BE1024788B1 - Werkwijze voor het beheren en verzenden van gist voor de productie van gefermenteerde dranken - Google Patents

Abstract

Een werkwijze voor gistbeheer omvattend het conserveren en propageren van gistcellen in een centrale gistinzamelfaciliteit en het verzenden van gistcellen van die gistinzamelfaciliteit naar afgelegen gistverwerkende plaatsen, waarbij de werkwijze voor gistbeheer omvat: a) Het conserveren van gistcellen bij een temperatuur van min 80 °C of minder; b) Het ontdooien van voornoemde gistcellen onder omstandigheden die herstel mogelijk maken van een meerderheid van de gistcellen; c) Het propageren van de ontdooide gistcellen; d) Het verpakken van ten minste een deel van de gepropageerde gistcellen voor vervoer naar gistverwerkende plaatsen; e) Productie van een gefermenteerde drank door inoculatie van een fermenteerbare wort met gistcellen die zijn gepropageerd uit de verpakte en vervoerde gistcellen van stap (d); f) Optioneel het conserveren van een deel van de gepropageerde gistcellen door het invriezen van de gistcellen bij een temperatuur van min 80 °C of lager, Met het kenmerk dat de werkwijze een stap omvat voor: g) het kweken van de gistcellen op een uitsluitend niet-fermenteerbare koolstofbron voor het selectief propageren van gistcellen met een regelmatige functionele ademhalingsketen (niet-petites).

Description

(73) Houder(s) :

ANHEUSER-BUSCH INBEV S.A.

1000, BRUSSEL

België (72) Uitvinder(s) :

DAENEN Luk 3000 LEUVEN België

CHRISTIAENS Joaquin 3000 LEUVEN België (54) Werkwijze voor het beheren en verzenden van gist voor de productie van gefermenteerde dranken (57) Een werkwijze voor gistbeheer omvattend het conserveren en propageren van gistcellen in een centrale gistinzamelfaciliteit en het verzenden van gistcellen van die gistinzamelfaciliteit naar afgelegen gistverwerkende plaatsen, waarbij de werkwijze voor gistbeheer omvat: a) Het conserveren van gistcellen bij een temperatuur van min 80 °C of minder; b) Het ontdooien van voornoemde gistcellen onder omstandigheden die herstel mogelijk maken van een meerderheid van de gistcellen; c) Het propageren van de ontdooide gistcellen; d) Het verpakken van ten minste een deel van de gepropageerde gistcellen voor vervoer naar gistverwerkende plaatsen; e) Productie van een gefermenteerde drank door inoculatie van een fermenteerbare wort met gistcellen die zijn gepropageerd uit de verpakte en vervoerde gistcellen van stap (d); f) Optioneel het conserveren van een deel van de gepropageerde gistcellen door het invriezen van de gistcellen bij een temperatuur van min 80 °C of lager, Met het kenmerk dat de werkwijze een stap omvat voor: g) het kweken van de gistcellen op een uitsluitend nietfermenteerbare koolstofbron voor het selectief propageren van gistcellen met een regelmatige functionele ademhalingsketen (niet-petites).

BELGISCH UITVINDINGSOCTROOI

FOD Economie, K.M.O., Middenstand & Energie

Publicatienummer: 1024788 Nummer van indiening: BE2017/5541

Dienst voor de Intellectuele Eigendom Internationale classificatie: C12N 1/18 C12N 1/04 C12C 11/00 C12C 12/00

Datum van verlening: 27/06/2018

De Minister van Economie,

Gelet op het Verdrag van Parijs van 20 maart 1883 tot Bescherming van de industriële Eigendom;

Gelet op de wet van 28 maart 1984 op de uitvindingsoctrooien, artikel 22, voor de voor 22 September 2014 ingediende octrooiaanvragen ;

Gelet op Titel 1 Uitvindingsoctrooien van Boek XI van het Wetboek van economisch recht, artikel XI.24, voor de vanaf 22 September 2014 ingediende octrooiaanvragen ;

Gelet op het koninklijk besluit van 2 december 1986 betreffende het aanvragen, verlenen en in stand houden van uitvindingsoctrooien, artikel 28;

Gelet op de aanvraag voor een uitvindingsoctrooi ontvangen door de Dienst voor de Intellectuele Eigendom op datum van 02/08/2017.

Overwegende dat voor de octrooiaanvragen die binnen het toepassingsgebied van Titel 1, Boek XI, van het Wetboek van economisch recht (hierna WER) vallen, overeenkomstig artikel XI.19, § 4, tweede lid, van het WER, het verleende octrooi beperkt zal zijn tot de octrooiconclusies waarvoor het verslag van nieuwheidsonderzoek werd opgesteld, wanneer de octrooiaanvraag het voorwerp uitmaakt van een verslag van nieuwheidsonderzoek dat een gebrek aan eenheid van uitvinding als bedoeld in paragraaf 1, vermeldt, en wanneer de aanvrager zijn aanvraag niet beperkt en geen afgesplitste aanvraag indient overeenkomstig het verslag van nieuwheidsonderzoek.

Besluit:

Artikel 1. - Er wordt aan

ANHEUSER-BUSCH INBEV S.A., Grand'Place 1, 1000 BRUSSEL België;

vertegenwoordigd door

VAN DAELE Maarten, Mechelsesteenweg 32 bus 103, 2018, ANTWERPEN;

een Belgisch uitvindingsoctrooi met een looptijd van 20 jaar toegekend, onder voorbehoud van betaling van de jaartaksen zoals bedoeld in artikel XI.48, § 1 van het Wetboek van economisch recht, voor: Werkwijze voor het beheren en verzenden van gist voor de produetie van gefermenteerde dranken.

UITVINDER(S):

DAENEN Luk , Brouwerijplein 1, 3000, LEUVEN;

CHRISTIAENS Joaquin, Brouwerijplein 1, 3000, LEUVEN;

VOORRANG:

AFSPLITSING :

Afgesplitst van basisaanvraag : Indieningsdatum van de basisaanvraag :

Artikel 2. - Dit octrooi wordt verleend zonder voorafgaand onderzoek naar de octrooieerbaarheid van de uitvinding, zonder garantie van de Verdienste van de uitvinding noch van de nauwkeurigheid van de beschrijving ervan en voor risico van de aanvrager(s).

Brussel, 27/06/2018,

Bij bijzondere machtiging:

BE2017/5541

Werkwijze voor het beheren en verzenden van gist voor de productie van gefermenteerde dranken nadeel

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het beheren van gist en het verzenden van de gist naar verwerkingsplaatsen, in het bijzonder voor de productie van gefermenteerde dranken.

Achtergrond van de uitvinding

Op dit moment, worden gistkulturen gepropageerd en vervoerd in de vorm van zogenaamde gisthellingen. Een van de huidige beheerswerkwi j ze is dat de gisthellingen een vrij groot aantal (tot 5 of zelfs meer) gistcellen kunnen bevatten met defecten in hun ademhalingsketen. Het brouwen van een wort of fermenteerbare wort met een gistcultuur omvattend dergelijke defecte gistcellen (petites), kan leiden tot een vertraagde fermentatie of gewoonlijk resulteren in een hogere productie van smaakafwijkingen tijdens fermentatie, waardoor de bierrijpingstijd aan het einde van fermentatie toeneemt en/of een ongewenst smaakprofiel van de gefermenteerde drank ontstaat en/of wordt uitgevlokt op een ongewenste tijd of tegen een ongewenste snelheid tijdens het fermentatieproces.

Aangezien het aantal petites de neiging heeft om toe te nemen tijdens hergebruik van gistpartijen tijdens volgende fermentatiecycli, kunnen gisthellingen met een groot aantal petites, niet garant staan voor brouwsels van hoge kwaliteit gedurende een aantal fermentatiecycli, wat leidt tot een kostenstijging voor brouwen.

Het is bekend dat petites defecten zijn in het mitochondriale of chromosomale DNA van de gist die optreden wanneer de gist wordt gekweekt onder verhoogde stressomstandigheden. Het gistbeheersysteem in, bv.

opeenvolgende aanzienlij ke

BE2017/5541 brouwerijen, omvat verscheidene processtappen waarin gistcellen zieh onder hoge stressomstandigheden bevinden. In het bijzonder, in bedrijven die gefermenteerde dranken produceren in een wereldwijd netwerk van brouwerijen, worden gistculturen gewoonlijk bewaard in een centrale gistverzameling die, op regelmatige basis, de gistculturen naar de verschillende brouwerijen verzendt.

In de centrale gistverzameling, worden de gistculturen geconserveerd door invriezing en opslag bij een temperatuur van min 80 °C of lager. Voor verzending, worden de gistculturen achtereenvolgens ontdooid, gepropageerd en overgebracht naar een voedingsmedium (agar) in een flacon of houder (de zogenaamde gisthellingen).

Tijdens het invriezen en ontdooien van de gistcultuur en zeifs daaropvolgende propagatie- en vervoerstappen, kunnen vrije zuurstofradicalen worden gevormd waarvan bekend is dat ze DNA-mutaties veroorzaken en de ademhalingsketen van de gistcellen kunnen beïnvloeden, wat mogelijk leidt tot gisthellingen met een grote hoeveelheid gistcellen met een déficiente functionele ademhalingsketen en het brouwproces in de brouwerijen negatief beïnvloeden.

De onderhavige uitvinding behandelt de bovenstaande Problemen en maakt het mogelijk om de kwaliteit van gistcellen te waarborgen in termen van levensvatbaarheid en fermentatiecapaciteit bij het verzenden van de gisthellingen.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor gistbeheer omvattend het conserveren en propageren van gistcellen in een centrale gistinzamelfaciliteit en het verzenden van gistcellen van die gistinzamelfaciliteit naar afgelegen gistverwerkende plaatsen, waarbij de werkwijze voor gistbeheer omvat:

BE2017/5541 (a) Het conserveren van gistcellen bij een temperatuur van min 80 °C of minder;

(b) Het ontdooien van voornoemde gistcellen onder omstandigheden die herstel mogelijk maken van een meerderheid van de gistcellen;

(c) Het propageren van de ontdooide gistcellen;

(d) Het verpakken van ten minste een deel van de gepropageerde gistcellen voor vervoer naar gistverwerkende plaatsen;

(e) Productie van een gefermenteerde drank door inoculatie van een fermenteerbare wort met gistcellen die zijn gepropageerd uit de verpakte en vervoerde gistcellen van stap (d);

(f) Optioneel het conserveren van een deel van de gepropageerde gistcellen door het invriezen van de gistcellen bij een temperatuur van min 80 °C of lager,

Met het kenmerk dat de werkwijze een stap omvat voor :

(g) het kweken van de gistcellen op een uitsluitend niet-fermenteerbare koolstofbron voor het selectief propageren van gistcellen met een regelmatige functioneie ademhalingsketen (nietpetites).

Bij voorkeur, omvat de uitvinding een aanvullende stap voor het conditioneren van de gistcellen voor conservering.

Werkwij zestap (f) kan op elk moment tijdens de bovenstaande werkwijze worden uitgevoerd zoals na het ontdooien van de gistcellen; tijdens het propageren van de ontdooide gistcellen; voor, tijdens of na het propageren van de gistcellen; vddr of tijdens het conditioneren; of voorafgaand aan het optioneel invriezen van de gistcellen.

In werkwi j zestap (f) worden de gistcellen BE2017/5541 gekweekt op de uitsluitend niet-fermenteerbare koolstofbron gedurende een période die het toelaat om ten minste 3 verdubbelingscycli van de gistcellen met een regelmatige functionele ademhalingsketen te hebben. De nietfermenteerbare koolstofbron wordt hierbij bij voorkeur gekozen uit de groep omvattend: glycerol, lactaat, ethanol en/of mengsels daarvan.

Voor het bevriezen van de gist(cultuur) voor conservering, wordt de gist bij voorkeur gepropageerd op een koolstofbron omvattend maltose en trehalose en/of kan deze worden behandeld met RNAlater of Allproctect.

Tijdens conservering, kunnen de gistcellen in contact komen met een medium omvattend een nietfermenteerbare koolstofbron; op een medium omvattend zink; een medium omvattend een zuurstofbinder en/of een antioxidant (bv. glutathion); een medium omvattend 15 tot 80 gew.%, bij voorkeur 60 tot 80 gew.%, glycerol als cryoprotectant.

De gistcellen worden bij voorkeur verpakt in een flacon of houder omvattend een agar omvattend een koolstofbron, waarbij de gistcellen niet worden verschaft als enkele kloonvormende kolonies (er worden geen point single clones geselecteerd). Dit is vooral het geval wanneer de gistcellen een complexe cultuur vormen. De agar omvattend een fermenteerbare koolstofbron, bevat bij voorkeur een gistmoutwort (bv. 3 g/L gistextract, 3 g/L moutextract, 5 g/L pepton en 10 g/L dextrose)

De flacons of houders kunnen hermetisch worden afgedicht na introductie van de gistcellen. Eventueel is een zuurstofbinder voorzien in voornoemde flacon of houder.

De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op flacons of houders omvattend een gistcultuur voor het vervoeren van de gistcellen volgens de hierboven beschreven werkwijze. De gistcultuur in voornoemde flacon of houder BE2017/5541 omvat ten minste 99 % van gistcellen met een regelmatige functionele ademhalingsketen (max. 1 % petites).

Bij voorkeur, is de flacon of houder volgens de uitvinding vervaardigd uit of bedekt met een materiaal met een doorlaatbaarheid voor straling met een golflengte die varieert van 10 nm tot 400 nm van minder dan 20 %.

De werkwijze en flacons of houders volgens de onderhavige uitvinding worden geacht bijzonder geschikt te zijn voor het verzenden van gistculturen voor de bereiding van een gefermenteerde drank op de gistverwerkende plaats.

Ten slotte, omvat de gistcultuur bij voorkeur gist van een Saccharomyces sp.

KORTE BESCHRIJVING VAN DE TEKENINGEN

Fig. la Een cultuur (contrôle) omvattend zowel normale (rood, grijs op de figuren) als respiratoir déficiente (witte, kleine) cellen, heeft verschillende fenotypes wanneer ze op een YPD-plaat wordt geplateerd (gistextract 1 % ; pepton 2 % ; dextrose 2 % ; agarose 2 %) en wordt bedekt met TTC (2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride);

Fig. lb De cultuur die is bereid volgens een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding die wordt geplateerd op hetzelfde type plaat als hierboven (gistextract 1 %, pepton 2 %, dextrose 2 %, agarose 2 %) en wordt bedekt met TTC (2,3, 5-trifenyltetrazoliumchloride).

UITGEBREIDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

BE2017/5541

De levensvatbaarheid van gist (bv. Saccharomyces cerevisiae) in een drankfermentatieproces is een belangrijk kenmerk voor het optimaliseren van de omzetting van suikers in ethanol en voor het optimaliseren van de produetie van gewenste smaakverbindingen die essentieel zijn voor de organoleptische handtekening van de resulterende drank.

Volgens de onderhavige uitvinding kunnen gistlevensvatbaarheid en gistkwaliteit worden gewaarborgd. Bij de produetie van bier, worden gisten gewoonlijk längere tijd opgeslagen (geconserveerd) in een diepvriezer bij temperaturen van -80 °C of lager. De gistconservering kan worden bereikt door op de eerste plaats de gistcellen te conditioneren en vervolgens de geconditioneerde gistcellen in te vriezen. Een voorbeeld van gistconservering omvat de stappen van, het aseptisch inoculeren van een gist in een steriele brouwerswort en vervolgens het propageren van de gist in aseptische omstandigheden.

Na propagatie wordt een, bij voorkeur klein, monster van de gist overgebracht naar een cryovial en gemengd met een cryoprotectantoplossing, zoals een 15-80 gew.%, bij voorkeur 60-80 gew.% glyceroloplossing. De cryovial wordt vervolgens afgesloten en opgeslagen in een vriezer bij -80 °C of minder.

Aangezien het invriezen van de gistcellen en vervolgens het ontdooien van de gistcellen het best worden uitgevoerd bij hoge snelheid, heeft het de voorkeur om cryovials met beperkt volume (bv. 4 ml) te gebruiken.

Een voorbeeld van gistconservering omvat het aseptisch inoculeren van gist (bv. uit een agarmedium, eventueei omvattend trehalose en/of maltose) in een geautoclaveerde 500 ml Schott-fies die is gevuld met 90 ml steriele, 13,5° Plato Brewers-wort. De fies wordt afgesloten met een waterslot en gerncubeerd op een

Ί schudplateau bij 105 tpm in een incubator bij 19 °C. Na 42 uur incubatie (gistpropagatie), wordt een 2,1 ml monster van de gist toegevoegd aan een 4 ml steriele cryovial (bv. Cryoclear™ van Globe Scientific Inc.) waaraan 0,9 ml steriele 73 % v/v glyceroloplossing wordt toegevoegd waarna beide worden gemengd. Na het mengen, wordt de cryovial opgeslagen bij een temperatuur van -80 °C voor conservering.

Aangezien gistculturen die worden gebruikt in drankenfermentatieprocessen zullen evolueren tijdens latere fermentatiecycli, is het nodig om te beginnen met een 'verse' gistcultuur voor fermentatie na een bepaaid aantal brouwcycli (gewoonlijk na 4, 5 of 6 fermentatiecycli) om de kans te beperken op het brouwen van een partij gefermenteerde drank met een ongewenst organoleptisch profiel.

De 'verse' gist kan ofwel worden gepropageerd op basis van een ontdooide gist die uit de diepvriezer is gehaald ofwel op basis van een gistcultuur die is gepropageerd op basis van een monster van gepropageerde ontdooide gist die uit de diepvriezer is gehaald.

Net als bij grotere brouwerijen, is gistconservering gecentraliseerd, verse gistmonsters moeten op regelmatige tijdsintervallen naar verschillende brouwerijen worden verzonden en de gistlevensvatbaarheid in deze monsters moet worden gewaarborgd doorheen het gehele gistbeheersysteem van conservering tot fermentatie.

Om de gistlevensvatbaarheid te waarborgen of zelfs te verbeteren tijdens de daaropvolgende delen van het gistbeheersysteem, verschaft de onderhavige uitvinding een werkwijze omvattend:

i. Het ontdooien van voornoemde gistcellen onder omstandigheden die herstel mogelijk maken van een meerderheid van de gistcellen;

BE2017/5541 van ii. Het propageren van de ontdooide gistcellen;

iii. Het verpakken van ten minste een deel van de gepropageerde gistcellen voor vervoer naar gistverwerkende plaatsen;

iv. Het produceren van een gefermenteerde drank door inductie van een fermenteerbare wortmet gistcellen die zijn gepropageerd uit de verpakte en vervoerde gistcellen van stap (iii);

v. Optioneel het conserveren van een deel van de gepropageerde gistcellen door het invriezen van de gistcellen bij een temperatuur van min 80 °C of lager, waarbij in overeenstemming met de onderhavige uitvinding, de werkwijze een stap omvat voor:

vi. het kweken van de gistcellen op een uitsluitend niet-fermenteerbare koolstofbron voor het selectief propageren van gistcellen met een regelmatige functionele ademhalingsketen (niet-petites).

Het kweken van de gistcellen op een uitsluitend niet-fermenteerbare koolstofbron zoals glycerol, lactaat of ethanol, maakt het mogelijk om alleen die gistcellen te propageren die een regelmatige functionele ademhalingsketen hebben en dus niet-fermenteerbare suikers kunnen gebruiken als koolstofbron, wat niet het geval is voor gistcellen die defecten hebben in hun mitochondriale DNA.

Als voorbeeld van de bovenstaande werkwijze volgens de uitvinding, wordt een cryovial die is opgeslagen bij -80 °C (uitgaande van het hierboven beschreven opslagen conserveringsvoorbeeld) uit de diepvriezer gehaald en ontdooid door deze in een waterbad van 31 °C te plaatsen. Aangezien de cryovial bij voorkeur slechts een beperkt volume gistoplossing (bv. 3 ml) bevat, wordt ontdooien bij hoge snelheden bereikt.

Vervolgens wordt een monster (bv. 900 microliter) het cryovialgehalte overgebracht naar een geautoclaveerde Schott-fles die is gevuld met 90 ml BE2017/5541 steriele, 13,5° Plato Brouwers-wort. De fies wordt afgesloten met een waterslot en gelncubeerd op een schudplateau bij 105 tpm in een incubator bij 19 °C. Na 42 uur incubatie, wordt 900 microliter van de gistcultuur overgebracht naar een geautoclaveerde 500 ml Schott-fles die is gevuld met 90 ml steriel YPGlycerol-medium (gistextract 1 % w/w; pepton 2 % w/w; glycerol 2,5 % v/v en

water). De	fies	wordt afgesloten door	een	waterslot	en
gelncubeerd	op	een schudplateau bij	105	tpm in	een
incubator	bij	19 °C waardoor	ten	minste	3

verdubbelingscycli van de gistcellen (bv. 66 uur) mogelijk zijn. Aangezien het YPGlycerol-medium geen fermenteerbare suikers bevat, zullen alleen gistcellen propageren die koolstof uit glycerol kunnen terugwinnen. Na 66 uur incubatie wordt het mengsel grondig gehomogeniseerd en gelncubeerd op een YM-agar (gistextract 1 % w/w; moutextract 3 % w/w; agar 2 % w/w en water) in een buisje. Het buisje wordt dan afgesloten met een katoenprop en gelabeld.

Het buisje (ook wel gisthelling genoemd) wordt 48 tot 72 uur bij 24 °C gelncubeerd, vervolgens afgekoeld tot 4 °C en dan in een veilige houder in een afgekoeld transport naar een gistverwerkende plaats verzonden.

Een deel van de gist die op de YM-agar is gelncubeerd wordt gewoonlijk gebruikt als uitgangspunt voor conservering bij -80 °C of lager zoals hierboven geopenbaard.

Ter ondersteuning van de uitvinding, toont figuur 1 een gistcultuur die is bereid volgens werkwijzestappen i) en ii) zoals hierboven geïdentificeerd, terwiji figuur 2 een gistcultuur toont op basis van hetzelfde conserveringsmonster als de cultuur op figuur 1, maar dan bereid volgens een werkwijze volgens de onderhavige

BE2017/5541 uitvinding zoals hierboven is toegelicht. Het is duidelijk dat er geen respiratoir déficiente kolonies achterblijven na de kweekstap op YPGlycerol, een medium dat als enige koolstofbron glycerol heeft, een uitsluitend nietfermenteerbare koolstofbron

De gistverwerkende plaats kan ofwel een brouwerij ofwel een laboratorium zijn, waar de gist wordt gepropageerd en vervolgens wordt gernoculeerd in een fermenteerbare wortvoor drankproductie of wordt verzonden naar een brouwerij om hetzelfde te doen.

Naast gistextract, moutextract, agar en water, kan de YM-agar ook trehalose- en/of graanwortels bevatten.

Tijdens vervoer, kunnen de gisthellingen worden afgesloten met een katoenprop of hermetisch worden afgedicht. Bovendien kan een zuurstofbinder en/of antioxidant zoals glutathion in het buisje of de agar worden verschaft.

Biergistculturen kunnen duidelijk gedefinieerde gistculturen of ongedefinieerde gistculturen zijn, maar aangezien tijdens het gehele gistbeheersysteem en tijdens het brouwen de gistcellen aan meerdere stresstactoren worden onderworpen, heeft het de voorkeur dat gedurende de gehele gistbeheersystemen werken met enkele klonen (point single clones) wordt vermeden.

BE2017/5541

1. Een werkwijze voor gistbeheer omvattend het conserveren en propageren van gistcellen in een centrale gistinzamelfaciliteit en het verzenden van gistcellen van die gistinzamelfaciliteit naar afgelegen gistverwerkende plaatsen, waarbij de werkwijze voor gistbeheer omvat:

a) Het conserveren van gistcellen bij een temperatuur van min 80 °C of minder;

b) Het ontdooien van voornoemde gistcellen onder omstandigheden die herstel mogelijk maken van

Claims (12)

1. CONCLUSIES

   een meerderheid van de gistcellen; c) Het propageren van de ontdooide gistcellen; d) Het verpakken van ten minste een deel

   van de gepropageerde gistcellen voor vervoer naar gistverwerkende plaatsen;

   e) Productie van een getermenteerde drank door inoculatie van een fermenteerbare wort met gistcellen die zijn gepropageerd uit de verpakte en vervoerde gistcellen van stap (d);

   f) Optioneel het conserveren van een deel van de gepropageerde gistcellen door het invriezen van de gistcellen bij een temperatuur van min 80 °C of lager,

   Met het kenmerk dat de werkwijze een stap omvat voor :

   g) het kweken van de gistcellen op een uitsluitend niet-fermenteerbare koolstofbron voor het selectief propageren van gistcellen met een regelmatige functionele ademhalingsketen (niet- petites). 2 . De werkwijze volgens conclusie 1, omvattend

   een stap voor het conditioneren van de gistcellen voor conservering.

   BE2017/5541
2. 3. De werkwijze voigens conclusie 2, omvattend het uitvoeren van werkwijzestap (f) na het ontdooien van de gistcellen; tijdens propagatie van de ontdooide gistcellen; voor, tijdens of na propagatie van de gistcellen; voor of tijdens de conditionering van de gistcellen; of voorafgaand aan de optionele invriezing van de gistcellen.
3. 4. De werkwijze voigens één van de voorgaande conclusies, waarbij de niet-fermenteerbare koolstofbron is gekozen uit de groep omvattend: glycerol, lactaat, ethanol en/of mengsels daarvan.
4. 5. De werkwijze voigens één van de voorgaande conclusies, waarbij de gistcellen worden gekweekt op de uitsluitend niet-fermenteerbare koolstofbron gedurende een période die het toelaat om ten minste 3 verdubbelingscycli van de gistcellen met een regelmatige functionele ademhalingsketen te hebben.
5. 6. De werkwijze voigens één van de voorgaande conclusies, waarbij de gistcellen zijn verpakt in een flacon of houder omvattend een koolstofbron, eventueel inclusief trehalose.

   agar omvattend een graanwortels en/of
6. 7. De werkwijze voigens conclusie 6, omvattend het verschaffen van een zuurstofbinder in voornoemde flacon of houder.
7. 8. De werkwijze voigens één van de voorgaande conclusies, waarbij voorafgaand aan conservering, de gist wordt gepropageerd op een koolstofbron omvattend maltose en/of trehalose.
8. 9. De werkwijze voigens één van de voorgaande conclusies, waarbij tijdens conservering, de gistcellen in contact zijn met een medium omvattend een nietfermenteerbare koolstofbron, anders dan ethanol.
9. 10. De werkwijze voigens één van de voorgaande conclusies, waarbij tijdens één van de stappen a) tot f), de gistcellen in contact zijn met een medium omvattend een zuurstofbinder en/of een antioxidant (bv. glutathion).
10. 11. De werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij tijdens conservering, de gistcellen in contact zijn met een medium omvattend 15 tot 80 gew.% glycerol als cryoprotectant, bij voorkeur bij 60-80 gew.%.
11. 12. De werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij niet wordt gewerkt met enkele klonen (er worden geen point single clones geselecteerd) .
12. 13. De werkwijze of verpakking volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij de gistcellen een een Saccharomyces sp. zijn.

    BE2017/5541

    BE2017/5541