源于Takara（大连）网站）

（1）挑取转化平板上的克隆到添加有相应抗生素（氨苄青霉素终浓度100mg/mL）的新鲜LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜；

（2）取3ml菌液于l.5mL Eppendof管中，12000rpm离心l min，弃上清，收集沉淀菌体；

（3）将沉淀重悬于100μL冰上预冷的溶液Solution I中，涡旋震荡；

（4）加入200μl Solution II，轻轻颠倒离心管5次，使溶液混匀；

（5）加入150μL冰上预冷的溶液Solution III，上下颠倒数次，将离心管置于冰上，放置5min；

（6）4℃，12000rpm离心10min，留上清；

（7）加入等体积（约500μl）酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），充分震荡，12000rpm离心10min，将上清转移到新管中；

（8）加入等体积预冷的异丙醇，上下颠倒充分混匀，于-20℃放置30min，12000rpm离心10min，弃上清；

（9）用1mL70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心2min，去除上清液，可以再重复一遍该洗涤过程，然后放置在室温中挥发剩余酒精；

（11）加入适量含有RNaseA的蒸馏水或TE溶液溶解质粒DNA，37℃消化，-20℃冻存或直接用于后续实验。

1.5.4PCR鉴定阳性转化子

将提取的质粒进行PCR反应，以验证转化子。

验证引物如下：

PCR反应体系如下（25μL）：

PCR反应程序设置：

PCR结束后，产物用琼脂糖凝胶电泳检测片断大小符合。

1.6重组质粒的线性化

因为重组质粒需要线性化后才能转入酵母中，进行整合表达，所以用NotI酶切对质粒进行酶切。酶切反应体系如下：

37℃温育反应2h。

凝胶回收试剂盒回收目的DNA片段，-20℃冻存备用。

实施例2：含组蛋白甲基化酶编码基因SET5的工业酿酒酵母的转化

酿酒酵母细胞转化方法如下：

2.1酿酒酵母电转化感受态细胞的制备

（1）酵母接种YPD培养基，30℃，150rpm培养12-14小时，然后转接新的YPD培养基（1%接种）过夜培养；

（2）次日，将培养瓶放在冰上至少15min，让菌停止生长。将50mL离心管，超纯水，1M的山梨醇溶液都放在冰上预冷，处于低温状态；

（3）离心收集菌体，用等体积的超纯水将菌体轻轻混匀（上下颠倒晃动，不要用移液枪吹打），3000g，5min，4℃离心收集菌体，弃上清，重复此步骤两次；（4）用20mL预冷的1M山梨醇溶液清洗菌体沉淀2次，最后一次用0.5mL，1M山梨醇溶液重悬酵母细胞，即为酵母感受态细胞。

2.2电转法获得转化子

(1)将感受态细胞分装至1.5ml EP离心管中，加入3-5μL线性化质粒，用移液枪轻轻混匀，放置冰上；

(2)将40ul感受态细胞和线性化质粒混合液加入0.2的电转杯中，冰浴5-10分钟；

(3)设置酵母参数“fungi”，“Sc02”，点击Pulse；

(4)取出电转杯，迅速加入1ml冰浴的山梨醇，用枪轻轻吹打，再转移至5ml灭菌离心管中，30℃静置，孵育5h；

（5）3000g离心5分钟；

（6）浓缩，涂布含有300μg/ml的YPD-G418平板；

（7）将平板于30℃培养箱培养，至酵母转化子克隆长出；

（8）随机挑取12个菌落重新培养在YPD液体培养基中（含100μg/ml的G418抗生素），然后提基因组DNA（方法与1.1相同），PCR验证（方法与1.5相同）基因的整合情况。琼脂糖凝胶电泳结果显示转化子的验证结果（图3）。

实施例3：重组空载酵母4126-HO对照菌株和重组酿酒酵母4126-SET5在含有不同胁迫因素下的平板生长比较

3.1重组空载酵母4126-HO对照菌株和重组酿酒酵母4126-SET5在高温平板的生长比较

（1）把重组空载酵母4126-HO对照菌株和重组酿酒酵母4126-SET5接种到含有50mL种子培养基（20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸粉）的250mL摇瓶中，30℃，150转/分，过夜培养；

（2）重复步骤（1）；

（3）分别取菌液，测其在620nm处吸光值OD，然后用种子培养基调节OD都为0.3，以10%的接种量分别接种到种子培养基中（同步骤1），培养5h；

（4）分别取菌液，测其在620nm处吸光值OD，此时OD值都在1.2左右，用灭菌后的蒸馏水调节OD值至相同；

（5）对调节后的菌液按10倍梯度稀释；

（6）2μl点样于YPD平板上（20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸粉，20g/L琼脂粉）；

（7）于30℃和42℃培养箱中静置培养，待菌落长出后观察对比并拍照。

3.2重组空载酵母4126-HO对照菌株和重组酿酒酵母4126-SET5在含乙酸平板的生长比较

（2）重复步骤（1）；

（3）分别取菌液，测其在620nm处吸光值OD，然后用种子培养基调节OD都为0.3，以10%的接种量分别接种到种子培养基中（同步骤（1）），培养5h；

（5）对调节后的菌液按10倍梯度稀释；

（6）2μl点样于浓度分别为0、5g/L乙酸的YPD平板上（20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸粉，20g/L琼脂粉）；

（7）于30℃培养箱中静置培养，待菌落长出后观察对比并拍照。

3.3重组空载酵母4126-HO对照菌株和重组酿酒酵母4126-SET5在含H2O2平板的生长比较

（2）重复步骤（1）；

（5）对调节后的菌液按10倍梯度稀释；

（6）2μl点样于浓度分别为0、5mM/L H₂O₂的YPD平板上（20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸粉，20g/L琼脂粉）；

3.4重组空载酵母4126-HO对照菌株和重组酿酒酵母4126-SET5在含乙醇平板的生长比较

（2）重复步骤（1）；

（5）对调节后的菌液按10倍梯度稀释；

（6）2μl点样于浓度分别为0、10%乙醇的YPD平板上（20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸粉，20g/L琼脂粉）；

结果：从图4中看出，在正常培养条件下（培养了24h）两株菌种4126-HO和4126-SET5的生长状态一致，说明过表达组蛋白甲基化酶编码基因SET5后不对菌株的生长没有影响。

当培养条件改为高温42℃（培养3天），其它条件不变时，可以看到菌株4126-SET5在10^-3情况下仍有菌落生长，而对照菌株4126-HO基本不能生长，说明过表达SET5基因后提高了菌株的高温耐受性。

当培养基中添加5g/L乙酸（培养了3天），其它培养条件不变的情况下，菌株4126-SET5的耐性是4126-HO的1000倍左右，即过表达SET5基因后提高了菌株的乙酸耐受性。

当培养基中添加5mM/L H₂0₂（培养了3天），其它培养条件不变的情况下，菌株4126-SET5的耐性是4126-HO的1000倍左右，说明过表达SET5基因后提高了菌株的氧化胁迫耐受性。

在培养中添加10%的乙醇（培养3天），而其它条件不变的情况下，菌株4126-SET5在稀释至10^-3情况下仍有菌落生长，而对照菌株4126-HO基本不能生长，即乙醇的耐受性提高了1000倍，说明过表达SET5基因后提高了菌株的乙醇耐受性。

通过本次不同胁迫条件下平板生长实验表明，在工业酿酒酵母4126中过表达组蛋白甲基化酶编码基因SET5后提高菌株抵抗环境胁迫因素的耐受性。

实施例4：重组空载酵母4126-HO对照菌株和重组酿酒酵母4126-SET5在5g/L乙酸中的发酵比较

为了验证重组酿酒酵母的发酵性能，考察了重组菌在含有高浓度乙酸的发酵培养基的发酵性能。

（2）重复步骤（1）；

（5）以10%的接种量接种到发酵培养基（100g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸粉，添加5g/L乙酸），在30℃，150转/分的条件下进行发酵比较。

在相同的时间对空载酵母4126-HO和重组酿酒酵母4126-SET5取样，分别取部分菌液用酶标仪测定吸光值来确定菌体的含量（图5）；剩余的菌液离心后取上清液通过高效液相色谱检测剩余葡萄糖和乙醇的含量（图6），当上清液中葡萄糖的浓度低于1g/L时定义为发酵结束。

结果：从图5看出，初始菌体的OD值都为0.24左右，但是随着发酵的进行，从24h开始，过表达菌株4126-SET5的OD值快速增加，至81h达到OD值最大值3.95，而此时对照组4126-HO的OD值仅为0.81；从第81h开始菌株4126-SET5的OD值开始下降，说明从此时开始糖分已经消耗完，菌体可能开始出现消融。对照组4126-HO直到132h才达到OD值最高值2.42。由此表明，在含有5g/L乙酸的发酵培养基中，重组酿酒酵母4126-SET5比对照菌株4126-HO有更高的耐受性。

根据图6所示，菌株4126-SET5从24h开始进入快速消耗葡萄糖的时期，至57h残糖浓度小于1g/L，而对照菌株4126-HO的糖的消耗速度一直很缓慢，直至144h仍然有24g/L左右的残糖，发酵的结束时间比突变体推迟超过87h。这跟图5生物量的变化是一致的。表明，过表达组蛋白甲基化酶编码基因SET5后确实提高了酵母细胞的乙酸耐受性。

基因序列和氨基酸序列:

Claims

1.一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae），其特征在于：所述菌株的登记入册编号为 CGMCC No. 8724 ，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年 01月15日。