CN104640976B - 能够代谢木糖且对抑制剂耐受的酵母菌株、其获得方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明的主题是能够代谢木糖且对至少一种发酵抑制剂耐受的新型酵母菌株，还涉及其获得方法。本发明的主题还是通过培养所述酵母菌株获得的酵母和其用于特别是在包含木糖和至少一种发酵抑制剂的培养基中产生至少一种发酵产物(优选乙醇)的用途。

Description

能够代谢木糖且对抑制剂耐受的酵母菌株、其获得方法及其 用途
发明领域
本发明涉及能够代谢木糖且还表现出对至少一种发酵抑制剂的耐受性的酵母菌株的领域，涉及其获得方法，涉及从所述酵母菌株获得的酵母和涉及其用于在包含木糖的培养基中、任选在至少一种发酵抑制剂存在的情况下产生发酵产物的用途。
背景技术
文献PCT/EP2011/071616描述了用于经由表达XI-XDH代谢途径在含有至少一种戊糖的培养基中产生乙醇的酵母。所述文献首次描述了木糖异构酶(XI)活性的过表达与木糖醇脱氢酶(XDH)活性的过表达的组合，并且显示木糖醇脱氢酶活性的过表达使得可能防止木糖醇对木糖异构酶活性的抑制。文献PCT/EP2011/071616描述了，例如，以编号I-4538于2011年10月5日保藏于CNCM[国家微生物培养物保藏中心]的酵母菌株。
酵母从木质纤维素水解产物工业生产乙醇不仅需要用于代谢戊糖的遗传机制，而且需要对这些木质纤维素水解产物中存在的发酵抑制剂的耐受性的特性。
发酵抑制剂在木质纤维素生物质的预处理和水解过程中产生。发酵抑制剂有糠醛类(糠醛，HMF)、酚类化合物类和有机酸类(乙酸、乙酰丙酸、甲酸)。
已经描述了对抗发酵抑制剂的作用的各种方式，其中有发酵培养基的解毒、发酵方法的改进或酵母对发酵抑制剂的耐受性的改进。
酵母对发酵抑制剂的耐受性，例如，已经通过定向进化或通过环境适应(acclimatization)来遗传改进(Almeida和International SugarJournal,2009,Vol.111,No.1323)。
然而，提供给出以下酵母的工业酵母菌株似乎是困难的，所述酵母既对于在包含至少一种戊糖的发酵培养基中的乙醇生产是有效的，又对至少一种发酵抑制剂耐受。
因此，的确需要提供甚至在至少一种发酵抑制剂诸如乙酸存在的情况下能够代谢至少一种戊糖(例如木糖)的新型酵母菌株，所述酵母菌株甚至在至少一种发酵抑制剂存在的情况下提供有效生产乙醇的酵母。
发明概述
本发明的第一个目的涉及以编号I-4627保藏于CNCM[国家微生物培养物保藏中心]的酵母菌株。
本发明的第二个目的涉及用于获得能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株的方法，其包括以下步骤：
-将以编号I-4538保藏于CNCM[国家微生物培养物保藏中心]的酵母菌株与以编号I-4627保藏于CNCM的酵母菌株杂交，以便获得至少一种杂合体，
-选择能够代谢木糖且对乙酸耐受的至少一种杂合体。
本发明的第三个目的涉及能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株，其可以借助如上所定义的方法获得。
本发明的第四个目的涉及衍生自如上所定义的酵母菌株的酵母菌株，其特征在于所述衍生的酵母菌株能够代谢木糖且对乙酸耐受。
本发明的第五个目的涉及通过培养如上所定义的酵母菌株或通过培养如上所定义的衍生的酵母菌株而获得的酵母。
本发明的第六个目的涉及用于产生至少一种发酵产物的方法，其包括使用如上所定义的酵母在厌氧条件下发酵的步骤。
本发明的第七个目的涉及如上所定义的酵母用于优选在包含木糖和/或一种发酵抑制剂的发酵培养基中产生至少一种发酵产物的用途。
附图说明
图1：I-4538酵母菌株(菱形)、H1酵母菌株(正方形)、ED1酵母菌株(三角形)、ED2酵母菌株(圆形)和ED3酵母菌株(十字)在YFGX-Ac发酵培养基中在32℃下随时间(以小时计)的乙醇产量(以g/kg发酵培养基计)。
图2：I-4538酵母菌株(菱形)、ED1酵母菌株(三角形)和ED2酵母菌株(圆形)在培养基A中在32℃下随时间(以小时计)的乙醇产量(以g/kg发酵培养基计)。
图3：I-4538酵母菌株(菱形)、ED1酵母菌株(三角形)、ED2酵母菌株(圆形)和ED3酵母菌株(十字)在培养基A中在35℃下随时间(以小时计)的乙醇产量(以g/kg发酵培养基计)。
图4：I-4538酵母菌株(菱形)、ED1酵母菌株(三角形)、ED2酵母菌株(圆形)和ED3酵母菌株(十字)在培养基B中在35℃下随时间(以小时计)的乙醇产量(以g/kg发酵培养基计)。
定义
表述“酵母菌株”表示酵母细胞的相对均匀群体。
酵母菌株获得自克隆的分离，克隆是获得自单一酵母细胞的细胞群体。
术语“外源”基因意指所考虑物种的酵母菌株中非天然存在的基因。
术语“内源”基因意指所考虑物种的酵母菌株中天然存在的基因。
木糖异构酶或XI在本文中表示能够在单一步骤中将D-木糖转化为D-木酮糖且其对应于分类EC5.3.1.5的酶。
木糖醇脱氢酶或XDH在本文中表示能够在单一步骤中将木糖醇转化为D-木酮糖且其对应于分类EC 1.1.1.9的酶。
木糖还原酶或XR在本文中表示能够在单一步骤中将D-木糖转化为木糖醇且其对应于分类EC 1.1.1.307的酶。
D-木酮糖激酶或XKS在本文中表示能够在单一步骤中将D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸且其对应于分类EC 2.7.1.17的酶。
GRE3基因编码对应于分类EC 1.1.1.21的醛糖还原酶。
RPE1基因编码对应于分类EC 5.1.3.1的D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶。
RKI1基因编码对应于分类EC 5.3.1.6的核糖-5-磷酸酮醇-异构酶。
TKL1基因编码对应于分类EC 2.2.1.1的转酮醇酶。
TAL1基因编码对应于分类EC 2.2.1.2的转醛醇酶。
原养型酵母菌株是能够在基础培养基上生长的酵母菌株。具体而言，根据本发明的原养型酵母菌株能够合成其生长所需的所有氨基酸和碱。
基础培养基是包含碳源(CxHyOz)、无机氮源、钾源、磷源、硫源、镁源、钙源、铁源、微量元素源和水的培养基。
基础培养基的一个实例是向其中添加碳源(例如糖)和无机氮源(例如硫酸铵)的YNB(酵母氮基)培养基。
YNB培养基每升包含：2μg生物素、400μg泛酸钙、2μg叶酸、2000μg肌醇、400μg烟酸、200μg对氨基苯甲酸、400μg盐酸吡哆醇、200μg核黄素、400μg盐酸硫胺素、500μg硼酸、40μg硫酸铜、100μg碘化钾、200μg氯化铁、400μg硫酸锰、200μg钼酸钠、400μg硫酸锌、1g磷酸二氢钾、500mg硫酸镁、100mg氯化钠、100mg氯化钙、5g/l硫酸铵，最终pH 5.4。
表述“衍生的酵母菌株”表示通过一次或多次杂交和/或通过突变和/或通过遗传转化衍生的酵母菌株。
通过杂交衍生的酵母菌株可以通过将根据本发明的酵母菌株与相同的酵母菌株、根据本发明的另一种酵母菌株、或与任何其他酵母菌株杂交来获得。
通过突变衍生的酵母菌株可以是已经在其基因组中经历至少一个自发突变或通过诱变诱导的至少一个突变的酵母菌株。衍生菌株的突变可以是或可以不是沉默的。
表述“诱变”既表示通过施加辐射(例如UV辐射)或使用化学诱变剂获得的随机诱变，又表示通过转座或通过外源DNA片段的整合的插入或定点诱变。
通过遗传转化衍生的酵母菌株是其中已经引入DNA序列的酵母菌株，所述DNA序列优选由质粒提供，或直接整合到基因组中。
发明详述
本发明的目的是提供甚至在至少一种发酵抑制剂诸如乙酸存在的情况下能够代谢至少一种戊糖(特别是木糖)的酵母菌株。
对于本发明的目的，能够代谢木糖的酵母菌株是能够在包含木糖的培养基中在厌氧条件下生产乙醇的酵母菌株。
具体地，能够代谢木糖的酵母菌株是能够将木糖转化为乙醇(即能够发酵木糖)的酵母菌株。
木糖向乙醇的转化由木糖向木酮糖的直接或间接异构化，随后使用戊糖磷酸途径的非氧化部分中所得木酮糖而产生。
对于本发明的目的，能够代谢木糖的酵母菌株是能够在包含55g葡萄糖和45g木糖/kg发酵培养基的发酵培养基中在厌氧条件下在60小时内将至少70％、优选至少80％、更优选至少90％的木糖转化为乙醇的酵母菌株。
用于测量转化为乙醇的木糖的百分比的酵母菌株的接种量优选为0.25g干物质/kg发酵培养基。
从酵母菌株接种到发酵培养基中开始计算60小时的时间段。
用于测量转化为乙醇的木糖的百分比的发酵培养基优选为合成培养基。
合成培养基是确切化学组成已知的培养基。
根据本发明的合成培养基包含碳源、氮源、磷源和还有对于酵母菌株的生长必需的维生素和矿物质。
在一个优选的实施方案中，用于测量转化为乙醇的木糖的百分比的发酵培养基是包含55g/kg葡萄糖、45g/kg木糖、10g/kg酵母提取物、10g/kg蛋白胨和2000ppm乙酸的YFGX合成培养基(用KOH将pH调节至5)。
在YFGX培养基中，pH5的以2000ppm的浓度存在的乙酸没有抑制作用。
发酵优选在32℃下在温和搅拌(例如90rpm)下进行。
搅拌温和，以便不需要充氧。
优选例如通过YFGX培养基中的酸/碱对的缓冲能力，例如乙酸/乙酸盐缓冲能力来控制培养基的pH。
发酵培养基中存在的乙醇量通过本领域技术人员已知的任何适当的方式来测量。
它可以涉及生产的乙醇的直接测量，或经由与乙醇生产相关的参数(诸如质量损失)的间接测量。
例如，乙醇生产可以通过色谱法，尤其是通过HPLC(高效液相色谱)、酶试剂盒(例如，来自Boehringer的乙醇测定试剂盒)或使用重铬酸钾的测定法，来测量。
发酵培养基中存在的木糖量通过本领域技术人员已知的任何适当的方式，优选通过色谱法，尤其是通过HPLC，来测量。
使用包含葡萄糖和木糖两者的发酵培养基使得可能使用对于评价的各种酵母菌株相当的生物质的量来评价木糖向乙醇的转化。事实上，酵母菌株首先发酵葡萄糖和木糖混合物中的葡萄糖，然后发酵葡萄糖和木糖。
在至少一种发酵抑制剂存在的情况下代谢木糖的能力被描述为对所述发酵抑制剂的耐受性。
在本发明的上下文中，发酵抑制剂优选为乙酸。
它是乙酸的非离子化形式，从某一浓度开始，称为毒性浓度，这负责其毒性，因此，负责其抑制作用。
例如，乙酸(pH 4.4)的4000ppm的浓度对于不耐受乙酸的菌株(诸如I-4538酵母菌株)而言是毒性浓度。
在厌氧条件下的发酵过程中，乙酸的抑制作用特别导致糖向生物量和向乙醇的转化起始的延迟。
对乙酸的耐受性在本文中相对于糖向乙醇的转化起始的延迟，即，乙醇发酵的起始的延迟，进行测量。
代表作为时间的函数产生的乙醇的量的乙醇发酵曲线通常包含三个阶段：
-潜伏期，在其过程中，没有乙醇产生，
-乙醇产生期，和
-平台期，其对应于发酵结束。
乙醇发酵的起始的延迟在本文中对应于线原点的x轴，其代表乙醇产率的最大导数。
更简单地，乙醇发酵的起始的延迟在本文中对应于线原点的x轴，其代表乙醇产生期的斜率。
对乙酸耐受的酵母菌株在本文中定义为在包含4000ppm乙酸(pH 4.4)的发酵培养基中具有小于30小时、优选小于29小时、更优选小于28小时的乙醇发酵的起始的延迟的酵母菌株。
用于评价对乙酸的耐受性的发酵培养基优选为合成培养基，更优选YFAc培养基。
YFAc培养基的组成如下：150g/kg葡萄糖、5g/kg酵母提取物、4.7g/kg DAP(磷酸氢二铵)、11.5g/kg柠檬酸、4g/kg乙酸、13.5g/kg柠檬酸钠、1ml/kg Tween 80、2ml/kg ZnSO4(10.6g/l)、2.5ml/kg MgSO4.7H2O(400g/l)、1ml/kg硫胺素(18.24g/l)、1ml/kg吡哆醇(5.28g/l)、1ml/kg生物素(1.76g/l)、1ml/kg泛酸盐(3.8g/l)、2.5ml/kg烟酸(8g/l)、1ml/kg内消旋肌醇(50g/l)，1ml/kg核黄素(在1g/l)、1ml/kg对氨基苯甲酸盐(1.2g/l)，用KOH将pH调节至4.4。
用于评价对乙酸的耐受性的酵母菌株的接种量优选为0.25g干物质/kg发酵培养基。
乙醇发酵曲线的时间t＝0对应于将酵母菌株接种到发酵培养基中的时间。
乙醇发酵在厌氧条件下，优选在32℃和温和搅拌(例如90rpm)下进行。
搅拌温和，以便不需要充氧。
优选例如通过YFAc培养基中的酸/碱对的缓冲能力，例如乙酸/乙酸盐缓冲能力来控制培养基的pH。
在YFAc发酵培养基中，对乙酸不耐受的酵母菌株可以具有至少40小时的乙醇发酵起始的延迟。
本发明人已经寻求获得甚至在乙酸存在的情况下能够代谢木糖的酵母菌株，从在将木糖转化为乙醇方面有效的酵母菌株开始。
选择作为从赋予其对乙酸的耐受性的特征的观点来看改进的起始菌株的在木糖转化为乙醇方面有效的酵母菌株是I-4538酵母菌株，其在布达佩斯条约下在2011年10月5日保藏于CNCM(国家微生物培养物保藏中心)，25，rue du Docteur Roux，75724Pariscedex 15，法国。
I-4538酵母菌株在包含55g葡萄糖和45g木糖/kg培养基的YFGX发酵培养基中在60小时内将至少90％木糖转化为乙醇。
然而，I-4538酵母菌株对乙酸特别敏感；它在包含4000ppm乙酸(pH 4.4)的YFAc发酵培养基中具有至少40小时的乙醇发酵起始的延迟。
I-4538酵母菌株是通过定向进化从酵母菌株获得的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株，所述酵母菌株通过以下遗传修饰：
-在pADH1启动子和CYC1终止子的控制下插入至少一个拷贝的编码Clostridiumphytofermentans的木糖异构酶(XI)的外源基因，
-在pADH1启动子和CYC1终止子的控制下插入至少一个拷贝的编码树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的木糖醇脱氢酶(XDH)的外源基因，
-至少一个拷贝的TAL1内源基因，将其置于pPGK1启动子的控制下，
-至少一个拷贝的TKL1内源基因，将其置于pTDH3启动子的控制下，
-至少一个拷贝的RPE1内源基因，将其置于pTDH3启动子的控制下，
-至少一个拷贝的RKI1内源基因，将其置于pTDH3启动子的控制下，
-在pADH1启动子和CYC1终止子的控制下插入至少一个拷贝的编码木酮糖激酶(XKS1)的内源基因，
-缺失至少一个拷贝的编码醛糖还原酶的GRE3内源基因的开放阅读框。
I-4538酵母菌株不含任何残留的可选择标记。
I-4538酵母菌株不包含编码外源来源的XR的基因，也不包含araA、araB或AraD基因。
编码Clostridium phytofermentans的木糖异构酶(XI)的外源基因是文献DE102008031350中描述的优化序列SEQ ID NO:3的基因。
编码树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶(XDH)的外源基因是Genbank上参考序列X55392.1的基因。
pADH1、pPGK1和pTDH3启动子是酿酒酵母的启动子。
CYC1终止子是酿酒酵母的启动子。
I-4538酵母菌株是非整倍体的工业酵母菌株。
I-4538酵母菌株是原养型的。
为了在I-4538酵母菌株上赋予对乙酸的耐受性的性质，但基本上不改变其代谢木糖的能力，本发明人已经选择使用菌株杂交技术。
据本发明人所知，这是首次杂交技术用于改进遗传修饰的非整倍体酵母菌株。
事实上，当起始酵母菌株如下时，本领域技术人员将不会乍看之下将预期使用杂交技术：
-包含不少于八个遗传修饰，其必须先验被转移到选择的分离子，
-是非整倍体酵母菌株且在不存在严格二倍体的情况下存在分离问题，
-已经经历在定向进化背景下的诱变步骤，这可能是杂交困难的原因，特别是在导致萌发问题(germination problems)的染色体易位的情况下。
因此，在I-4538酵母菌株和对乙酸耐受且未经遗传修饰、即不具有木糖发酵所需的遗传机制的酵母菌株之间进行杂交。
用于杂交的对乙酸耐受的酵母菌株在YFAc发酵培养基中具有小于14小时的乙醇发酵起始的延迟。
杂交的结果不是结论性的：尽管对乙酸耐受的特征确实被转移到杂合体，但后者的效率远低于用于将木糖转化为乙醇的起始I-4538酵母菌株。
在最好的情况下，获得的杂合体在包含55g葡萄糖和45g木糖/kg培养基的YFGX发酵培养基中在60小时内将40％木糖转化为乙醇。
发明人试图通过定向进化改进这些杂合体的木糖发酵，但没有进一步成功。
因此本发明人已经证明，为了通过杂交转移对乙酸耐受的特征，而不损失有效代谢木糖的能力，必需将I-4538酵母菌株与对乙酸耐受且具有类似的遗传背景(即其也具有代谢木糖的遗传机制)、但无需在代谢木糖方面有效的酵母菌株杂交。
使用的既对乙酸耐受、且还具有代谢木糖的遗传机制的酵母菌株是根据布达佩斯条约于2012年5月24日以编号I 4627保藏于CNCM(国家微生物培养物保藏中心)，25，rue duDocteur Roux，75724Paris cedex15，法国的酿酒酵母菌株。
因此，通过杂交I-4538酵母菌株与I-4627酵母菌株，本发明人已经获得了既能效代谢木糖又对乙酸耐受的酵母菌株。
因此，本发明的目的是以编号I-4627保藏于CNCM的酵母菌株。
I-4627菌株构成了用于获得根据本发明的酵母菌株的两种起始菌株之一。
I-4627酵母菌株是一种新颖酵母菌株，其通过将对乙酸耐受且未经遗传修饰的非整倍体酵母菌株与经遗传修饰的非整倍体酵母菌株杂交的原始方法而获得。
因此，I-4627酵母菌株已经通过以下方式获得：
-选择对乙酸耐受、即在YFAc发酵培养基中具有小于14小时的乙醇发酵起始的延迟的酵母菌株。
-选择通过以下遗传修饰的酵母菌株：
○在pADH1启动子和CYC1终止子的控制下插入至少一个拷贝的编码Clostridiumphytofermentans的木糖异构酶(XI)的外源基因，
○在pADH1启动子和CYC1终止子的控制下插入至少一个拷贝的编码树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶(XDH)的外源基因，
○至少一个拷贝的TAL1内源基因，将其置于pPGK1启动子的控制下，
○至少一个拷贝的TKL1内源基因，将其置于pTDH3启动子的控制下，
○至少一个拷贝的RPE1内源基因，将其置于pTDH3启动子的控制下，
○至少一个拷贝的RKI1内源基因，将其置于pTDH3启动子的控制下，
○在pADH1启动子和CYC1终止子的控制下插入至少一个拷贝的编码木酮糖激酶(XKS1)的内源基因，
○缺失至少一个拷贝的编码醛糖还原酶的GRE3内源基因的开放阅读框，
-将所述对乙酸耐受的酵母菌株与所述遗传修饰的酵母菌株杂交，以便获得杂合体，
-定向进化所述杂合体，以便获得I-4627酵母菌株。
I-4627酵母菌株包含在pADH1启动子和CYC1终止子的控制下的至少一个拷贝的编码Clostridium phytofermentans的木糖异构酶(XI)的外源基因、在pADH1启动子和CYC1终止子的控制下的至少一个拷贝的编码树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶(XDH)的外源基因、置于pPGK1启动子的控制下的至少一个拷贝的TAL1内源基因、置于pTDH3启动子的控制下的至少一个拷贝的TKL1内源基因、置于pTDH3启动子的控制下的至少一个拷贝的RPE1内源基因、置于pTDH3启动子的控制下的至少一个拷贝的RKI1内源基因、在pADH1启动子和CYC1终止子的控制下的至少一个拷贝的编码木酮糖激酶(XKS1)的内源基因、和已经缺失的至少一个拷贝的编码醛糖还原酶的GRE3内源基因的开放阅读框。
至于I-4538酵母菌株，编码Clostridium phytofermentans的木糖异构酶(XI)的外源基因是文献DE102008031350中描述的优化序列SEQ ID NO:3的基因，且编码树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶(XDH)的外源基因是Genbank上参考序列X55392.1的基因。
I-4627酵母菌株不含任何残留的可选择标记。
I-4627酵母菌株不包含编码外源来源的XR的基因，也不包含araA、araB或AraD基因。
I-4627酵母菌株是工业酵母菌株，且其是非整倍体。
I-4627酵母菌株是原养型的。
I-4627酵母菌株对乙酸的耐受性小于用于杂交的起始乙酸耐受的酵母菌株，但其对乙酸的耐受性对于工业应用是广泛可接受的。
因此，I-4627酵母菌株在YFAc发酵培养基中具有小于20小时的乙醇发酵起始的延迟。
至于对木糖的有效性，I-4627酵母菌株在包含55g葡萄糖和45g木糖/kg培养基的YFGX发酵培养基中在60小时内将约60％的木糖转化为乙醇。
因此，I-4627酵母菌株是原始酵母菌株，其具有对乙酸的耐受性且具有用于代谢木糖的遗传机制，但是其不能为本发明目的代谢木糖，即从生产乙醇的观点来看与工业使用不相容。
因此，本发明人已经将I-4538酵母菌株与I-4627菌株杂交，以便获得能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株。
因此，本发明的一个目的是用于获得能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株的方法，其包括以下步骤：
-将以编号I-4538保藏于CNCM[国家微生物培养物保藏中心]的酵母菌株与以编号I-4627保藏于CNCM的酵母菌株杂交，以便获得至少一种杂合体，
-选择至少一种能够代谢木糖且对乙酸耐受的杂合体，以便获得能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株。
如上所定义，根据本发明的能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株具有下列特性：
-其在包含55g葡萄糖和45g木糖/kg发酵培养基的YFGX发酵培养基中在厌氧条件下在60小时内将至少70％、优选至少80％、更优选至少90％的木糖转化为乙醇，且
-其在包含4000ppm乙酸(pH 4.4)的YFAc发酵培养基中具有小于30小时、优选小于29小时、更优选小于28小时的乙醇发酵的起始的延迟。
杂交步骤根据常规技术，诸如以下中教导的那些来进行：A.H.Rose和J.S.Harrison,1969-Academic Press编辑的参考书“The Yeasts”第1卷，R.R.Fowell的第7章“Sporulation and Hybridization of Yeast”。
为了改进用于获得根据本发明的酵母菌株的方法的效率，在衍生自I-4538酵母菌株的分离子和/或衍生自I-4627酵母菌株的分离子上进行选择是特别有利的。
优选基于其代谢木糖的能力选择用于杂交的I-4538酵母菌株的分离子。
基于其对乙酸的耐受性选择用于杂交的I-4627酵母菌株的分离子。
因此，本发明的一个目的是如上定义的方法，其特征在于所述杂交步骤包括：
-以编号I-4538保藏于CNCM[国家微生物培养物保藏中心]的酵母菌株的孢子形成，以便获得至少一种分离子X的步骤，
-通过至少一种分离子X评价将木糖转化为乙醇的任选步骤，
-以编号I-4627保藏于CNCM的酵母菌株的孢子形成，以便获得至少一种分离子Y的步骤，
-通过至少一种分离子Y评价对乙酸的耐受性的任选步骤，
-将至少一种分离子X与至少一种分离子Y杂交，以便获得至少一种杂合体的步骤，所述分离子X能够将木糖转化为乙醇和/或所述分离子Y具有对乙酸的耐受性。
孢子形成、评价将木糖转化为乙醇和评价对乙酸的耐受性的步骤可以以任何所需顺序进行，只要在评价其分离子之前进行给定酵母菌株的孢子形成。
例如，本发明的一个目的是如上定义的方法，其特征在于所述杂交步骤包括：
-以编号I-4538保藏于CNCM[国家微生物培养物保藏中心]的酵母菌株的孢子形成，以便获得至少一种分离子X的步骤，
-测量至少一种分离子X在包含55g葡萄糖和45g木糖/kg发酵培养基的所述培养基中在60小时内在厌氧条件下转化为乙醇的木糖的百分比的任选步骤，
-以编号I-4627保藏于CNCM的酵母菌株的孢子形成，以便获得至少一种分离子Y的步骤，
-测量包含4000ppm乙酸(pH 4.4)的发酵培养基中至少一种分离子Y的乙醇发酵起始的延迟的任选步骤。
-将至少一种分离子X与至少一种分离子Y杂交，以便获得至少一种杂合体的步骤，所述分离子X在60小时内将至少60％的木糖转化为乙醇和/或所述分离子Y具有小于30小时的乙醇发酵起始的延迟。
孢子形成、测量转化为乙醇的木糖的百分比和测量乙醇发酵起始的延迟的步骤可以以任何所需顺序进行，只要在测量应用于该菌株的分离子的选择参数之前进行给定酵母菌株的孢子形成。
用于测量通过I-4538酵母菌株的至少一种分离子转化为乙醇的木糖的百分比的接种量优选为0.25g干物质/kg发酵培养基。
用于测量通过I-4538酵母菌株的至少一种分离子转化为乙醇的木糖的百分比的发酵培养基优选为YFGX发酵培养基。
I-4538酵母菌株的分离子在代谢木糖方面自然没有起始非整倍体菌株那么有效。因此，关于将木糖转化为乙醇应用的选择标准没有起始I-4538酵母菌株的能力那么要求高。
因此，在一个有利的实施方案中，如果在厌氧条件下，I-4538酵母菌株在包含55g葡萄糖和45g木糖/kg发酵培养基，优选至少65％木糖，甚至更优选至少70％木糖的所述培养基中在60小时内将至少60％木糖转化为乙醇，则选择所述分离子。
为了优化分离子选择步骤的持续时间，可以测量在较短时间段内，例如在48小时的时间段内I-4538酵母菌株的分离子将木糖转化为乙醇。
因此，在另一个有利的实施方案中，如果在厌氧条件下，I-4538酵母菌株的分离子在包含55g葡萄糖和45g木糖/kg发酵培养基，优选至少65％木糖，甚至更优选至少70％木糖的所述培养基中在48小时内将至少60％木糖转化为乙醇，则选择所述分离子。
在另一个有利的实施方案中，如果I-4627酵母菌株的分离子在包含4000ppm乙酸(pH 4.4)的发酵培养基中具有小于30小时、优选小于29小时、更优选小于28小时的乙醇发酵起始的延迟，则选择所述分离子。
然而，令人惊讶地，大多数I-4627酵母菌株的分离子比起始I-4627酵母菌株对乙酸更耐受，即它们的乙醇发酵起始的延迟小于起始I-4627酵母菌株。
因此，关于对乙酸的耐受性应用的选择标准优选要求更高。
因此，在一个特别有利的实施方案中，如果I-4627酵母菌株的分离子具有小于25小时、优选小于20小时的乙醇发酵起始的延迟，则选择所述分离子。
用于测量I-4627酵母菌株的至少一种分离子的乙醇发酵起始的延迟的发酵培养基优选为YFAc发酵培养基。
用于测量I-4627酵母菌株的至少一种分离子的乙醇发酵起始的延迟的接种量优选为0.25g干物质/kg发酵培养基。
还可以根据其将木糖转化为乙醇的能力选择I-4627酵母菌株的分离子。
然而，令人惊讶地，已经使用仅基于其对乙酸的耐受性选择的I-4627酵母菌株的分离子获得了最好的杂合体。
优选地，杂交步骤用以下进行：
-至少一种分离子X，其在60小时内、优选在48小时内，将至少60％木糖、优选至少65％木糖、甚至更优选至少70％木糖转化为乙醇，和
-至少一种分离子Y，其具有小于30小时、优选小于29小时、更优选小于28小时、更优选小于25小时、甚至更优选小于20小时的乙醇发酵起始的延迟。
然后基于两个标准选择因此获得的杂合体：其代谢木糖的能力和其对乙酸的耐受性。
本发明的一个目的更具体地是如上所定义的方法，其特征在于所述选择能够代谢木糖且对乙酸耐受的至少一种杂合体的步骤包括以下步骤：
-测量至少一种杂合体在包含55g葡萄糖和45g木糖/kg发酵培养基的发酵培养基中在60小时内在厌氧条件下转化为乙醇的木糖的百分比，
-测量杂合体包含4000ppm乙酸(pH 4.4)的发酵培养基中至少一种杂合体的乙醇发酵起始的延迟，
-选择至少一种杂合体，其在60小时内将至少70％、优选至少80％、更优选至少90％的木糖转化为乙醇，且其乙醇发酵起始的延迟小于30小时、优选小于29小时、更优选小于28小时，
以便获得能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株。
测量转化为乙醇的木糖的百分比和测量乙醇发酵起始的延迟的步骤的顺序不重要；它们可以一个在另一个之后、以一个方向或另一个方向或者同时进行。
用于测量转化为乙醇的木糖的百分比和乙醇发酵起始的延迟的条件如上所定义。
因此，本发明的一个目的特别是用于获得能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株的方法，其包括以下步骤：
-将以编号I-4538保藏于CNCM[国家微生物培养物保藏中心]的酵母菌株与以编号I-4627保藏于CNCM的酵母菌株杂交，所述杂交步骤包括以下步骤：
○以编号I-4538保藏于CNCM的酵母菌株的孢子形成，以便获得至少一种分离子X，
○测量通过至少一种分离子X在包含55g葡萄糖和45g木糖/kg发酵培养基的所述培养基中在60小时内、优选在48小时内转化为乙醇的木糖的百分比，
○选择至少一种分离子X，其在60小时内、优选在48小时内，将至少60％木糖转化为乙醇，
○以编号I-4627保藏于CNCM的酵母菌株的孢子形成，以便获得至少一种分离子Y，
○测量在包含4000ppm乙酸(pH 4.4)的发酵培养基中通过至少一种分离子Y的乙醇发酵起始的延迟，
○选择至少一种分离子Y，其具有小于30小时的乙醇发酵起始的延迟，
-将在60小时内、优选在48小时内将至少60％木糖转化为乙醇的至少一种分离子与具有小于30小时的乙醇发酵起始的延迟的至少一种分离子Y杂交，以便获得至少一种杂合体，
-选择能够代谢木糖且对乙酸耐受的至少一种杂合体，所述选择步骤包括以下步骤：
○测量通过至少一种杂合体在包含55g葡萄糖和45g木糖/kg发酵培养基的发酵培养基中在60小时内在厌氧条件下转化为乙醇的木糖的百分比，
○测量杂合体包含4000ppm乙酸(pH 4.4)的发酵培养基中所述至少一种杂合体的乙醇发酵起始的延迟，
○选择至少一种杂合体，其在60小时内将至少70％、优选至少80％、更优选至少90％的木糖转化为乙醇，且其乙醇发酵起始的延迟小于30小时、优选小于29小时、更优选小于28小时，
以便获得能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株。
如上所述，杂交步骤的步骤顺序不重要，正如选择至少一种杂合体的步骤的步骤顺序不重要一样。
优选地，杂交步骤在以下之间进行：
-至少一种分离子X，其在60小时内、优选在48小时内，将至少60％木糖、优选至少65％木糖、甚至更优选至少70％木糖转化为乙醇，和
-至少一种分离子Y，其具有小于30小时、优选小于29小时、更优选小于28小时、甚至更优选小于25小时、甚至更优选小于20小时的乙醇发酵起始的延迟。
根据本发明的方法可以任选包括定向进化步骤。
在本发明的一个有利的实施方案中，从使所述杂合体能够将木糖代谢为乙醇和/或使其对乙酸耐受的观点来看，在不是如上所定义的用于获得能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株的方法的选择步骤过程中选择的杂合体上进行定向进化步骤。
因此，本发明的一个目的还是如上所定义的用于获得能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株的方法，其包括以下步骤：
-将以编号I-4538保藏于CNCM[国家微生物培养物保藏中心]的酵母菌株与以编号I-4627保藏于CNCM的酵母菌株杂交，以便获得至少一种杂合体，
-定向进化至少一种杂合体，
-选择至少一种能够代谢木糖且对乙酸耐受的杂合体，以便获得能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株。
定向进化步骤包括下列分步骤：
-诱变，以便获得突变体，和
-在包含木糖和/或发酵抑制剂的培养基中在缺氧条件下以循环培养增殖突变体。
为了简化，在定向进化步骤结束时获得的突变体仍描述为杂合体。
表述“在缺氧条件下”表示在氧缺乏的条件下。
氧缺乏在本文中通过小于20％空气的氧百分比来定义。
诱变步骤优选为“温和”诱变，即，通过将酵母细胞暴露于254nm的100和500J/cm2之间，例如300J/cm2的UV辐射来获得。
这些条件引起经受UV辐射的细胞群体的仅7％至16％的死亡率。
死亡率通过将相同体积的诱变之前和之后的细胞悬液铺板在碳源为葡萄糖的培养基的皿上且通过比较生长48小时之后的菌落数来测定。
在包含木糖和/或抑制剂的培养基中在缺氧条件下以循环培养增殖突变体包括，例如：
a)在培养基中，在搅拌下，在缺氧条件下，优选在32℃下培养经受诱变的细胞群体，
b)取样步骤a)中获得的培养物的体积，例如，一ml，且将其重新接种到具有与步骤a)相同组成的培养基中，
将步骤a)和b)重复至少3次，优选至少4次，例如6次、7次或8次。
当增殖突变体过程中培养基中存在发酵抑制剂时，其优选为乙酸。
在本发明一个优选的实施方案中，在缺氧条件下以循环培养增殖突变体在包含木糖且不存在乙酸的培养基中进行。
用于增殖突变体的培养基包含，例如，7％木糖。
用于增殖突变体的培养基的实例为具有以下组成的YFX培养基：70g/kg葡萄糖、5g/kg酵母提取物、4.7g/kg DAP(磷酸氢二铵)、11.5g/kg柠檬酸、13.5g/kg柠檬酸钠、1ml/kg Tween 80、2ml/kg ZnSO4(10.6g/l)、2.5ml/kg MgSO4.7H2O(400g/l)、1ml/kg硫胺素(18.24g/l)、1ml/kg吡哆醇(5.28g/l)、1ml/kg生物素(、1.76g/l)、1ml/kg泛酸盐(3.8g/l)、2.5ml/kg烟酸(8g/l)、1ml/kg内消旋肌醇(50g/l)、1ml/kg核黄素(1g/l)、1ml/kg对氨基苯甲酸盐(1.2g/l)，用KOH将pH调节至4.4。
缺氧条件，例如，借助使用的设备(例如，烧瓶或发酵罐)中的局部超压而获得，所述局部超压由于在发酵过程中产生的CO2产生之后的超压和缺乏通风而导致。
优选地，培养a)的持续时间使得培养基中的所有木糖都被消耗。
培养的持续时间为，例如，1周至48小时。
所进行的培养的数量是可变的，例如，5次至20次。
在一个优选的实施方案中，定向进化步骤包括选择非呼吸缺陷突变体的分步骤。
非呼吸缺陷突变体是能够在氧化代谢条件下增殖的突变体。
具体而言，非呼吸缺陷突变体能够在有氧条件下，在30℃下，在含有甘油作为唯一碳源的培养基中，例如包含20g/kg丙三醇、5g/kg硫酸铵和1.7g/kg YNB(酵母氮基)培养基的培养基，例如来自Difco的YNB培养基中增殖。
当培养基中不包含发酵抑制剂时，在包含乙酸的培养基中增殖的分步骤可以在循环培养的增殖的特定或每个分步骤之后进行，以便验证所述培养基仍含有对乙酸耐受的至少一种突变体。
在包含乙酸的培养基中增殖的持续时间优选大于20小时且小于75小时。
例如，在包含乙酸的培养基中增殖的分步骤的持续时间被包括在70小时至75小时。
还可能通过在包含葡萄糖的培养基，例如包含20g/l葡萄糖的培养基中培养，且选择具有适当生长速率的突变体来进行选择具有适当生长速率的突变体的步骤。
定向进化步骤也可以使用在用于获得如上所定义的能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株的方法的选择步骤结束时选择的杂合体来进行，例如以进一步改进其代谢木糖的能力和/或其对乙酸的耐受性。
本发明的一个目的还是能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株，其可以借助如上所定义的方法获得。
因此，H1酵母菌株借助如上所定义的用于获得酵母菌株的方法来获得(参见实施例1)。
H1酵母菌株在YFGX培养基中在60小时内在厌氧条件下将至少90％的木糖转化为乙醇，且在YFAc发酵培养基中具有小于22小时的乙醇发酵起始的延迟。
本发明的一个目的还特别是借助如上所定义的方法获得的能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株，其选自以编号I-4624保藏于CNCM[国家微生物培养物保藏中心]的酵母菌株、以编号I-4625保藏于CNCM的酵母菌株和以编号I-4626保藏于CNCM的酵母菌株。
I-4624、I-4625和I-4626菌株是根据布达佩斯条约于2012年5月24日保藏于CNCM(国家微生物培养物保藏中心)，25，rue du Docteur Roux，75724Paris cedex 15，法国的酿酒酵母菌株。
酵母菌株编号I-4624在YFGX培养基中在60小时内在厌氧条件下将至少90％的木糖转化为乙醇，且在YFAc发酵培养基中具有小于23小时的乙醇发酵起始的延迟。
酵母菌株编号I-4625在YFGX培养基中在60小时内在厌氧条件下将至少90％的木糖转化为乙醇，且在YFAc发酵培养基中具有小于23小时的乙醇发酵起始的延迟。
酵母菌株编号I-4626在YFGX培养基中在60小时内在厌氧条件下将至少90％的木糖转化为乙醇，且在YFAc发酵培养基中具有小于27小时的乙醇发酵起始的延迟。
本发明的一个目的还是衍生自共有相同特性的根据本发明的酵母菌株的酵母菌株。
因此，本发明的一个目的还是衍生自根据本发明的酵母菌株的酵母菌株，其特征在于所述衍生的酵母菌株能够代谢木糖且对乙酸耐受。
衍生的酵母菌株如上述定义中所定义。
本发明的一个目的还是通过培养如上所定义的酵母菌株或通过培养如上所定义的衍生的酵母菌株而获得的酵母。
酵母通过培养根据本发明的酵母菌株或根据本发明的衍生的酵母菌株来获得，特别如参考书“Yeast Technology”，第2版，1991,G.Reed和T.W.Nagodawithana，VanNostrand Reinhold出版,ISBN 0-442-31892-8中所述。
酵母的工业规模增殖通常至少包含以下步骤集合的前两个步骤：
-在几个阶段中增殖酵母菌株，首先在半厌氧条件下，然后在有氧条件下，
-通过从酵母的培养基中离心所得酵母而分离，以便获得含有约12％至25％干物质，或甚至更高含量干物质的液体酵母乳(如果将酵母乳与渗透质产物混合)，
-过滤所得液体酵母乳，通常在真空下在旋转过滤器上，以便获得含有26％至35％干物质的脱水新鲜酵母，
-混合所述脱水新鲜酵母，以便获得均匀体，
-挤压所得酵母，以便获得：
○含有约30％干物质的新鲜酵母饼或压碎新鲜酵母的形式的压缩酵母，或
○如果意欲将酵母进行干燥，颗粒(通常颗粒剂)形式的酵母，
-任选地，以抽气(sparing)方式，在热空气流中，例如，通过流化，干燥通过挤压获得的酵母颗粒，以便获得干燥酵母。
干燥步骤优选为在乳化剂存在下的抽气快速干燥。
可以在干燥步骤过程中使用的乳化剂中，可以选择山梨醇酐单硬脂酸酯，其例如以约1.0％的浓度(以相对于干燥酵母的重量的重量计)使用。
根据本发明的酵母可以以任何可能的形式使用。
例如，本发明的一个目的是如上所定义的酵母，其特征在于其为酵母乳、压缩酵母、干燥酵母或深冻酵母的形式。
根据本发明的酵母具有与通过培养获得它们的酵母菌株相同的特性，即：
-根据本发明的酵母能够代谢木糖，和
-根据本发明的酵母对乙酸耐受。
根据本发明的酵母对于生产工业乙醇、例如意欲用于生物燃料或用于化学工业的乙醇是特别有利的。
本发明的一个目的也是用于产生至少一种发酵产物的方法，其包括通过如上所定义的酵母在发酵培养基中在厌氧条件下发酵的步骤。
发酵产物特别选自乙醇、从乙醇获得的代谢物或次级代谢物。
根据本发明的一种优选的发酵产物是乙醇。
乙醇生产借助乙醇发酵获得。
本领域技术人员知道如何确定用于乙醇发酵的适当条件。
通过举例的方式，可以参考参考书“Yeast Technology”，第2版，1991,G.Reed和T.W.Nagodawithana，Van Nostrand Reinhold出版,ISBN0-442-31892-8中所述的乙醇发酵条件。
发酵培养基包含以下元素：至少一种可发酵的碳源、至少一种氮源、至少一种硫源、至少一种磷源、至少一种维生素源和/或至少一种矿物质源。
碳源，例如，以可以立即被酵母同化的糖的形式，戊糖诸如木糖、甘油、乙醇和/或其混合物，提供。
碳源优选由可以立即被酵母同化的糖和由木糖提供。
可以立即被酵母同化的糖是，例如，葡萄糖、果糖或半乳糖类型的单糖、蔗糖类型的二糖和/或这些糖的混合物。
碳源可以以葡萄糖糖浆、果糖糖浆、糖蜜、低级流出物(run-off)2(从糖的第二次结晶获得的低级流出物)、所有或部分植物材料的水解产物、和/或其混合物的形式提供。
氮源例如，以硫酸铵、氢氧化铵、磷酸氢二铵、氨、尿素和/或其组合的形式提供。
硫源，例如，以硫酸铵、硫酸镁、硫酸和/或其组合的形式提供。
磷源，例如，以磷酸、磷酸钾、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和/或其组合的形式提供。
维生素源，例如，以糖蜜、酵母水解产物、纯维生素或纯维生素的混合物的溶液、和/或其组合的形式提供。
维生素源为酵母提供了至少等于参考手册推荐量的所有维生素。可以组合几种维生素源。
矿物质源，例如，以糖蜜、矿物盐的混合物和/或其组合的形式提供。
矿物质源为酵母提供了至少等于参考手册推荐量的所有常量元素和痕量元素。可以组合几种矿物质源。
相同物质可以提供多种不同的元素。
本发明的一个目的特别是如上所定义的用于产生至少一种发酵产物(优选乙醇)的方法，其包括通过如上所定义的酵母在包含木糖和/或至少一种发酵抑制剂的发酵培养基中在厌氧条件下发酵的步骤。
发酵抑制剂，例如，选自有机酸、糠醛、HMF(羟甲基糠醛)、一种或多种酚类化合物和渗透压。
有机酸，例如，选自乙酸、乳酸、甲酸和乙酰丙酸。
在一个优选的实施方案中，所述至少一种发酵抑制剂是乙酸。
渗透压存在于，例如，所有或部分植物材料的水解产物中。渗透压然后特别源自用于获得所述水解产物的方法过程中提供的盐水载量。
发酵培养基如上所定义。
发酵培养基优选包含至少0.2％木糖，百分比通过重量/发酵培养基的重量表示。
一种优选的发酵培养基包含2％至7％木糖。
在本发明一个优选的实施方案中，发酵培养基还包含可以立即被酵母同化的糖，例如葡萄糖。
发酵培养基包含，例如，2％至7％木糖和0.5％至15％葡萄糖。
在一个优选的实施方案中，发酵培养基包含木糖、葡萄糖和乙酸。
本发明的一个目的特别是如上所定义的用于产生至少一种发酵产物(优选乙醇)的方法，其特征在于，所述发酵培养基包含所有或部分植物材料的至少一种水解产物。
所有或部分植物材料的水解产物可以借助以下步骤获得：例如在高温下和在有机酸或溶剂存在下预处理植物材料，任选随后以酶促和/或化学和/或热的方式部分或全部水解糖聚合物。
因此，所有或部分植物材料的水解产物包含源自糖聚合物的水解的糖的混合物，诸如纤维素、半纤维素和淀粉。
发酵培养基还可以包含所有或部分植物材料的水解产物和蔗糖。
本发明的一个目的还是如上所定义的酵母用于优选在包含木糖和/或至少一种发酵抑制剂的发酵培养基中产生至少一种发酵产物的用途。
发酵产物如上所定义。
发酵产物优选为乙醇。
发酵培养基如上所定义。
发酵抑制剂如上所定义。
本发明的其他特征和优点在阅读以下示例性实施方案后将甚至更加清楚，所述示例性实施方案说明本发明而不限制它，并且将参考附图对其进行理解。
具体实施方式
实施例1：获得能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株
材料与方法
(i)发酵培养基
用于繁殖酵母菌株的繁殖培养基包含10g/kg酵母提取物、10g/kg蛋白胨和20g/kg葡萄糖。
下文描述的YFGX培养基用于测量木糖向乙醇的转化。
下文描述的YFAc培养基用于测量对乙酸的耐受性。
下文描述的YFGX-Ac培养基用于评价同时含有木糖、葡萄糖和发酵抑制剂乙酸的培养基中的酵母菌株。
YFGX YFGX-Ac
葡萄糖 55g/kg 55g/kg
木糖 45g/kg 45g/kg
酵母提取物 10g/kg 10g/kg
蛋白胨 10g/kg 10g/kg
乙酸 2000ppm 8000ppm
用KOH调节pH pH 5 pH 5
在YFGX培养基中，pH5的2000ppm的乙酸浓度没有抑制作用。
另一方面，在YFGX-Ac培养基中，pH5的8000ppm的乙酸浓度具有抑制作用。
(ii)酵母菌株繁殖
酵母菌株繁殖以两个步骤进行：预培养步骤和随后的培养步骤。
预培养通过将酵母菌株环接种到5ml如上定义的繁殖培养基中来进行。
在通过搅拌通气的培养基中在30℃培养24小时后，取出2ml该预培养物，且接种到50ml繁殖培养基中。
该培养在通过搅拌通气的培养基中在30℃进行24小时。
对该培养获得的酵母细胞测量木糖向乙醇的转化和对乙酸的耐受性。
(iii)测量木糖向乙醇的转化
为了测定木糖向乙醇的转化，每kg YFGX培养基接种0.25g干物质的如上所述繁殖的酵母菌株。
发酵在32℃在厌氧条件下在温和搅拌下进行。
乙醇和还有木糖和葡萄糖浓度通过HPLC测量。
然后以下公式用于获得木糖向乙醇的转化度：
％转化＝[木糖]初始-[木糖]最终/[木糖]初始×100
其中[木糖]初始对应于用酵母菌株接种时培养基中的木糖浓度，且[木糖]最终对应于在60小时时(从接种开始)培养基中的木糖浓度。
(iv)测量对乙酸的耐受性
酵母菌株对乙酸的耐受性通过乙醇发酵起始的延迟来测定。
每kg YFAc培养基接种0.25g干物质的如上所述繁殖的酵母菌株。
发酵在厌氧条件下在32℃在温和搅拌下进行。
乙醇产量通过测量发酵烧瓶的质量损失来间接测量，这种质量损失与乙醇产量直接相关。
产生表示作为时间函数的质量损失的乙醇发酵曲线。
测定x轴和质量损失的最大导数之间的交叉点：其对应于发酵起始的延迟。
应当指出，如果乙醇发酵曲线表示作为时间函数的乙醇产量，而不是作为时间函数的质量损失，则质量损失的最大导数给出与乙醇产率的最大导数相同的结果。
获得的持续时间越受限制，则发酵起始的延迟越短，且酵母菌株对乙酸越耐受。
(v)杂交
用于杂交的起始菌株是I-4538酵母菌株和I-4627酵母菌株。
步骤1：酵母菌株生长
将起始菌株环(保存在-80℃)接种在培养基A的Petri皿的琼脂表面。
培养基A的组成如下：10g酵母提取物、10g蛋白胨、20g葡萄糖、20g琼脂、pH 6.2+/-0.2，水适量1l。
然后将Petri皿在30℃孵育24小时。
步骤2：培养基2上孢子形成
将先前培养物的环接种在培养基B的Petri皿的琼脂表面。
培养基B的组成如下：6.5g乙酸钠、15g琼脂、pH 6.5-7、水适量1l。
将Petri皿在25℃孵育96分钟。然后将在所述皿表面获得的生物质收获在500μl无菌水中。将25μl裂解酶添加至100μl该悬液中。将悬液在30℃孵育30分钟，然后铺出至培养基1的琼脂皿上。四分切开优选在20分钟后实施。
步骤3：四分切开
将四分体用Singer显微操纵器切开，然后将Petri皿在30℃孵育48小时。
步骤4：分离子储存
然后将分离子在-80℃储存于包含20％甘油的培养基1中。
步骤5：I-4538酵母菌株分离子的选择
根据其将木糖转化为乙醇的能力选择I-4538酵母菌株分离子。
如(iii)中，使用如(ii)中繁殖的分离子用于酵母菌株测量木糖转化，除了测量在48小时，而不是60小时时进行。
选择的分离子在48小时时转化至少70％的木糖。
通过PCR确定选择的分离子的Mat a或Matα性类型。
步骤6：I-4627菌株分离子的选择
基于其对乙酸的耐受性选择I-4627酵母菌株分离子。
如(iv)中，使用如(ii)中繁殖的分离子用于酵母菌株评价对乙酸的耐受性。
选择的分离子具有小于25小时的发酵起始的延迟。
通过PCR确定选择的分离子的Mat a或Matα性类型。
步骤7：杂合体的杂交和选择
将Matα单倍体分离子的环接种在培养基A的Petri皿的琼脂表面。将Mat a单倍体分离子的环与Matα菌株的保藏物混合。
培养基A的组成如下：10g酵母提取物、10g蛋白胨、20g葡萄糖、20g琼脂、pH 6.2+/-0.2、水适量1l。
然后将Petri皿在30℃孵育24小时。将混合物的环接种在培养基A的Petri皿的琼脂表面。该步骤重复5次。
在最后接种过程中，将细胞划线，以便获得分离的菌落。从每个分离的菌落取出酵母细胞且培养，提取它们的基因组DNA且在该基因组DNA上进行PCR，以便验证Mat a和Matα等位基因确实存在于一种且相同的酵母细胞中。
具有Mat a和Matα等位基因的酵母细胞被称为杂合体。
然后基于两个标准选择杂合体：它们代谢木糖的能力和它们对乙酸的耐受性，其如(iii)和(iv)中所示来评价。
选择的杂合体如下：
-具有小于30小时的乙醇发酵起始延迟的杂合体，
-在60小时时转化至少60％木糖的杂合体。
(vi)定向进化
定向进化是UV诱变步骤和随后在木糖构成唯一碳源的发酵培养基上富集的组合。
步骤1：在UV诱变过程中，将15ml 5％(以对于100g悬液的g干物质计)酵母细胞的悬液置于9cm Petri皿中。然后将Petri皿置于254nm的300J/cm2的UV辐射下。
步骤2：然后将辐射的酵母细胞以1g干物质/kg YFX培养基的量接种。在32℃下在缺氧条件下增殖96小时后，100μl培养基用于接种50ml含有20g/kg甘油、5g/kg硫酸铵和1.7g/kg来自Difco的YNB(酵母氮基)培养基的甘油培养基。该第二次培养在有氧条件下在30℃进行48小时。
然后将1ml该培养物取出以接种170ml YFX培养基。
该循环重复8次。
结果
通过将I-4538菌株与I-4627菌株杂交获得几种杂合体，其中为H1和H2杂合体。
不能够代谢木糖用于本发明的目的、但呈现对乙酸的耐受性的H2杂合体经受定向进化步骤：然后获得ED1、ED2和ED3杂合体，分别对应于I-4624、I-4626和I-4625酵母菌株。
表1表明各种酵母菌株在60小时时在YFGX培养基中转化为乙醇的木糖的百分比和YFAc培养基中乙醇发酵起始的延迟(以小时计)：
-Ac对照，其是对乙酸耐受的未遗传修饰的酵母菌株，因此不能代谢木糖，
-I-4538起始酵母菌株，其对于生产乙醇是非常有效的，但对乙酸不耐受，
-I-4627起始酵母菌株，其对乙酸耐受，但不能代谢木糖用于本发明的目的，
-H1杂合体，其是能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株，
-H2杂合体，其不能代谢木糖用于本发明的目的、但呈现对乙酸的耐受性，
-ED1、ED2和ED3杂合体，其能够代谢木糖且对乙酸耐受。
表1
此外，在同时包含葡萄糖、木糖和作为发酵抑制剂的乙酸的YFGX-Ac发酵培养基中评价酵母菌株的乙醇产量。
根据本发明的H1、ED1、ED2和ED3酵母菌株在YFGX-Ac培养基中具有与I-4538亲本酵母菌株相比明显改善的乙醇产量(参照图1)。
实施例2：使用根据本发明的酵母菌株在实际应用培养基中的乙醇生产
材料与方法
在实际应用培养基中评价ED1、ED2和ED3酵母菌株的乙醇生产。
还通过比较的方式评价I-4538亲本酵母菌株的乙醇生产。
在两种不同的应用培养基上进行酵母菌株的乙醇生产的评价：
-培养基A，其包含：
○半纤维素底物，其对应于已经经历麦秸的预处理和热化学水解的生物质的固/液分离后获得的液相，且主要包含木糖(48g/kg)、少量其他糖、和还有由木质纤维素生物质的物理化学预处理获得的发酵抑制剂，和
○营养物(氮源和磷源)，
-培养基B，其对应于补充有葡萄糖的上述培养基A，以模拟木质纤维素生物质的水解产物，其半纤维素级分已经水解，且其纤维素级分已经部分水解。
将培养基A和B的初始pH调节至pH 5.5。
发酵罐用1.5g/kg干物质的待评价的酵母菌株接种。
乙醇发酵在35℃下进行。
发酵也在32℃下用培养基A进行。
结果
在32℃和35℃用培养基A获得的结果分别在图2和3中给出，且在35℃用培养基B的结果在图4中给出。
应注意，在图3中，对于I-4538酵母菌株，点都停在60h，这是由于已经达到平台期。
与I-4538亲本酵母菌株相比，ED1和ED2杂合体在32℃在应用培养基A中显示真正的优势。
与I-4538亲本酵母菌株相比，ED1、ED2和ED3杂合体在35℃在应用培养基A中显示真正的优势。事实上，即使对于I-4538酵母菌株在前60小时中乙醇产率更好，生产的乙醇的最高量为6.3g/每kg培养基，然而用ED1、ED2和ED3杂合体获得了大于10g/kg的乙醇的量。
与I-4538酵母菌株相比，ED1和ED2杂合体在35℃在应用培养基B中再一次显示真正的优势。ED3杂合体在应用培养基中稍微落后。

Claims (19)

1.于2012年5月24日以编号I-4627保藏于国家微生物培养物保藏中心(CNCM)的酵母菌株。
2.用于获得能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株的方法，其包括以下步骤：
-将于2011年10月5日以编号I-4538保藏于CNCM的酵母菌株与于2012年5月24日以编号I-4627保藏于CNCM的酵母菌株杂交，以便获得至少一种杂合体，和
-选择能够代谢木糖且对乙酸耐受的至少一种杂合体。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述杂交步骤包括：
-于2011年10月5日以编号I-4538保藏于CNCM的酵母菌株的孢子形成，以便获得至少一种分离子X的步骤，
-于2012年5月24日以编号I-4627保藏于CNCM的酵母菌株的孢子形成，以便获得至少一种分离子Y的步骤，和
-将至少一种分离子X与至少一种分离子Y杂交，以便获得至少一种杂合体的步骤，其中所述分离子X将木糖转化为乙醇和/或所述分离子Y对乙酸耐受。
4.能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株，其使用如权利要求2所述的方法获得。
5.能够代谢木糖且对乙酸耐受的酵母菌株，其使用如权利要求3所述的方法获得。
6.酵母菌株，其中所述酵母选自于2012年5月24日以编号I-4624保藏于CNCM的酵母菌株、于2012年5月24日以编号I-4625保藏于CNCM的酵母菌株和于2012年5月24日以编号I-4626保藏于CNCM的酵母菌株。
7.衍生自权利要求4-6任一项所述的酵母菌株的酵母菌株，其中所述衍生的酵母菌株代谢木糖且对乙酸耐受。
8.通过培养权利要求4-6任一项所述的酵母菌株而获得的酵母。
9.通过培养权利要求7所述的酵母菌株而获得的酵母。
10.用于产生至少一种发酵产物的方法，其包括在发酵培养基中在厌氧条件下发酵如权利要求8所述的酵母的步骤。
11.权利要求10所述的方法，其中所述发酵培养基包含木糖和/或至少一种发酵抑制剂。
12.权利要求10所述的方法，其中所述发酵培养基包含所有或部分植物材料的至少一种水解产物。
13.权利要求11所述的方法，其中所述发酵培养基包含所有或部分植物材料的至少一种水解产物。
14.用于产生至少一种发酵产物的方法，其包括在发酵培养基中在厌氧条件下发酵如权利要求9所述的酵母的步骤。
15.权利要求14所述的方法，其中所述发酵培养基包含木糖和/或至少一种发酵抑制剂。
16.权利要求14所述的方法，其中所述发酵培养基包含所有或部分植物材料的至少一种水解产物。
17.权利要求15所述的方法，其中所述发酵培养基包含所有或部分植物材料的至少一种水解产物。
18.权利要求8所述的酵母用于在包含木糖和/或至少一种发酵抑制剂的发酵培养基中产生发酵产物的用途。
19.权利要求9所述的酵母用于在包含木糖和/或至少一种发酵抑制剂的发酵培养基中产生发酵产物的用途。
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