ES2608784T3 - Procedimiento de preparación de una levadura industrial, levadura industrial y aplicación a la producción de etanol a partir de al menos una pentosa - Google Patents

Procedimiento de preparación de una levadura industrial, levadura industrial y aplicación a la producción de etanol a partir de al menos una pentosa Download PDF

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Abstract

Cepa de levadura caracterizada por que consiste en genes exógenos de la ruta metabólica de la xilosa, en la que los genes exógenos de la ruta metabólica de la xilosa presentes en la cepa de levadura consisten en al menos una copia de un gen exógeno que codifica una xilosa isomerasa, y una copia de un gen exógeno que codifica una xilitol deshidrogenasa, y en la que ha experimentado una etapa posterior de evolución dirigida que comprende las etapas sucesivas siguientes que consisten en someter a dicha cepa de levadura a: (i) una mutagenia, (ii) un crecimiento en cultivos cíclicos bajo O2 limitado en un medio que comprende al menos una pentosa, principalmente xilosa, y (iii) una selección por crecimiento aerobio en medio sólido que contiene glicerol como única fuente de carbono.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento de preparacion de una levadura industrial, levadura industrial y aplicacion a la produccion de etanol a partir de al menos una pentosa
Campo tecnico
La presente exposicion se refiere al campo de los procedimientos de obtencion de cepas de levadura que producen etanol, levaduras asf como productos, y de la produccion industrial de etanol a partir de dichas levaduras. Mas especfficamente la presente exposicion se refiere en su aspecto mas general, a un procedimiento de preparacion de levaduras a partir de cepas de Saccharomyces cerevisiae llamadas industriales, dichas levaduras y su aplicacion a la produccion industrial de etanol a partir de los medios industriales que contienen al menos una pentosa, tal como la xilosa.
Estado de la tecnica
El punto comun a la mayor parte de los enfoques de la tecnica anterior del campo consiste en procedimientos para la mejora de las cepas en patrimonio genetico conocido y/o construido y cuyas capacidades para producir etanol se estudian en general en entornos y en condiciones “ideales” de laboratorio.
De hecho, la bibliograffa cientffica asf como los documentos de patente analizados por el solicitante ensenan, muy a menudo, procedimientos de obtencion de cepas haploides o diploides, debilmente tolerantes al estres sobre todo a altas concentraciones de etanol y/o a temperaturas elevadas y/o a los inhibidores fermentacion. Ademas, estos metodos necesitan en su mayor parte tener recursos, para estas cepas, con utilizacion de de auxotroffa y/o marcadores de resistencia a los antibioticos que pueden descalificarles para una utilizacion posterior en un entorno industrial por razones obvias de , o sea a veces de salud o ambientales.
Las propiedades de crecimiento de cepas desarrolladas anteriormente son generalmente insuficientes y estas cepas no se han enfrentado nunca a los imperativos de produccion de biomasa a escala industrial, es decir, por mencionar solo tres: fuerte tasa de crecimiento, capacidad de secado, estabilidad de conservacion.
Los llamados rendimientos de fermentacion (capacidad de produccion anaerobia del etanol) se obtienen en medios sinteticos o denominados de laboratorio con estas cepas anteriores, no pueden transponerse en general, en entornos industriales que comportan mezclas complejas derivadas por ejemplo de residuos de tratamiento de celulosa que contienen compuestos toxicos capaces de inhibir a diferentes niveles la maquinaria celular de la levadura, principalmente furfural, HMF, derivados fenolicos, acido acetico. Ademas, la capacidad de “scale up” o transposicion de escala de estos procedimientos anteriores de produccion de etanol rara vez se documenta.
El documento WO 2008/133665 da a conocer la produccion de alcohol a partir de una cepa de levadura en el “contexto genetico” de tipo:
- Gen STP15 mutado (F117S, Y195H, K218R).
- Genes que codifican los exogenes XI/XR/XDH o XK.
“XI” designa la xilosa isomerasa, “XR” designa la xilosa reductasa, “XDH” designa la xilitol deshidrogenasa y “XK” designa la D-xilulocinasa.
El documento WO 2005/113774 da a conocer un operon recombinado que comprende dos secuencias de acido nucleico que codifican, respectivamente una XI de E. coli y XDH de Trichoderma reesei en el marco de la produccion de xilitol.
En el documento Plos Genetics de Gavin Sherlock et al., publicado el 13 de mayo de 2010, describe un gen XDH1 presente en algunas cepas especfficas de Saccharomyces cerevisiae, que posiblemente codifican una xilitol deshidrogenasa.
El documento a nombre de Dawid Brat, Eckhard Boles y Beate Wiedemannn en Appl. Environ. Microbiol., abril de 2009, vol. 75, n° 8, pag. 2304- 2311, describe la expresion en Saccharomyces cerevisiae del gen de la xilosa isomerasa proveniente de Clostridium phytofermentans.
Se desprende de este examen de documentos de la tecnica anterior, asf como de los trabajos de los inventores de la presente invencion, dado que los contextos/patrimonios geneticos muy diferentes de las cepas de levaduras Saccharomyces cerevisiae utilizadas con el fin de crecer en la xilosa y/o fermentarla, las consecuencias, por ejemplo, de una sobreexpresion y/o de una supresion de genes naturales y/o la introduccion de uno o de varios genes heterologos no se pueden predecir.
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Resumen de la invencion
Ademas, el solicitante estudiando numerosas cepas de tipo alcohol, cerveceras y de panaderfa, ha constatado de manera sorprendente que la introduccion en cepas de levadura de casetes de expresion o de supresion determinadas a fin de expresar en ellas a ruta metabolica XI-XDH, les hacfa particularmente eficaces en la produccion de etanol. Aun mas, el solicitante ha constatado que la introduccion del acido nucleico que codifica XI no es suficiente por si sola para la fermentacion eficiente de la xilosa.
En general, el solicitante ha constatado que la introduccion de casetes de expresion de un gen que codifica una enzima capaz de convertir cualquier hidrato de carbono (principalmente D-xilosa) en xilulosa (D-xilulosa) y de un gen que codifica una enzima capaz de convertir cualquier pentol (especialmente xilitol) en xilulosa en una sola etapa, hacfa a todas las cepas asf modificadas particularmente eficaces en el crecimiento y/o la fermentacion de la xilosa.
Por "enzima capaz de convertir la xilosa en xilulosa" se entiende una enzima xilosa isomerasa.
Por "enzima capaz de convertir en una sola etapa el xilitol en xilulosa" se entiende una enzima xilitol deshidrogenasa.
De hecho, el solicitante ha confirmado que contrariamente a la via llamada fungica que relaciona XR y XDH, dicha via bacteriana de isomerizacion (uno de cuyos ejemplos es el de C. phytofermentans), cuando se aplica, no implica cosustratos. Ademas, esta via permite evitar la acumulacion de xilitol, que es un intermedio metabolico presente en la via fungica y puede reducir de manera significativa el rendimiento de la produccion de etanol.
Muy recientemente, en algunas cepas de S. cerevisiae, principalmente las utilizadas en la elaboracion del vino, ha sido identificado un gen XDH1 como esencial para el metabolismo de la xilosa de dichas cepas (PLoS Genetics 2010, 6, 1
17). Ademas, el solicitante ha constatado que, incluso suprimiendo el gen GRE3 de las cepas modificadas de genes, hay otras actividades parasitas que pueden convertir la xilosa en xilitol (actividad de aldosa reductasa). Lo que es perjudicial para la actividad XI reduciendo asf el rendimiento del etanol buscado.
Los trabajos realizados por el solicitante muestran que el fortalecimiento de los resultados de la actividad xilitol deshidrogenasa se traduce en la ausencia de inhibicion de la XI y por lo tanto en la estimulacion de esta via. Lo que permite la produccion de etanol a partir de un medio que comprende al menos xilosa, con un buen rendimiento cinetico.
En otras palabras, en el estado de la tecnica, se han explorado dos vfas diferentes para permitir la fermentacion de la xilosa por la levadura: la via llamada fungica que utiliza las enzimas XR y XDH; y la via llamada bacteriana que utiliza la enzima XI. El objeto de la presente exposicion combina de una manera original enzimas procedentes de estas dos vfas con el fin de obtener un mejor resultado.
La invencion se define en las reivindicaciones adjuntas.
La invencion se refiere en particular a una cepa de levadura que comprende al menos una copia de un gen exogeno que codifica una xilosa isomerasa, y una copia de un gen exogeno que codifica una xilitol deshidrogenasa.
Por gen "exogeno" (en contraposicion a "endogeno") se entiende un gen que no esta presente de forma natural en la especie de levadura considerada. El gen que codifica una xilitol deshidrogenasa puede ser el gen XYL2, pero en este caso se trata del gen XYL2 de otra especie distinta de la cepa considerada.
La exposicion tambien se refiere a un procedimiento de preparacion una cepa de levadura que comprende al menos una copia de un gen exogeno que codifica una xilosa isomerasa, y una copia de un gen exogeno que codifica una xilitol deshidrogenasa.
La exposicion tambien se refiere a un procedimiento de produccion de etanol que utiliza las cepas de levadura segun la invencion.
Breve descripcion de las figuras
- La Figura 1 ilustra un vector de sobreexpresion de la XDH de Pichia stipitis.
- La figura 2 ilustra un vector de sobreexpresion de la XI de Closthdium phytofermentans.
- La figura 3 es un grafico que ilustra la produccion de etanol como una funcion del tiempo de fermentacion a 32°C de dos cepas de levadura segun la invencion despues de la evolucion dirigida y de la cepa etanol red™. Los clones ensayados han sido inoculados a razon de 5 g de masa seca/l en un medio YF + xilosa a 70 g/l.
- La figura 4 es un grafico que ilustra la produccion de etanol en funcion del tiempo de fermentacion a 32°C de dos de levadura, uno segun la invencion despues de la evolucion dirigida, la otra cepa derivada de la primera pero despues de la sustitucion de la copia del gen XDH con un marcador de resistencia a la kanamicina
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(KanMX4). Los clones ensayados se han inoculado a razon de 5 g de masa seca/l en un medio YF + xilosa 70 g/1.
- La Figura 5 es un grafico que ilustra la produccion de etanol (en ordenadas, en g por 1 kg de medio) en funcion del tiempo de fermentacion a 32°C (en abscisas, en horas) de dos cepas de levadura segun la invencion, EG8 y EG10. Los clones ensayados se inocularon a razon de 0,25 g de levadura seca por kg de medio YF que contiene xilosa a 70 g/l como la unica fuente de carbono.
Descripcion detallada de las realizaciones
Por lo tanto, la presente exposicion tiene por primer objeto un procedimiento de preparacion de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae capaz de producir etanol a partir de un medio que comprende al menos una pentosa (principalmente la xilosa) y que comprende las etapas siguientes consistentes en
(i) seleccionar (o proporcionar) una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae
(ii) integrar los siguientes casetes de expresion en el genoma de la levadura de la etapa (i),
a. la asociacion del tipo marco abierto de lectura (ORF) de un gen que codifica una enzima capaz de convertir cualquier
hidrato de carbono, principalmente xilosa, en xilulosa bajo el control de un activador y de un terminador de Saccharomyces cerevisiae, estando dicho casete flanqueado aguas arriba y aguas abajo de las regiones
recombinogenas que permiten su integracion dirigida en el genoma,
b. la asociacion del tipo marco abierto de lectura (ORF) de un gen que codifica una enzima capaz de convertir en una
sola etapa cualquier pentol, principalmente xilitol, en xilulosa bajo el control de un activador y de un terminador de Saccharomyces cerevisiae, estando dicho casete flanqueado aguas arriba y aguas abajo de las regiones
recombinogenas que permiten su integracion dirigida en el genoma,
(iii) inducir la expresion de al menos un gen de cada etapa de la parte no oxidativa la via de las pentosas fosfato asf
como al menos un gen que codifica la xilulocinasa (XKS1), colocandolos bajo el control de un activador de un gen,
principalmente de la glucolisis, sin control ni por anaerobiosis ni por represion catabolica y altamente expresado durante la fermentacion alcoholica, y
(iv) suprimir al menos una copia o preferiblemente al menos dos copias del marco abierto de lectura (ORF) del gen de Saccharomyces cerevisiae GRE3 que codifica una aldosa reductasa. Preferentemente se eliminan todas las copias del marco abierto de lectura (ORF) del gen de Saccharomyces cerevisiae GRE3.
El gen XKS1 es preferiblemente el gen que aparece en GenBank con el numero 853108.
El gen GRE3 es preferiblemente el gen que aparece en GenBank con el numero 856 504.
Preferiblemente, el gen de la etapa (ii)a es un gen XI que codifica la enzima xilosa isomerasa seleccionada entre las presentes en los genomas de Clostridium, Pyromyces, Bacteroides, Streptomyces, Haemophilus, Burkholderia, Enterococcus, Thermotoga, Fusobacterium, Geobacillus, Arthrobacter, Ciona, Physcomitrella, Cellvibrio, Chitinophaga, Saccharopolyspora o Salinibacter.
El XI se selecciona preferiblemente entre un gen de Clostridium phytofermentans, Saccharopolyspora erythraea, Salinibacter ruber o Piromyces sp. E2.
Segun una realizacion preferida, el gen XI tiene por secuencia la secuencia de nucleotidos SEQ ID n°: 1 (que representa la secuencia del gen XI de Clostridium phytofermentans, descrita en el documento DE 102008031350). Alternativamente, el gen XI tiene una secuencia que presenta al menos 70% de identidad, preferentemente al menos 75% de identidad, o al menos 80% de identidad, o al menos 85% de identidad, o al menos 90% identidad, o al menos 95% de identidad, o al menos 98% de identidad, o al menos 99% de identidad, con la secuencia SEQ ID n°: 1, y codifica una enzima xilosa isomerasa funcional.
Segun otra realizacion, el gen XI presenta una secuencia que codifica un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID n°: 2 (que representa la secuencia de la protefna XI de Clostridium phytofermentans, descrita en el documento DE 102008031350). Alternativamente, dicho polipeptido tiene una secuencia que presenta al menos 70% de identidad, preferentemente al menos 75% de identidad, o al menos 80% de identidad, o al menos 85% de identidad, o al menos 90% identidad, o al menos 95% de identidad de, o al menos 98% de identidad, o al menos 99% de identidad, con la secuencia SEQ ID n°: 2, y tiene una actividad xilosa isomerasa.
Segun la presente invencion por “transformar el xilitol en xilulosa en una sola etapa” se entiende una oxidacion directa del xilitol a xilulosa y esto por una sola y la misma enzima (xilitol deshidrogenasa).
Preferiblemente, el gen de la etapa (ii)b, es un gen de Pichia stipitis que codifica la enzima xilitol deshidrogenasa XDH.
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Preferentemente, se trata del gen XYL2, cuya secuencia figura en GenBank con el numero 4.852.013, o una secuencia que presenta al menos 70% de identidad de, preferentemente al menos 75% de identidad, o al menos 80% de identidad, o al menos 85% de identidad, o al menos 90% de identidad, o al menos 95% de identidad, o al menos 98% de identidad, o al menos 99% de identidad, con respecto a dicha secuencia que figura en GenBank con el numero 4.852.013, codificando la secuencia una enzima xilitol deshidrogenasa funcional.
Preferentemente, la cepa de levadura de la etapa (i) presenta una actividad xilitol deshidrogenasa XDH endogena inferior a 150 mKat/g de protefnas. La actividad xilitol deshidrogenasa puede medirse en las condiciones indicadas en el artfculo de Xu et al., titulado Characterization of Ethanol Production from Xylose and Xylitol by a Cell-Free Pachysolen tannophilus System en Appl. Environ. Microbiol. 59:231 -235 (1993).
Es sabido que, durante el tratamiento de la biomasa destinada a la fermentacion alcoholica, aparecen algunos inhibidores de fermentacion. Entre ellos se pueden citar los productos fenolicos, el furfural o incluso el acido acetico. Tambien es sabido que estos inhibidores son perjudiciales para los rendimientos, incluso la supervivencia de la levadura.
Para resolver este problema adicional, el solicitante propone seleccionar la cepa de la etapa i entre las cepas industriales que presentan resistencia a los derivados fenolicos.
Otra ventaja de la via XI es la posibilidad de “injertar en paralelo la via arabinosa bacteriana” como se describe por ejemplo en EP 1.499.708 o aun en el documento WO 2008/041840, permitiendo esta combinacion a continuacion aumentar el grado de alcohol final en caso de presencia de arabinosa en los medios a fermentar.
El procedimiento de preparacion de la levadura de la presente invencion tiene en cuenta tanto las limitaciones del productor de levadura como al mismo tiempo de las de un usuario final en sus aplicaciones principalmente en terminos de produccion industrial de etanol a bajo costo y alto rendimiento.
El metodo segun la invencion presenta, en particular, las siguientes ventajas:
Para el productor de levadura, permite:
- La construccion de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae aneuploide o poliploide, prototrofa para permitir la produccion de biomasa en fuentes simples de carbono, nitrogeno, fosforo en los medios de bajo costo, tales como los subproductos de la industria azucarera como melaza por ejemplo,
- disponer de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae que presenta una tasa maxima de crecimiento (p max) comprendida entre 0,37 h"1 y 0,5 h"1 ,
- disponer de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae que, cuando se produce segun un procedimiento tal como se describe en el libro de referencia “Yeast Technology (2a edicion, 1991, G. Reed y T.W. Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8), permite obtener un rendimiento de produccion de biomasa de al menos 45 g de materias secas de levadura por 100 g de equivalente de sacarosa aplicado,
- disponer de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae resistente a proceso de secado tal se describe en los documentos de patentes EP 511.108 y US 5.741.695, no debiendo exceder de 30% la perdida de actividad fermentativa despues del secado,
- la produccion en condiciones industriales (especialmente medio poco costoso, buen rendimiento de biomasa, levadura seca lista para su uso) de una levadura fresca o seca, a partir de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae geneticamente estable, robusta ya que especialmente tolerante a altas concentraciones de etanol y capaz de producir, a partir de por ejemplo biomasas semicelulosicas, etanol, a razon de al menos, 40 g/l y este a una temperatura elevada de aproximadamente 30 a 40°C.
Una cepa de levadura prototrofa es una cepa capaz de crecer en un medio mfnimo. En particular, una cepa de levadura prototrofa segun la invencion es capaz de sintetizar todos los aminoacidos y bases necesarios para su crecimiento.
Un medio mfnimo es un medio que comprende una fuente de carbono, una fuente de nitrogeno, una fuente de potasio, una fuente de fosforo, una fuente de azufre, una fuente de magnesio, una fuente de calcio, una fuente de hierro, una fuente de oligoelementos y agua.
Un ejemplo de medio mfnimo es el medio YNB (Yeast Nitrogen Base). El medio YNB comprende por litro: 2 pg de biotina, 400 pg de pantotenato de calcio, 2 pg de acido folico, 2.000 pg de inositol, 400 pg de niacina, 200 pg de acido p - aminobenzoico, 400 pg de hidrocloruro de piridoxina, 200 pg de riboflavina, 400 pg de clorhidrato de tiamina, 500 pg de acido borico, 40 pg de sulfato de cobre, 100 pg de yoduro de potasio, 200 pg de cloruro ferrico, 400 pg de sulfato de manganeso, 200 pg de molibdato de sodio, 400 pg de sulfato de cinc, 1 g d e fosfato de potasio monobasico, 500 mg de sulfato de magnesio, 100 mg de cloruro de sodio, 100 mg de cloruro de calcio, 5 g/l de sulfato de amonio, pH final 5,4.
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Segun otra variante preferida del procedimiento segun lo expuesto, cuando en la etapa (ii) la casete de expresion consiste en la asociacion del tipo marco abierto de lectura (ORF) del gen XI que codifica la enzima xilosa isomerasa de Clostridium phytofermentansIactivador y terminador de Saccharomyces cerevisiae, siendo dicha casete flanqueada aguas arriba y aguas abajo de las regiones recombinogenas que permiten su integracion dirigida en el genoma, dicho proceso comprende entonces ademas una etapa de sacarificacion y fermentacion simultaneas (SSF) en presencia de polfmeros de hexosas, en su mayor parte constituidos por glucosa y al menos una enzima capaz de hidrolizarlos.
Ademas, para el productor de etanol, la ventaja del proceso segun la invencion es una vez mas disponer de una levadura activa (fresca - lfquida o comprimida, comprimida o seca), obtenida segun un procedimiento de produccion tal como se describe en la obra "Yeast Technology", a partir de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae tal como se define en el parrafo anterior que es:
- capaz, en las condiciones de SSF descritas en el documento de patente WO 2004/046333, de fermentar a 32°C un hidrolizado de cereales hasta una concentracion de etanol de 16% (p/p) mfnimo;
- capaz, en las condiciones de SSF descritas en el documento de patente WO 2004/046333, de fermentar a 35°C un hidrolizado de cereales hasta una concentracion en etanol de 14,5% (p/p) mfnimo.
Los resultados del proceso segun la invencion son tanto mas notables cuando se obtiene de una cepa llamada industrial, aneuploide o poliploide prototrofa y que tiene de hecho un material genetico mucho mas complejo que el de una cepa llamada de laboratorio, que hace por lo menos imprevisibles las consecuencias de las modificaciones de dicha cepa industrial. Este fondo genetico complejo, especffico para las cepas industriales hace tanto mas diffcil la obtencion de cepas cepas geneticamente modificadas al final de marcadores de resistencia a los antibioticos, sobre todo cuando hay que cambiar numerosas dianas geneticas. Las cepas exentas de marcadores con resistencia a antibioticos son obviamente por razones de salud y ambientales.
Las cepas prototrofas segun la invencion tienen la ventaja de crecer en fuentes simples de carbono, nitrogeno y fosforo.
Pero esta caracterfstica hace que los vectores de transformacion disponibles en la comunidad cientffica (vectores que utilizan marcadores de auxotroffa) son inoperantes.
Es pues necesario tener disponibles herramientas/vectores utilizando marcadores de resistencia a los antibioticos, estando construidas convenientemente estas llamadas herramientas/marcadores para permitir al final la escision de estos marcadores. A modo de ejemplo, se puede utilizar la tecnologfa Cre-lox. En resumen, se preve secuencias loxP que encuadran cada marcador de seleccion. La escision de los marcadores de seleccion se efectua mediante la transformacion de la cepa de levadura por el metodo de acetato de litio (Schiestl y Gietz, 1989, Current Genetics, vol. 16, pags. 339-346), con un plasmido que comprende el gen de la recombinasa Cre y un marcador de seleccion diferente o marcadores de seleccion a extirpar. La expresion de la recombinasa Cre en la cepa de levadura permite extirpar el marcador de seleccion, dejando solo una secuencia loxP, opcionalmente con sus regiones flanqueantes. Es entonces posible inducir la perdida del plasmido que comprende el gen Cre mediante el cultivo en condiciones no selectivas, es decir en medio enriquecido y en ausencia de antibiotico. La construccion de levaduras segun la invencion ha necesitado por ejemplo el empleo de 4 marcadores positivos diferentes que confieren resistencias a 5 antibioticos diferentes (geneticina, fleomicina, higromicina, blasticidina y nourseotricina).
Las cepas segun la invencion son preferiblemente aneuploides o poliploides: es una caracterfstica generalmente encontrada en las levaduras industriales que vienen del medio natural. La historia filogenetica de estas cepas es el origen de esta caracterfstica.
Pero es una dificultad adicional encontrada cuando se desea destruir/inactivar todas las copias de un gen dado. Sin embargo, este caracter de aneuploidfa o poliploidfa esta por lo general en el origen de muchas de las propiedades de interes de las levaduras industriales (tasa de crecimiento, resistencia a varios tipos de estres, estabilidad fenotfpica).
Ademas, el solicitante despues de largas investigaciones ha constatado con sorpresa que con el procedimiento segun la invencion, aplicado a partir de la cepa seleccionada:
- la introduccion de casetes de expresion y de supresion no debilitaba de ninguna manera la levadura modificada que ve mejorada su herencia genetica.
En particular, los inventores han demostrado que con dicha cepa es posible realizar:
- la supresion de al menos dos copias del gen GRE3 de S. cerevisiae (siendo la enzima Gre3p una aldosa reductasa, que consume NADPH, H+ que es producida en gran medida por la parte oxidativa de la via de las pentosas) en dicha cepa industrial segun la invencion ha permitido reducir otro tanto el consumo de NADPH, H+ por dicha enzima.
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En la variante preferida, al menos dicho gen de cada etapa de la parte no oxidativa de la pentosa fosfato de la etapa (iii) se selecciona del grupo constituido por los genes que codifican las enzimas D-ribulosa 5-fosfato 3-epimerasa, ribosa 5- fosfato cetol-isomerasa, transcetolasa y transaldolasa, y principalmente en el grupo constituido por los genes RPE1, RKI1, TKL1 y TAL1. Preferiblemente, dicho activador de un gen de la glucolisis muy expresado durante una fermentacion alcoholica es el activador de TDH3 para RPE1, RKI1 y TKL1 y PGK1 para TAL1.
El gen TAL 1 gen es preferentemente el gen que aparece en el GenBank con el numero 851.068.
El gen TKL 1 es preferentemente el gen que aparece en GenBank con el numero 856.188.
El gen RKI1 es preferentemente el gen que aparece en GenBank con el numero 854.262.
El gen RPE1 es preferentemente el gen que aparece en GenBank con el numero 853.322.
Segun caracterfsticas complementarias o alternativas, en el procedimiento de preparacion de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae segun la invencion:
- El activador de Saccharomyces cerevisiae de las etapas (ii)(a) y (ii)(b) se selecciona en el grupo que comprende los activadores de genes que codifican enzimas de la glucolisis y los que codifican las enzimas alcohol deshidrogenasa y preferentemente se selecciona en el grupo constituido por ADH1, ADH2, PGK1, TDH3, PDC2 y GAL1/10, preferentemente ADH1. El terminador de Saccharomyces cerevisiae esta constituido por CYC1 o por el terminador propio del gen de la via no oxidativa de las pentosas fosfato.
Esta previsto preferentemente una etapa posterior de la evolucion dirigida que comprende las siguientes etapas sucesivas que consisten en someter la levadura obtenida a
(i) una mutagenia,
(ii) un crecimiento en cultivos cfclicos bajo O2 limitado en un medio que comprende al menos dicha pentosa, y
(iii) una seleccion por crecimiento aerobio en medio solido que contiene glicerol como unica fuente de carbono,
a fin de obtener mutantes sin insuficiencia respiratoria de dicha levadura que presentan crecimiento en condiciones anaerobias en presencia de un medio que comprende al menos dicha pentosa (principalmente xilosa).
Preferiblemente, en esta variante, la mutagenia de la etapa (i) se realiza en condiciones "suaves", es decir, mutagenia moderada con 100 a 500 J/cm2 y, mas preferentemente, 300 J/cm2 de radiacion UV a 254 nm. Estas condiciones no suponen mas que una mortalidad del 7% al 16% de la poblacion expuesta a la radiacion UV.
Los inventores sorprendentemente han demostrado de este modo que con una mortalidad controlada tan baja, se reduce en un factor de 10 la duracion de la etapa de evolucion dirigida por cultivos cfclicos necesaria para la obtencion de mutantes capaces de fermentar al menos dicha pentosa (especialmente xilosa). La tasa de supervivencia se determina sembrando en placas de medio, cuya fuente de carbono es la glucosa, un volumen identico de la suspension de celulas antes y despues de la mutagenia. El numero de colonias se determina despues de 48 horas de crecimiento.
Preferiblemente, la limitacion de O2 de la etapa (ii) de esta variante se realiza gracias a la sobrepresion parcial en el equipo utilizado (por ejemplo, matraces o fermentadores) debido a una sobrepresion consecutiva a la produccion del CO2 producido.
Los cultivos cfclicos segun esta variante, en las condiciones de fermentacion, utilizados permiten enriquecer la poblacion en mutantes capaces de fermentar dicha pentosa (principalmente xilosa) y esto en un tiempo de 2 a 6 semanas y preferentemente de 3 a 4 semanas que es relativamente corto y muy interesante en comparacion con lo que se habrfa obtenido por quimiostato como describen Kuyper et al. (2004), FEMS Yeast Res., 4, 655-664.
Aunque el fenotipo con insuficiencia respiratoria "pequeno” pueda concordar con los criterios fermentacion de al menos dicha una pentosa, en esta variante los presentes inventores han realizado una etapa de eliminacion de levaduras “pequenas ya que este fenotipo es incompatible con los procedimientos de produccion de levaduras industrials en el sentido de la invencion.
Los investigadores han constatado que la etapa en la evolucion dirigida, tal como se explica anteriormente ha permitido aumentar de manera no despreciable la actividad de la xilosa isomerasa, lo que se ha traducido en un aumento de la velocidad de consumo de la xilosa.
Sin querer estar ligado por una teorfa, este efecto inesperado se debe aparentemente al aumento del numero de copias XI en la cepa modificada.
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La presente invencion ademas tiene por objeto la cepa EG6 de la levadura industrial Saccharomyces cerevisiae obtenida directamente por el procedimiento segun la invencion despues de la etapa de evolucion dirigida y que consiste en la cepa de levadura presentada el 23 de noviembre de 2010 a la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, Francia) con el n° I-4399 en las condiciones del Tratado de Budapest.
La presente invencion tiene igualmente por objeto la cepa EG7 de la levadura industrial Saccharomyces cerevisiae directamente obtenida por el procedimiento segun la invencion despues de la etapa de evolucion dirigida presentada el 23 de noviembre de 2010 a la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur) con el n° l-4400 en las condiciones del Tratado de Budapest.
La presente invencion tiene igualmente por objeto la cepa EG8 de la industrial Saccharomyces cerevisiae directamente obtenida por el procedimiento segun la invencion despues de la etapa de evolucion dirigida presentada el 14 de diciembre de 2010 a la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur) con el n° I-4417 en las condiciones del Tratado de Budapest.
La presente invencion tiene igualmente por objeto la cepa EG10 de la levadura industrial Saccharomyces cerevisiae directamente obtenida por el procedimiento segun la invencion despues de la etapa de evolucion dirigida presentada el 5 de octubre de 2011 en la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'IInstitut Pasteur) con el n° I-4538 N en las condiciones del Tratado de Budapest.
Otras cepas segun la invencion son cepas derivadas de una o mas cepas de la invencion, por ejemplo de una cepa o mas cepas obtenidas segun el procedimiento anterior, y principalmente de " una o mas cepas presentadas en la C.N.C.M. con el numero I-4399 el 23 de de noviembre de 2010, con el numero I-4400 el 23 de noviembre de 2010, con el numero I-4417 el 14 de diciembre de 2010 y con el numero I-4538 el 5 de octubre de 2011.
La expresion "cepa derivada", designa en especial las cepas derivadas por uno o o mas crecimientos y/o por mutacion y/o por transformacion genetica.
Las cepas derivadas por cruce pueden obtenerse cruzando una cepa segun la invencion con la misma cepa, u otra cepa segun la invencion, o cualquier otra cepa.
Las cepas derivadas por mutacion puede ser cepas que hayan experimentado al menos una mutacion espontanea en su genoma o al menos una mutacion inducida por mutagenia. La mutacion o mutaciones de cepas derivadas pueden ser imperceptibles o no.
El termino "mutagenia" designa tanto la mutagenia aleatoria obtenida por aplicacion de un rayo de luz (por ejemplo UV), o por agentes quimicos mutagenos, y la mutagenia por insercion o dirigida, por transposicion o por integracion de un fragmento de aDn exogeno.
Las cepas derivadas dentro del marco de lo expuesto son los que comprenden al menos un gen XI exogeno y un gen XDH exogeno, y que son capaces de fermentar la xilosa para producir etanol, y principalmente con un rendimiento medio de etanol producido sobre la xilosa consumida superior o igual a 0,2 g, preferentemente 0,3 g, 0,35 g o sea 0,38 g de etanol por g de xilosa consumida.
Estas cepas derivadas presentan ademas preferentemente una supresion del gen GRE3, y/o un control de los genes XKS1 y/o RPE1 y/o RKI1 y/o TKL1 y/o TAL1 bajo el control de un activador de un gen no reprimido por anaerobiosis o por represion catabolica inducida por cualquier fuente de carbono, y muy expresado durante la fermentacion alcoholica, tal como un activador de un gen que codifica una enzima de la glucolisis o que codifica la enzima alcohol deshidrogenasa, preferentemente el activador de ADH1, PGK1, TDH3, PDC2 o GAL1/10.
Preferiblemente ademas:
- la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae obtenida esta practica o completamente exenta de marcadores principalmente de resistencia a antibioticos.
Preferentemente, las cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae preparadas conforme a la presente invencion, segun los criterios definidos anteriormente, conservan, despues de la introduccion de modificaciones geneticas y otras mutaciones generadas durante la etapa de evolucion dirigida, sus caracteristicas genotipicas y fenotipicas despues de un proceso industrial completo de produccion. En especial, s levaduras producidas presentan una cinetica de produccion de alcohol, una cinetica de consumo de xilosa y/o arabinosa y una cantidad maxima de alcohol producido rigurosamente identicas a la cepa de levadura antes de la aplicacion de un proceso industrial completo.
Ademas, las caracteristicas industriales de la cepa seleccionada antes de la manipulacion tal como se describe anteriormente (tasa de crecimiento, rendimiento de produccion, capacidad de secado) permanecen inalteradas.
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La presente exposicion tiene ademas por objeto un procedimiento de produccion de etanol, a partir de un medio que comprende al menos una pentosa, por fermentacion con ayuda de una levadura segun la invencion, mencionada anteriormente, y tal que se obtiene por un procedimiento segun la invencion como se acaba de describir.
Preferiblemente, el procedimiento de produccion de etanol presenta las caracterfsticas alternativas y/o complementarias siguientes:
- Al menos dicha pentosa es la xilosa o una mezcla de xilosa y arabinosa.
- Dicho medio se selecciona del grupo constituido por, los hidrolizados de lignina, de celulosa, de hemicelulosa, de dextrinas o de almidon.
- En el caso de una solucion salina fisiologica, las velocidades medias de liberacion de hexosas, principalmente de glucosa, son del orden de 2,8 a 5,6 g/l/h con una concentracion extracelular en hexosa, principalmente glucosa, cero.
- El rendimiento medio de etanol producto sobre la xilosa consumida es superior o igual a 0,38 g de etanol por g de xilosa consumida, por ejemplo, puede ser aproximadamente de 0,40 g de etanol por g de xilosa consumida.
Las concentraciones de azucares que pueden aplicarse (por ejemplo, 70 g/kg de xilosa o 150 g/kg de xilosa) estan en conocimiento del solicitante, las concentraciones maximas que pueden encontrarse en la practica. Todos los ensayos publicados que se refieren a la fermentacion de la xilosa se han realizado con concentraciones significativamente inferiores en azucares totales.
Otras caracterfsticas y ventajas de la invencion llegaran a ser aun mejor en la lectura de los ejemplos de realizacion que siguen que se dan a tftulo puramente ilustrativo y no exhaustivo, y para la comprension de los cuales se hace referencia a los dibujos adjuntos.
Ejemplos
Ejemplo 1
La seleccion de la cepa es tal como se describe en la descripcion anterior.
Todas las secuencias de ADN que se han utilizado para las diferentes transformaciones destinadas a la sobreexpresion de un gen se han obtenido a partir de un vector tfpico (tipo pUC) en el que se han rechazado:
- las dianas de integracion;
- los activadores/terminadores seleccionados por gen de interes y
- los marcadores de resistencia seran eliminados despues (vease mas adelante).
Un ejemplo de vector utilizado para la sobreexpresion de la XDH de Pichia stipitis se ilustra en la figura 1.
Un ejemplo de vector utilizado para la sobreexpresion de la XI de Closthdium phytofermentans se ilustra en la figura 2.
Para la interrupcion de copias del gen GRE3 de la cepa industrial seleccionada, los inventores han utilizado amplificados PCR a partir de un plasmido de tipo pUG6 (Guldener U., Heck S., Fielder T., Beinhauer J., Hegemann J.H. Nucleic Acids Res. 1 Jul. 1996; 24(13):2519-24).
La etapa de transformacion de la levadura se llevo a cabo segun Gietz, R.D. y R.A. Woods. (2002) TRANSFORMATION OF YEAST BY THE Liac/SS CARRIER DNA/PEG METHOD. Methods in Enzymology 350: 87-96.
Las cepas de levadura segun la invencion, respectivamente EG6, EG7, EG8 y EG10 se han depositado en la CNCM y se les han atribuido los numeros I-4399, I-4400, I-4417 e I-4538, respectivamente.
Las cepas segun la invencion:
- poseen el genotipo siguiente:
Etanol Red™, Delta GRE3, BUD5::pADH 1 -XKS1-tCYC1, TAL1::pPGK1-TAL1-tCYC1, TKL1::pTDH3- TKL1- tCYC1, RPE1::pTDH3-RPE1-tCYC1, RKI1::pTDH3-RKI1-tCYC1, HO::PsXYL2-HYGRO, BUD5::CpXI-BLAST
- Estan desprovistos de cualquier marcador residual. (por accion de la recombinasa Cre).

Claims (31)

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    1. Cepa de levadura caracterizada por que consiste en genes exogenos de la ruta metabolica de la xilosa, en la que los genes exogenos de la ruta metabolica de la xilosa presentes en la cepa de levadura consisten en al menos una copia de un gen exogeno que codifica una xilosa isomerasa, y una copia de un gen exogeno que codifica una xilitol deshidrogenasa, y en la que ha experimentado una etapa posterior de evolucion dirigida que comprende las etapas sucesivas siguientes que consisten en someter a dicha cepa de levadura a:
    (i) una mutagenia,
    (ii) un crecimiento en cultivos cfclicos bajo O2 limitado en un medio que comprende al menos una pentosa, principalmente xilosa, y
    (iii) una seleccion por crecimiento aerobio en medio solido que contiene glicerol como unica fuente de carbono.
  2. 2. Cepa de levadura segun la reivindicacion 1, en el que el gen exogeno que codifica una xilosa isomerasa es un gen de Clostridium, Piromyces, Bacteroides, Streptomyces, Haemophilus, Burkholderia, Enterococcus, Thermotoga, Fusobacterium, Geobacillus, Arthrobacter, Ciona, Physcomitrella, Cellvibrio, Chitinophaga, Saccharopolyspora o Salinibacter, y preferiblemente es un gen de Clostridium phytofermentans o Piromyces sp. E2.
  3. 3. Cepa de levadura segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el gen exogeno que codifica una xilitol deshidrogenasa procede de Pichia stipitis.
  4. 4. Cepa de levadura segun una de las reivindicaciones 1 a 3, seleccionada entre Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces spp., Pichia spp., Paffia spp., Kluyveromyces spp., Candida spp., Talaromyces spp., Brettanomyces spp., Pachysolen spp. y Debaryomyces spp., y preferentemente es una cepa de Saccharomyces cerevisiae.
  5. 5. Cepa de levadura segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que se elimina al menos una copia, preferentemente al menos dos copias, de un gen que codifica una aldosa reductasa.
  6. 6. Cepa de levadura segun la reivindicacion 5, en el que el gen eliminado es GRE3.
  7. 7. Cepa de levadura segun una de las reivindicaciones 1 a 6, en la que un gen endogeno que codifica una xilulocinasa, preferentemente el gen XKS1, se coloca bajo el control de un activador de un gen no reprimido por anaerobiosis o por represion catabolica inducida por cualquier fuente de carbono, y muy expresado en la fermentacion alcoholica.
  8. 8. Cepa de levadura segun una de las reivindicaciones 1 a 7, en la que al menos un gen endogeno de la parte no oxidativa de la via de las pentosas fosfato, preferentemente seleccionado entre los genes RPE1, RKI1, TKL1 y TAL1, y de manera especialmente preferida todos estos genes, se colocan bajo el control de un activador de un gen no reprimido por anaerobiosis o represion catabolica inducida por cualquier fuente de carbono, y muy expresado en la fermentacion alcoholica.
  9. 9. Cepa de levadura segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el activador es el activador de un gen que codifica una enzima de la glucolisis o que codifica una enzima alcohol deshidrogenasa, preferentemente el activador de ADH1, PGK1, TDH3, PDC2 o GAL1/10.
  10. 10. Cepa de levadura segun una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada por que es una cepa aneuploide o poliploide y/o es una cepa prototrofa.
  11. 11. Cepa de levadura segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada por que comprende al menos dos copias del gen exogeno que codifica una xilosa isomerasa, preferentemente al menos tres copias o al menos cuatro copias del gen exogeno que codifica una xilosa isomerasa.
  12. 12. Cepa de levadura segun una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada por que es una cepa industrial que presenta resistencia a los inhibidores de fermentacion procedentes de la hidrolisis de la biomasa, tales como los productos fenolicos, furfural o acido acetico.
  13. 13. Cepa de levadura segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada por que produce una concentracion de etanol de al menos 16%, preferentemente de al menos 17% v/v, en un hidrolizado de cereales, en condiciones de sacarificacion y fermentacion simultaneas a 32°C.
  14. 14. Cepa de levadura segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada por que se selecciona del grupo consistente en la cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada en la C.N.C.M. el 23 de noviembre de 2010, con el n° I-4399, la cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada en la C.N.C.M. el 23 de noviembre de 2010, con el n° I-
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  15. 15. Cepa de levadura segun una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada por que es una cepa derivada de una o mas cepas definidas en la reivindicacion 14.
  16. 16. Procedimiento de preparacion de una cepa de levadura, que comprende la introduccion en una cepa de partida de genes exogenos de la ruta metabolica de la xilosa, en el que los genes exogenos de la ruta metabolica de la xilosa introducidos en la cepa de levadura de partida consistentes en al menos una copia de un gen exogeno que codifica una xilosa isomerasa, y al menos una copia de un gen exogeno que codifica una xilitol deshidrogenasa, y que comprende ademas una etapa posterior de evolucion dirigida que comprende las etapas sucesivas siguientes que consisten en someter a dicha cepa de levadura a:
    (i) una mutagenia,
    (ii) un crecimiento en cultivos cfclicos bajo O2 limitado en un medio que comprende al menos una pentosa, principalmente xilosa, y
    (iii) una seleccion por crecimiento aerobio en medio solido que contiene glicerol como unica fuente de carbono,
    de manera que se obtengan mutantes sin insuficiencia respiratoria de dicha levadura que presenten un crecimiento en anaerobiosis en presencia de un medio que comprende al menos dicha pentosa.
  17. 17. Procedimiento segun la reivindicacion 16, que comprende ademas la supresion de al menos una copia, preferiblemente al menos dos copias de un gen que codifica una aldosa reductasa, preferiblemente el gen GRE3, en la cepa de partida.
  18. 18. Procedimiento segun la reivindicacion 16 o 17, de preparacion de una cepa de levadura segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
  19. 19. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, de preparacion de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae capaz de producir etanol a partir de un medio que comprende xilosa y que comprende las etapas siguientes, consistentes en:
    (i) seleccionar una cepa de Saccharomyces cerevisiae,
    (ii) integrar las casetes de expresion siguientes en el genoma de la levadura de la etapa (i),
    a. la asociacion del tipo de marco abierto de lectura (ORF) de un gen que codifica una xilosa isomerasa bajo el control de un activador y de un terminador de Saccharomyces cerevisiae, estando dicha casete flanqueada aguas arriba y aguas abajo de las regiones recombinogenas que permiten la integracion dirigida en el genoma,
    b. la asociacion del tipo marco abierto de lectura (ORF) de un gen que codifica una xilitol deshidrogenasa bajo el control de un activador y un terminador de Saccharomyces cerevisiae, estando dicha casete flanqueada aguas arriba y aguas abajo de las regiones recombinogenas que permiten su integracion dirigida en el genoma,
    (iii) inducir la expresion de al menos un gen de cada etapa de la parte no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato asf como al menos un gen que codifica la xilulocinasa (XKS1), colocandolos bajo el control de un activador de un gen no reprimido ni por anaerobiosis ni por represion catabolica inducida por cualquier fuente de carbono, y muy expresado en la fermentacion alcoholica, y
    (iv) suprimir al menos dos copias del marco de lectura abierto (ORF) del gen GRE3 de Saccharomyces cerevisiae que codifica una aldosa reductasa.
  20. 20. Procedimiento segun la reivindicacion 19, caracterizado por que el gen que codifica una xilosa isomerasa es un gen Xl que codifica la enzima xilosa isomerasa seleccionada entre las presentes en los genomas de Clostridium, Piromyces, Bacteroides, Streptomyces, Haemophilus, Burkholderia, Enterococcus, Thermotoga, Fusobacterium, Geobacillus, Arthrobacter, Ciona, Physcomitrella, Cellvibrio, Chitinophaga, Saccharopolyspora o Salinibacter.
  21. 21. Procedimiento segun las reivindicaciones 19 o 20, caracterizado porque dicho gen XI se selecciona entre un gen de Clostridium phytofermentans o de Piromyces sp. E2.
  22. 22. Procedimiento segun las reivindicaciones 19 o 20, caracterizado por que el gen que codifica una xilitol deshidrogenasa es un gen de Pichia stipitis que codifica la enzima xilitol deshidrogenasa.
  23. 23. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado por que la cepa de levadura de la etapa (i) presenta una actividad xilitol deshidrogenasa XDH endogena inferior a 150mKat/g de protefnas.
  24. 24. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 19 a 23, caracterizado por que la cepa de levadura de la etapa (i) se selecciona entre las cepas industriales que presentan una resistencia a los inhibidores de la fermentacion procedentes de la hidrolisis de la biomasa, tales como los productos fenolicos, el furfural y el acido acetico.
  25. 25. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 19 a 24, caracterizado por que el activador de Saccharomyces 5 cerevisiae de la etapa (iii) se selecciona entre el grupo que comprende los activadores de genes que codifican las
    enzimas glucolfticas y los que codifican las enzimas alcohol deshidrogenasa.
  26. 26. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 25, caracterizado por que dicho grupo esta constituido por ADH1, PGK1, TDH3, PDC2 y GAL1/10, preferiblemente ADH1, y por que el terminador de Saccharomyces cerevisiae esta constituido por CYC1 o por el propio terminador del gen de la ruta no oxidativa de las
    10 pentosas fosfato.
  27. 27. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26, caracterizado por que la cepa de la etapa (i) es una cepa industrial seleccionada entre las cepas capaces de producir altas concentraciones de etanol, de al menos 17% v/v, en un hidrolizado de cereales, en condiciones de sacarificacion y fermentacion simultanea (SSF) y a 32°C.
  28. 28. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27, caracterizado por que comprende ademas una 15 o varias etapas de insercion de marcadores de resistencia a antibioticos, una o varias etapas de seleccion de cepas
    segun el criterio de su resistencia a los antibioticos, y una o varias etapas de escision de marcadores de resistencia a los antibioticos.
  29. 29. Procedimiento de produccion de etanol, a partir de un medio que comprende xilosa, por fermentacion de una levadura segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o de una levadura obtenida por un procedimiento segun
    20 una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 28.
  30. 30. Procedimiento segun la reivindicacion 29 caracterizado porque el medio comprende una mezcla de xilosa y arabinosa.
  31. 31. Procedimiento segun las reivindicaciones 29 o 30, caracterizado porque dicho medio se selecciona del grupo constituido por los hidrolizados de lignina, de celulosa, de hemicelulosa o de almidon.
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