发明内容
本发明的目的在于针对木质纤维素乙醇生产中的乙酸抑制问题,培育一株具有乙酸高耐受性的乙醇生产酿酒酵母菌株。
本发明的另一目的在于提供一种筛选上述菌株的方法。
为实现上述目的,本发明提供的乙酸耐性乙醇生产酿酒酵母菌株,该菌株分类学命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)E5.9,保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物保藏中心(CGMCC),保藏号为CGMCCNo.3618。
本发明提供的筛选上述乙酸耐性乙醇生产酿酒酵母菌株的方法,为液体全筛选法,主要步骤如下:
1)菌株诱变:对酿酒酵母出发菌株进行物理、化学或生物诱变;
2)液体全筛选:将所有诱变菌株平均转接于24孔板中,首先无选择压力预培养,然后添加选择压力继续培养至多个孔出现正突变体;
3)固体平板筛选:稀释正突变培养物,涂布固体选择培养基,挑选优势抗性克隆;
4)传代驯化:将优势抗性克隆在选择性液体培养基中传代驯化,筛选遗传稳定的抗逆菌株。
所述的筛选方法中,菌株诱变是采用紫外诱变、EMS诱变或微波诱变。
所述的筛选方法中,菌株诱变的诱变细胞数为2×106-5×108个。
所述的筛选方法中,24孔板为1-100个,每孔的选择培养基量为0.5-2.5ml。
所述的筛选方法中,传代驯化接种量由大到小,第一次驯化接种量为20-10%,逐次递减至接种量小于1%。
本发明的效果是:
(1)本发明所提供菌株的乙酸耐受性高,在含166mM乙酸的YPD培养基中生长与无乙酸压力对照菌同时达到稳定期;本发明所提供的菌株在133mM乙酸压力下发酵20%葡萄糖,产生76g/L乙醇。
(2)本发明液体筛选步骤对所有诱变菌株做了筛选,而传统的固体筛法通常只对部分突变体进行选择;液体全筛选法实现全筛选的过程简单,以2×108个诱变细胞为例,应用液体全筛选法将所有细胞平均分到1-100个24孔板中,可以实现全筛选,而传统固体筛选法要对所有细胞进行筛选,按照每个固体平板涂布500个细胞算,需要涂布4×105个固体平板,工作量巨大。
本发明培育能够发酵不脱毒水解液的抗逆性酿酒酵母菌株,能够有效降低木质纤维素乙醇生产成本。本发明通过诱变筛选,获得了能够耐受乙酸的酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae E5.9,为近一步发展具有综合抗逆能力、能够有效发酵不脱毒木质纤维素水解液的生产菌株提供了基础。
具体实施方式
本发明所提供的酿酒酵母菌株为Saccharomyces cerevisiae E5.9,已保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物保藏中心(CGMCC),保藏日期:2010年1月19日;保藏号:CGMCC No.3618。
本发明所提供的菌株是通过以下措施获得的:
分析96株不同来源酿酒酵母菌株的压力耐受能力,从中选择综合抗逆性强的菌株XL14-1作为出发菌株;应用紫外诱变、EMS诱变和微波诱变三种方法诱变出发菌株XL14-1;应用实施例2所述液体全筛选法筛选乙酸耐性菌株,即将全部诱变菌液平均转接于24孔板,预培养,然后加入选择压力,继续培养至多个孔出现抗性正突变;将正突变培养物涂布于固体选择培养基,待菌落长出,挑取大菌落转接于更高选择压力培养基中;传代驯化。
本发明所提供的菌株具有如下特征:
(1)形态学特征:细胞呈椭圆形、卵形或圆形;大小在1.0-8.0μm×2.0-12μm之间;菌落颜色为乳白色到微黄色,边缘平滑,有隆起;液体静止培养,菌体沉于底部;在醋酸钠产孢培养基上能产生子囊,子囊内形成2-4个圆形子囊孢子。
(2)抗逆性特征:E5.9在无乙酸和低于166mM乙酸压力下,培养36小时同时达到稳定期,在200mM乙酸压力下出现12h的生长延迟。
(3)产乙醇能力:E5.9在133mM乙酸压力下发酵20%葡萄糖,产生76g/L乙醇。
本发明所提供的抗逆筛选方法步骤如下:
1)菌株诱变:对酿酒酵母出发菌株进行紫外、EMS或微波诱变。
2)液体全筛选:将所有诱变菌株平均转接于1-100个24孔板,无选择压力预培养1-8小时(h),添加选择压力继续培养至24孔板中多个孔出现抗性正突变。
3)固体平板筛选:稀释正突变培养物,涂布固体选择培养基,挑选优势克隆于选择性斜面培养基上培养。
4)传代驯化:将斜面上的抗性菌株在选择性液体培养基中传代驯化,筛选遗传稳定的抗逆性菌株。
以下通过实施例对本发明做进一步的阐述,但不应理解为对本发明的限制,在不背离发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换都属于本发明的范围。
实施例1:乙酸耐性酿酒酵母E5.9的筛选
1)出发菌株
通过分析96株不同来源酿酒酵母菌株的压力耐受性,从中选择综合抗逆性强的菌株XL14-1作为出发菌株。菌株鉴定采用表型和核糖体基因26S rDNA D1/D2区和ITS区序列分析方法。
2)秸秆预处理发酵液
秸秆汽爆预处理固体物由中粮生化能源(肇东)有限公司提供,经反复提取,获得水解液。在15%提取水解液中添加葡萄糖15%、酵母提取物0.6%、蛋白胨1%、(NH4)2SO4 0.2%、KH2PO4 0.1%、MgSO4.7H2O 0.15%、CaCl20.055%做成预处理发酵液,葡萄糖终浓度为20.5%。
3)诱变
本发明采用的紫外诱变、EMS诱变和微波诱变三种诱变方法均按照常规方法进行。
4)生长曲线测定
生长曲线测定采用YPD培养基(酵母提取物1%,蛋白胨2%,葡萄糖2%),添加乙酸至终浓度分别为0mM、50mM、83mM、133mM、166mM和200mM。
5)发酵产乙醇测试
种子培养基:酵母提取物0.6%,蛋白胨1%,(NH4)2SO4 0.2%,KH2PO40.1%,MgSO4.7H2O 0.15%,CaCl2 0.055%,乙酸130mM,葡萄糖10%。
发酵培养基:酵母提取物0.6%,蛋白胨1%,(NH4)2SO4 0.2%,KH2PO40.1%,MgSO4.7H2O 0.15%,CaCl2 0.055%,乙酸130mM,葡萄糖20%。
6)分析方法
使用生物传感分析仪SBA-40D(济南)测定乙醇和葡萄糖浓度。
7)结果和讨论
7-1)菌株鉴定结果
菌株XL14-1的核糖体基因26S rDNA D1/D2区序列与酿酒酵母模式菌株序列相似性为100%,ITS区序列相似性为99%,结合表型鉴定,该菌株确定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。诱变菌株E5.9在这两个DNA区域无碱基变异,序列与出发菌株XL14-1完全相同(图1)。
7-2)紫外诱变结果
培养XL14-1至指数生长期,收集5×107-2×108个细胞,按照常规紫外诱变方法诱变,然后按照实施例2所述液体全筛选方法进行筛选,获得一系列能耐受130mM乙酸的菌株,最终选择乙酸耐受性和遗传稳定性最好的菌株C4为下一步诱变的出发菌株。
7-3)EMS诱变和发酵测试
以C4为出发菌株,进行EMS诱变。培养菌体至指数生长期,收集5×107-2×108个细胞,按照常规EMS诱变方法诱变,然后按照实施例2所述液体全筛选方法进行筛选,获得一系列在200mM乙酸压力下能生长的菌株。从中选择遗传稳定性好的菌株E5、E6、E9、E11、E13、E14和E15在133mM乙酸压力下进行发酵产乙醇测试。如图2所示,E5在133mM乙酸压力下发酵产乙醇量最高,达75g/L,该菌株为下一步诱变的出发菌株。
7-4)微波诱变和发酵测试
以E5为出发菌株,进行微波诱变。培养菌体至指数生长期,收集5×107-2×108个细胞,按照常规微波诱变方法诱变,然后按照实施例2所述液体全筛选方法进行筛选驯化,获得一系列在260mM乙酸压力下能生长的菌株。从中选择9个突变体进行133mM乙酸压力下发酵测试,如图3所示E5.9乙醇产率最高,达76g/L。
7-5)E5.9在乙酸压力下的生长测试
将E5.9在含130mM乙酸的YPD培养基中过夜培养,以初始OD600=0.05为接种量,测定其在不同浓度乙酸压力下的生长曲线。如图4所示,E5.9在无乙酸和低于166mM乙酸压力下,同时在36h达到稳定期,在200mM乙酸压力下出现12h的生长延迟,而对照出发菌株在133mM乙酸下被完全抑制。
7-6)秸秆预处理发酵液的发酵
E5.9在种子发酵培养基中培养24-48h,以2g/L酵母培养物的接种量接种秸秆预处理发酵液,至发酵结束乙醇浓度为6%,糖醇转化率为57%,而对照出发菌株无法在预处理发酵液中生长。
实施例2:抗逆筛选方法—液体全筛选法
1、液体全筛选法流程
本方法包括四个步骤:(1)菌株诱变,(2)液体全筛选,(3)固体平板筛选,(4)传代驯化,其中液体全筛选是该方法的核心,参见图5。首先,应用紫外、EMS、微波或者其他诱变方法诱变酿酒酵母细胞,获得突变菌株库;其次,将诱变处理后的全部菌体细胞平均转接到24孔板中,120rpm,30℃预培养6h,然后在预培养菌液中加入选择压力,继续培养,至出现抗性正突变;再次,将正突变菌液稀释涂布相同浓度的固体选择培养基,待菌落长出,挑取大菌落在相同压力液体培养基中培养,培养物作为驯化出发菌株;最后,将驯化出发菌株多次在液体压力培养基中培养,以10%的接种量转接更高压力的培养基,进行菌株驯化,逐渐减小接种量,传代驯化。
2、抗逆菌株筛选实例
以酿酒酵母XL14-1作为研究对象。压力分别设置为:乙酸130mM,乙醇12%(v/v),温度(42℃),渗透压(2M KCl),H2O26mM,糠醛15mM,遗传霉素(G418)400μg/ml,20%玉米秸秆汽爆浸提液。
2-1)耐乙酸压力筛选
如图4,应用紫外、EMS和微波诱变菌株,经三次液体全筛选,最终获得的乙酸耐受性酿酒酵母E5.9能够在含166mM乙酸的YPD培养基中生长,与无乙酸条件同时达到稳定期,而对照出发菌株不能在133mM乙酸压力下生长。如图3,E5.9在含130mM乙酸的发酵培养基中产乙醇量达7.6%。
2-2)耐乙醇压力筛选
应用紫外诱变方法处理1×108-2×108个细胞,应用液体全筛选法,将所有细胞平均转接5个24孔板,预培养后施加12%(v/v)的乙醇压力,120个孔中有21个孔出现乙醇抗性正突变体,从中选择6个生长密度大的培养物稀释涂乙醇压力选择平板,分离单菌落。最终获得的突变菌株能够耐受12%(v/v)的乙醇,延迟期为12h,而出发菌株无法生长。
2-3)耐高温压力筛选
应用紫外诱变方法处理5×107-2×108个细胞,应用液体全筛选法,将所有细胞平均转接5个24孔板,30℃预培养后,转到42℃继续培养,有14个孔出现耐高温正突变体,从中选择7个菌体密度大的培养物稀释涂平板,42℃培养,分离单菌落。最终获得的突变菌株能够在42℃生长,延迟期为6h,细胞终浓度可达7.5×108个/ml,而出发菌株无法生长。
2-4)耐氧压筛选
应用紫外诱变方法处理5×107-2×108个细胞,应用液体全筛选法,将所有细胞平均转接5个24孔板,预培养后施加6mM H2O2压力,有9个孔出现乙醇抗性正突变体,将正突变培养物稀释涂氧压平板,分离单菌落。最终获得的突变菌株能够在6mM H2O2压力下生长,延迟期为8h,稳定期细胞浓度与无压力对照相近,而出发菌株无法生长。
2-5)耐渗透压筛选
应用紫外诱变方法处理5×107-2×108个细胞,应用液体全筛选法,将所有细胞平均转接5个24孔板,30℃预培养后,加入KCl至终浓度为2mol/L,继续培养,有33个孔出现耐渗透压正突变体,从中选择6个菌体密度大的培养物稀释涂渗透压选择平板,分离单菌落。最终获得的突变菌株能够在含2M KCl的YPD培养基中生长,延迟期为16h,细胞终浓度为4×108个/ml,而出发菌株无法生长。
2-6)耐糠醛筛选
应用紫外诱变方法处理5×107-2×108个细胞,应用液体全筛选法,将所有细胞平均转接5个24孔板,30℃预培养后,加入糠醛至终浓度为15mmol/L,继续培养,有28个孔出现耐糠醛正突变体,从中选择6个菌体密度大的培养物稀释涂糠醛选择平板,分离单菌落。最终获得的突变菌株能够在含15mM糠醛的YPD培养基中生长,延迟期为16h,而出发菌株无法生长。
2-7)耐遗传霉素筛选
应用紫外诱变方法处理5×107-2×108个细胞,应用液体全筛选法,将所有细胞平均转接5个24孔板,30℃预培养后,加入遗传霉素至终浓度为400μg/ml,继续培养,有5个孔出现耐遗传霉素正突变体,将正突变培养物稀释涂遗传霉素选择平板,分离单菌落。最终获得的突变菌株能够在含400μg/ml遗传霉素的YPD培养基中生长,延迟期为8h,稳定期细胞浓度与无压力对照相近,而出发菌株无法生长。
2-8)耐玉米秸秆汽爆水解物筛选
应用紫外诱变方法处理5×107-2×108个细胞,应用液体全筛选法,将所有细胞平均转接5个24孔板,30℃预培养后,离心,用PBS缓冲液洗涤细胞两次,加入含20%玉米秸秆汽爆浸提液的YPD培养基,继续培养,测定细胞浓度,稀释6个细胞浓度大的培养物,涂布浸提液压力平板,分离单菌落。最终获得的突变菌株能够在含20%玉米秸秆汽爆浸提液的YPD培养基中生长,稳定期细胞浓度为5×108个/ml,而出发菌株无法生长。