CN102876595B - 高温高效木糖发酵的耐热工程酵母菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种木糖发酵的耐热工程酵母菌株，其以敲除了木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因的耐热酵母菌株马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)作为宿主，并将含有密码子优化后的木糖异构酶基因的耐热酵母表达载体转化到所述宿主中。本发明还涉及所述木糖发酵的耐热工程酵母菌株的驯化菌株；以及它们的制备方法和应用。

Description

高温高效木糖发酵的耐热工程酵母菌株及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及通过工程菌改造提高木糖发酵的领域。

背景技术

温室气体排放的增加和全球的温暖化、石油资源的枯竭和日益上涨的能源需求以及国家能源安全问题使得可再生能源的利用和开发是21世纪最重要的课题之一。其中从生物质生产燃料乙醇是其中重要的一个方向。木质纤维素类是地球上最丰富的可再生生物资源(每年约200X10⁹吨的产量)，中国每年约产生10亿吨农业和森林废弃物(Reddy and Yang，2005；Yinbo et al.，2006)，但是其中只有3％在非食品领域比如造纸和纸浆得到使用(Kamm and Kamm，2004)。

天然的木质纤维素类主要是植物纤维原料，主要成分含有40-50％的纤维素、20-30％的半纤维素，另外还有木素等组分。其中半纤维素主要成分是木聚糖，木聚糖的水解主要产物是木糖。

迄今为止发现很多种微生物能够代谢木糖产乙醇，包括细菌(Clostridia，Bacillusspp.等)、真菌(Mucor spp.，Rhizopus spp.，Monilia spp.，and Fusaria spp.Neurospora spp等)和酵母菌(Candida spp，Pichia spp，Kluyveromyces spp.等)。木糖的代谢和发酵都要将醛糖转化成酮糖再进入磷酸戊糖途径(PPP)，按照转化途径的不同可分为酵母等真核生物中的木糖还原氧化途径(即木糖还原酶(Xylose reductase(XR)、木糖醇脱氢酶(Xylitol dehydrogenase(XDH)及木酮糖激酶(Xylulokinase(XKS)的体系)和以细菌及一些低等真菌为主的木糖异构酶(Xylose isomerase(XI))的途径(图2)。

酵母中通过XR、XDH、XKS体系的木糖代谢和发酵已有很多文献报道。其代谢途径比葡萄糖代谢途径复杂得多，首先是在依赖NADPH的木糖还原酶(XR)的作用下还原木糖为木糖醇，随后在依赖NAD+的木糖醇脱氢酶(XDH)作用下氧化形成木酮糖，再经木酮糖激酶(XK)磷酸化形成5-磷酸木酮糖，由此进入磷酸戊糖途径(PPP)。PPP途径的中间产物6-磷酸葡萄糖及3-磷酸甘油醛通过酵解途径形成丙酮酸。丙酮酸或是经丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶产乙醇，或是在好氧条件下，最终通过三羧酸循环(TCA)及呼吸链彻底氧化成CO₂(Walfridsson et al.，1995)。目前已知至少22种酵母能转化D-木糖成乙醇，但是只有几种酵母菌(如：Brettanomyces naardenensis，休合塔假丝酵母(Candida shehatae)，Candida tenuis，嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)，Pichia segobiensis，树干毕赤酵母(Pichia stipitis))能产生较多的乙醇。其中研究较为深入的只有三种酵母，即休合塔假丝酵母、嗜鞣管囊酵母、树干毕赤酵母。但这些酵母的乙醇耐受性比较低，或者乙醇发酵能力还不够高，使它们的应用受到限制。

与之相对应，细菌和一些真菌通过木糖异构酶(XI)体系进行木糖代谢和发酵。与木糖的还原氧化体系不同，木糖异构酶体系通过异构酶将木糖直接变成木酮糖。在这个过程中无需辅酶来氧化还原，在厌氧条件下利用木糖不会产生还原力的不平衡(Hahn-Hagerdal et al.，2007)。这个体系主要存在细菌中，在少数低等真菌中也存在(Kuyper et al.，2003)。能够发酵木糖产乙醇的细菌有Bacillus macerans，Bacillus subtilis，Clostridium thermoaceticum等菌株。但这些细菌由于乙醇产率、乙醇耐受性、副产物及抗污染能力的问题，而在应用上受到限制。

由上所述，无论是酵母菌、细菌还是真菌，其野生型利用并发酵木糖生产乙醇能力均有限。

工程酵母中多采用氧化还原体系。其中以酿酒酵母为多(Jeppsson et al.，2003；Jin and Jeffries，2003；Liu et al.，2005；Matsushika et al.，2008；Tantirungkijet al.，1993；Wang et al.，2004)。由于木糖还原酶的辅酶为偏好NADPH，而木糖醇脱氢酶的辅酶为偏好NAD+，这就导致采用这个体系在厌氧条件下酵母细胞内的还原力不平衡，使大量的木糖醇不能被氧化而累积，影响木糖的发酵(Jeffries，2006)，导致木糖转化成乙醇的效率降低，而且会有大量副产物木糖醇的积累。而木糖异构酶体系理论上可以解决此问题。但是实际上，仍然会有木糖醇甚至甘油、乙酸等副产物的积累。

最近，木糖异构酶体系也取得了一些突破。研究人员通过转入来源于厌氧真菌Piromyces sp.E2的木糖异构酶得到了一株TMB202的酿酒酵母，有较好的乙醇得率(0.42g/g D-木糖)，但是有木糖醇(2.8mM)副产品；最近，日本的一个研究组将来自瘤胃真菌Orpinomyces的木糖异构酶在酿酒酵母中表达成功，取得了类似的结果(0.48g/g D-木糖)(Madhavan et al.，2009；Madhavan et al.，2009)，但是木糖醇积累达2.83g/L，甘油积累最高达2.05g/L。Kondo研究组把木糖异构酶体系导入酿酒酵母中，乙醇得率为理论值的61.9％，如同时敲除了宿主自身的一个编码非特异性醛糖还原酶基因(GRE3基因)，木糖消耗量和乙醇产量比敲除前提高了一倍以上(Tanino et al.，2010)，不过仍然有0.51g/L木糖醇和2.20g/L甘油产生。并且，目前这些通过异构酶路径的酵母都不具有在较高温度(＞42℃)下进行发酵的能力，而且仍然都有较多的副产物例如木糖醇、甘油等产生。这都是需要解决的问题。

在高温下发酵将带来以下优势：1.降低发酵中的冷却费用；2.提高以淀粉、纤维素等生物质为原料的同步糖化发酵(SSF)温度，促进糖化，减少在酶上的费用；3.降低污染。发酵的温度的提高可以抑制许多杂菌的污染。据Akada统计，采用淀粉为材料的3万吨规模的乙醇企业，如果发酵温度上升5℃，可以节约3万美元/年的降温费用。同步糖化过程中，如果在40℃糖化可以比在32℃糖化节省50％在酶上的花费(25万美元/年)(Abdel-Banat et al.，2010)，另外由于污染带来的乙醇发酵得率急剧下降的损失不好估算，但是在260吨的发酵罐中因污染被迫重新发酵的代价是5万美元。除此之外，高温发酵可以促进发酵后的处理如提高蒸馏效率，降低蒸馏费用。

Dmytruk等曾经尝试在能够耐热的多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)中通过表达木糖异构酶构建能够在高温下发酵木糖的工程菌株，但是效果很差，消耗80g/l木糖培养基中的40g/l木糖，仅仅能够得到1.03g/l(37℃)和0.60g/l(48℃)的产量(Dmytruk et al 2008)。这说明，构建能够在较高温度下发酵的木糖发酵的酵母，不是仅仅通过在耐热酵母中表达木糖还原酶等酶的基因就可以成功的。

本发明采用K.marxianus也是一种GRAS(general regarding as safe)酵母，广泛地在乳制品、葡萄酒发酵制造中存在，对环境、动物及人类是安全的微生物。K.marxianus有很高的代谢多样性，能利用多种工业上的底物糖类生长发酵(Nonklanget al.，2008)。K.marxianus能够利用木糖在较高的温度下生长(Banat and Marchant，1995)；具有能利用多种廉价底物、耐热、高生长率等特点。在木质纤维素的同步糖化和发酵过程(SSF)中，大多数发酵是采用酿酒酵母在中温进行(25-37℃)，而商业化纤维素酶半纤维素酶的最适温度多为48-50℃左右，采用耐热酵母在较高温度(42-50℃)下发酵更有利于纤维素酶半纤维素酶发挥水解能力，促进对木质纤维素的利用，提高糖化与发酵同步反应的效率(Fonseca et al.，2008)。

耐热酵母K.marxianus，利用葡萄糖在30℃可以达到与酿酒酵母同等的发酵能力，在高温条件下(45℃)，K.marxianus在发酵乙醇上有绝对的优势(Banat and Marchant，1995；Nonklang et al.，2008)。虽然有一些K.marxianus菌株能直接发酵木糖产乙醇(Banat and Marchant，1995；Banat et al.，1996；Margaritis and Bajpai，1982；Wilkins et al.，2008)，但是其乙醇的产率较低。Margaritis等报道K.marxianus在35℃，从20g/l木糖发酵产5.6g/l乙醇(Margaritis and Bajpai，1982)；而Banat等采用K.marxianus在45℃从10g/l木糖发酵产0.8-1.2g/l乙醇(Banat andMarchant，1995；Banat et al.，1996)，在40℃产2.08g/l乙醇(Wilkins et al.，2008)。这说明K.marxianus中天然存在着酿酒酵母不具有的利用木糖并发酵的代谢路径，但利用木糖发酵的能力还不够高，尤其是在较高温度下效率很低。

发明内容

本发明通过敲除K.marxianus的木糖氧化还原体系，引入木糖异构酶体系，成功构建了在高温下利用和发酵木糖的工程菌K.marxianus YRL005。该工程菌解决了之前耐热酵母在高温下木糖发酵能力低的问题，乙醇产量大幅度提高，而且与之前的酿酒酵母体系相比没有木糖醇、甘油的产物积累。

本发明通过在耐热酵母中高效表达的木糖异构酶，构建通过木糖异构酶代谢路径在较高温度(＞42℃)下能够利用和发酵木糖的耐热酵母菌株马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)；本发明对马克斯克鲁维酵母中木糖代谢的还原氧化路径中导致还原力不平衡的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因(Xyl1和Xyl2)进行敲除，再将密码子优化后的木糖异构酶基因的密码子进行优化、后在上述双基因敲除的耐热酵母中表达，构建了对木糖的利用和发酵大幅度改良，能够在较高温下利用木糖发酵的耐热工程酵母。构建的酵母能够在高温下利用木糖生长和发酵；本发明耐热工程菌株还可以利用玉米芯水解液中的木糖进行发酵(图1)。

本发明通过敲除马克斯克鲁维酵母木糖代谢路径中将木糖转化为木酮糖的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因，并将在酿酒酵母中表达的木糖异构酶基因的密码子进行优化后在上述双基因敲除的耐热酵母中表达，通过驯化，获得一株对木糖的利用和发酵有大幅度改良，并能够在较高温下发酵的耐热工程酵母。

具体地，本发明包括以下内容：

1.一种木糖发酵的耐热工程酵母菌株，其以敲除了木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因的耐热酵母马克斯克鲁维酵母菌株作为宿主，并将含有密码子优化后的木糖异构酶基因的耐热酵母表达载体转化到所述宿主中。

2.第1项的耐热工程酵母菌株，其中所述密码子优化后的木糖异构酶基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

3.第1项的耐热工程酵母菌株，其中通过对在野生型马克斯克鲁维酵母菌株NBRC1777的基础上敲除了磷酸核糖基邻氨酸苯甲酸异构酶基因(TRP1基因)、5’-乳清核苷酸磷酸脱羧酶基因(URA3基因)、3-异丙基苹果酸脱氢酶基因(LEU2基因)的菌株YHJ010进行木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的敲除并进一步敲除其中转入的选择标记基因5’-乳清核苷酸磷酸脱羧酶基因从而获得所述宿主。

4.第1项的耐热工程酵母菌株，其中所述宿主为YRL002。

5.一种木糖发酵的耐热工程酵母菌株的驯化菌株，其使用第1-4项中任一项的耐热工程酵母菌株经过驯化步骤而获得，其保藏号为：CGMCC 6389。

6.一种制备第1-4项中任一项的耐热工程酵母菌株的方法，其包括以下步骤：

通过按照马克斯克鲁维酵母中密码子进行优化获得密码子优化后的木糖异构酶基因；

构建含有所述密码子优化后的木糖异构酶基因的耐热酵母表达载体；

对在野生型马克斯克鲁维酵母菌株NBRC1777的基础上敲除了磷酸核糖基邻氨酸苯甲酸异构酶基因(TRP1基因)、5’-乳清核苷酸磷酸脱羧酶基因(URA3基因)、3-异丙基苹果酸脱氢酶基因(LEU2基因)的菌株YHJ010进行木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因的敲除，并进一步敲除其中转入的选择标记基因5’-乳清核苷酸磷酸脱羧酶基因从而获得宿主；和

将所述含有密码子优化后的木糖异构酶基因的耐热酵母表达载体转化到所述宿主中，从而获得耐热工程酵母菌株。

7.一种制备第5项的驯化菌株的方法，其包括以下步骤：

通过按照马克斯克鲁维酵母中密码子进行优化获得密码子优化后的木糖异构酶基因；

构建含有所述密码子优化后的木糖异构酶基因的耐热酵母表达载体；

对在野生型马克斯克鲁维酵母菌株NBRC1777的基础上敲除了磷酸核糖基邻氨酸苯甲酸异构酶基因(TRP1基因)、5’-乳清核苷酸磷酸脱羧酶基因(URA3基因)、3-异丙基苹果酸脱氢酶基因(LEU2基因)的菌株YHJ010进行木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因的敲除，并进一步敲除其中转入的选择标记基因5’-乳清核苷酸磷酸脱羧酶基因从而获得宿主；

将所述含有密码子优化后的木糖异构酶基因的耐热酵母表达载体转化到所述宿主中，从而获得耐热工程酵母菌株；和

对所获得的耐热工程酵母菌株进行驯化。

8.第5项的驯化菌株用于通过木糖发酵产生乙醇的应用。

9.第5项的驯化菌株用于利用玉米芯水解物发酵产生乙醇的应用。

优点和积极效果

本发明中所得到的菌株YRL005有着与和野生型菌株NBRC1777(购自日本技术评价研究所生物资源中心(NITE Biological Resource Center，National Institute ofTechnology and Evaluation(NITE)，JAPAN))及NBRC1777衍生的色氨酸、亮氨酸和尿嘧啶的营养缺陷型菌株YHJ010(即在K.marxianus野生型菌株NBRC1777的基础上敲除了磷酸核糖基邻氨酸苯甲酸异构酶基因(TRP1)，5’-乳清核苷酸磷酸脱羧酶基因(URA3)，3-异丙基苹果酸脱氢酶基因(LEU2)，Hong et al，2007)相当的利用木糖生长的能力，在37℃合成培养基中，它的OD600可达1.3；而在相对较高的温度42℃下及YPX培养基下，YRL005的OD600可达15。而很多酿酒酵母及细菌在这个温度，已经不能正常生长。并且本发明的YRL005不仅能利用木糖生长，还能在厌氧发酵的条件下利用木糖生产乙醇。在50g/l的YPX培养基下，消耗30.49g/l的木糖并产生了11.67g/l的乙醇，该乙醇产量在已知的耐热酵母中处于领先地位。本发明还在对农业废弃物中的木糖利用进行了测试。在利用玉米芯水解物发酵的应用中，同样能产生乙醇(消耗了19.05g/l的木糖生成7.93g/l乙醇)。本发明中的YRL005菌株在42℃以上发酵，没有木糖醇、甘油等副产物，仅有非常少量副产物醋酸(0.066g/l)的生成。所以本发明的YRL005菌株不仅在较高温度(＞42℃)条件下有比其他酵母强的利用木糖发酵能力，而且具有比其他酵母更优秀的特点-副产物极少。

附图说明

图1.本发明的研究过程；

图2.木糖的两种代谢路径；

图3.驯化菌株在木糖合成培养基下的生长情况(37℃，250rpm)；

图4.驯化菌株在高温营养培养基下的生长情况(42℃，250rpm)；

图5.A.42℃发酵时木糖的消耗及乙醇的产生，B.45℃发酵时木糖的消耗及乙醇的产生；和

图6.42℃发酵玉米芯水解物时木糖的消耗及乙醇的产生。

保藏说明

本发明的菌株马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)YRL005已经于2012年8月10日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6389。

具体实施方式

试剂和菌株：本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上试剂，其中YNB(酵母氮源基础)、木糖、葡萄糖、酵母基本氮源、酪氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、胶回收试剂盒以及所有的限制性内切酶均来源于上海生工生物工程公司。PrimeSTAR HS DNA聚合酶，Solution I连接酶以及pMD18-T载体购自于大连宝生物公司。PfuDNA聚合酶试剂盒由上海申能博彩提供。大肠杆菌Escherichia coli XL10 gold菌株作为DNA操作时使用的宿主菌，包含100μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基用作培养E.coli。木糖合成培养基(YNB，木糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，亮氨酸30mg/ml，尿嘧啶20mg/ml，酪氨酸20mg/ml)主要用于驯化。质粒YEGAP，YEUGAP，pKMURA3由本实验室保存(Hong et al.，2007)。

YPD培养基(酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l)用于酵母的前培养。YPX(酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，木糖20g/l(或50g/l))用于发酵培养基。

实施例1菌株的制备

1.优化XI密码子

真菌Orpinomyces.sp(瘤胃真菌)来源的XI密码子在酵母中不一定是最优密码子，如果直接采用XI原始基因可能会导致表达量低甚至难以表达。在不改变氨基酸序列前提下，采用K.marxianus酵母中密码子进行优化，并在两端加上克隆用引物。获得的密码子优化后的木糖异构酶基因序列长度1334bp，如SEQ ID NO：1所示。

2.合成XI基因

将XI基因分为4个片段F1，F2，F3，F4，其长度分别为F1(356bp)，F2(354bp)，F3(354bp)，F4(354bp)。序列记录为SEQ ID NOs：2-5。每个片段通过Tmprime工具(http://prime.ibn.a-star.edu.sg/)切割成11根寡聚核苷酸(其中正链(A链)6根，互补链(C链)5根)，共得到44根寡聚核苷酸序列(序列分别记录为，F1：SEQ ID NOs：6-16，F2：SEQ ID NOs：17-27，F3：SEQ ID NOs：28-38，F4：SEQ ID NOs：39-49)并委托上海生工生物工程公司合成。

将每根片段所合成的11根寡聚核苷酸稀释，并分别取出1pmol，使用PfuDNA聚合酶试剂盒进行PCR assembling(基于聚合酶链式反应的片段拼装)，得到的产物作为模板，使用片段引物(4个片段的引物分别为SEQ ID NOs：50-57)进行扩增，此时即得到片段，其过程以F1为例显示如下(片段F2、F3和F4使用与F1相同的酶体系和反应程序，区别仅在于它们使用不同的引物，分别为SEQ ID NOs：52-53；54-55；和56-57)。

PCR assembling体系

PCR assembling程序

片段扩增体系

片段扩增程序

得到4根片段后，采用PrimeSTAR HS DNA聚合酶试剂盒进行融合PCR并使用全长引物SEQ ID NO：50和57进行PCR扩增，并将全长片段克隆到pMD18-T载体中，获得含有正确XI序列的PMD18-T载体，即pMD18-T-XI。

融合PCR体系

融合PCR程序

全长基因扩增体系

全长基因扩增程序

pMD18-T克隆连接体系

XI基因全长                          0.3pmol

pMD18-T                             0.03pmol

Solution I连接酶(购自大连宝生物)    5μl

连接程序：16℃    16h

3.构建XI耐热酵母表达载体

使用全长序列引物SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：59从含有正确XI序列的PMD18-T载体，即pMD18-T-XI中用PrimeSTAR HS DNA聚合酶PCR扩增出含有酶切位点的片段(酶切位点为EcoRI和NotI)，并把该片段克隆到YEUGAP载体相同位点中。YEUGAP载体是带有可在酵母中组成型表达的启动子(pGAP，甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子)和终止子的酵母用表达载体(Hong et al.，2007)。。

3.1.1 XI基因PCR反应体系

PCR反应程序

3.1.2 XI基因及YEGUAP载体酶切体系

反应条件：  37℃    8h

(其中10xO缓冲液购自Fermentas(中国深圳))

回收所有的酶切片段与载体，并进行连接。采用日本宝生物公司Solution I连接酶。

连接体系如下。

EcoRI-NotI-XI                 0.3pmol

EcoRI-NotI-YEUGAP             0.03pmol

Solution I连接酶              5μl

反应条件：16℃        16h

成功构建YEUGAP-XI载体后，需要将XI及启动子终止子序列(XI表达模块)克隆到耐热酵母pKMURA3表达载体，这里采用PrimeSTAR HS DNA聚合酶和启动子终止子的引物(SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：61)以YEUGAP-XI为模板扩增XI表达模块；在将此模块用StuI酶切之后，插入到同样以限制性内切酶StuI酶切的pKMURA3载体(Hong et al.，2007)中，pKMURA3载体是含有耐热酵母5’-乳清核苷酸磷酸脱羧酶基因(URA3基因)并可以用来筛选的载体。

3.2.1 XI表达模块PCR反应体系

PCR反应程序

3.2.2 XI表达模块及pKMURA3载体酶切体系

(其中10xB缓冲液购自Fermentas(中国深圳))

反应条件：37℃      8h

3.2.3 回收所有的酶切片段与载体，并进行连接。采用日本宝生物公司Solution I连接酶。连接体系如下。

XI                         0.3pmol

pKMURA3                    0.03pmol

Solution I连接酶           5μl

反应条件：16℃     16h

载体构建成功，即得到XI在耐热酵母的表达载体pKMURA3-XI。

4.敲除K.marxianus木糖代谢路径中木糖还原酶及木糖脱氢酶基因

4.1 敲除木糖还原酶XR基因

以YEGAP质粒为模板(YEGAP是带有酿酒酵母TRP1表达基因的酵母用穿梭质粒(Hong et al.，2007))，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶PCR(引物SEQ ID NO：62和SEQID NO：63)得到酿酒酵母的色氨酸合成基因(TRP1基因)表达片段1.2k，通过限制性内切酶SalI酶切TRP1表达片段和载体pET21c-XR(Zhang et al 2011)，并用Solution I连接酶进行连接(反应条件：16℃，16h)，构建载体pET21c-XR-TRP1。使得TRP1表达序列插入到XR的ORF内，从而破坏XR的表达框。

用XR基因引物(SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65)做以pET21c-XR-TRP1为模板，使用PrimestarDNA聚合酶PCR扩增，得到包含TRP1表达序列的2k的片段(XR-TRP1)，并将PCR产物转化至YHJ010菌株(在K.marxianus野生型菌株NBRC1777的基础上敲除磷酸核糖基邻氨酸苯甲酸异构酶基因(TRP1)，5’-乳清核苷酸磷酸脱羧酶基因(URA3)，3-异丙基苹果酸脱氢酶基因(LEU2)，其含有的营养缺陷型标签可用于后续实验操作)(Hong et al，2007)，同源重组后，转化子将获得磷酸核糖基邻氨酸苯甲酸异构酶基因的功能并破坏XR功能。在含有亮氨酸和尿嘧啶的合成培养基上筛选阳性克隆，并在以木糖为唯一碳源的合成培养基上生长，与阳性对照YHJ010菌株，野生型NBRC1777菌株相比，没有生长即表示XR基因已经被破坏。得到菌株命名为YZB002(Zhang et al.2011)。

4.1.1 PCR TRP1表达片段

以YEGAP为模板进行PCR，PCR产物经过酶切后，克隆到pET21c-XR(包含XR的表达载体)载体中，构建pET21c-XR-TRP1载体。

PCR反应体系

PCR反应程序

4.1.2 TRP1基因及pET21c-XR酶切体系

4.1.3 XR敲除片段PCR反应体系

PCR反应程序

回收XR敲除用片段，并以PCR产物用以转化至YHJ010菌株以达到敲除XR基因的目的，过程如下所述。

酵母化学转化步骤

1.YHJ010菌株在YPD平板上划线，37℃培养24h。

2.取5ml液体YPD，并在YPD平板上挑取单克隆，37℃，250rpm，培养18h。

3.取1ml培养物转接与装入9ml液体YPD的50ml三角瓶内，37℃，250rpm，摇床培养5h。

4.取出培养物，常温下离心5000rpm，3min，弃上清液，保留菌体。

5.配制1ml转化缓冲液：50％PEG4000，800μl；4M醋酸锂，50μl；ddH₂O，50μl；1M DTT(溶于10mM醋酸钠，PH5.2)，100μl。

6.使用500μl转化缓冲液重悬菌体，5000rpm，3min，离心去上清。

7.用90μl转化缓冲液重悬浮菌体，加入10μl(1-10μg)纯化的PCR产物(XR-TRP1)，轻微震荡30sec。

8.47℃，水浴，15min。

9.将菌体涂布于含有亮氨酸(leucine)和尿嘧啶(uracil)(购自上海生工生物工程公司)的合成培养基，37℃，培养2天。

10.挑取板上克隆，在液体YPD中培养，采用玻璃珠破碎法提取基因组，并通过PCR鉴定转化结果，经鉴定，有XR敲除用片段插入(基因组提取步骤和PCR鉴定过程如下所示)。

耐热酵母基因组提取步骤

1.挑取单克隆(YZB002)，接入5ml液体YPD中，37℃，250rpm，培养24h。

2.常温下12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。

3.500μl蒸馏水重悬菌体，12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。

4.取200μl实验室自配1x breaking缓冲液(TritonX-100(2％(w/v))，SDS(1％(w/v))，NaCl(100mM)，Tris-Cl(10mM，PH8.0)，EDTA(1mM))重悬菌体，并将菌液转入到含有0.3g玻璃珠(425-600μm，sigma，美国)的EP离心管内。

5.加入200μl酚氯仿溶液后，高速震荡3min，加入200μl1X TE(Tris-Cl(10mM，PH8.0)，EDTA(1mM))。轻微震荡。

6.12000rpm，5min，离心，取最上层清液转入新的EP离心管内，加入1ml预冷的无水乙醇。

7.12000rpm，4℃，10min离心，弃上清，室温下干燥沉淀，并用400μl 1x TE重悬沉淀。

8.加入2μl RNase(RNA水解酶，2mg/ml)到EP离心管内，混匀，37℃，酶切1h。

9.取40μl醋酸钠(3M)(PH 5.2)加入到管内，混匀并加入1ml预冷的无水乙醇。

10.12000rpm，4℃，30min，离心，弃上清室温下干燥。用合适体积重悬沉淀，此即酵母基因组DNA。

XR敲除鉴定PCR反应体系

PCR反应程序

提取基因组，通过PCR鉴定菌株后。需在功能上进行验证XR的敲出。

配制50ml木糖合成培养基，其以木糖为唯一碳源，选择敲除后的菌株YZB002，YHJ010，及耐热酵母的野生型NBRC1777在合成培养内进行生长曲线测试。从功能上验证XR的敲除。敲除后的菌株未有生长，而YHJ010菌株，野生型NBRC1777生长良好。

木糖合成培养基配方：

20g/l木糖

6.7g/l酵母基本氮源

亮氨酸(30mg/ml)，尿嘧啶(20mg/ml)，酪氨酸(20mg/ml)

4.2. 敲除木糖醇脱氢酶XDH

以YEUGAP质粒(含有5’-乳清核苷酸磷酸脱羧酶基因表达片段的酿酒酵母质粒(Hong et al.，2007))为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶通过PCR(引物为SEQ IDNO：66和SEQ ID NO：67)得到酿酒酵母的5’-乳清核苷酸磷酸脱羧酶基因表达片段1.5k(URA3)，通过限制性内切酶EcoRI，KpnI酶切表达片段和载体pPICZaB-XDH(已构建，含有XDH基因的表达质粒(即将来自马克斯克鲁维酵母的XDH基因插入到pPICZaB载体(Invitrogen)的EcoRI位点(Li et al 2012))，构建pPICZaB-XDH-URA3载体。使得5’-乳清核苷酸磷酸脱羧酶基因表达序列插入到XDH基因内，破坏XDH的表达框。

以pPICZaB-XDH-URA3为模板，用XDH基因引物(SEQ ID NO：68和SEQ IDNO：69)使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶做PCR，得到包含5’-乳清核苷酸磷酸脱羧酶基因表达序列的2.2k的片段，并将PCR产物转化至YZB002(已经敲出XR的菌株)，同源重组后，将破坏了的XDH的功能。在含有Leu的合成培养基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，亮氨酸30mg/ml，琼脂15g/l)上筛选阳性克隆，并在以木糖醇为唯一碳源的木糖醇合成培养基上生长，与对照YZB002相比没有生长即表示XDH基因被破坏。得到菌株命名为YLUA006。

4.2.1 PCR扩增URA3表达片段，以YEUGAP为模板进行PCR，PCR产物经过酶切后，克隆到pPICZaB-XDH(包含XDH基因的表达载体)载体中，构建pPICZaB-XR-URA3载体。

PCR反应体系

PCR反应程序

酶切体系

在此酶切反应后，通过PCR纯化试剂盒回收酶切产物(试剂盒购自上海生工生物工程公司)，再进行第二个酶切。

酶切体系

在第二次酶切完成以后，通过胶回收试剂盒(上海生工生物工程公司)回收酶产物，并进行连接

连接体系

URA3                0.3pmol

PPICZaB-XDH         0.03pmol

SolutionI连接酶     5μl

连接程序

16℃              16h

4.2.2 XDH敲除片段PCR反应体系

PCR反应程序

回收XDH敲除用片段，并以PCR产物用以转化YZB002以达到敲除XDH的目的。提取基因组，通过PCR鉴定菌株后(方法与4.1.3中所述类似)。在功能上进行验证XDH的敲出。命名在YZB002菌株基础上敲出XDH基因的菌株为YLUA006。

配制50ml木糖醇合成培养基，其以木糖醇为碳源，以敲除后的菌株YLUA006，与YHJ010，及YZB002在合成培养内进行生长曲线测试。从功能上验证XDH的敲除。YLUA006菌株未有生长，而YZB002，YHJ010生长良好。

木糖醇合成培养基配方：

20g/l木糖醇

6.7g/l酵母基本氮源

亮氨酸(30mg/ml)，尿嘧啶(20mg/ml)，酪氨酸(20mg/ml)

4.3 敲除URA3基因

为转入XI基因，需要敲除已经被使用的URA3标签。破坏了URA3表达框的菌株只能从培养基内摄取尿嘧啶，而不能自己合成。未被敲除URA3基因的菌株可以通过自身代谢合成尿嘧啶，而FOA(5-氟乳清酸)是尿嘧啶代谢路径中有毒的代谢类似物。因此如果在培养基中加入FOA，未被敲除URA3的菌株将会死亡。

用Bst1107I酶切pPICZaB-XDH-URA3，切出594bp片段，从而破坏URA3的表达框。

以破坏过URA3基因的载体pPICZa-XDH-URA3为模板，用XDH基因引物(SEQ IDNO：68和SEQ ID NO：69)做PCR，得到1.6k的片段，将PCR产物转化YLUA006，在含有ura，leu和FOA的合成培养基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，尿嘧啶20mg/ml，亮氨酸30mg/ml，5-氟乳清酸0.1％(m/v)，琼脂15g/l)上筛选阳性克隆，命名菌株为YRL002，此菌株即是被敲除URA3基因的YLUA006菌株。

5.构建耐热酵母XI表达菌株

用SpeI酶切pKMURA3-XI载体。将酶切产物转化至YRL002，同源重组后，将使菌株恢复URA3基因的功能，并新增XI的功能。在仅含有Leu的合成培养基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，亮氨酸30mg/ml，琼脂15g/l)上筛选阳性克隆，命名为YRL003，并在以木糖为唯一碳源的液体合成培养基上生长(37℃)。其OD600可达0.6，而对照YRL002 OD600能达到0.2，野生型NBRC1777可达1.4。

6.YRL003 菌株驯化

与野生株NBRC1777相比，YRL003利用木糖能力显然很弱。需要经过一段时间的驯化，使其更好的利用木糖。驯化的目的是使菌株在木糖培养基的环境压力下，自身通过进化，将会提升其利用木糖代谢路径中如关键酶的表达等等，从而达到高效利用木糖的效果。

驯化步骤：

1.在平板上挑取单克隆YRL003，接入5ml液体木糖合成培养基(配方：木糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，亮氨酸30mg/ml，尿嘧啶20mg/ml，酪氨酸20mg/ml)，37℃，250rpm，2天

2.待其生长进入平台期(2天)，取菌液，接入新的木糖合成培养基中继续培养，使其在新的木糖合成培养基中OD600达到0.2，此即第1代。

3.经过90代驯化后，菌株较驯化前生长有明显的提高，在木糖合成培养基上培养，OD600从0.6提升至1.2，而野生型可达1.4。

4.在木糖合成培养基的平板上稀释涂布菌落，挑取菌落较大的克隆在同样的液体培养基中培养，与驯化前，野生型相比。

5.菌株XI-1生长优于其他菌株，命名为YRL005其在以木糖为碳源的合成培养基中，OD600可达1.3，已接近野生型(1.4)。并将YRL005于2012年8月10日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6389。

实施例2驯化株中木糖异构酶活力的测定

1.将驯化所得菌株YRL005及YHJ010，YRL003菌株在5ml液体YPX培养基中培养48h。

2.通过1500rpm在4℃离心10min回收菌体细胞，并用500μl无菌水洗两次。

3.再将细胞悬浮在1ml buffer A(50mM Tris-HCl，25mM NaCl，pH 8.0)中。

4.所得的悬液通过超声波破碎。采用Vibra-Cell VC505超声破碎仪(Connecticut，USA)，在40％强度，处理10min。

5.通过15000rpm在4℃离心20min，回收上清作为粗酶液。

6.配置275μl木糖异构酶酶活反应体系，其中包括100μl的粗酶液体和终浓度分别为50mM Na₃PO₄的缓冲液(pH 8.0)以及40mM MgCl₂。

7.加入终浓度为20mM的xylose开启酶活反应，37℃反应15min。

8.加入25ul的50％TCA(三氯乙酸)终止反应。

9.将酶反应液转入洗净的玻璃试管中，加入1.5ml预冷的70％H₂SO₄，震荡混匀，冰浴3min。

10.加入50μl 1.5％Cys-HCl(半胱氨酸盐酸盐)和50μl 0.12％(w/v)咔唑酒精，震荡混匀。

11.室温25℃放置30min，在OD560下测定吸收值。以木酮糖为标准最终换算成酶活单位。

测量结果显示K.marxianus YHJ010，YRL002，YRL003和YRL005的酶活力结果分别为0.0017，0.0013，0.056，和0.25U/mg，可以看出表达木糖异构酶基因菌株的木糖异构酶活力比没有此基因的菌株高几十倍。

实施例3 驯化菌株在合成培养基下的生长情况

该实施例用于了解驯化菌株生长情况，它与野生型菌株NBRC1777的比较及其比驯化之前菌株YRL003的提高。

1.在YPD培养基平板上复苏菌株。野生株：NBRC1777。驯化株：YRL005。木糖代谢路径敲除菌株：YRL002。驯化前菌株：YRL003。37℃培养1天。

2.分别挑取单克隆，接于5ml液体YPD培养基。37℃，250rpm，过夜。

3.配制12瓶50ml木糖合成培养基分装于250-ml锥形三角瓶。配方：20g/l xylose，6.7g/l YNB。分别加入氨基酸：亮氨酸(30mg/ml)，尿嘧啶(20mg/ml)，酪氨酸(20mg/ml)。灭菌待用。

4.取适量过夜培养物转入灭菌离心管，离心除去上清，并用灭菌水悬洗两次。

5.把悬洗的菌体接入50ml木糖合成培养基中，使他们的初始OD600达到0.2。37℃，250rpm培养。

6.在0h，4h，8h，12h，16h，24h，32h，40h，48h取样监测OD600(图3)。

7.从图3可知，在木糖合成培养基的培养条件下，驯化株YRL005已经较之驯化前YRL003有了明显的提高(OD600分别为1.3和0.4)，且与野生型生长能力相当(它们在24小时左右生长达到平衡，OD600分别为1.3和1.5)。

实施例4驯化菌株在42℃富营养培养基下的生长情况

该实施例用于了解驯化菌株在高温(42℃)条件下，它的生长情况与野生株NBRC1777的比较，及较之驯化前菌株生长能力的提高。

1.在YPD培养基平板上复苏菌株。野生株：NBRC1777。驯化株：YRL005。木糖代谢路径敲除菌株：YRL002。驯化前菌株：YRL003。37℃培养1天。

2.分别挑取单克隆，接于5ml液体YPD培养基。37℃，250rpm，过夜。

3.配制12瓶50ml YPX培养基分装于250-ml锥形三角瓶。配方：木糖20g/l，酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l。

4.取适量过夜培养物转入灭菌离心管，离心除去上清，并用灭菌水悬洗两次。

5.把悬洗的菌体接入50ml YPX培养瓶中，使他们的初始OD600达到0.2，42℃，250rpm培养。

6.在0h，4h，9h，14h，19h，24h，30h，36h，48h取样监测OD600(图4)

7.从图4可知，在42℃营养培养基YPX培养条件下，驯化株YRL005不仅能够有很好的生长，且较之驯化前YRL003有了明显的提高(OD600分别为15和4)，另外它与野生型菌株生长能力相当(它们在36小时左右生长达到平衡，OD600分别为15和18)。

实施例5驯化菌株在木糖培养基下的发酵测试

该实施例用于了解驯化菌株在高温(42℃和45℃)条件下，它在木糖培养基下的发酵能力。

1.在YPD培养基平板上复苏驯化菌YRL005。37℃培养1天。

2.分别挑取单克隆，接于5ml液体YPD培养基。37℃，250rpm，过夜。并把培养基全部接入150ml YPD培养基中，37℃培养24h。

3.配制3瓶40ml YPX培养基分装于50-ml发酵用厌氧瓶。配方：木糖50g/l，酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l。

4.取适量培养物转入灭菌离心管，离心除去上清，并用灭菌水悬洗两次。

5.把悬洗的菌体接入40ml厌氧瓶中，使他们的起始OD600达到10，42℃，250rpm培养。

6.每24h取样500μl，共取样192h。并把样品15000rpm离心，留下上清，弃去沉淀。

7.上清样品采用Rezex ROA-Organic Acid H+(8％)(Phenomenex，Torrence，USA)HPLC(高效液相色谱)分析柱子和Agilent 1200示差检测器(Agilent Technologies，Inc CA，USA)，分析其中的木糖、木糖醇、乙酸、甘油和乙醇的含量。

8.从图5A可知，在42℃培养基YPX培养时，驯化株YRL005不仅利用木糖发酵，并能产生较多的乙醇(消耗30.49g/l的木糖并产生了11.67g/l的乙醇)。该乙醇产量在已知的耐热酵母中处于领先地位。并且在图中可以看到没有木糖醇和甘油等副产品的产生，虽然从第二天又少量乙酸产生(0.021g/l)，但是随着发酵进程，浓度一直保持很低。从图5B可知，在45℃培养基YPX培养时，驯化株YRL005仍然利用木糖发酵，并能乙醇(消耗14.5g/l的木糖并产生了4.67g/l的乙醇)。虽然有少量中间产物木酮糖积累，但是同样没有木糖醇和甘油等副产品的产生，而乙酸也一直保持很低水平(＜0.051g/l)。

实施例6驯化菌株在玉米芯水解中的发酵测试

该实施例用于了解驯化菌株在高温(42℃)条件下，它在玉米芯水解物中的发酵能力。

1.半纤维素水解液的制备。

取100g玉米芯(产自河北唐山，半纤维素含量约为36％)粉碎至粒径30目左右，按固液比1∶10(质量∶体积)加入1000ml 1.0％的H₂SO₄，在110℃下水解3h。水解液在70℃下用石灰乳(购自上海生工生物工程公司)过中和至pH10.0，立即趁热抽滤去CaSO₄沉淀后，用浓H₃PO₄回调pH至6.0，4℃静置过夜，抽滤去Ca₃(PO₄)₂沉淀，所得水解液于4℃冷藏备用。

2.木糖溶液的制备。活性炭(购自上海生工生物工程公司)用0.4mol/L的盐酸浸泡24h，清水洗至中性，30℃晾干备用。取半纤维素水解液，将活性炭以2.4％(W/V)的固液比与水解液混合，震荡脱色，脱色条件为：42℃下、250rpm、脱色1h。真空抽滤后，上清液以6000r/min离心15min。经HPLC测定，玉米芯半纤维素水解液中木糖浓度为29.61g/l，葡萄糖浓度为1.62g/l。灭菌备用。

3.在YPD培养基平板上复苏驯化菌YRL005。37℃培养1天。

4.分别挑取单克隆，接于5ml液体YPD培养基。37℃，250rpm，过夜。并把培养基全部接入150ml YPD培养基中，37℃培养24h。

5.配制3瓶40ml玉米芯发酵培养基分装于50-ml发酵用厌氧瓶。配方：酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，另加入80％(v/v)已灭菌的玉米芯水解液。

6.将150ml前培养物转入灭菌离心管，离心除去上清，并用灭菌水悬洗两次。

7.把悬洗的菌体接入40ml厌氧瓶中，使他们的起始OD600达到10，42℃，250rpm培养。

8.每24h取样500μl，共取样192h。并把样品15000rpm离心，留下上清，弃去沉淀。

9.上清样品采用Rezex ROA-Organic Acid H+(8％)(Phenomenex，Torrence，USA)HPLC分析柱子和Agilent 1200示差检测器(Agilent Technologies，Inc CA，USA)检测器，分析木糖、木糖醇、乙酸、甘油和乙醇的含量。

10.从图6可知，在42℃玉米芯培养基培养条件下，驯化株YRL005不仅能利用农业废物玉米芯酸水解物发酵，并能产生乙醇。(消耗了19.05g/l的木糖生成7.93g/l乙醇)，并仅有少量副产物醋酸(0.066g/l)的生成。

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Claims (3)

1.一种发酵木糖产乙醇的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)耐热工程菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6389。

2.权利要求1所述的菌株用于通过利用木糖发酵产生乙醇的应用。

3.权利要求1所述的菌株用于通过利用玉米芯水解物发酵产生乙醇的应用。

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