CN102918161B - 能够由至少一种戊糖生产乙醇的工业酵母 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于获得产乙醇的酵母菌株的方法的领域、涉及如此产生的菌株的和涉及由所述菌株工业生产乙醇的领域。特别地，本发明在其最一般的方面涉及从酿酒酵母工业菌株制备酵母的方法、涉及所述菌株和涉及其在由含至少一种戊糖的工业培养基工业生产乙醇的用途。

Description

能够由至少一种戊糖生产乙醇的工业酵母
发明领域
本发明涉及用于获得产乙醇酵母菌株的方法的领域，由此而产生的酵母以及通过所述酵母进行的乙醇工业生产的领域。更为特别地，本发明在其最一般的方面涉及由酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)“工业”菌株制备酵母的方法、涉及所述的酵母并且涉及其在由包含至少一种戊糖的工业培养基工业生产乙醇中的用途。
背景技术
本领域现有技术方法的共同点在于致力于使用已知的和/或构建的基因遗传性改善“实验室”菌株的方法，并且通常在培养基中和在标准化和最优的实验室条件下研究其产生乙醇的能力。
实际上，经本申请人分析的科技文献和专利文件最为普遍地教导了用于获得单倍体或二倍体菌株的方法，其对于应激(特别是高浓度的乙醇)和/或对于高温和/或对于发酵抑制剂有弱的耐受性。此外，这些方法多数需要这些菌株具有使用营养缺陷型标记和/或抗生素抗性标记的资源，这可防止这些菌株随后用于工业培养基中，这是由于明显的成本原因，或者甚至在一些情况下由于公共健康原因。
此前开发的这些菌株的生长特性通常不够充分，并且这些菌株从未面对工业规模的生物质生产的需求，即，仅举例来说以下三种：高生长速率、被干燥的能力、储存稳定性。
虽然使用这些现有技术菌株在合成的或限定性的“实验室”培养基中获得了“发酵”性能水平(厌氧条件下生产乙醇的能力)，但它们通常不能转换到包含例如由处理纤维素或木质纤维素材料的残余物(其包含可在不同水平上抑制所述酵母的细胞机制的毒性化合物，特别是糠醛、HMF、酚衍生物和乙酸)所产生的复杂混合物的工业培养基。此外，这些现有技术的乙醇生产过程进行放大的能力罕有记载。
本申请人因此注意到对于制备“工业”酵母的方法仍存在需求，所述方法将对酵母制备的制约及同时其应用中最终用户的约束加以考虑，特别是以低成本和高产量进行乙醇的工业生产的方法。
发明内容
本发明目的正是在于满足该双重需求。
因此，本发明的第一个主题是用于制备能够由包含至少一种戊糖的培养基生产乙醇的酿酒酵母工业酵母菌株的方法，并且其包括下列步骤：
(i)选择并且获得能够在同步糖化发酵(SSF)的条件下和35℃的温度下以谷物水解物产生高浓度乙醇的酿酒酵母“工业”酵母菌株，所述乙醇浓度至少为14.5％(v/v)，并且优选地至少为16％，
(ii)将至少一个表达盒或删除盒(deletioncassette)整合到步骤(i)的酵母基因组中，所述至少一个盒选自以下组成的组：
a.编码使用NADH；H+而非NADPH；H+作为优先辅因子的突变木糖还原酶的树干毕赤酵母(Pichiastipitis)XRm基因/酿酒酵母启动子和终止子的开放阅读框(ORF)型的结合，所述盒上游和下游侧邻有使其靶向整合到所述基因组中的重组区域(recombinogenicregion)，
b.编码木糖醇脱氢酶的树干毕赤酵母XDH基因/酿酒酵母启动子和终止子的开放阅读框(ORF)型的结合，所述盒上游和下游侧邻有使其靶向整合到所述基因组中重组区域，
c.编码木酮糖激酶的酿酒酵母XKS1基因/酿酒酵母启动子和终止子的开放阅读框(ORF)型的结合，所述盒上游和下游侧邻使其靶向整合到所述基因组中的重组区域，
(iii)通过将戊糖磷酸途径的非氧化部分中的各步骤的至少一种基因置于在乙醇发酵过程中强表达的糖酵解基因启动子的控制下而诱导其表达，以及
(iv)删除编码醛糖脱氢酶的酿酒酵母GRE3基因的开放阅读框(ORF)的至少两个拷贝。
本发明的方法特别地具有以下优点：
对于酵母制造商，其使得可能：
—构建原养型非整倍体/多倍体(aneu/polyploid)酿酒酵母酵母菌株以允许以廉价培养基(诸如糖工业的副产物，例如废蜜)中的简单碳源、氮源和磷源生产生物质，
—具有表现出0.37h-1至0.5h-1的最大生长速度(μmax)的酿酒酵母酵母菌株，
—具有当根据描述于参考书《YeastTechnology》(第2版，1991年，G.Reed和T.W.Nagodawithana，VanNostrandReinhold出版，ISBN0-442-31892-8)中的方法制备时，使得能够获得至少45g的酵母干物质每100g处理蔗糖当量的生物质产率的酿酒酵母酵母菌株，
—具有对描述于专利文件EP511108和US5741695中的干燥处理具有耐受性的酿酒酵母酵母菌株，其中干燥后的发酵活性损失不得超过30％，
—在工业条件下(特别是廉价培养基、优良生物质产量、即用型干酵母)由遗传上稳定的酿酒酵母酵母菌株制备新鲜酵母或干酵母，其由于特别耐受高浓度乙醇而是强健的，并且能够由例如半纤维素生物质以至少80g/L生产乙醇，这是在约30至40℃的高温下进行。
此外，对于乙醇生产商，本发明的方法的优点在于具有活性酵母(新鲜的—液体或压缩的—或干燥的)，其根据手册《YeastTechnology》中所描述的制备方法由前文段落所定义的酿酒酵母酵母菌株而获得，所述酵母：
—能够在描述于专利文件WO2004/046333中的SSF条件下在35℃下将谷物水解物发酵达到至少14.5％(v/v)的乙醇浓度，
—能够在描述于专利文件WO2004/046333中的SSF条件下在35℃下将谷物水解物发酵达到至少16％(v/v)的乙醇浓度。
因为本发明方法的结果获自原养型非整倍体/多倍体“工业”菌株(其因此具有远比“实验室”菌株更为复杂的遗传物质，这导致对所述工业菌株的修饰的结果至少可以说是无法预见的)，本发明方法的结果均更为引人注目。工业菌株特有的这种复杂的遗传背景使得获得最终无抗生素抗性标记的遗传修饰菌株非常困难，特别是当大量基因靶标需进行修饰时。出于健康和环境原因，无抗生素抗性标记的菌株明显是非常优选的。
本申请人已经表明，根据本发明的方法进行的遗传修饰在其应用于具有复杂基因遗传性并且具有生产高浓度乙醇的能力的工业菌株时并不诱导任何基因组不稳定性。
根据本发明的原养型菌株具有在简单碳源、氮源和磷源上生长的优势。
然而，这一特征意味着科学界可得的转化载体(使用营养缺陷型标记的载体)是无效的。
因此有必要获得使用抗生素抗性标记的可用工具/载体，这些所述工具/载体经有利地构建从而最终允许切除这些标记。根据本发明的酵母的构建需要例如使用4种不同的阳性标记(遗传霉素、腐草霉素、潮霉素和杀稻瘟菌素)。
根据本发明的菌株是非整倍体/多倍体：这是在源自自然环境的工业酵母中通常存在的特征。这些菌株的系统发生史导致了这一特性。
然而，当希望破坏/灭活给定基因的全部拷贝时，其遭遇额外的困难。但是，这一非整倍体-多倍体特征通常导致工业酵母的多种所关注的特性(生长速度、对各种应激的抗性、表型稳定性)。
此外，在长期研究后本发明人已经惊奇地注意到，通过使用已经经过选择的“工业”菌株实施的本发明的方法：
—表达盒和删除盒的引入在修饰的酵母中不诱导任何基因组不稳定性，所述修饰的酵母发生其遗传性的改善，
—对其XK活性的调控并非必需的。实际上现有技术中关于在实验室菌株(其因此得到更好的定义)中XKS1的过表达存在争议，这表明木酮糖激酶活性应受到精细地调控(Jin等，AEM2003，69，495-503对于Ho等，1999，AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology，第65卷，第163-192页)。
特别地，本发明人已经表明，使用所述的工业菌株，有可能完成：
—根据本发明在所述工业菌株中对酿酒酵母GRE3基因(所述Gre3p酶为消耗NADPH；H+的醛糖还原酶，NADPH；H+在较大程度上通过戊糖途径的氧化部分产生)的至少两个拷贝的删除，这使得相应地降低所述酶的NADPH；H+消耗成为可能，
—XKS1的天然过表达，即本发明方法的步骤c)可被省略，假定XKS1是内源的酿酒酵母基因。根据下文所述，当该方法包括后续的定向进化(directedevolution)步骤时，这种过表达特别地可在循环培养之后成为可能。
作为该第一主题的优选变型，步骤(ii)的盒a)、b)和c)全部被整合。
对于其构建体，本发明人首先检验了树干毕赤酵母的野生型XR基因的效果。在去除标记并进行定向进化步骤后，获得了菌株EG4和EG5，其在2010年11月23日以No.CNCMI-4397和I-4398保藏于CNCM[法国微生物保藏中心]。
然而，尽管所获得的EG4和EG5菌株比EG1和EG2菌株更快，但它们产生平均多50％的木糖醇。所述木糖醇导致了碳的分流，并且显著地降低了乙醇-糖转化率，考虑到所期望的工业应用，这是非常不利的。
本申请人随后将树干毕赤酵母的野生型XR基因替换为突变基因XRm，并且注意到XRm基因优选地是具有以下突变K270M的基因或是具有一种不同突变或不同突变之一如K270R(由Watanabe等，Microbiol.2007，153，3044-3054所描述)的突变XR基因，从而该突变导致所编码的酶使用NADH；H+作为优先的辅因子而不是NADPH；H+。
这两种木糖还原酶之间的差别在于一种在第270位携带甲硫氨酸(K270M)以替代赖氨酸残基，而另一种携带精氨酸(K270R)以替代赖氨酸残基。
本申请人已经注意到，K270R修饰降低了XR对于NADPH；H+的亲和性并且提高了其使用NADH；H+的能力。此外，该修饰诱导了木糖转向木糖醇转化的降低并且使得在发酵条件下改善木糖-乙醇转化率成为可能。
甚至更为优选地，在该变型中，突变XR基因(XRm)的克隆通过单拷贝克隆而完成。
在该变型中，还优选的是步骤(iii)的戊糖磷酸途径的非氧化部分中的各步骤的所述至少一种基因选自由RPE1、RKI1、TKL1和TAL1组成的组，并且所述在醇发酵过程中强表达的糖酵解基因的启动子对对RPE1、RKI1和TKL1选自TDH3启动子和对对TAL1选自PGK1启动子。
根据补充性或替代性特征，在根据本发明的用于制备酿酒酵母工业酵母菌株的方法中：
—步骤(ii)中的启动子选自由ADH1、ADH2、PGK1、TDH3、PDC2和GAL1/10组成的组，优选地是ADH1，并且所述终止子由CYC1的终止子或由所述修饰基因自身的终止子(例如，所述TAL1基因的TAL1终止子)构成；
—提供了后续的定向进化步骤，其包括以下顺序步骤：使所获得的酵母进行：
(i)诱变，
(ii)在限制O2条件下在包含所述至少一种戊糖的培养基中在循环培养中生长，以及
(iii)在包含甘油作为唯一碳源的固体培养基上通过有氧生长进行的选择，
从而获得了在包含所述至少一种戊糖的培养基存在的情况下表现出有氧生长的所述酵母的非呼吸缺陷型突变体。
在该变型中，优选地在温和条件下进行步骤(i)的诱变，温和诱变主要使用254nm下100至500J/cm2，并且更为优选地是300J/cm2的紫外照射。这些条件仅对经受紫外照射的群体导致10％的致死率。
因此，本发明人表明，令人惊讶的是以这样的低水平受控制的致死率，仍有可能将获得能够发酵所述至少一种戊糖的突变体所必需的通过循环培养进行定向进化步骤的持续时间降低10倍。通过在诱变之前和之后从包含营养培养基的琼脂盘上取出等体积的细胞悬液测定存活率。在生长48h后测定集落的数量。
优选地，在步骤(ii)中该变体的O2限制借助于所使用的设备中(例如，烧瓶或发酵罐)由于所产生的CO2而导致的超分压(partialoverpressure)实施。
在所述的至少一种戊糖发酵的条件下，该变体的循环培养使得有可能在4至8周的时间内，且优选地在6周内富集突变体中能够发酵所述戊糖的群体，所述时间与根据Kuyper等，(2004)4，655-664的描述通过恒化器获得的时间相比相对较短并且非常有利。
尽管所述“小”呼吸缺陷表型可能符合所述至少一种戊糖发酵的标准，但在该变型中，本发明人已经实施了去除所述“小”酵母的步骤，这是因为该表型与本发明情况中的生产工业酵母的方法不相容。
本发明的主题还在于通过本发明的方法在所述定向进化步骤前直接获得的酿酒酵母工业酵母菌株EG3，并且其为根据布达佩斯条约的条款在2010年4月14日以No.I-4295保藏于CNCM(巴斯德学院的法国微生物保藏中心)的酵母菌株。
本发明的主题还在于通过本发明的方法在所述定向进化步骤后直接获得的酿酒酵母工业酵母菌株EG2，并且其为根据布达佩斯条约的条款在2010年4月14日以No.I-4294保藏于CNCM(巴斯德学院的法国微生物保藏中心)的酵母菌株。
本发明的主题还在于通过本发明的方法在所述定向进化步骤后直接获得的酿酒酵母工业酵母菌株EG1，并且其为根据布达佩斯条约的条款在2010年4月14日以No.I-4293保藏于CNCM(巴斯德学院的法国微生物保藏中心)的EG2酵母菌株不能形成孢子的变异体。
不能形成孢子的菌株在环境保护方面具有优点，这是因为其消除了转基因通过与周边环境中的其它酵母进行接合而扩散的风险。当在非常大的规模下使用所述遗传修饰的微生物时，该特征具有高得多的重要性。
本发明的主题还在于通过本发明的方法在所述定向进化步骤后直接获得的酿酒酵母工业酵母菌株EG9，并且其为根据布达佩斯条约的条款在2011年3月1日以No.I-4450保藏于CNCM(巴斯德学院的法国微生物保藏中心)的酵母菌株。
更为优选地，
—所获得的酿酒酵母工业酵母菌株实质上或完全没有标记，特别是抗生素抗性标记。
依照本发明制备的酿酒酵母酵母菌株，根据上文定义的标准，在引入所述遗传修饰和在所述定向进化步骤过程中所产生的其它突变后，在完整的工业生产过程后保持其基因型和表型特征。特别地，所产生的酵母表现出醇生产动力学、木糖消耗动力学以及所产生醇的最大量，其严格地与在应用完整工业过程之前的酵母菌株一致。
此外，如前所述，在操作前选择的菌株的工业特征(生长速度、产量、被干燥的能力)保持不变。
本发明的主题还在于用于通过使用本发明的酵母进行发酵由包含至少一种戊糖的培养基生产乙醇的方法，所述酵母如上文所述或通过本发明的方法获得，如刚刚所描述的。
优选地，用于生产乙醇的方法具有下列的替代性和/或补充性的特征：
—其包含在己糖聚合物(主要由葡萄糖组成)和能够对其进行水解的至少一种酶存在的情况下进行的同步糖化发酵(SSF)步骤，
—所述至少一种戊糖是木糖，
—所述培养基选自由木质素水解物、纤维素水解物、半纤维素水解物和糊精水解物组成的组，
—所述己糖(主要为葡萄糖)的平均释放速率约为2.8至5.6g/L/h，细胞外己糖(主要为葡萄糖)浓度为零。
本发明人在真实SSF(同步糖化发酵)条件下实施了根据本发明的生产乙醇的方法，如在乙醇生产工业中(特别是在美国)实施的。
据本申请人所知，所使用的糖浓度(70g/kg的木糖和130g/kg的葡萄糖当量)是实际中可遇到的最高浓度。涉及木糖发酵的所有公开的测试方法均以低得多的总糖浓度进行。
附图简要说明
本发明的其它特征和优点将通过阅读下文的详细描述而更为清晰地展现，其包含具有结果列表的示例性实施方案，这些示例性实施方案仅以非限制性说明的方式给出，并且出于对其加以理解的目的而引用了附图，其中：
—图1示出了用于树干毕赤酵母XDH过表达的载体，
—图2是示出了随时间变化的酶促水解释放的葡萄糖的曲线图，其根据三个初始释放条件(A)：2.8g/L/h、(B)：3.9g/L/h和(C)：5.6g/L/h，
—图3至5对于根据本发明EG3的菌株示出了葡萄糖、木糖、乙醇、木糖醇和甘油浓度随时间的变化；图3对应于酶A的剂量，图4对应于酶B的剂量，并且图5对应于酶C的剂量，
—图6至8对于根据本发明EG1的又一菌株示出了葡萄糖、木糖、乙醇、木糖醇和甘油浓度随时间的变化；图6对应于酶A的剂量，图7对应于酶B的剂量，并且图8对应于酶C的剂量，
—图9示出了在所进行的三次测试期间EG1和EG3两种菌株各自导致的木糖消耗率的移动平均数(movingaverages)的变化，其为在相同时间段内培养基中葡萄糖浓度的移动平均数的函数，
—图10是对于两种菌株EG1和EG3示出了木糖醇的比生产速率(g/L/h)随培养基中木糖的比消耗速率(g/L/h)变化的曲线图，
—图11是示出了在木糖(70g/L)存在的情况下由两种进化物(evoluate)EG3和EG2导致的质量损失随发酵时间变化的曲线图(EthanolRedTM菌株是起始菌株)，
—图12示出了在木糖发酵过程中所观察到的由EG5和EG9菌株导致的质量损失的变化。细胞以1g/kg干物质的量接种到包含70g/kg木糖的培养基中。发酵在32℃下进行。
实施例
实施例1
所述工业菌株的选择根据上文描述。
用于以基因过表达为目标的各种转化的所有DNA序列从已知的标准载体(大肠杆菌pUC型)获得，其中具有以下成分：
—整合靶标；
—针对目标基因而选择的启动子/终止子，以及
—抗性标记，其将随后去除(见下文)。
用于树干毕赤酵母XDH过表达的载体的实例在图1中示出。
为破坏所选择的工业菌株的GRE3基因拷贝，本发明人使用了由pUG6型质粒进行PCR扩增的材料(GüldenerU，HeckS，FielderT，BeinhauerJ，HegemannJH.NucleicAcidsRes.1996年7月1日；24(13)：2519-2524)。
酵母转化步骤根据Gietz，R.D.与R.A.Woods.(2002)TransformationofyeastbytheLiac/SSCarrierDNA/PEGmethod.MethodsinEnzymology350：87-96进行。
本发明的酵母菌株(分别为EG1、EG2和EG3)在2010年4月14日保藏于CNCM并且对其分别赋予保藏号No.I-4293、I-4294和I-4295。
根据一种优选的模式，本发明的菌株具有以下基因型：
EthanolRedTM，BUD5::ADH1p-PsXRm(K270M)-CYC1t；HO::ADH1p-PsXDH-CYC1t；BUD5::ADH1p-XKS1-CYC1t；RPE1::TDH3p-RPE1-CYC1t；RKI1::TDH3p-RKI1-CYC1t；TKL1::TDH3p-TKL1-CYC1t；TAL1::PGK1p-TAL1-CYC1t；ΔGRE3
实施例2
对在前一实施例中获得的菌株进行温和诱变，即254nm下100至500J/cm2，并且优选地是300J/cm2的紫外照射。
在包含7％木糖的YE型(酵母提取物0.5％)培养基中搅拌和不充气条件下在32℃下进行1周的培养后—O2的限制借助于在烧瓶中由于发酵过程中产生的CO2而导致的超分压实现—将1毫升的所述培养物用于对相同培养基进行再接种。重复这一操作6次。最终将所述细胞涂布于包含20g/L葡萄糖的YE琼脂培养基上。移取分离的集落并且随后依次培养于：
—YE20g/L的甘油并且处于有氧条件下，用于消除“小”突变体，即呼吸缺陷型突变体；
—YE葡萄糖，用于确认其生长速率；
—YE木糖，用于鉴别最有利的克隆。
实施例3
本发明者首先在无氧批式培养中测试了在实施例2中所获得经遗传修饰从而能够将木糖转化成为乙醇的菌株。
通过测量在木糖作为唯一碳源进行发酵期间随木糖浓度变化的CO2生成速率能够测量木糖的表观Km：其为6.16M。
在所测试菌株中，在SSF条件下选择了三种以用于评估其在与葡萄糖同时代谢木糖的能力。所述SSF测试使用低剂量酶进行，所述酶的活性介于4.3和8.6μKat之间，以使葡萄糖释放速率低下并且使发酵过程中残余葡萄糖浓度为零。
所测试的菌株是EG3菌株和EG1菌株，其分别在所述定向进化步骤之前和之后获得。
EG1菌株的细胞不能形成孢子。这些细胞形成孢子的能力通过对在SSA型贫乏培养基(0.8％乙酸钠、1.5％琼脂)上培养细胞48h而获得的四分体或子囊的显微镜观测而确定。
测试条件
所述测试在32℃，pH5下进行。接种为0.5g酵母干物质每kg初始发酵汁(must)。通过使用糊精和添加葡糖淀粉酶而获得所述葡萄糖的逐步酶促释放。所使用的葡糖淀粉酶剂量是低下的(介于4.3μKat和8.6μKat之间)，用以模拟在72h中发生的纤维素酶水解纤维素的动力学。所测试的初始葡萄糖释放的速率分别为(A)：2.8g/L/h、(B)：3.9g/L/h和(C)：5.6g/L/h。
根据总体观察，当60-70％的糊精已被水解时水解动力学降低，并且对于所述三种条件，葡萄糖释放平均速率随后为约0.4-0.45g/L/h，其中条件A具有略快的速率(图2)。
实际上，所使用的培养基是包含酵母提取物(5g/kg)、尿素(2.5g/kg)、磷酸氢二钾(1g/kg)、12mM柠檬酸缓冲剂以及矿物质和维生素的合成培养基。
所获得的结果
EG3菌株
图3至5给出了葡萄糖、木糖、乙醇、木糖醇和甘油浓度随时间的变化。这些图显示，在72h中：
-根据测试，EG3菌株消耗了30至33g的木糖，而其在木糖批式模式中实质上无消耗；
-从被消耗的30-33g木糖产生了17-20g木糖醇，即，对于条件A为0.5g/g的比率以及对于条件B和C为0.6g/g的比率；
-所产生的甘油的量是低的，低于在该类型测试中所预期的量。
总体上，三个测试给出了等同的结果。
表1：EG3菌株所产生和消耗的分子(以72h时每kg初始培养基中的g计)
酶剂量 葡萄糖 木糖 生物质 木糖醇 甘油 乙醇 碳平衡
A 103.3 32.8 10 17.0 1.1 51.7 101％
B 114.4 33.2 10 19.6 1.6 57.7 103％
C 122.2 30.9 10 17.9. 2.5 60.6 103％
EG1菌株
图4至6给出了葡萄糖、木糖、乙醇、木糖醇和甘油浓度随时间的变化。这些图显示，在72h中：
根据测试，EG1菌株消耗了45至60g的木糖，即，实质上两倍于EG3菌株；
被消耗的45-60g木糖产生了10-13g木糖醇，即对于所述三个测试为0.2g/g的比率；
所产生的甘油量是低的，但高于EG3菌株。
总体上，所述测试给出了等同的结果。
表2：EG1菌株所产生和消耗的分子(以72h时每kg初始培养基中的g计)
酶剂量 葡萄糖 木糖 生物质 木糖醇 甘油 乙醇 碳平衡
A 102.5 60.61 10 12.74 2.86 65.49 100％
B 115.6 51.65 10 11.90 4.17 69.34 102％
C 120.9 45.96 10 9.86 5.33 70.18 103％
关于所获得的结果的讨论和假设，特别是涉及允许采用木糖的葡萄糖浓度。
以葡萄糖-木糖批次获得的结果显示了质量损失斜率的中断，其似乎表明葡萄糖首先被消耗并且此后木糖被随后以低得多的速率消耗。
根据实施例而实施的SSF测试使得对于采用木糖是否优于非零的葡萄糖输入流而非零葡萄糖浓度进行评估成为可能。
图9示出了在所进行的三个测试期间由两种菌株各自导致的木糖消耗率的移动平均数的变化，其为在相同时间段内培养基中葡萄糖浓度的移动平均数的函数。
所述结果使得可能说明：
—在溶液中约5g/kg的葡萄糖下，存在所测试的菌株对木糖的消耗，
—使用EG3菌株所观察到的木糖消耗速率是使用EG1菌株所观察到的一半。
在根据本发明生产乙醇的方法的优选变型中，如实施例中所示的，葡萄糖的缓慢和受控释放使细胞不会经受强烈的渗透压变化并且使其避免了发酵途径(糖酵解、戊糖磷酸以及糖转运)的阻塞，所述阻塞将限制木糖的使用。
令人惊奇并且显著的是，使用本发明的方法，细胞能够在50小时中在约200g/L(使用130g/L的葡萄糖当量和70g/L的木糖进行的实施例)的碳源极丰富的培养基中代谢62g/L的木糖。像这样的这些极端条件据我们所知从未被描述过。
根据所进行的SSF测试：
—EG1菌株的比速率是0.5g木糖/gDM酵母/h；
—对于所消耗的60.61g木糖形成了12.74g木糖醇，即，21g/100g的比率。

Claims (23)

1.一种用于制备不含抗生素抗性标记并能够从包含至少一种戊糖的培养基生产乙醇的酿酒酵母工业酵母菌株的方法，其中所述方法包含以下步骤：
(i)选择并且获得能够在同步糖化发酵(SSF)条件下和35℃的温度下以谷物水解物产生高浓度乙醇的酿酒酵母工业酵母菌株，所述乙醇浓度至少为14.5％(v/v)，
(ii)将三个表达盒整合到步骤(i)中的酵母的基因组中，所述三个盒为：
a.编码使用[NADH][H+]而非[NADPH][H+]作为优先辅因子的突变木糖还原酶的树干毕赤酵母XRm基因和酿酒酵母启动子和终止子的开放阅读框(ORF)型的结合，所述盒上游和下游侧邻有允许其靶向整合到所述基因组中的重组区域，
b.编码木糖醇脱氢酶的树干毕赤酵母XDH基因和酿酒酵母启动子和终止子的开放阅读框(ORF)型的结合，所述盒上游和下游侧邻有允许其靶向整合到所述基因组中的重组区域，和
c.编码木酮糖激酶的酿酒酵母XKS1基因和酿酒酵母启动子和终止子的开放阅读框(ORF)型的结合，所述盒上游和下游侧邻有允许其靶向整合到所述基因组中的重组区域，
(iii)通过将戊糖磷酸途径的非氧化部分中的各步骤的至少一种基因置于在醇发酵过程中强表达的糖酵解基因的启动子的控制下而诱导其表达，以及
(iv)删除编码醛糖脱氢酶的酿酒酵母GRE3基因的开放阅读框(ORF)的至少两个拷贝。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(i)的酿酒酵母工业酵母菌株能够在同步糖化发酵(SSF)条件下和35℃的温度下以谷物水解物产生浓度为至少16％(v/v)的乙醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述XRm是编码K270MXRm的基因或编码K270RXRm的基因。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述酿酒酵母启动子选自由ADH1、ADH2、PGK1、TDH3、PDC2和GAL1/10组成的组，并且特征在于所述酿酒酵母终止子由CYC1的终止子构成。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述酿酒酵母启动子选自由ADH1、ADH2、PGK1、TDH3、PDC2和GAL1/10组成的组，并且特征在于所述酿酒酵母终止子由CYC1的终止子构成。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述酿酒酵母启动子是ADH1。
7.2010年4月14日以No.I-4295在CNCM(巴斯德学院的法国微生物保藏中心)进行保藏的酿酒酵母酵母菌株EG3。
8.2010年4月14日以No.I-4294在CNCM(巴斯德学院的法国微生物保藏中心)进行保藏的酿酒酵母酵母菌株EG2。
9.2010年4月14日以No.I-4293在CNCM(巴斯德学院的法国微生物保藏中心)进行保藏的酿酒酵母酵母菌株EG1。
10.2011年3月1日以No.I-4450在CNCM(巴斯德学院的法国微生物保藏中心)进行保藏的酿酒酵母酵母菌株EG9。
11.一种通过根据权利要求1至5中任一项所述的方法而获得的酵母菌株，其特征在于所述酵母菌株不含抗生素抗性标记。
12.一种用于从包含至少一种戊糖的培养基生产乙醇的方法，其通过根据权利要求7至10中任一项所述的酵母的发酵来实现。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述至少一种戊糖是木糖。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述培养基选自由木质素水解物、纤维素水解物、半纤维素水解物和糊精水解物组成的组。
15.根据权利要求12所述的方法，包括在己糖聚合物和能够对其进行水解的至少一种酶存在的情况下进行同步糖化发酵(SSF)的步骤。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述己糖的平均释放速度为2.8至5.6g/L/h，己糖细胞外浓度为零。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其特征在于所述己糖主要由葡萄糖组成。
18.一种用于从包含至少一种戊糖的培养基生产乙醇的方法，其通过根据权利要求1所述的方法而获得的酵母的发酵来实现。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述至少一种戊糖是木糖。
20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述培养基选自由木质素水解物、纤维素水解物、半纤维素水解物和糊精水解物组成的组。
21.根据权利要求18所述的方法，包括在己糖聚合物和能够对其进行水解的至少一种酶存在的情况下进行同步糖化发酵(SSF)的步骤。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于所述己糖的平均释放速度为2.8至5.6g/L/h，己糖细胞外浓度为零。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其特征在于所述己糖主要由葡萄糖组成。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2953857B1 (fr) * 2009-12-15 2012-10-12 Lesaffre & Cie Nouvelles souches de levure pour la production d'alcool
FR2991339B1 (fr) * 2012-06-01 2016-02-19 Lesaffre & Cie Souches de levure aptes a metaboliser le xylose et resistantes a au moins un inhibiteur de fermentation, procede d'obtention et utilisation
FR2991340B1 (fr) 2012-06-01 2016-02-19 Lesaffre & Cie Procede d'obtention de souches de levure ameliorees par modification genetique et croisement
FR2996855B1 (fr) * 2012-10-16 2016-11-11 Lesaffre & Cie Souches de levures pour la production de biomasse sur un substrat comprenant un sucre en c5, leurs procedes d'obtention et utilisations de la biomasse produite
CN103981109B (zh) * 2013-05-02 2016-08-03 江南大学 一株对啤酒发酵环境具有多种耐受性的啤酒酵母及其应用
EP3228699B1 (en) * 2014-12-05 2019-01-09 Honda Motor Co., Ltd. Highly efficient ethanol-fermentative bacteria
JP6145582B2 (ja) * 2014-12-05 2017-06-14 本田技研工業株式会社 高効率エタノール発酵菌
JP6228323B2 (ja) * 2014-12-05 2017-11-15 本田技研工業株式会社 高効率エタノール発酵菌
BR112017011307A2 (pt) * 2014-12-05 2018-07-31 Honda Motor Co Ltd leveduras fermentativas de etanol altamente eficientes
FR3036709B1 (fr) 2015-05-29 2019-06-07 Lesaffre Et Compagnie Propagation de levures simultanee a la saccharification

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004046333A3 (en) * 2002-11-15 2004-09-16 Novozymes North America Inc Ethanol production by simultaneous saccharification and fermentation (ssf)
WO2009109634A1 (en) * 2008-03-07 2009-09-11 Dsm Ip Assets B.V. A pentose sugar fermenting cell

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2675815B1 (fr) 1991-04-23 1994-11-04 Lesaffre & Cie Nouvelles souches de levure de panification et leur procede d'obtention, nouvelles levures fraiche et seche correspondantes.
US20090246844A1 (en) 2007-10-26 2009-10-01 Arbor Fuel Inc. Methods for the production of ethanol
US8367393B2 (en) * 2008-11-24 2013-02-05 C5 Ligno Technologies Lund Ab Saccharomyces strain with ability to grow on pentose sugars under anaerobic cultivation conditions

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004046333A3 (en) * 2002-11-15 2004-09-16 Novozymes North America Inc Ethanol production by simultaneous saccharification and fermentation (ssf)
WO2009109634A1 (en) * 2008-03-07 2009-09-11 Dsm Ip Assets B.V. A pentose sugar fermenting cell

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Metabolic engineering of a xylose-isomerase-expressing Saccharomyces cerevisiae strain for rapid anaerobic xylose fermentation;Marko Kuyper et al.;《FEMS Yeast Research》;20041126;全文 *
Xylose reductase from Pichia stipitis with altered coenzyme preference improves ethanolic xylose fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae;Oskar Bengtsson et al.;《Biotechnology for Biofuels》;20090505;第2卷(第9期);摘要部分，第2页右栏第1-2段、表1，第5页表4，第8页表6、右栏第2段 *

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CA2794843C (fr) 2019-06-18

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