CN103146741B - 三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法及基因工程菌株 - Google Patents
三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法及基因工程菌株 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及乙醇的生物制备领域，具体地涉及三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法及基因工程菌株。所述方法包括通过构建基因XR、XDH、XK、RPE1、RKI1和TAL1的表达质粒，在酿酒酵母中表达上述基因的步骤，其中，用KGD1启动子介导限速基因XK，用HSP26启动子介导关键限速基因TAL1。本发明将纤维素酒精发酵过程分为厌氧的葡萄糖发酵阶段，好氧的木糖呼吸代谢阶段，具有热休克特征的高温抑制为主的发酵后期阶段，共三个阶段。让目标基因在三个阶段的每一个阶段都能得到高效的表达，从而让纤维素底物更加高效地转化为纤维素乙醇。
Description
技术领域
本发明涉及乙醇的生物制备领域，具体地涉及三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法及基因工程菌株。
背景技术
随着人类文明的不断进步，全球能源问题彰显，现已成为制约全球经济持续稳定发展的重要因素。燃料乙醇是一种清洁、可再生的生物质能源，纤维素燃料乙醇技术原料来源广泛，是一项可持续发展的环境友好型技术，其核心技术体系的建设已成为一个全球能源战略必争之地。木质纤维素分解之后主要转化为葡萄糖和木糖，葡萄糖和木糖在厌氧条件下经酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）发酵生成乙醇。本发明旨在以木质纤维生物质为原料，对经过多重基因改良获得酿酒酵母工程菌株进行发酵获得的纤维素乙醇关键技术进行系统地研究，通过筛选并获得一系列优化的高产和高效率的纤维素乙醇目标菌株，为纤维素乙醇商业化生产奠定技术基础。
木糖发酵时先经木糖还原酶基因XR，木糖醇脱氢酶基因XDH，木酮糖激酶基因XK连续催化生成5-磷酸-木酮糖，然后在磷酸戊糖途径主要基因RPE1,RKI1,TAL1,TKL1催化作用下进入糖酵解途径，最后转化为乙醇。在上述发酵过程中，目前许多研究者对XR进行蛋白工程，例如单突变体XR（K270R）和四突变体XR（K270S/N272P/S271G/R276F），希望通过调节XR的氧化还原水平来提高木糖的消耗速率。有一些研究者对木糖利用代谢途径关键基因XR/XDH/XK/TAL1中的一个或者两个进行不同拷贝的探索，期望更有效的提高木糖和葡萄糖的利用率。
现有技术研究表明木糖乙醇发酵过程中大部分基因的转录水平发生了显著改变，因此转录调控是进一步提高乙醇产量的有效途径。现有基因转录调控技术主要是通过经典的组成型强启动子PGK1和ADH1来介导上述重要的七基因转录，期望提高七基因的表达水平，从而实现纤维素乙醇产量的提高。但上述现有技术改造的酿酒酵母工程菌株发酵木糖时生长速率缓慢，乙醇产量及转化率偏低，乙醇的产量水平在0.36-0.42g/g总糖。
然而，基因转录调控技术带来的基因工程发酵代谢过程中的质粒负担，代谢负担，各种环境压力响应都有可能影响最终的乙醇产量和产率，这是该研究技术的不确定性。同时木糖利用的低消耗速率，低转化速率，尽管研究者尝试了不同的启动子，不同的拷贝数目，不同的微生物菌株背景来源，不同的基因蛋白工程，都没有改变纤维素乙醇技术目前面临的瓶颈和难点。
发明内容
因此为了解决上述问题提出并完成了本发明。
本发明的首要目的是提供三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法。
本发明的另一目的是提供三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的基因工程菌株。
根据本发明的三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法包括通过构建基因XR、XDH、XK、RPE1、RKI1和TAL1的表达质粒，在酿酒酵母中表达上述基因的步骤，其中，用KGD1启动子介导限速基因XK，用HSP26启动子介导关键限速基因TAL1。
根据本发明具体实施方式，所述三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法包括步骤：
（1）将质粒p61转入酿酒酵母WT，得到WXY1，其菌株含有两基因pADH1-RPE1和pPGK1-XDH，质粒p61的构建过程：721bp的启动子克隆进入pbluescript，接下来71bp7的ADH1启动子，434bp的PGK1终止子，410bp的RPE1启动子，629bp（自ATG起629bp）的RPE1结构基因一部分，XDH结构基因，选择标记RKUR，依次克隆进来，形成质粒p61；
（2）将质粒p62转入WXY1，得到WXY2，该菌株额外含有pADH1-XR和pPGK1-XK，质粒p62的构建过程：在上述p61质粒的基础上，500bp的XK启动子替换RPE1启动子，419bp（自ATG起419bp）的XK结构基因一部分替换RPE1结构基因一部分（自ATG），含有四个突变的XRK270S/N272P/S271G/R276F替换XDH结构基因，形成质粒p62；
（3）将质粒p64转入WXY2，得到WXY3，该菌株额外含有多拷贝的pPGK1-RKI1和pADH1-TAL1，并且该菌株能初步利用木糖产生乙醇，质粒p64的构建过程：用717的ADH1启动子替换pESC-LEU中的反向启动子PGAL10/PGAL1，接下来721bp的PGK1启动子，选择标记Zeocin，1723bp的rDNA，TAL1和RKI1结构基因依次克隆进来，形成质粒p64；
（4）将质粒pUC-3XK270R转入酿酒酵母WT，得到WXY4，该菌株含有三基因pADH1-XR/pPGK1-XDH/pPGK1-XK，能初步利用木糖产生乙醇；将质粒pUC-3XK270R转入WXY3，得到WXY5，该菌株能很好地利用木糖，产生更多的乙醇；
（5）pv3质粒的构建过程如下：首先将TAL1结构基因连接在pBluscript原始质粒上，接下来依次将启动子CRE1，启动子KGD1r，XK-ORFr，选择标记基因RUR结构，启动子HSP26r，终止子CRE1克隆进来，形成pv3质粒，其表型见表1，整合插入位点为CRE1结构基因，被分别转进WXY3和WXY5，得到了工程菌株WXY6和WXY7；
（6）将pUC-3X(野生型XR)分别转入酵母菌株酿酒酵母WT，WXY3，WXY6，分别得到工程菌株WXY8，WXY9，WXY10。
根据本发明的具体实施方式，以安琪酵母公司的工业酿酒酵母YC-DM拆分孢子获得的单倍体菌株为出发菌株WT，首先构建了一个能够有效利用木糖的工程菌株即WXY3，含有XRK270S/N272P/S271G/R276F/XDH/XK/RPE1/RKI1/TAL1。在此基础上，进一步转入了一个已验证过的质粒pUC-3XK270R含有木糖利用三基因XRK270R/XDH/XK，得到了工程菌株WXY5，此即第一阶段葡萄糖阶段。
接下来以WXY5为研究对象，委托深圳华大基因对其在高浓度混合糖发酵过程中的4小时，24小时和48小时进行了RNA-Seq分析。根据发表的DNA芯片数据，获得RNA-seq的绝对表达量RPKM，我们自己验证的RT-qPCR数据，筛选获得了好氧状态下的启动子KGD1和发酵后期的热休克启动子HSP26。用KGD1启动子介导限速基因XK，HSP26启动子介导关键限速基因TAL1，构建了质粒pv3，含有木糖阶段和热休克阶段。将pv3转入WXY5，得到了一个有良好发酵特征的WXY7。
用pUC-3X替换WXY7中的pUC-3XK270R，得到了阶段性的高产乙醇工程菌株WXY10，该菌株在5%（木糖+葡萄糖）厌氧发酵过程中，6小时消耗完了葡萄糖，大概60小时左右消耗完了木糖，乙醇转化率达到了0.48g乙醇/g总糖。
根据本发明的三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的基因工程菌株其保藏编号为CGMCC No.7191。
根据本发明的技术方案，其中所用木糖还原酶基因XR的序列如SEQ ID No.1所示：
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木糖醇脱氢酶基因XDH的序列如SEQ ID No.2所示：
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介导限速基因XK的序列如SEQ ID No.3所示：
atgttgtgttcagtaattcagagacagacaagagaggtttccaacacaatgtctttagactcatactatcttgggtttgatctttcgacccaacaactgaaatgtctcgccattaaccaggacctaaaaattgtccattcagaaacagtggaatttgaaaaggatcttccgcattatcacacaaagaagggtgtctatatacacggcgacactatcgaatgtcccgtagccatgtggttagaggctctagatctggttctctcgaaatatcgcgaggctaaatttccattgaacaaagttatggccgtctcagggtcctgccagcagcacgggtctgtctactggtcctcccaagccgaatctctgttagagcaattgaataagaaaccggaaaaagatttattgcactacgtgagctctgtagcatttgcaaggcaaaccgcccccaattggcaagaccacagtactgcaaagcaatgtcaagagtttgaagagtgcataggtgggcctgaaaaaatggctcaattaacagggtccagagcccattttagatttactggtcctcaaattctgaaaattgcacaattagaaccagaagcttacgaaaaaacaaagaccatttctttagtgtctaattttttgacttctatcttagtgggccatcttgttgaattagaggaggcagatgcctgtggtatgaacctttatgatatacgtgaaagaaaattcagtgatgagctactacatctaattgatagttcttctaaggataaaactatcagacaaaaattaatgagagcacccatgaaaaatttgatagcgggtaccatctgtaaatattttattgagaagtacggtttcaatacaaactgcaaggtctctcccatgactggggataatttagccactatatgttctttacccctgcggaagaatgacgttctcgtttccctaggaacaagtactacagttcttctggtcaccgataagtatcacccctctccgaactatcatcttttcattcatccaactctgccaaaccattatatgggtatgatttgttattgtaatggttctttggcaagggagaggataagagacgagttaaacaaagaacgggaaaataattatgagaagactaacgattggactctttttaatcaagctgtgctagatgactcagaaagtagtgaaaatgaattaggtgtatattttcctctgggggagatcgttcctagcgtaaaagccataaacaaaagggttatcttcaatccaaaaacgggtatgattgaaagagaggtggccaagttcaaagacaagaggcacgatgccaaaaatattgtagaatcacaggctttaagttgcagggtaagaatatctcccctgctttcggattcaaacgcaagctcacaacagagactgaacgaagatacaatcgtgaagtttgattacgatgaatctccgctgcgggactacctaaataaaaggccagaaaggactttttttgtaggtggggcttctaaaaacgatgctattgtgaagaagtttgctcaagtcattggtgctacaaagggtaattttaggctagaaacaccaaactcatgtgcccttggtggttgttataaggccatgtggtcattgttatatgactctaataaaattgcagttccttttgataaatttctgaatgacaattttccatggcatgtaatggaaagcatatccgatgtggataatgaaaattgggatcgctataattccaagattgtccccttaagcgaactggaaaagactctcatctaa
基因R削1的序列如SEQ ID No.4所示：
atggctgccggtgtcccaaaaattgatgcgttagaatctttgggcaatcctttggaggatgccaagagagctgcagcatacagagcagttgatgaaaatttaaaatttgatgatcacaaaattattggaattggtagtggtagcacagtggtttatgttgccgaaagaattggacaatatttgcatgaccctaaattttatgaagtagcgtctaaattcatttgcattccaacaggattccaatcaagaaacttgattttggataacaagttgcaattaggctccattgaacagtatcctcgcattgatatagcgtttgacggtgctgatgaagtggatgagaatttacaattaattaaaggtggtggtgcttgtctatttcaagaaaaattggttagtactagtgctaaaaccttcattgtcgttgctgattcaagaaaaaagtcaccaaaacatttaggtaagaactggaggcaaggtgttcccattgaaattgtaccttcctcatacgtgagggtcaagaatgatctattagaacaattgcatgctgaaaaagttgacatcagacaaggaggttctgctaaagcaggtcctgttgtaactgacaataataacttcattatcgatgcggatttcggtgaaatttccgatccaagaaaattgcatagagaaatcaaactgttagtgggcgtggtggaaacaggtttattcatcgacaacgcttcaaaagcctacttcggtaattctgacggtagtgttgaagttaccgaaaagtga
基因RPE1的序列如SEQ ID No.5所示：
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:基因TAL1的序列如SEQ ID No.6所示：
atgtctgaaccagctcaaaagaaacaaaaggttgctaacaactctctagaacaattgaaagcctccggcactgtcgttgttgccgacactggtgatttcggctctattgccaagtttcaacctcaagactccacaactaacccatcattgatcttggctgctgccaagcaaccaacttacgccaagttgatcgatgttgccgtggaatacggtaagaagcatggtaagaccaccgaagaacaagtcgaaaatgctgtggacagattgttagtcgaattcggtaaggagatcttaaagattgttccaggcagagtctccaccgaagttgatgctagattgtcttttgacactcaagctaccattgaaaaggctagacatatcattaaattgtttgaacaagaaggtgtctccaaggaaagagtccttattaaaattgcttccacttgggaaggtattcaagctgccaaagaattggaagaaaaggacggtatccactgtaatttgactctattattctccttcgttcaagcagttgcctgtgccgaggcccaagttactttgatttccccatttgttggtagaattctagactggtacaaatccagcactggtaaagattacaagggtgaagccgacccaggtgttatttccgtcaagaaaatctacaactactacaagaagtacggttacaagactattgttatgggtgcttctttcagaagcactgacgaaatcaaaaacttggctggtgttgactatctaacaatttctccagctttattggacaagttgatgaacagtactgaacctttcccaagagttttggaccctgtctccgctaagaaggaagccggcgacaagatttcttacatcagcgacgaatctaaattcagattcgacttgaatgaagacgctatggccactgaaaaattgtccgaaggtatcagaaaattctctgccgatattgttactctattcgacttgattgaaaagaaagttaccgcttaa
本发明拟采用DNA芯片及qRT-PCR方法对酵母细胞在葡萄糖发酵阶段，木糖发酵阶段包括发酵后期等不同阶段的转录组表达谱进行构建。针对不同代谢阶段发现的转录水平大幅上调的特征基因，拟利用其启动子驱动木糖代谢中相关目标基因XR，XDH，XKS1，TAL1在相应阶段继续进行高水平表达，以使目标基因在发酵的各阶段都能持续高效表达。酵母在混合糖发酵的前期及对数生长期优先利用葡萄糖，本发明根据RT-PCR筛选并确认了厌氧状态下强启动子pPGK1,pADH1。当葡萄糖耗尽后，本发明筛选了TCA中代谢转录水平发生较大改变的基因的启动子，用来调控具有呼吸特征的木糖基因转录，确定了木糖发酵状态下强启动子有pKGD1。发酵后期也称应激阶段，其中环境温度上升5℃引起的热休克效应对乙醇产量变化非常明显。将筛选获得的热休克蛋白强启动子pHSP26，pHSP70整合到目标基因上，以增强酵母细胞对发酵后期不利环境的抗性和适应性，提前到达发酵终点。总之，本发明通在葡萄糖阶段，木糖阶段及发酵后期阶段引入强启动子来优化乙醇的生物合成途径中目标基因的转录调控，并通过调控靶点基因mRNA转录水平这一核心思路解决发酵中后期的代谢瓶颈。
因此，本发明相对于现有技术的改进和优点如下：
本发明将纤维素酒精发酵过程分为厌氧的葡萄糖发酵阶段，好氧的木糖呼吸代谢阶段，具有热休克特征的高温抑制为主的发酵后期阶段，共三个阶段。针对现有基因工程菌株的具体问题，本发明提出在三个阶段用上述各阶段筛选出的目标基因转录上调的特征启动子全面启动木糖利用的七基因或者主要基因的转录调控，让目标基因在三个阶段的每一个阶段都能得到高效的表达，从而让纤维素底物更加高效地转化为纤维素乙醇。综上所述，我们提出了这样的三阶段转录调控理论（three stagetranscription regulations,简称为TSTR）。
本理论的创新点及改进之处：1第一次优化总结并提出了三阶段转录调控关键基因提高纤维素乙醇产量的理论体系；2第一次将热休克启动子HSP26和TCA循环启动子KGD1等相关启动子用于介导木糖利用的关键基因XR/XDH/XK/TAL1提高乙醇的产量；3本发明实现了通过快速耗尽葡萄糖来降低葡萄糖在乙醇发酵过程中对木糖的代谢抑制；4我们构建的工程菌株WXY10在各5%左右的混合糖发酵过程中，60小时左右实现了0.48g乙醇/g总糖的糖醇转化率，达到了理论最大值的94%，具有一定的工业化潜力，处于国内外前沿水平。
附图说明
图1显示了在45g/L（葡萄糖+木糖）厌氧发酵各时间段各酵母菌株WT(A),WXY3(B),WXY4(C),WXY5(D)的乙醇代谢图谱。
图2显示对TCA循环基因和HSP家族基因考察的结果，在50g/L（葡萄糖+木糖）厌氧发酵各时间段各酵母菌株的乙醇代谢图谱。
图3显示为菌株发酵结果，在45g/L和50g/L（葡萄糖+木糖）厌氧发酵各时间段各酵母菌株的乙醇代谢图谱。
图4为WXY7和WXY10在50g/L葡萄糖和50g/L木糖的培养基下进行发酵的结果。
图5显示各菌株在YPD培养基中发酵12小时，菌株WTWXY（3-5A）和WXY(6,7,10,B)的基因XR/XDH/XK/TAL1的相对转录水平。
酿酒酵母WXY10（Saccharomyces cerevisiae），于2013年1月23日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101），其保藏编号是：CGMCC No.7191。
具体实施方式
实施例1
1、混合糖共发酵菌株的构建
出发菌株WT来自安琪酵母公司的酿酒酵母工业菌株，经过从工业二倍体拆分孢子转化为单倍体，经过发酵筛选具有更好发酵特性的优势菌株，作为我们试验的原始工业出发菌株。
将质粒p61转入WT，得到WXY1，其菌株含有两基因pADH1-RPE1和pPGK1-XDH；将质粒p62转入WXY1，得到WXY2，该菌株额外含有pADH1-XR4m和pPGK1-XK；将质粒p64转入WXY2，得到WXY3，该菌株额外含有多拷贝的pPGK1-RKI1和pADH1-TAL1，并且该菌株能初步利用木糖产生乙醇；将质粒pUC-3XK270R转入WT，得到WXY4，该菌株含有三基因pADH1-XR(K270R)/pPGK1-XDH/pPGK1-XK，能初步利用木糖产生乙醇；将质粒pUC-3XK270R转入WXY3，得到WXY5，该菌株能很好地利用木糖，产生更多的乙醇。
图1显示了工程菌株WT和WXY（3-5）在约45克/升葡萄糖和45g/L的木糖培养基的发酵结果。WT菌株在24小时后，消耗完了43.5g/L的葡萄糖，在发酵结束后利用了约8g/L（17.8％）木糖，产生了约21.4g/L的乙醇和2.7g/L的木糖醇（图1A）。WXY4在24小时内完全消耗43.5g/L的葡萄糖，在发酵结束时利用了约16g/L（35.7％）的木糖，产生了26.4g/L的乙醇和1.7g/L木糖醇（图1C）。发酵结束后，菌株WXY3和WXY5消耗了16.2（36％）和31.4（70.1％）g/L的木糖，产生了3.0和1.5g/L木糖醇，并产生较高的25.1和34.2g/L的乙醇，分别为（图1B和D）。与WT和WXY3菌株相比，WXY4和WXY5拥有更多的细胞数量（图1E）。相关的菌株基因型和发酵数据也参见表1和表2。与发表的工业菌株基因修饰策略相比，本发明在整体水平上，特别是关键基因拷贝数量进行了优化通过RT-PCR证实了基因拷贝数目的增加及相关基因得到了相对高的表达量：WXY5有两拷贝突变体XR（K270R）和XR（K270S/N272P/S271G/R276F），两拷贝野生型XDH，两拷贝XK，多拷贝TAL1及其他相关基因。厌氧批发酵结果显示，混合糖到乙醇的转化率为0.39g/g总糖。
表1质粒
| 质粒 | 标记及描述 |
| pUC18-RKUR | AMP |
| pESC-LEU | AMP |
| pPICZαA | ZeocinTMresistance gene |
| p61 | AMP,PADH1-RPE1-RPE1t/PPGK1-XDH-PGK1t |
| p62 | AMP,PPGK1-XR4m-PGK1t/PADH1-XK-XKt |
| p64 | AMP,PPGK1-RKI1-CYC1t/PADH1-TAL1-ADH1t |
| pv3 | AMP,PHSP26-TAL1-TAL1t/PKGD1-XK-XKt |
| pUC-3X | AMP,PADH1-XR-ADH1t/PPGK1-XDH-PGK1t/PPGK1-XK-PGK1t |
| pUC-3XK270R | AMP,PADH1-XR(K270R)-ADH1t/PPGK1-XDH-PGK1t/PPGK1-XK-PGK1t |
| Strains | |
| YC-DM | MATa/α |
| CBS6054 | Sch.Stipitis CBS6054 |
| WT | MATa ura3 |
| WXY1 | MATa ura3::p61 |
| WXY2 | WXY1,ura3::p62 |
| WXY3 | WXY2,Zeocin::p64 |
| WXY4 | MATa ura3::pUC-3XK270R |
| WXY5 | WXY3,ura3::pUC-3XK270R |
| WXY6 | WXY3,ura3::pv3 |
| WXY7 | WXY5,ura3::pv3 |
| WXY8 | MATa ura3::pUC-3X |
| WXY9 | WXY3,ura3::pUC-3X |
| WXY10 | WXY6,ura3::pUC-3X |
表2菌株WT、WXY(3-7)、WXY7(生物反应器)及WXY10的发酵结果
Note:a,WXY7生物反应器试验
2、筛选木糖阶段启动子和构建高产乙醇菌株
本发明选取TCA循环的KGD1启动子调控限速基因XK；在发酵后期，选用HSP26能更好地调控关键限速基因TAL1的表达。本发明对菌株WXY5进行了RNA-seq的数据分析，对TCA循环基因和HSP家族基因进行了考察（图2A/C和2B/D）。结果显示HSP26在酵母进入平稳期阶段具有非常高的RPKM；而KGD1各时间段的RPKM并不高，但这与发表DNA芯片数据不一致。进而本发明通过RT-qPCR来验证HSP26和KGD1及相关基因的表达水平（图2E和2F）。结果表明HSP26和KGD1都显示了相对较高的表达水平。于是，构建的pv3质粒，pv3质粒的构建过程如下：首先将TAL1结构基因连接在pBluscript原始质粒上，接下来依次将CRE1-promoter，KGD1-promoter，XK-ORF&terminator，选择标记基因RUR结构，HSP26-promoter，CRE1-terminator克隆进来，形成pv3质粒，其表型见表1，整合插入位点为CRE1结构基因，因为缺失CRE1基因利于乙醇发酵，被分别转进WXY3和WXY5，得到了工程菌株WXY6和WXY7。本发明首次提出采用HSP26强启动子调节TAL1基因，好氧性的KGD1启动子调节XK基因来提高乙醇的产量。
步骤“1”相同的混合糖浓度发酵120小时后，WXY6消耗了100％的葡萄糖和16.3g/L（36.2％）的木糖，产生了27.1g/L的乙醇和4g/L的木糖醇（图3A）。在96h内，WXY7消耗了100％的葡萄糖和42.8g/L（95.3％）的木糖（图3B），产生了最大体积为40.2g/L的乙醇和2.0g/L的木糖醇。WXY7在混合糖发酵中产生了一致的乙醇产量为0.46g/g总糖，这相当于糖醇理论最大值产率的90.2％。WXY7的木糖体积生产率是1.2g/Lh，WXY7的木糖消耗率，乙醇产量和产率，远高于对照菌株WT和其他工程菌株WXY（3-6）（表2）。从图1和图3可见，WXY6和WXY7分别比WXY3和WXY5生产的乙醇产量增加了10.7％和17.9％。图1E和3D显示，WXY6和WXY7比WXY3和WXY5有更多的细胞数量。WXY7（r）在48.2g/L葡萄糖和47.8g/L的木糖培养基上的发酵罐结果如图3C所示。WXY7在24小时内完全消耗48.2g/L的葡萄糖，108小时完全消耗了47.8g/L的木糖，产生了6.1g/L的木糖醇和44.3g/L的乙醇。这说明WXY7在摇瓶和发酵罐都显示了相似的木糖/葡萄糖消耗率，乙醇产量（0.46g/g总糖）和乙醇产率。
3工程菌株WXY10的发酵特点
联合高NADH偏好性的XRK270R和XRK270S/N272P/S271G/R276F并未显著改变木糖的利用率，进一步用pUC-3X(野生型XR)替换pUC-3X K270R来增加木糖利用，从而增加乙醇的产量。这样我们将pUC-3X(野生型XR)分别转入酵母菌株WT，WXY3，WXY6，分别得到工程菌株WXY8，WXY9，WXY10。我们将WXY7和WXY10在50g/L葡萄糖和50g/L木糖的培养基下进行发酵，结果如图4所示。仅仅在6小时后，WXY10a几乎消耗了48.3g/L的葡萄糖和18.3%的木糖，这说明该菌株与WXY7相比，具有更高的葡萄糖和木糖消耗速率。发酵9小时后，WXY10消耗了全部的葡萄糖和43%的木糖，产生了33g/L的乙醇。此外,WXY10在60小时左右几乎消耗尽了所有的混合糖，产生了46.8g/L的乙醇和4.2g/L的木糖醇。WXY10工程菌株获得了非常高的乙醇产量(0.48g乙醇/g总糖),为最大理论值0.51的94%，而且该菌株在60小时内展现了非常高的乙醇体积浓度46.9g/L。此外在发酵过程中，WXY10比WXY7有更多的细胞数目(图4C)。这些结果显示了WXY10具有非常高的乙醇产量和产率，这可能归因于三阶段基因转录调控目标基因所产生的协同作用。需要指出的是，WXY10快速的消耗了葡萄糖，减轻了葡萄糖对木糖的代谢抑制，从而加速了木糖的利用，最后其成为高产乙醇工程菌株的候选者。将菌株WXY10进行保藏，其保藏编号为CGMCC No.7191。
4、工程菌株关键基因的转录水平
各菌株在YPD培养基中发酵12小时，与WT和WXY(3-7)相比，WXY10中的XR/XDH/XK/TAL1显示了最高的转录水平如图5A和5B所示。各菌株中的TAL1基因都展现了相似的表达水平。与WXY5和WXY3相比，WXY7和WXY6的XR/XDH的转录水平增加了一倍，此外WXY7的XK水平比WXY5高了2倍。对WXY7和WXY10在50g/L葡萄糖和50g/L木糖的发酵条件下4小时，24小时，48小时，72小时的关键基因XR,XDH,XK和TAL1表达水平进行了调查研究（图5C和5D）。结果显示WXY7和WXY10的XK和TAL1转录水平在各时间点都相似，XR和XDH的转录水平在4/24/48小时都是上升的，并且在48小时达到了峰值,WXY10在72小时展现了非常高的XR和XDH转录水平。相比于WXY5的4小时整体不同表达基因，在24小时呈现了下降的表达趋势，而后在48小时呈现了上升的表达趋势（图5E）。这些转录水平数据证明了我们三阶段转录水平调控。
根据本发明的三阶段基因转录水平的技术方案在实践过程中会遇到许多问题，比如XR基因做了两拷贝的整合，p62质粒中的XR定点整合在XK结构基因位置，pUC-3X和pUC-3XK270R质粒中的XR定点整合在URA3结构基因位置。这样子可以避免不同的拷贝之间发生内部的基因重组，从而保证了不同拷贝之间的基因可以有效的相互协作。
生物乙醇研究近三十年，科学家都集中在用组成型的强启动子或者诱导性的启动子，或者合成启动子来调控木糖利用基因，期望能够实现木糖的高效利用。本发明对于乙醇研究发现了多个维度，或者说不同的时间和空间上用启动子特异性的组合通过合理的转录调控目标基因有可能实现木糖的高效利用，从而产生高的乙醇产量和产率。为此本发明提出了通过采用三阶段筛选获得的特异性启动子分别调控木糖利用关键基因的三阶段转录调控方案，期望能够解决木糖关键基因转录水平过低的问题。然而任何组合新理论的都具有不确定性，所以本发明通过构建了30-50株工程菌株，逐步探讨不同拷贝关键基因，不同强度的启动子组合来系统提高目标基因的转录水平。总之，本发明涉及到的相关启动子特异性组合对基因转录水平的调控产生阶段性的效果，获得的工程菌株WXY10具有一定的商业化前景。
此外，目前对于XK转录调控研究有一些争议。一些学者认为过度表达XK可以有效利用木糖，增加细胞外木糖进入细胞内的效率，而XK又是木糖进入PPP途径的限速步骤，这样子XK过表达是显而易见的。而一些学者则认为应该适度表达XK，太低了不足以增加木糖的利用，太高了会对酵母细胞产生毒性，从而带来新的问题。本发明兼顾了上述两种可能的争议，我们采用了三羧酸循环中的表达水平适宜的好氧型启动子KGD1，而非表达水平最强的SDH3，来调控XK，目的就是为了保持合适的XK表达水平以使酿酒酵母更有效地利用木糖。
Claims (2)
1.提高纤维素乙醇产量的基因工程菌株，其保藏编号为：CGMCC No.7191。
2.一种通过生物发酵制备乙醇的方法，其特征在于，所述方法包括发酵提高纤维素乙醇产量的基因工程菌株CGMCC No.7191的步骤。
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