CN105368731A - 一株表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的是一株表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株及构建方法，解决了现有<i>xylA</i>基因在酿酒酵母中异源表达后，其构建的重组菌在木糖中的生长速率均比较缓慢，不能满足发酵需求的问题。本发明包括所述酿酒酵母(<i>Saccharomyces</i><i>？cerevisiae？</i>SEB7)菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC11327。本发明还提供了该酿酒酵母SEB7的构建方法。本发明得到的菌株SEB7在48h的发酵时间里，能够利用16.95g/L木糖，产生6.98g/L的乙醇，乙醇收率达到0.412g/g木糖；该菌株具有木糖发酵快、乙醇收率高等优点。

Description

一株表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株及构建方法

技术领域

本发明涉及一种酵母菌株，具体涉及的是一株表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株以及该菌株的构建方法。

背景技术

近年来，燃料乙醇作为一种最具发展前景的清洁能源受到广泛关注。以农林废弃物为原料的木质纤维素具有来源广泛、储量大、价格低廉、可再生等优点而被视为燃料乙醇生产的理想原料。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)因具有糖酵解速率快，乙醇产量高，对环境耐受能力好等优点，是工业乙醇生产过程最常用的微生物。然而，在木质纤维素水解获得的糖液中，约有20%–30%的糖为木糖，是野生型酿酒酵母不能直接利用木糖进行生长和发酵，但酿酒酵母体内存在木酮糖激酶（Xylulosekinase,XK），能将木酮糖磷酸化生成木酮糖-5-磷酸，然后进入戊糖磷酸途径(PentosePhosphatePathway,PPP)参与酵母的代谢。因此只要成功的沟通木糖转到木酮糖的桥梁，就能构建出能同时发酵木糖产乙醇的工程菌株。

自然界中存在两条木糖代谢途径，在大多数能利用木糖的真菌和酵母中，木糖可被NADPH依赖型木糖还原酶(Xylosereductase,XR)还原为木糖醇，然后被NAD⁺依赖型木糖醇脱氢酶(Xylitoldehydrogenase,XDH)氧化为木酮糖，再磷酸化进入PPP途径。然而，XR主要为NADPH依赖型酶，而XDH则是严格的NAD⁺依赖型酶，不同的辅酶亲和性导致体内的辅酶不平衡问题，从而使菌株大量积累中间代谢产物木糖醇，大大降低了乙醇的产量。

在一些细菌和厌氧真菌中，存在木糖异构酶(Xyloseisomerase,XI)基因xylA，可直接将木糖异构化生成木酮糖，然后磷酸化进入PPP途径。理论上讲，如果XI途径能够成功的在酿酒酵母中进行表达，则可以避免木糖醇的生成，从而提高乙醇的产量。但从相关报道来看，虽然xylA基因在酿酒酵母中异源表达后能产生相应的活性蛋白，但所构建的重组菌在木糖中的生长速率均比较缓慢，不能满足发酵的需求。

发明内容

本发明的目的在于解决现有xylA基因在酿酒酵母中异源表达后，其构建的重组菌在木糖中的生长速率均比较缓慢，不能满足发酵需求的问题；提供解决上述问题的一株基于木糖异构酶途径的且能够高效发酵木糖产乙醇的工业酿酒酵母。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一株表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeSEB7)菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC11327，保藏时间为2015年9月6日。

本发明首次使用具有木糖代谢背景的絮凝性工业酵母作为出发菌株，来构建基于XI途径可发酵木糖菌株。即将源自普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)TC2-24的木糖异构酶(xyloseisomerase,XI)基因(PXYLA1)进行密码子优化，将其氨基酸密码子优化为酿酒酵母偏好型密码子；将优化后的XI的编码基因PXYLA2连接入酵母多拷贝质粒pRS426上，导入絮凝性工业酿酒酵母YC-8中，然后利用两段式进化工程提升菌株在木糖培养基上的生长及发酵速率，进而获得高生长速率、且能高效发酵木糖产乙醇的酿酒酵母SEB7。

通过实验验证发现：本发明得到的菌株SEB7的木糖代谢速率达到1.70±0.04g/g-DCW/h，乙醇收率达到0.412±0.009g/g-木糖，即该菌株SEB7的木糖代谢速率和乙醇收率均高于大部分国内外的报道。其中，DCW代表细胞干重。

如权利要求1所述酿酒酵母菌株的构建方法，包括以下步骤：

1）构建出发菌株：将酿酒酵母SEB3进行产孢子后，筛选出单倍体菌株SEB3α25，利用同源重组的方法将单倍体菌株SEB3α25中的URA3-XYL1-XYL2片段进行敲除，再以KanMX为筛选标记，将单倍体菌株SEB3α25的GRE3基因进行敲除，得到出发菌株YC-8。

2）构建表达载体：获得如SEQIDNO：1所示的PXYLA2基因，然后通过酶切、连接的方法将PXYLA2基因连接在酵母多拷贝质粒pRS426中，构建出多拷贝表达载体pRS426-PXYLA2；

所述PXYLA2基因的获得过程如下：将源自于普雷沃氏菌TC2-24的木糖异构酶基因PXYLA1，通过密码子优化后获得适合在酿酒酵母中进行表达的PXYLA2基因。

3）将多拷贝表达载体pRS426-PXYLA2通过醋酸锂法导入酵母菌株YC-8中，构建出工业酿酒酵母YCPA2；

4）利用两段式进化工程(有氧生长驯化和微氧发酵驯化)对菌株YCPA2进行驯化后获得菌株SEB7。

所述有氧生长驯化过程如下：按起始OD₆₆₀=0.05的接种量，将菌株YCPA2接入含100mL2%的YNBX培养基中，30℃下180rpm转速摇床培养到细胞生长对数期，再按OD₆₆₀=0.05接种量转接入新的培养基，如此反复培养转接，共驯化28天；

所述微氧发酵驯化过程如下：有氧生长驯化结束后，将菌株按起始OD₆₆₀=0.05的接种量，接入含100mL2%的YNBX培养基中，于水浴锅中30℃、200rpm的条件下培养，待菌株生长到对数期时，将菌株按起始OD₆₆₀=0.05的接种量转接入新的培养基，如此反复培养转接，驯化24天后得到SEB7菌株；

所述2%YNBX培养基主要由1.7g/L无氨基酵母氮源、10g/L硫酸铵、20g/L木糖构成。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

1、本发明首次使用具有木糖代谢背景的絮凝性工业酵母作为出发菌株，来构建基于XI途径可发酵木糖菌株；

2、本发明得到的菌株SEB7在48h的发酵时间里，能够利用16.95g/L木糖，产生6.98g/L的乙醇，乙醇收率达到0.412g/g木糖；该菌株具有木糖发酵快、乙醇收率高等优点。

本发明中涉及保藏的微生物的保藏信息如下：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2015年9月6日；保藏编号：CGMCC11327、CGMCC11323；分类命名：Saccharomycescerevisiae。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一株表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeSEB7)菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC11327。该酿酒酵母菌株SEB7的具体构建方法如下：

1）构建出发菌株：

将酿酒酵母SEB3在产孢子培养基(0.5g/L葡萄糖，20g/L醋酸钾，2g/L酵母粉，pH5.5)上培养2天后，利用溶壁酶30℃下处理10-20min后，于四孢子分析仪上挑取单孢子，经验证后获得单倍体细胞。本发明只选择性别为α的单倍体，最终筛选出单倍体菌株SEB3α25。

以质粒pBlu-LTKTL-TDH3为模板，利用引物Fg3/Rg3扩增出loxP-KanMX-loxP片段，然后利用醋酸锂法导入菌株SEB3α25中，利用同源重组的方式，以KanMX为筛选标记，将loxP-KanMX-loxP片段导入菌株的GER3位点上，敲除GRE3基因，使菌株失去木糖醇生成能力，基因敲除与否利用引物Fg-v/Rg-v进行验证。

利用同样原理，以质粒pBlu-LTKTL-TDH3为模板，利用引物Fxy/Rxy扩增出loxP-KanMX-loxP片段，利用同源重组的方式，以G418为筛选标记，将loxP-KanMX-loxP片段导入菌株的URA3位点上，将SEB3α25中的URA3-XYL1-XYL2基因敲除，使菌株失去木糖利用能力，利用5-氟乳清酸(5-FOA)平板(1.7g/L无氨基酸酵母氮源，5.0g/L(NH₄)₂SO₄，20g/L葡萄糖，50mg/L尿嘧啶，1.0g/L5-FOA)验证URA3基因的敲除，同时利用引物XYL1-F/XYL1-R验证XYL1的敲除情况，利用XYL2-F/XYL2-R验证XYL2基因的敲除情况，最后得到出发菌株YC-8。

本发明中URA3-XYL1-XYL2基因和GRE3基因敲除的先后顺序可以调换。

上述酿酒酵母SEB3保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC11323。质粒pBlu-LTKTL-TDH3为现有质粒，记载在下述文献中：Tomitaka,M.,Taguchi,H.,Fukuda,K.,Akamatsu,T.,Kida,K.,IsolationandcharacterizationofamutantrecombinantSaccharomycescerevisiaestrainwithhighefficiencyxyloseutilization,J.Biosci.Bioeng.,2013,116,706–715.该文献翻译后名称为：分离及鉴定一株经突变和重组的能高效利用木糖的酿酒酵母。上述利用同源重组的方式，以KanMX为筛选标记、以及以G418为筛选标记进行位点基因敲除的方法为本行业常规技术手段，因此在此不再赘述。

2）构建表达载体：

2.1）将源自于P.ruminicolaTC2-24的木糖异构酶原始基因序列PXYLA1的密码子进行酿酒酵母偏好型优化，获得如SEQIDNO：1所示的PXYLA2基因。

2.2）以质粒pXR为模板，利用引物T7-F及TDH3t-R扩增T_THD3基因片段，引物T7-F及TDH3t-R上分别带有酶切位点XhoI和SalI，pRS426质粒经XhoI和SalI双酶切后，利用T4连接酶将T_THD3连接入经双酶切的pRS426质粒上，形成pRS426-T_TDH3。

质粒pXR为现有质粒，与质粒pBlu-LTKTL-TDH3一起被公开在上述文献中。

2.3）以质粒pXR为模板，利用引物TDH3p-F及T3-R扩增P_THD3基因片段，引物TDH3p-F及T3-R上分别带有酶切位点BamHI和NotI，pRS426质粒经BamHI和NotI双酶切后，利用T4连接酶将P_THD3连接入经双酶切的pRS426质粒上，形成pRS426-P_TDH3-T_TDH3。

2.4）分别利用引物PXYLA1-F/PXYLA1-R和PXYLA2-F/PXYLA2-R将PXYLA2基因扩增出来，将PXYLA2基因片段及质粒pRS426-P_TDH3-T_TDH3经EcoRI酶切后，用T4连接酶连接，经酶切、测序验证后，即获得多拷贝表达载体pRS426-PXYLA2。

3）利用醋酸锂法将多拷贝表达载体pRS426-PXYLA2导入酵母菌株YC-8中，利用2%YNBX平板筛选出阳性转化子，即为木糖利用菌株，命名为工业酿酒酵母YCPA2。本步骤中YNBX平板由1.7g/L无氨基酵母氮源、5.0g/L硫酸铵、20g/L木糖、20g/L琼脂构成。

4）利用两段式进化工程对菌株YCPA2进行驯化后获得菌株SEB7；其中，所述两段式进化工程包括：有氧生长驯化和微氧发酵驯化。

4.1）有氧生长驯化：按起始OD₆₆₀=0.05的接种量，将菌株YCPA2接入含100mL2%的YNBX培养基的500mL三角瓶中，30℃下180rpm转速摇床培养到细胞生长对数期，再按OD₆₆₀=0.05接种量转接入新的培养基中，反复培养转接，共驯化28天。

4.2）微氧发酵驯化：有氧生长驯化结束后，将菌株按起始OD₆₆₀=0.05的接种量，接入含100mL2%的YNBX培养基的300mL三角瓶中，于水浴锅中30℃下200rpm的转速培养，待菌株生长到对数期时，将菌株按起始OD₆₆₀=0.05的接种量转接入新的培养基中，反复培养转接，驯化24天后得到菌株SEB7。

本步骤4）中YNBX培养基由1.7g/L无氨基酵母氮源、10g/L硫酸铵、20g/L木糖构成。

上述各步骤中所用引物的序列如表1所示。

表1

本实施例对菌株SEB7的生长情况、发酵情况以及酶活情况进行了测定，具体测定步骤如下：

①生长评价

将酵母菌株在2%YNBG培养基上预培养24h，收集菌体，按OD₆₆₀=0.05的接种量将菌体接种至100mL的2%YNBX培养基中，在摇床中30℃下以180rpm的转速下培养，定期取菌液测定OD值，并绘制生长曲线。YNBG培养基由1.7g/L无氨基酵母氮源、5.0g/L硫酸铵、20g/L葡萄糖构成。

②发酵评价

菌株用5%YNBG培养基预培养48h后，离心收集菌体，称取湿重为2.5g的菌体，接入含50mL的2%YPX培养基的100mL三角瓶中，于摇床中转速为120rpm下发酵48h。分别于0h、8h、24h、48h取一定量的培养液，按一定比例稀释之后测定木糖消耗、乙醇生成、甘油生成情况。YPX培养基由20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、20g/L木糖构成。

③酶活测定

将菌株于2%YNBX平板上活化后，接种于2%YNBX培养基中培养至对数中期，4℃下离心收集菌体。将菌体用1mL的TEA缓冲液洗涤3次，然后用1mLTEA缓冲液悬浮菌体，将菌悬液转入含0.5g直径为0.5mm玻璃珠的破碎管中，添加终浓度为1mM的PMSF和0.5mMDTT。然后于破碎仪上于4500rpm破碎30s，后于冰上放置2min，重复破碎5次，然后于4℃下12000g离心15min，取上清液，即为粗蛋白液。利用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白的总浓度。所述TEA缓冲液由0.5M的三乙醇胺、0.5mM的EDTA构成，该TEA缓冲液的pH为7.0。

配制0.5mL酶反应体系，体系由150mMpH7.5的Tris-HCl缓冲溶液、10mMMgCl₂、66.6mM木糖、0.1mL粗蛋白液构成。在37℃下反应10min，然后于沸水浴中灭活3min，然后测定产物木酮糖的生成浓度。。

本发明中木糖异构酶酶活(U/mg-protein)定义为单位时间内每产生1μmol木酮糖所需的酶量。

实施例2

本实施例为实施例1的对比实施例，本实施例中构建步骤和构建条件与实施例1相同，区别点仅仅在于步骤2.4）中分别利用引物PXYLA1-F/PXYLA1-R和PXYLA2-F/PXYLA2-R将木糖异构酶原始基因序列PXYLA1扩增出来，将其及质粒pRS426-P_TDH3-T_TDH3经EcoRI酶切后，用T4连接酶连接，经酶切、测序验证后，即获得多拷贝表达载体pRS426-PXYLA1。

通过步骤3）构建后获得工业酿酒酵母YCPA1。通过对菌株YCPA1进行步骤4）的有氧生长驯化和微氧发酵驯化后获得菌株YCPA1E。

通过对YCPA1和YCPA2的生长评价，在第5代前，菌株需要培养36h才能达到对数生长中期。在前5代的驯化中，菌株的生长得到显著提升，当到第5代时，培养36h其YCPA1和YCPA2的OD660分别达到1.845和2.435，较第1代分别提高1.42和7.33倍。从第5代以后，驯化的转接时间缩短到24h。

通过上述结果表明：通过对XI基因的密码子进行酿酒酵母偏好型优化后的菌种YCPA2，其在生长和发酵能力上的提升远远大于原始基因序列XI的密码子构建的菌种YCPA1。同时，本研究经过密码子优化后的XI基因，在酿酒酵母中具有很好的表达效果。

在YNBX培养基中经过72h的培养，YCPA1的OD₆₆₀为2.16，比生长速率为0.063h^-1。经过两段式进化工程驯化之后，YCPA1E的OD₆₆₀达到3.14，比未驯化菌株提高了1.45倍；而在YNBX培养基中经过72h的培养，YCPA2的OD₆₆₀为2.16，比生长速率达到0.018h^-1。经过两段式进化工程驯化之后，比生长速率达到0.153h^-1，比未驯化菌株提高了8.5倍。

通过上述数据表明：菌株通过进化工程的驯化过程，能更加显著的提升菌株的生长速率；同时，本研究经过密码子优化后的XI基因，在酿酒酵母中具有很好的表达效果。

对菌株的酶活做进一步的评价发现，未经密码子优化的菌株YCPA1的酶活为0.469U/mg-protein，经进化工程育种后，其酶活提升了1.61倍。同样，密码子优化并没有直接提高菌株的XI酶活，菌株YCPA2的酶活与YCPA1相当。然而，进化工程却能更加显著的提升密码子优化菌株的XI酶活，其酶活提高了2.23倍。进一步验证了密码子优化有利于改善XI基因在酿酒酵母中的表达。

对本发明菌株SEB7和YCPA1E的生长情况、发酵情况进行了测定，测定结果如表2所示。

表2

上表2中，该DCW代表细胞干重；表2中的实验结果均为三次重复试验平均值±SD；表2中的木糖比消耗速率，乙醇产率，以及乙醇收率均是基于48h的发酵结果计算而来。

通过上述实验数据可知：经过48h的发酵，菌株YCPA1能够代谢10.30g/L的木糖并产生3.94g/L的乙醇。乙醇的收率及产率分别达到0.382g/g和0.082g/L/h。密码子优化并没有直接提升菌株的发酵能力。然而，经过进化工程驯化后，YCPA1E和SEB7的发酵能力均得到显著提升。特别是经过密码子优化后的SEB7菌株，其木糖代谢速率和乙醇生产速率较为驯化菌株YCPA2分别提高1.6和1.7倍，乙醇收率也达到0.412g/g-木糖。

本研究得到的菌株SEB7无论是在木糖代谢速率，还是乙醇收率，均高于大部分国内外的报道。

上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明保护范围的限制，但凡采用本发明的设计原理，以及在此基础上进行非创造性劳动而作出的变化，均应属于本发明的保护范围之内。

SEQUENCELISTING

<110>四川大学

<120>一株表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株及构建方法

<130>2015

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Claims (5)

1.一株表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeSEB7)菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC11327。

2.如权利要求1所述酿酒酵母菌株的构建方法，包括以下步骤：

1）构建出发菌株：将酿酒酵母SEB3进行产孢子后，筛选出单倍体菌株SEB3α25，利用同源重组的方法将单倍体菌株SEB3α25中的URA3-XYL1-XYL2片段进行敲除，再以KanMX为筛选标记，将单倍体菌株SEB3α25的GRE3基因进行敲除，得到出发菌株YC-8；

2）构建表达载体：获得如SEQIDNO：1所示的PXYLA2基因，然后通过酶切、连接的方法将PXYLA2基因连接在酵母多拷贝质粒pRS426中，构建出多拷贝表达载体pRS426-PXYLA2；

3）将多拷贝表达载体pRS426-PXYLA2导入酵母菌株YC-8中，构建出工业酿酒酵母YCPA2；

4）利用两段式进化工程对菌株YCPA2进行驯化后获得菌株SEB7。

3.根据权利要求2所述的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述两段式进化工程包括：有氧生长驯化和微氧发酵驯化；

所述有氧生长驯化过程如下：按起始OD660=0.05的接种量，将菌株YCPA2接入含100mL2%的YNBX培养基中，30℃下180rpm转速摇床培养到细胞生长对数期，再按OD660=0.05接种量转接入新的培养基，如此反复培养转接，总共驯化28天；

所述微氧发酵驯化过程如下：有氧生长驯化结束后，将菌株按起始OD660=0.05的接种量，接入含100mL2%的YNBX培养基中，于水浴锅中30℃下200rpm的转速培养，待菌株生长到对数期时，将菌株按其实OD660=0.05转接入新的培养基，如此反复培养转接，驯化24天后得到SEB7菌株；

所述2%YNBX培养基主要由1.7g/L无氨基酵母氮源、10g/L硫酸铵、20g/L木糖构成。

4.根据权利要求2所述的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述PXYLA2基因的获得过程如下：

将源自于普雷沃氏菌TC2-24的木糖异构酶基因PXYLA1，通过密码子优化后获得适合在酿酒酵母中进行表达的PXYLA2基因。

5.根据权利要求2所述的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述多拷贝表达载体pRS426-PXYLA2通过醋酸锂法导入酵母菌株YC-8中。