CN107592884B - 在乙酸的存在下具有提高的发酵木糖能力的酵母菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种筛选酵母菌株的方法，所述酵母菌株在非解离形式的有机酸，优选地是乙酸的存在下具有提高的发酵戊糖，优选地是木糖的能力，其中至少一株能够发酵所述戊糖的酵母菌株在以下两种培养基中连续培养：第一生长培养基，其包含作为唯一碳源的所述戊糖和非解离形式的所述有机酸；第二生长培养基，其包含作为唯一碳源的另一碳源，优选地为葡萄糖，不含非解离形式的所述有机酸，在浓度升高的非离解形式的有机酸存在下，至少在所述两种生长培养基中连续培养，重复至少两次。

Description

在乙酸的存在下具有提高的发酵木糖能力的酵母菌株

技术领域

本发明涉及包括在该发酵的抑制剂(包括非解离形式的乙酸)的存在下，能够发酵戊糖(特别是木糖)的酵母菌株。

更具体地，本发明提供了一种用于筛选改良菌株的方法，所述菌株代谢木质纤维素水解产物中存在的这种类型的糖的能力非常有效。

现有技术描述

主要来自农业和农工业活动的木质纤维素或植物生物质是一种复合基质，由三种主要成分(纤维素、半纤维素和木质素)组成。这是一种潜在的可回收利用的废物，可用于生产乙醇，其需求量不断增加，鉴于其例如作为生物燃料的用途。

从木质纤维素生物质生产乙醇的方法包括：通过水解回收尽可能多的纤维素和半纤维素部分中存在的糖，然后通过发酵将其转化成乙醇。

对于存在于该生物质中的糖(包含C6糖(己糖)和C5糖(戊糖))的发酵，优选酵母厌氧发酵，特别是使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其发酵葡萄糖的能力得到良好的控制和开发。

然而，戊糖，特别是木糖的发酵引起了大量注意，其可以代表了木素纤维素生物质中所含的总糖的25至40％。因此，能够发酵葡萄糖的酵母菌株被改造为也能够代谢戊糖。

例如，文献WO 2010/000464报道获得了由于编码木糖异构酶(XI)的细菌基因而能够发酵戊糖的酵母菌株，该酶将木糖转化成酵母可以代谢的木酮糖。

作为替代方案，应该注意真核途径，包括产生木糖醇的木糖还原酶(XR或XYL1)和也可产生木酮糖的木糖醇脱氢酶(XDH或XYL2)。

因此，文献WO 2012/072793记载了整合编码木糖异构酶和木糖醇脱氢酶的外源基因的改良的酵母菌株，其中木糖醇脱氢酶用于消除被证明是木糖异构酶抑制剂的木糖醇。这种菌株，特别是于2011年10月5日在CNCM(国家微生物保藏中心，Collection Nationalede Cultures de Microorganismes)保藏的菌株，保藏号为I-4538，其具有提高的产量，从而证明了乙醇生产的工业实用性。

另一个关键问题是在木质纤维素水解产物中的发酵抑制剂，其中包括呋喃甲醛(糠醛和HMF)、酚类化合物和有机酸(乙酸、乙酰丙酸和甲酸)。超过5g/kg(初始培养基)并且可达到10g/kg的高浓度乙酸的存在，本质上与共价键合到半纤维素分子的乙酰基的浓度相关。

以前的工作已经改善了菌株在乙酸存在下发酵所必要的耐受性。因此，文献WO2011/080411报道了获得的在葡萄糖上对乙酸的耐受性提高的酵母菌株。

然而，乙酸也是木糖发酵的抑制剂。这种抑制的特点在于木糖消耗动力学的降低(Bellisimi等人，FEMS Yeast Res.，2009.9:358-364)，而对于葡萄糖，这种抑制被认为是在发酵开始期间的延迟，随后动力学保持不变。应该注意的是，在培养基中葡萄糖和木糖都存在的情况下，由于分解代谢物的阻遏，酵母菌首先发酵葡萄糖。

因此文献WO 2013/178915和WO 2013/178918描述了获得能够代谢戊糖，特别是木糖，并且对发酵抑制剂(特别是乙酸)具有耐受性的酵母菌株的方法。

然而，显然需要获得能够发酵己糖和戊糖的新酵母菌株，进一步减少发酵抑制剂，特别是乙酸的影响，特别是对戊糖(如木糖)发酵动力学的影响。

发明详述

本发明是基于发明人显示了分离对发酵抑制剂(特别是乙酸)具有耐受性的新酵母菌株的可能性，其不仅涉及菌株的葡萄糖代谢，而且涉及包括木糖在内的戊糖发酵。

以这种方式，在本发明上下文中，开发了一种筛选酵母菌株的方法，所述酵母菌株在有机酸型发酵抑制剂(特别是乙酸)的存在下，显示出提高的戊糖(特别是木糖)发酵。使用这种方法，可以在木糖消耗速率方面，分离具有提高的木糖发酵动力学的菌株，包括在高浓度乙酸存在的情况下。

应当注意以前的工作研究过这个问题：

因此，文献(Wright等人，FEMS Yeast Res.，2011.11：299-306)报道了提高在木糖上菌株对乙酸的耐受性。这项结果往往表明，在木糖上对乙酸的耐受性现象可能是一个可诱导的过程。而且，呈现的结果似乎非常混杂：

通过SBR方法(“单批次重复，Single Batch Repeat”)或用木糖限制的恒化器筛选的培养，与出发菌株的结果相比，仅显示木糖终浓度略有减少，并且因此在前三天内乙醇浓度略有增加。

此外，根据乙酸浓度的峰值，特定木糖消耗速率的峰值与起始菌株中观察到的值非常接近，为2.5g/L。

此外，观察到对于分离的菌株，特定木糖消耗速率然后以与起始菌株观察到的相似的方式降低。根据得出的结论，这些结果表明，SPR培养中的长期筛选不能产生具有乙酸耐受性的稳定表型。

另一个文献(Sanda等人，生物资源技术(Bioresource Technology)，2011.102:7917-7924)报道了在含有葡萄糖和木糖的木素纤维素水解产物上进行定向进化。然而，用于选择最快繁殖菌株的SBR技术产生在葡萄糖上生长最快的菌株的选择。

尽管现有技术是失败的，本发明人开发了一种新的选择方法，用于得到在乙酸存在下具有木糖发酵方面所需性能的酵母菌株。

如第一方面，本发明涉及一种筛选酵母菌株的方法，所述酵母菌株在非解离形式的有机酸存在下具有提高的发酵戊糖能力。

因此，本发明的方法是用于从分离的菌株或菌株混合物中筛选一株菌株，其在含有所述戊糖和所述非解离形式的有机酸的培养基上的生长方面具有选择性优势。

本申请的对象，所述方法可以在分离的菌株上进行，特别是以下菌株：

-2013年5月16日保藏于CNCM的菌株，编号为I-4749；

-2013年12月12日保藏于CNCM的菌株，编号为I-4829；

-2015年4月9日保藏于CNCM的菌株，编号为I-4966。

在这种情况下，不想被任何理论所限制，在下述定义的生长培养基中，通过连续培养施加的选择压力，使菌株获得提高其在非解离形式的有机酸存在下发酵戊糖能力所必需的表型性状。

如另一方面，其是经受本发明方法的酵母菌株的混合物。在这种情况下，至少一种菌株经受如上所述的选择压力，从而开发出在非解离形式的有机酸存在下提高的发酵戊糖能力。或者，菌株混合物已经含有一株在非解离形式的有机酸存在下具有提高的发酵戊糖能力的菌株，本发明的方法用于富集混合物中的该菌株，因为其更快的增殖，从而分离或筛选所述菌株。

根据具体实施方式，在利用本发明的不同生长培养基进行培养之前，酵母菌株或菌株混合物进行在先诱变步骤，可能提高所需表型的出现。通常，这种诱变可以通过暴露于化学试剂或辐射，特别是紫外线(UV)辐射来实现。优选地，选择“温和”的条件，例如暴露于254nm的100至500J/cm²(例如300J/cm²)的UV辐射。

根据本发明的方法，酵母菌株或菌株混合物在至少两种生长培养基中连续培养。在本申请的上下文中，术语“生长培养基”和“培养基”无差别地用于指包含当前酵母生存乃至增殖所必需的成分的培养基。

第一生长培养基的特征在于，含有作为唯一碳源的戊糖，用于寻求提高的发酵能力。它优选地包括木糖或阿拉伯糖，更优选地是木糖。优选地，所述第一种培养基是液体培养基。

优选地，生长培养基的戊糖浓度是作为唯一碳源时通常实施的，特别地，包括在液体培养基的情况下在5-100g/L之间(在固体培养基的情况下5-100g/kg)，优选地包括在25-90g/L之间，例如等于50g/L。根据具体实施方式，生长培养基含有50g/L的木糖。

所述培养基还包括可抑制所述戊糖发酵的有机酸。优选地涉及乙酸或甲酸，更优选地是乙酸。

应当注意，已知只有非解离或非电离形式的这种酸具有抑制能力。在本发明的上下文中，羧酸的“未电离或非解离形式”理解为其质子化形式。实际上，这种有机酸的形式取决于它们所加入的培养基的pH。在pH大于酸的pKa时，酸将被发现主要为解离形式或COO^-离子。相反，在较低的pH下，主要形式为非解离的或未电离形式(COOH)。在本发明的其余部分中将说明，特别是关于数量或浓度，是否仅考虑存在有机酸的非离解形式，或者是否涉及添加到培养基中的乙酸，包括解离和非解离形式(取决于所述培养基的pH)。

优选地，生长培养基中非解离形式的有机酸(优选地为乙酸)的浓度包括在液体培养基中0.5-5g/L之间(相当于固体培养基中0.5-5g/kg)，优选地在1.3-2.6g/L之间。实际上，作为一个实例，该最终范围对应于加入到pH5的生长培养基中的乙酸浓度包括3-6g/L之间。

根据本发明，所述第一生长培养基在具有至少两种或甚至三种培养基的一个生长循环中实施，所述循环重复至少两次。以适合本发明的方式，在至少两个生长循环期间，增加非解离形式的有机酸的浓度。

换言之，在存在非解离形式的有机酸(优选地是乙酸)浓度增加的情况下，在关于本发明所定义的至少两种生长培养基中的连续培养重复两次。因此，在存在n个循环(n大于或等于2)的情况下，实施至少两个浓度，其中第一浓度低于第二浓度。

作为实例，在乙酸存在下进行8轮循环的培养，增加第一生长培养基中浓度的方案可以如下：

-第1轮循环：在pH5的培养基中加入的乙酸浓度为3g/L(或1.3g/L解离形式的乙酸)；

-第2轮循环：在pH5的培养基中加入的乙酸浓度为3g/L(或1.3g/L非解离形式的乙酸)；

-第3轮循环：在pH5的培养基中加入的乙酸浓度为3g/L(或1.3g/L非解离形式的乙酸)；

-第4轮循环：在pH5的培养基中加入的乙酸浓度为4g/L(或1.7g/L非解离形式的乙酸)；

-第5轮循环：在pH5的培养基中加入的乙酸浓度为4g/L(或1.7g/L非解离形式的乙酸)；

-第6轮循环：在pH5的培养基中加入的乙酸浓度为4g/L(或1.7g/L非解离形式的乙酸)；

-第7轮循环：在pH5的培养基中加入的乙酸浓度为5g/L(或2.15g/L非解离形式的乙酸)；

-第8轮循环：在pH5的培养基中加入的乙酸浓度为6g/L(或2.6g/L非解离形式的乙酸)；

除了这两种成分之外，该生长培养基优选地是完整的合成培养基，适合于酵母的生长，并且可以含有常规成分如盐、缓冲液、酵母提取物或酵母可以代谢的任何其它氮源、维生素等。本发明的上下文中，“合成培养基”理解为化学成分已知的培养基。

根据具体实施方式，除了作为唯一碳源的戊糖和有机酸以外，这种培养基可以包括：

-酵母提取物，优选地浓度为5g/L；

-磷酸氢二铵，优选地浓度为4.7g/L；

-柠檬酸，优选地浓度为11.4g/L；

-柠檬酸三钠，优选地浓度为13.5g/L；

-ZnSO₄，优选地浓度为21.2mg/L；

-MgSO₄ 7H₂O，优选地浓度为1g/L；

-硫胺素，优选地浓度为18.24mg/L；

-吡哆醇，优选地浓度为5.28mg/L；

-生物素，优选地浓度为1.76g/L；

-泛酸盐，优选地浓度为3.8mg/L；

-烟酸，优选地浓度为20mg/L；

-内消旋肌醇，优选地浓度为50mg/L；

-核黄素，优选地浓度为1mg/L；

-对氨基苯甲酸盐，优选地浓度为1.2mg/L；

-吐温80，优选地浓度为1g/L；

除了该生长培养基的特定组成之外，酵母菌株或菌株混合物的培养优选地在有利于酵母(特别是酵母属类型)生长及其发酵活性的标准条件下进行，特别是：

-酸性pH优选地包括在4-6之间，甚至4.5-5.5，甚至更优选地等于5；

-温度在28-37℃之间，甚至在30-35℃之间，优选地等于32℃；

-在温和搅拌下，例如等于100rpm；

-在减少氧气供应的条件下(在有限的O₂下)。在实践中，培养可以在使用盖子塞住的烧瓶中进行，从而减少培养基中O₂的供应，同时排出所产生的CO₂。

通常，当可水解的糖类碳源(此处为戊糖)已被完全消耗时，停止培养。在实践中，优选地，将培养物放置至少24小时，甚至几天，优选地为7天。

本发明的方法的第二步包括将在第一生长培养基中培养的酵母转接到第二生长培养基(优选地是液体的)中。其特征在于，与第一培养基不同，其存在不同的碳源，且不存在非解离形式的有机酸(优选地乙酸)。

在实践中，这种培养基有利于酵母的生长，并且允许提高适应现象以获得稳定的突变。因此，本发明的方法的该步骤被认为是去适应阶段。

该生长培养基的特征在于，其包含与所述第一培养基(具体地为戊糖，特别是木糖)不同的碳源作为唯一碳源。根据具体实施方式，第二培养基的碳源是可水解的糖类碳源，优选地是己糖，更优选葡萄糖。优选地，所述第二碳源(优选地为葡萄糖)的浓度在5-50g/L之间，优选地在5-20g/L之间，例如等于20g/L。

进一步优选地，其涉及丰富的合成生长培养基，包括例如：

-酵母提取物，优选地浓度为10g/L；

-蛋白胨，优选地浓度为10g/L；

因此，优选地，事实上丰富培养基允许所有酵母菌株繁殖，而没有与任何营养缺陷型有关的任何限制。

除了该第二种生长培养基的特定组成之外，酵母菌株或菌株混合物的培养优选地在有利于酵母生长的标准条件下进行，特别是：

-酸性且稳定的pH，优选地包括在4-6之间，例如等于5；

-温度在28-37℃之间，甚至在30-35℃之间，优选地等于30℃；

-在中等搅拌下，例如等于150rpm；

-在氧的存在下，特别是有氧生活。在实践中，培养可以在由多孔盖塞住的带挡板的烧瓶中进行，从而允许培养基中O²的供应，同时排出所产生的CO₂。

再次，当可水解的糖类碳源(优选地为葡萄糖)已被完全消耗时，停止培养。应该注意的是，在实践中，由于好氧生活，葡萄糖作为碳源且不存在乙酸，在第二培养基中的生长比第一培养基中的生长快。因此，优选地，培养在数小时，优选地24小时内完成。

根据本发明，酵母菌在上述条件下在两种生长培养基中连续培养，构成一个循环。

根据具体实施方式，本发明的方法中的一个循环还包括通过将酵母加入第三生长培养基(优选地是液体)，用于筛选能够进行呼吸作用的细胞，具体地具有功能性线粒体。在实践中，该步骤可以在每个循环中实施，或者至少在该方法中实施一次，用于克服“小细胞(petites)”的出现，其呼吸缺陷表型在工业酵母生产方法的背景下是不利的。

优选的是，该第三培养基是一种贫乏或基本培养基，其含有仅能够由保留功能性线粒体的细胞使用的碳作为唯一的碳源。在这种情况下，说到严格的呼吸性碳源，是指一种系统地涉及线粒体氧化且不产生乙醇的碳源。优选地是甘油或可能是乙醇。换言之，这样的培养基不含可发酵的糖。优选地，生长培养基的甘油浓度是当其用作唯一碳源时通常使用的，具体地包括在5-50g/L之间，优选地包括在10-50g/L之间，例如等于10g/L，以获得足够的生物量，用于接种下个循环的第一培养基。

根据定义，基本培养基除了碳源外还含有氮源、钾源、磷源、硫源、镁源、钙源、铁源、微量元素源和水源。

可用于制备所述第三培养基的培养基可包括：

-碱，如

酵母氮碱，优选地浓度为3.4g/L；

-和任选的硫酸铵，优选地浓度为5g/L。

除了该第三种生长培养基的特定组成之外，酵母菌株或菌株混合物的培养优选地在有利于酵母生长的标准条件下进行，特别是：

-酸性pH，优选地包括在4-6之间，甚至4.5-5.5，例如等于5；

-温度在28-37℃之间，甚至在30-35℃之间，优选地等于30℃；

-在中等搅拌下，例如等于150rpm；

-好氧生活。在实践中，培养可以在由多孔盖塞住的带挡板的烧瓶中进行，从而允许培养基中O₂的供应。

再次，当碳源(优选的是甘油)已被完全消耗时，停止培养。应注意，在实践中，由于氮的矿物来源，在该培养基的生长先天略快于第二培养基中的生长。因此，优选地，培养在数小时，优选地48小时内完成。

如已经提到的，根据本发明方法的特征在于，在上述两种或三种生长培养基中酵母菌株的培养，以循环的形式连续重复进行。

选择循环次数以增强具有所需特征(具体地是在有机酸抑制剂存在下提高的发酵戊糖能力)的菌株的筛选，同时也限制循环次数以避免在酵母中出现不良情况。

因此，优选地，循环次数至少等于2且优选地小于或等于10，例如等于8。换句话说，所定义的在至少两种生长培养基中的连续培养重复至少两次，优选地重复2次以上，但少于10次，例如8次。

根据本发明的方法的优选实施方式，在至少两种生长培养基中的连续培养，在浓度增加的非解离形式的有机酸(优选地为乙酸)的存在下，重复至少两次。换句话说，本发明的方法是在存在至少两个不同浓度的情况下进行的，其中第一浓度小于第二浓度。该浓度可以逐渐增加，可能通过阈值增加。因此，优选地，为了酵母菌株的适应，至少前两个循环以恒定浓度进行。

根据另一个优选的方面，第一生长培养基中非解离形式的有机酸(优选地为乙酸)的浓度包括在1.3-2.6g/L之间。

当达到所需的循环次数，并且为了获得分化的克隆，优选地将培养物分布在固体培养基上，更优选地在有利于酵母生长的合成培养基如YPG培养基上。接种水平通常为每个板2000个细胞，生长在30℃下进行约72小时。

在具体实施方式中，检测以这种方式分离的克隆的性能。

为此，可以准备在液体培养基，优选地在适合酵母生长的合成培养基(如YPG培养基)中预培养。

优选地，这些预培养允许接种选择培养基，特别是等同于上述第一生长培养基的培养基，其包含作为唯一碳源的所述戊糖(优选地为木糖)，所述非解离形式的有机酸(优选地为乙酸)。优选地，对于pH5的培养基，选择平均乙酸浓度，例如等于5g/L。

优选地，所选择的克隆是在该培养基中具有最佳生长的克隆。可以通过使用分光光度计在600-700nm之间的波长(例如等于630nm)下测量光密度，分析浊度来确定生长水平。在实践中，可以在下述条件下在深孔(DeepWell)型微量培养板或液体培养基中评估生长，特别是：

-酸性pH，优选地包括在4-6之间，甚至4.5-5.5，甚至更优选地等于5；

-温度在28-37℃之间，甚至在30-35℃之间，优选地等于32℃；

-在温和搅拌下，例如等于100rpm，或者不搅拌；

-在减少氧气供应的条件下(在有限的O₂下或厌氧生活)。

-生长时间至少为24小时，例如72小时。

因此，接种量必须适中，以防止酵母的“滴定(titrating)”效应，例如等于0.25g/kg相当的DM(DM＝干物质)。

因此，重要的第一标准是在非解离形式的有机酸型抑制剂(特别是乙酸)的存在下，一种或多种筛选的酵母菌株，在含有戊糖(特别是木糖)的培养基中生长的能力。

根据另一个实施方式，筛选方法可以包括用于评估质量损失的步骤，在筛选培养基中在上述条件下，根据发酵时间评估质量损失。测量的发酵烧瓶中的质量损失与酒精的产生相关。跟踪该质量损失，因此反映了在非解离形式的有机酸型抑制剂(特别是乙酸)的存在下，戊糖(优选地是木糖)发酵的动力学。

在这些条件下，在仅有戊糖作为碳源(无葡萄糖)的情况下，预期的分布是单相，当糖处于非限制浓度时(在培养开始时)具有相关的ax+b型动力学。在筛选优选的菌株的情况下，特别是其戊糖(尤其是木糖)发酵速率，数值a(正数)应尽可能高。

此外，寻求能耐受木糖培养基中的乙酸，并且能够在包括高乙酸浓度下进行的酵母菌株。因此，可以在如前所述但含有不同浓度乙酸的培养基中，在木糖发酵期间，测量来自发酵培养基的最大CO₂产生速率。

对于给定的乙酸浓度，优选地，所选的菌株具有最大的木糖消耗速度，等于发酵质量损失的两倍，大于已经分离的菌株，并且无论乙酸浓度如何(包括不存在乙酸)，优选地在实际培养基的浓度范围内(例如4-8g/kg)均可进行。

此外，根据优选的实施方式，证实所选菌株在非解离形式有机酸(优选地为乙酸)存在下发酵葡萄糖(己糖)和木糖(戊糖)的能力不受影响。因此，通常在接近实际培养基的含有己糖和戊糖的培养基中分析发酵特性。

实际上，在含有葡萄糖、木糖和乙酸的YFP型丰富培养基上进行发酵，例如培养基包含：

-酵母提取物，优选地浓度为10g/L；

-细菌蛋白胨(Bacto-peptone)，优选地浓度为10g/L；

-葡萄糖，优选地浓度为55g/L；

-木糖，优选地浓度为45g/L；

-乙酸，优选地加入到培养基中的浓度为5g/L；

-KOH。

培养条件是适合酵母生长和发酵的条件，优选地：

-酸性pH，优选地包括在4-6之间，甚至更优选地等于5；

-温度在28-37℃之间，甚至在30-35℃之间，优选地等于32℃；

-在温和搅拌下，例如等于100rpm；

-在减少氧气供应的条件下(在有限的O₂下或厌氧生活)。

-生长时间至少为24小时，例如72小时。

因此，接种量必须适中，以防止酵母的“滴定”效应，例如等于0.25g/kg相当的DM(DM＝干物质)。

预期曲线显示乙酸对能发酵木糖和葡萄糖的酵母菌的双重影响：

-在第一阶段，称为“葡萄糖相”，发酵的延迟启动尽可能短，优选地在24小时内，更优选为5至6小时。因此，优选地，所选菌株在葡萄糖发酵期间不会失去对乙酸的耐受。

-在木糖发酵过程中，动力学尽可能优选，指尽可能快和高，具有比现有技术的菌株更好的性能。

根据优选的实施方式，在具有与目标应用相关的引人注目的特性的酵母菌株上实施本发明的方法：

-在合成和天然培养基生长良好；

-发酵葡萄糖的能力，包括优选地在非解离形式的有机酸(特别是乙酸)的存在下发酵；

-发酵木糖的能力，包括优选地在非解离形式的有机酸(特别是乙酸)的存在下发酵；

并且优选地，通过乙酸降低葡萄糖发酵途径的抑制作用。

这样的菌株例如选自以下组：

-2011年10月5日保藏于CNCM的菌株，编号为I-4538；

-2013年5月16日保藏于CNCM的菌株，编号为I-4749；

-2013年12月12日保藏于CNCM的菌株，编号为I-4829；

-2015年4月9日保藏于CNCM的菌株，编号为I-4966。

优选的菌株是2013年12月12日保藏于CNCM的菌株，编号为I-4829和/或2015年4月9日保藏于CNCM的菌株，编号为I-4966。

优选地，本发明的方法最终选择的菌株保留了用于实施所述方法的菌株中感兴趣的特征。

根据另一方面，本发明涉及使用上述方法获得的酵母菌株。

值得注意的是，这种菌株在乙酸存在下仍然具有无与伦比的发酵木糖的能力。

在以下条件下优选地检测该能力：

在液体培养基，优选地是有利于酵母生长的合成培养基(例如YPG培养基)中，并且在与上述方法中使用的第二培养基相关的所述条件下,进行菌株的预培养。

在30℃培养24至72小时后，将菌株转接到生长培养基，如本发明方法的第一种生长培养基中。这样的培养基优选地定义如下：

-酵母提取物，优选地浓度为5g/L；

-磷酸二氢铵，优选地浓度为4.7g/L；

-柠檬酸，优选地浓度为11.4g/L；

-柠檬酸三钠，优选地浓度为13.5g/L；

-ZnSO₄，优选地浓度为21.2mg/L；

-MgSO₄ 7H₂O，优选地浓度为1g/L；

-硫胺素，优选地浓度为18.24mg/L；

-吡哆醇，优选地浓度为5.28mg/L；

-生物素，优选地浓度为1.76g/L；

-泛酸盐，优选地浓度为3.8mg/L；

-烟酸，优选地浓度为20mg/L；

-内消旋肌醇，优选地浓度为50mg/L；

-核黄素，优选地浓度为1mg/L；

-对氨基苯甲酸盐，优选地浓度为1.2mg/L；

-吐温80，优选地浓度为1g/L；

其额外含有浓度优选地等于50g/L的木糖作为唯一的碳源，以及不同浓度的乙酸，范围优选为0-10g/L，以便能够建立剂量-反应曲线。此处涉及在pH5下向培养基中加入的乙酸的量的值。

接种和培养的条件优选地如下：

-酸性pH，优选地包括在4-6之间，甚至4.5-5.5，甚至更优选地等于5；

-温度在28-37℃之间，甚至在30-35℃之间，优选地等于32℃；

-在温和搅拌下，例如等于100rpm；

-在减少氧气供应的条件下(在有限的O₂下或厌氧生活)；

-生长时间至少为24小时，优选地72小时；

-接种量优选地等于0.25g/kg相当的DM(DM＝干物质)；

在培养结束时，测定每个乙酸浓度的最大CO₂产生速率。

在这些条件下，首次报道了现有技术的菌株从未获得的具有以下特性的酵母菌株的筛选：在液体培养基中，减少木糖消耗动力学50％所需的乙酸剂量大于2.5g/L(在固体培养基中，2.5g/kg)，甚至是3g/L，甚至大于或等于3.5g/L，优选的大于4g/L，或甚至大于或等于5g/L。这里涉及在pH5下向培养基中加入的乙酸的量的值。

在实践中，导致实际培养基中(通常含有2-8g/kg乙酸)较快的木糖发酵动力学。因此，在本发明的菌株的存在下，可以设想在72小时内(优选地在48-72小时)实现存在的糖的完全发酵。

根据具体实施方式，本发明目标的酵母菌株包含至少一个编码木糖异构酶(优选地来源于植物发酵梭菌，Clostridium phytofermentans)的外源基因的拷贝。关于本发明，“外源”理解为是指该基因事实上来自另一生物体。

根据另一个具体实施方式，本发明目标的酵母菌株包含至少一个编码己糖转运蛋白(能够捕获木糖)的GAL2基因的额外拷贝。根据另一个实施方式，所述菌株包含至少两个GAL2基因的额外拷贝。这可以置于pADH1型强组成型启动子的控制之下。

根据其他具体实施方式，本发明目标的酵母菌株具有选自下组的一个或多个特征：

-醛糖还原酶活性(GRE3)的抑制；

-木酮糖激酶(XKS1)的过量合成，特别是通过修饰启动子或引入额外拷贝；

-磷酸戊糖途径(RPE1、RKL1、TKL1、TAL1等)的表达或过量产生；

-木糖还原酶(XR)活性的缺失；

-发酵阿拉伯糖的能力，优选地是由于插入了细菌途径，如WO 2008/041840或欧洲专利1,499,708中所述。

根据一个优选的实施方式，本发明目标的酵母菌株属于半子囊菌纲(Hemiascomycetes group)。优选的菌株属于酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)和耶氏酵母属(Yarrowia)，优选地是酵母属。在酵母属中，优选地涉及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

如本申请的上下文所示，符合本发明的菌株是于2015年1月29日在CNCM(国家微生物保藏中心,巴斯德研究所，25rue du Docteur Roux，75724巴黎15区(Cedex15))保藏的菌株，其编号为I-4953。

在本发明的上下文中，“酵母菌株”理解为是基因上严格相同的酵母菌群。这包括称为实验室菌株的菌株和称为工业菌株的菌株。

根据另一方面，本发明还靶向通过如上定义的菌株的培养获得的酵母。

在本发明的上下文中，“酵母”理解为通过实施酵母菌株的生产方法获得的商品。因此，可以从单一菌株获得具有不同性质的酵母，其中这些差异与实施的生产方法相关。

根据另一方面，本发明涉及如上所定义的菌株或酵母用于发酵原料(优选地含有木糖和/或葡萄糖)，和/或用于乙醇生产的用途。根据具体实施方式，该原料是木质纤维素原料。这种原料通常包含：

-戊糖，特别是D-木糖和L-阿拉伯糖；

-己糖，特别是D-甘露糖，D-半乳糖，L-鼠李糖和D-葡萄糖；

-糖醛酸。

根据具体方面，本发明涉及发酵产品或乙醇的制备方法，包括以下步骤：

-在含有木糖的原料或培养基中培养如上所定义的菌株或酵母；

-在厌氧或半厌氧条件下发酵；

-回收一种或多种发酵产物或乙醇。

根据所述方法的具体实施方式，所述原料或培养基也含有葡萄糖。

通过以下实施例和附图支持，更进一步地说明本发明。但其不对范围产生限制。

保藏信息

本申请使用的菌株EG25是由保藏人(乐斯福公司)于2015年1月29日在CNCM(国家微生物保藏中心,巴斯德研究所，25rue du Docteur Roux，75724巴黎15区(Cedex 15))保藏的菌株，其编号为I-4953。

附图说明：

图1显示了在含有50g/L木糖和5g/L乙酸的培养基(pH＝5)中，不同菌株根据发酵时间的质量损失(以g/kg表示)的过程。

图2显示了在含有50g/L木糖的培养基中，不同菌株发酵期间，乙酸浓度(在pH 5下以g/L表示)对质量损失率(从木糖产生CO₂)的影响。

图3显示了在含有55g/L葡萄糖、45g/L木糖和5g/L乙酸的培养基(在pH5)中，不同菌株根据发酵时间的质量损失(以g/kg表示)的过程。

实施例

I)材料和方法：

1)菌株：

酵母：酿酒酵母

菌株：I-4829或I-4966

2)培养基和培养条件：

2-a)定向进化：

培养基1：YFX50＝

-木糖50g/L；

-酵母提取物5g/L；

-磷酸氢二铵4.7g/L；

-柠檬酸11.4g/L；

柠檬酸三钠13.5g/L；

-ZnSO₄ 21.2mg/L；

-MgSO₄ 7H₂O 1g/L；

-硫胺素18.24mg/L；

-吡哆醇5.28mg/L；

-生物素1.76g/L；

-泛酸盐3.8mg/L；

-烟酸20mg/L；

-肌醇50mg/L；

-核黄素1mg/L；

-对氨基苯甲酸酯1.2mg/L；

-吐温80，1g/L；

在此培养基中培养酵母，其中木糖作为唯一的碳源，并且乙酸的浓度随循环增加而增加(见结果部分)。

培养基的pH值保持在5。

在32℃下在100rpm搅拌下在烧瓶中进行培养，其中烧瓶用盖子塞住，用于减少培养基中的氧气供应并允许在培养中产生的过量压力的CO₂逸出。在此条件下，培养持续约七天。

培养基2(YPG)：

-10g/L酵母提取物；

-10g/L蛋白胨；

-20g/L葡萄糖，作为唯一的碳源。

在30℃下在150rpm搅拌下在带挡板的烧瓶中进行培养，其中烧瓶由多孔盖塞住，允许提供氧气进入培养基。在此条件下，培养持续约24小时。

培养基3：

-3.4g/L

酵母氮源；

-5g/L硫酸铵；

-10g/L甘油，作为唯一的碳源。

在30℃下在150rpm搅拌下在带挡板的烧瓶中进行培养，其中烧瓶由多孔盖塞住，允许提供氧气进入培养基。在此条件下，培养持续约24-48小时。

2-b)最有效菌株的筛选：

在第八个循环结束时，将细胞以每个含琼脂培养基(YPG+琼脂)的培养皿(150mm直径)2000个细胞的浓度分布。

然后将所得菌落在深孔形式(＝96孔微量培养板)的YPG培养基中培养。

在30℃培养72小时后，将菌落转接到YFX50-Ac-5000培养基中，其组成如下所示：

实际上，它包括本发明的方法中使用的第一生长培养基相同的培养基，其乙酸浓度(加入到pH 5的培养基中的量)等于5g/L。

同样，培养条件相似：

条件：

pH：5

温度：32℃

O₂条件:不供入氧气(厌氧)

搅拌：100rpm

培养时长：72小时

预培养/孵育：

-从深孔(96孔微板)中取出用于液体培养的菌落；

-0.25g/kg相当的DM液体培养。

2-c)分离菌株的验证

培养基：YFP-5000

-10g/L酵母提取物；

-10g/L细菌蛋白胨；

-55g/L葡萄糖；

-45g/L木糖；

-5g/L乙酸(加入到pH 5的培养基中的量)；

-KOH。

条件：

pH：5

温度：32℃

O₂条件:不供入氧气

搅拌：100rpm

培养时长：直至72小时

预培养/孵育：将0.25g/kg eq DM的酵母预先在YPG培养基中繁殖。

3)质量损失的评估：

通过测量发酵烧瓶的质量损失间接测量乙醇的产生，因为这种质量损失与酒精生产直接相关。以克/千克培养基表示。

4)二氧化碳生产速率的评估：

从确定质量损失(相当于二氧化碳产量)开始，可以确定木糖消耗率(以g/L表示)是质量损失的两倍。

最大二氧化碳生产速率以g.kg^-1.h^-1.g^-1的DM(干物质)表示。

II)结果：

1)目的菌株的筛选：

1-a)定向进化：

定向进化在单批次重复模式下进行：

-循环1-3：含3g/L乙酸(加入到pH 5的培养基中)的培养基1，然后培养基2，然后培养基3；

-循环4-6：含4g/L乙酸的培养基1，然后培养基2，然后培养基3；

-循环7：含5g/L乙酸的培养基1，然后培养基2，然后培养基3；

-循环8：含6g/L乙酸的培养基1，然后培养基2，然后培养基3；

1-b)最有效菌株的筛选：

在固体培养基上分离克隆并将其在液体培养基中预培养后，将它们接种在含有YFX50-Ac-5000培养基(50g/kL木糖和5g/L乙酸，pH＝5)的深孔型微量培养板中。

在该培养基中发酵72小时后，通过分析培养基的细胞密度，所选的菌株(总共16株)是具有最佳生长的菌株。菌株CNCM I-4071和CNCM I-4829分别作为细胞利用木糖进行生长的能力的阴性和阳性对照。

在同一培养基上对这16种菌株进行动力学评估。结果如图1所示，显示了根据发酵时间的质量损失。如预期的那样，由于该培养基仅含有木糖(无葡萄糖)，所有检测菌株的观察曲线均为单相。另一方面，曲线开始阶段的导数似乎取决于菌株。这可以使用等式ax+b来表示，其中a根据菌株变化而变化。

图1显示菌株E9表现出最佳性能。该菌株于2015年1月29日在巴斯德研究所(国家微生物保藏中心，25rue du Docteur Roux，75724巴黎15区(Cedex 15))保藏，其编号为I-4953，并在余下的实验中使用。

2)菌株I-4953的性质：

2-1)在木糖培养基中:

第一步包括测定定向进化对木糖发酵过程中该菌株耐受乙酸的能力的影响。为此，所述检测包括测定在YFX50-Ac培养基上木糖发酵期间的最大CO₂生产速率。为了获得剂量-反应曲线，向发酵培养基中加入不同浓度的乙酸。

图2显示，该菌株具有最大木糖消耗速率(等于发酵过程中质量损失的两倍)，不存在乙酸时，比菌株I-4829的速率增加大约15％。当乙酸剂量为4g/L时，该差距更大。事实上，在该浓度下，对于菌株I-4829，木糖消耗率降低了85％，而对于菌株I-4953仅为15％。这表明在4g/L乙酸的存在下且pH5时，菌株I-4953具有与没有乙酸时菌株I-4829相同的木糖消耗速率。

2-2)在葡萄糖+木糖培养基中:

为了更好地理解定向进化对发酵的影响，监测在含有葡萄糖、木糖和乙酸的培养基中根据发酵时间的质量损失。

结果如图3所示，清楚地显示了乙酸对能够发酵木糖的酵母菌的双重影响：

-在第一阶段，称为“葡萄糖相”，菌株I-4538显示约24小时的发酵起始延迟。对于其他菌株(I-4749、I-4829和I-4953)，延迟仅为5至6小时。这种观察结果意味着分离的菌株在葡萄糖发酵过程中没有失去对乙酸的耐受性。

-当木糖发酵获得延迟时，菌株I-4538、I-4749和I-4829的动力学是相当的。相比之下，对于菌株I-4953，值得注意的是，CO₂产生(因此乙醇生产)比其他3株菌株观察到的更快、更多。

这些结果证实，获得了在木糖发酵过程中更耐受乙酸的菌株，因此它在全局上更有效。

III)结论：

因此，利用所述的方法，可以筛选至少一种稳定菌株I-4953，其保持在有限的起始延迟下发酵葡萄糖的能力，同时显示了在乙酸存在下提高的木糖发酵动力学。

Claims (16)

1.一种筛选酵母菌株的方法，所述酵母菌株在非解离形式的乙酸存在下具有提高的发酵木糖的能力，

其中，至少一株能够发酵木糖的酵母菌株在以下两种培养基中连续培养：

-第一生长培养基，包含作为唯一碳源的木糖和所述非解离形式的乙酸；

-第二生长培养基，包含作为唯一碳源的葡萄糖，不含所述非解离形式的乙酸；

在浓度升高的非解离形式的乙酸的存在下，至少在所述两种生长培养基中连续培养，重复至少两次。

2.根据权利要求1所述的筛选酵母菌株的方法，其特征在于，所述的酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。

3.根据权利要求1所述的筛选酵母菌株的方法，其特征在于，在两种所述第一生长培养基中培养之后，在含有严格呼吸性碳源的基本培养基中进行好氧培养。

4.根据权利要求1所述的筛选酵母菌株的方法，其特征在于，在两种所述第一生长培养基中培养之后，在含有甘油作为唯一碳源的基本培养基中进行好氧培养。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的筛选酵母菌株的方法，其特征在于，在两种或三种生长培养基中菌株的连续培养重复两次以上，但是少于10次。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的筛选酵母菌株的方法，其特征在于，在两种或三种生长培养基中菌株的连续培养重复两次以上，但是少于8次。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的筛选酵母菌株的方法，其特征在于，第一生长培养基中非解离形式的乙酸的浓度包括在1.3-2.6g/L之间。

8.根据前述权利要求1-4中任一项所述的筛选酵母菌株的方法，其特征在于，具有代谢木糖能力的酵母菌株选自下组：CNCM I-4538、CNCM I-4749、CNCM I-4829和CNCM I-4966。

9.根据前述权利要求5所述的筛选酵母菌株的方法，其特征在于，具有代谢木糖能力的酵母菌株选自下组：CNCM I-4538、CNCM I-4749、CNCM I-4829和CNCM I-4966。

10.根据前述权利要求7所述的筛选酵母菌株的方法，其特征在于，具有代谢木糖能力的酵母菌株选自下组：CNCM I-4538、CNCM I-4749、CNCM I-4829和CNCM I-4966。

11.根据前述权利要求8所述的筛选酵母菌株的方法，其特征在于，具有代谢木糖能力的酵母菌株选自下组：CNCM I-4829和/或CNCM I-4966。

12.一种酿酒(Saccharomyces cerevisiae)酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株于2015年1月29日在CNCM(国家微生物保藏中心,巴斯德研究所，25rue du Docteur Roux，75724巴黎15区)保藏，其编号为I-4953。

13.权利要求12所述的菌株的用途，用于发酵原料，和/或用于生产乙醇。

14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述发酵原料含有木糖。

15.一种发酵产物或乙醇的制备方法，包括以下步骤：

-在含有木糖的原料或培养基中培养权利要求12所述的菌株；

-在厌氧或半厌氧条件下发酵；

-一种或多种发酵产物或乙醇的回收。

16.根据权利要求15所述的发酵产物或乙醇的制备方法，其特征在于，所述的原料或培养基还含有葡萄糖。

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