KR101843158B1 - 아라비노스 이송체를 도입한 효모를 이용한 자일리톨 및 에탄올 생산 - Google Patents

아라비노스 이송체를 도입한 효모를 이용한 자일리톨 및 에탄올 생산 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일 실시예는 아라비노스 수송 단백질(arabinose transport protein) 유전자, 자일로스 환원효소(xylose reductase) 유전자, 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase) 유전자, 및 자일룰로스 인산화효소(xylulose kinase) 유전자를 포함하는, 자일리톨 및 에탄올 제조용 재조합 미생물을 제공한다.

Description

아라비노스 이송체를 도입한 효모를 이용한 자일리톨 및 에탄올 생산{PRODUCTION OF XYLITOL AND ETHANOL BY RECOMBINANT SACCHAROMYCES CEREVISIAE EXPRESSING ARABINOSE TRANSPORTER}
본 발명은 자일리톨 및 에탄올 제조용 재조합 미생물 및 이를 이용한 자일리톨 및 에탄올의 제조방법에 관한 것이다.
화석 연료는 지구상에 한정적으로 존재하기 때문에, 최근 이의 고갈 문제가 부각되면서 이들을 대체할 수 있는 자원에 대한 관심이 전세계적으로 급증하고 있다.
이러한 대체 자원 중 생물 자원, 즉 바이오매스는 환경 친화적이면서도 유용한 에너지로 전환하기 위한 비용이 상대적으로 적게 요구되므로, 이에 대한 연구 개발이 지속적으로 이루어지고 있다.
자일로스는 폐목재, 쌀짚, 밀짚, 억새와 같은 목초본계 바이오매스의 30% 이상의 비중을 차지하는 주요 구성 성분으로 자리하고 있다. 이에 따라, 미생물을 이용하여 자일로스를 유용한 화합물로 전환하는 기술과 관련된 다양한 시도가 이루어지고 있다. 이러한 자일로스 전환 기술에서, 미생물이 자일로스를 신속하고 효율적으로 유입 및 대사하는 것이 필수 조건이라 할 수 있다.
자일로스를 대사할 수 있는 미생물은 자연계에 다수 존재하나, 이들 대부분은 고삼투압적 환경, 혐기적 환경, 또는 목초본계 바이오매스의 전처리 공정에서 발생하는 발효 저해제가 존재하는 환경에 대한 취약한 내성을 나타내므로 산업적으로 이용하는 데 한계가 있다.
반면, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모는 상기와 같은 환경에 강한 내성을 보유하고 있는 장점이 있으나, 자일로스를 대사할 수 있는 효소를 보유하고 있지 않기 때문에, 이를 극복하기 위한 대사공학적 접근이 활발하게 이루어지고 있다.
다만, 현재까지 효모를 이용하여 자일로스를 자일리톨, 에탄올 등의 화합물로 전환하는 기술은 생산성이 미흡하기 때문에, 이를 해결할 수 있는 기술의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 자일리톨 및 에탄올의 생산성을 향상시킬 수 있는 재조합 미생물, 및 이를 이용한 자일리톨 및 에탄올의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면은 아라비노스 수송 단백질(arabinose transport protein) 유전자, 자일로스 환원효소(xylose reductase) 유전자, 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase) 유전자, 및 자일룰로스 인산화효소(xylulose kinase) 유전자를 포함하는, 자일리톨 및 에탄올 제조용 재조합 미생물을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 아라비노스 수송 단백질은 AraE 단백질일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 아라비노스 수송 단백질 유전자는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 유래할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 아라비노스 수송 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 자일로스 환원효소 유전자, 자일리톨 탈수소효소 유전자, 및 자일룰로스 인산화효소 유전자는 쉐퍼소마이세스 스티피티스(Scheffersomyces stipitis)에서 유래할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 자일로스 환원효소, 자일리톨 탈수소효소, 및 자일룰로스 인산화효소는 각각 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 미생물은 효모일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 측면은 (a) 자일로스를 배지에 투입하는 단계; 및 (b) 자일로스가 투입된 상기 배지에서 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계;를 포함하는, 자일리톨 및 에탄올의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 효모와 같은 미생물에 아라비노스 수송 단백질 유전자와 자일로스 환원효소 유전자를 도입하여 발현시킴으로써 자일로스 유입능 및 자일리톨 생산성을 향상시킬 수 있다.
또한, 상기 미생물에 자일리톨 탈수소효소 유전자와 자일룰로스 인산화효소 유전자를 도입 및 발현시킴으로써 에탄올 생산성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 자일리톨 및 에탄올의 제조방법을 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예 및 일 비교예에 따른 재조합 미생물의 공초점 현미경 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 미생물의 모식도이다.
도 4는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 재조합 미생물의 자일로스 소모량 및 자일리톨 생산량을 측정한 값을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 재조합 미생물의 모식도이다.
도 6은 본 발명의 다른 일 실시예 및 일 비교예에 따른 재조합 미생물의 건조 중량을 측정한 값을 나타낸 그래프이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
이하, 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 일 측면에 따른 자일리톨 및 에탄올 제조용 재조합 미생물이 아라비노스 수송 단백질(arabinose transport protein) 유전자, 자일로스 환원효소(xylose reductase) 유전자, 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase) 유전자, 및 자일룰로스 인산화효소(xylulose kinase) 유전자를 포함할 수 있다.
상기 재조합 미생물은 형질 전환에 의해 대사 조작된 상기 숙주 세포(host cell)를 의미한다. 상기 숙주 세포는 발현 벡터에 의한 형질 전환이 용이한 세포를 지칭하는 것으로 유전 공학적 방법에 의해 형질 전환되어 특정의 유전자를 효율적으로 발현할 수 있으면 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 상기 적합한 숙주 세포는 자연적으로 발생하거나 또는 야생형 숙주 세포일 수 있고, 또는 변화된 숙주세포일 수 있다. 상기 야생형 숙주 세포(wide-type host cell)는 재조합 방법에 의해 유전적으로 변화되지 않은 숙주 세포일 수 있다.
상기 “대사 조작된(metabolically engineered)" 또는 "대사 조작(metabolic engineering)"은 미생물에서 알코올 또는 단백질과 같은 원하는 대사산물의 생산을 위하여, 생합성 유전자, 오페론과 연관된 유전자, 그리고 이들 핵산 서열의 제어 요소(control elements)의 합리적 경로 디자인과 어셈블리를 수반할 수 있다.
또한, 상기 "대사 조작된"은 유전자 조작과 적절한 배양 조건을 이용한 전사(transcription), 번역(translation), 단백질 안정성(protein stability), 단백질 기능성(protein functionality)의 제어를 통한 대사 흐름(metabolic flux)의 최적화를 더욱 포함할 수 있다. 생합성 유전자는 숙주에 외인성이거나, 돌연변이유발(mutagenesis), 재조합(recombination) 또는 내인성 숙주 세포에서 이종 발현 제어 서열과의 연관에 의해 변형됨으로써, 숙주(예컨대, 미생물)에 이종성일 수 있다.
상기 재조합 미생물의 숙주 세포는 효모일 수 있고, 구체적으로 고삼투압적 환경, 혐기적 환경, 또는 발효 저해제가 존재하는 환경 등에 강한 내성을 가지는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.
다만, 야생형(wild type)의 사카로마이세스 세레비지애는 자일로스 환원효소 유전자인 xyl1, 및 자일리톨 탈수소효소 유전자인 xyl2가 존재하지 않아 자일로스를 탄소원으로 이용하여 대사할 수 없다. 또한, 자일룰로스 인산화효소 유전자인 xyl3가 존재하지만, 이에 따른 자일룰로스 인산화효소의 발현량이 미미하여 이로부터 에탄올을 생산하는 것에는 한계가 있다.
따라서, 상기 야생형의 사카로마이세스 세레비지애에 아라비노스 수송 단백질 유전자, 자일로스 환원효소 유전자 등을 도입함으로써 환경 저항성 및 자일로스 대사능이 우수한 재조합 미생물을 제작할 수 있다.
상기 "대사 조작된(engineered)" 또는 "변형된(modified)" 미생물은 유전 물질을 선택된 숙주 또는 부모 미생물 내로 도입하여 미생물의 세포 생리와 생화학을 변형하거나 변경함으로써 생산될 수 있다. 유전 물질의 도입을 통하여, 부모 미생물은 새로운 성질, 예컨대, 새로운 세포 내 대사산물 또는 더욱 많은 양의 세포 내 대사산물을 생산하는 능력을 획득할 수 있다.
유전 물질의 부모 미생물 내로의 도입은 화학 물질을 생산하는 새롭거나 변형된 능력을 초래할 수 있다. 부모 미생물에 도입된 유전 물질은 화학 물질 생산을 위한 생합성 경로에 관여하는 하나 이상의 효소를 코딩하는 유전자 또는 유전자의 일부를 포함하고, 이들 유전자의 발현 또는 발현 조절을 위한 추가 구성요소, 예를 들면, 프로모터 서열을 포함할 수도 있다.
상기 "변화된 숙주 세포(altered host cell)"는 유전적으로 설계된 숙주 세포를 의미하며, 여기서 목적 단백질은 발현의 수준으로 생성되거나 발현의 수준보다 더 큰 수준으로 생성되거나 본질적으로 동일한 성장 조건 하에서 성장하는 미변화된 또는 야생형 숙주 세포내에서의 목적 단백질의 발현의 수준보다 큰 발현의 수준으로 발현된다. "변형 숙주 세포(modified host cell)"은 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 과발현되도록 유전적으로 설계되는 야생형 또는 변화된 숙주 세포를 의미한다. 상기 변형 숙주 세포는 야생형 또는 변화된 모 숙주 세포보다 더 높은 수준으로 목적 단백질을 발현할 수 있다.
한편, 상기 “형질 전환”은 상기 벡터를 미생물 내로 운반하는 방법을 의미하며, 형질 전환 하고자 하는 세포가 원핵세포인 경우에는, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110- 2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.
형질 전환 하고자 하는 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell. Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990))등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
효모와 같은 진균의 형질 전환의 경우에는, 일반적으로 리튬 아세테이트(Lithium acetate, R.D. Gietz, Yeast 11, 355360(1995)) 및 열 충격(Keisuke Matsuura, Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 100, 5; 538-544(2005))을 이용한 형질 전환법과 전기천공법(Nina SkoluckaAsian, Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 94-98(2011))에 의해 실시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합 미생물은 상기 아라비노스 수송 단백질 유전자, 자일로스 환원효소 유전자, 자일리톨 탈수소효소 유전자, 및 자일룰로스 인산화효소 유전자를 과발현 할 수 있다.
상기 아라비노스 수송 단백질은 세포막에 존재하여 오탄당인 아라비노스를 세포 내로 유입시키는 수송 단백질로서, 유사한 구조의 자일로스를 세포 내로 유입시킬 수 있다. 따라서, 상기 아라비노스 수송 단백질을 발현하는 재조합 미생물은 자일로스 유입능이 개선될 수 있다.
구체적으로, 상기 아라비노스 수송 단백질은 AraE 단백질일 수 있고, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 유래할 수 있다.
상기 바실러스 서브틸리스 유래의 AraE 단백질은 다수의 소수성 영역을 포함하므로 자일로스 친화성이 우수하며, 타 종에서 유래한 AraE 단백질과 비교하여 자일로스 유입능을 더욱 효과적으로 증진시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 바실러스 서브틸리스 유래의 아라비노스 수송 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 아라비노스 수송 단백질에 의해 자일로스가 상기 재조합 미생물 내로 유입되면, 상기 자일로스는 자일로스 대사 경로에 따라 자일리톨과 에탄올로 전환될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “대사 경로(metabolic pathway)”는 숙주 세포 내에서 일어나는 하나의 효소적 반응의 생성물이 다음 반응을 위한 기질이 되는 일련의 효소적 반응을 의미한다.
구체적으로, 상기 재조합 미생물 내로 유입된 자일로스는 미생물 내에 존재하는 자일로스 환원효소에 의해 자일리톨로 전환될 수 있다. 다만, 상기 자일로스 환원효소만을 포함하는 미생물은 자일로스로부터 자일리톨만을 생성할 수 있고, 에탄올을 생성하기 위해서는 글루코오스를 별도의 기질로 사용해야 한다.
따라서, 상기 재조합 미생물 내에 자일리톨 탈수소효소와 자일룰로스 인산화효소를 발현시키는 유전자를 도입함으로써 자일로스 기질로부터 자일리톨 뿐만 아니라 에탄올까지 효과적으로 생산할 수 있다.
구체적으로, 상기 재조합 미생물 내에 생성된 자일리톨은 상기 자일리톨 탈수소효소에 의해 자일룰로스로 전환될 수 있고, 상기 자일룰로스는 상기 자일룰로스 인산화효소에 의해 에탄올로 전환될 수 있다.
한편, 상기 자일로스 환원효소 유전자, 자일리톨 탈수소효소 유전자, 및 자일룰로스 인산화효소 유전자는 쉐퍼소마이세스 스티피티스(Scheffersomyces stipitis)에서 유래할 수 있다.
상기 쉐퍼소마이세스 스티피티스 유래의 자일로스 환원효소 유전자는, NADH를 보조인자로 사용하는 자일로스 환원효소를 과발현하는 변형된 유전자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
통상적인 자일로스 환원효소는 NADH와 NADPH를 모두 보조인자로 사용하고, 자일리톨 탈수소효소는 NAD+를 보조인자로 사용하므로, 미생물 내에서 대사 경로가 진행되면서 보조인자 간 불균형이 야기될 수 있다.
반면, 상기 쉐퍼소마이세스 스티피티스 유래의 자일로스 환원효소는 NADPH가 아닌 NADH만을 보조인자로 사용하므로 상기 불균형을 해소하여 대사 효율을 증대시킬 수 있다.
구체적으로, 상기 자일로스 환원효소, 자일리톨 탈수소효소, 및 자일룰로스 인산화효소는 각각 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 아라비노스 수송 단백질 유전자가 바실러스 서브틸리스에서 유래하고, 상기 자일로스 환원효소 유전자, 자일리톨 탈수소효소 유전자, 및 자일룰로스 인산화효소 유전자가 쉐퍼소마이세스 스티피티스에서 유래한 경우, 이들 유전자 중 어느 하나 이상이 타 종에서 유래한 경우에 비해 자일리톨 및 에탄올의 생산성을 증대시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 자일리톨 및 에탄올의 제조방법을 도식화한 것이다. 도 1을 참고하면, 본 발명의 다른 일 측면에 따른 자일리톨 및 에탄올의 제조방법이 (a) 자일로스를 배지에 투입하는 단계; 및 (b) 자일로스가 투입된 상기 배지에서 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 (a) 단계는 자일로스를 기질로 투입한 배지를 준비하는 단계로, 자일로스 외에 상기 재조합 미생물의 성장에 필요한 보충물 등이 더 첨가될 수 있다.
예컨대, 상기 배지는 글루코오스, 말토오스와 같은 탄소원, 황산 암모늄, 염화 암모늄, 질산 암모늄 및 우레아와 같은 질소원 인산 수소 칼륨, 인산 이수소 칼륨, 황산 마그네슘과 같은 무기염, 및 필요에 따라 펩톤, 고기 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카사미노산, 비오틴, 티아민과 같은 각종 비타민 등의 보충물을 포함할 수 있다.
상기 (b) 단계에서 상기 재조합 미생물을 배지에서 배양하여 자일리톨 및 에탄올을 제조할 수 있다. 상기 자일로스로부터 자일리톨 및 에탄올이 생산되는 과정은 전술한 것과 같다.
상기 재조합 미생물은 배치, 공급-배치 또는 연속 발효 조건 하에서 배양될 수 있다.
이 때, 고전적인 배치 발효 방법은 폐쇄적인 시스템을 사용할 수 있고, 상기 배양 매질은 발효가 실행되기 전에 제조되며, 상기 매질에 유기체를 접종하고, 상기 매질에 어떠한 성분의 첨가도 없이 발효가 일어날 수 있다. 특정한 경우에서, 성장 매질의 상기 탄소원 내용물이 아닌, 상기 pH 및 산소 함량은 배치 방법 동안 변화될 수 있다. 배치 시스템의 상기 대사물 및 세포 바이오매스는 끊임없이 발효가 정지될 때까지 변화할 수 있다. 배치 시스템에서, 세포는 정지된 지체 상에서 고도성장 로그 상에 걸쳐 진척하고, 성장율이 감소되거나 멈춘 최종적으로 정지 상에 이를 수 있다. 일반적인 기간에서, 로그 상의 상기 세포는 대부분의 단백질을 만들 수 있다.
표준 배치 시스템의 변형은 "공급-배치 발효" 시스템이다. 상기 시스템에서, 영양(예를 들면, 탄소원, 질소원, O2, 및 통상적으로, 다른 영양)은 이들의 배양물의 농도가 한계치 미만으로 떨어질 때 첨가될 수 있다. 공급-배치 시스템은 이화 생성물 억제가 세포의 대사를 억제하고, 매질이 매질 내에서 영양소를 제한된 양으로 갖는 것이 바람직할 때 유용할 수 있다, 공급-배치 시스템에서의 실제 영양 농도의 측정은 pH, 용존 산소 및 CO2와 같은 폐기가스의 부분압과 같은 측정 가능한 인자의 변화에 기초하여 예측될 수 있다. 배치 및 공급-배치 발효는 일반적인 시스템으로서 당업계에 널리 알려져 있다.
계속적 발효는 정의된 배양 매질이 계속해서 생반응기(bioreactor)에 첨가되고, 조건화된 매질의 동일한 양이 과정 동안 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 계속적 발효는 일반적으로 세포가 처음에는 로그 상 성장에 있는 일정한 고 밀도의 배양물을 유지할 수 있다. 계속적 발효는 세포 성장 또는 마지막 생성물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 임의의 수의 인자의 조작이 가능할 수 있다.
예컨대, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소는 고정된 속도로, 모든 다른 파라미터는 적당하게 유지될 수 있다. 다른 시스템에서, 많은 성장에 영향을 주는 인자는 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도가 일정하게 유지되는 동안, 계속해서 변화할 수 있다. 계속적 시스템은 일정한 상태의 성장 조건을 유지하려고 한다. 따라서, 매질이 빠져나가는 것에 의한 세포 손실은 발효에서의 세포 성장 속도에 대항하여 균형이 맞을 수 있다. 생성물 형성의 속도를 최대화하는 기술뿐만 아니라, 계속적 발효 과정 동안 영양소 및 성장인자를 유지하는 방법은 당업계에 알려져 있다.
상기 (b) 단계의 생성물인 자일리톨과 에탄올은 공지의 방법을 통해 회수될 수 있다. 예를 들어, 상기 자일리톨과 에탄올은 염석법, 재결정법, 유기 용매 추출법, 에스테르화 증류법, 크로마토그래피 및 전기투석법 등에 의해 회수될 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 더욱 상세히 설명하기로 한다.
제조예 : 플라스미드의 제작
공지의 벡터인 p425GPD, p403GPD, 및 pδNeo_HXT 플라스미드를 기반으로 다양한 유전자를 도입하여 제조예 1~4 및 비교제조예의 플라스미드를 각각 제작하였다.
각 플라스미드의 종류를 하기 표 1에 나타내었고, araE 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화 한다.
구분 플라스미드 특징
제조예 1 p425GPD_araE_yeGFP Bacillus subtilis 유래의 araE 유전자와 효모 녹색 형광 단백질(yeGFP)의 융합 유전자가 도입된 p425GPD
제조예 2 p425GPD_araE Bacillus subtilis 유래의 araE 유전자가 도입된 p425GPD
제조예 3 p403GPD_XRm Scheffersomyces stipitis 유래의 자일로스 환원효소(XR) 유전자가 도입된 p403GPD
제조예 4 pδNeo_HXT_araE Bacillus subtilis 유래의 araE 유전자가 도입된 pδNeo_HXT
비교제조예 p425GPD_yeGFP 효모 녹색 형광 단백질(yeGFP) 유전자가 도입된 p425GPD
- p425GPD, p403GPD : GPD 프로모터를 포함하는 공벡터
- pδNeo_HXT : HXT 프로모터를 포함하고, 다수의 외래 유전자를 도입할 수 있는 공벡터
실시예 1
상기 제조예 1의 플라스미드를 야생형 효모인 D452-2에 도입하여 재조합 효모를 제작하였다.
실시예 2~7
6개의 야생형 효모를 선별하고, 각각의 야생형 효모에 제조예 3 및 제조예 4의 플라스미드를 도입하여 재조합 효모를 제작하였다(도 3).
실시예 8
쉐퍼소마이세스 스티피티스(Scheffersomyces stipitis) 유래의 자일로스 대사 관련 유전자(xyl1, xyl2, 및 xyl3), 즉, 자일로스 환원효소 유전자, 자일리톨 탈수소효소 유전자, 및 자일룰로스 인산화효소 유전자를 야생형 효모에 도입하고 상기 제조예 2의 플라스미드를 도입하여 재조합 효모를 제작하였고, 이를 도 5에 도식화하였다.
이 때, 상기 자일로스 환원효소 유전자, 자일리톨 탈수소효소 유전자, 및 자일룰로스 인산화효소 유전자는 각각 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4의 아미노산을 암호화한다.
비교예 1
상기 비교제조예의 플라스미드를 야생형 효모인 D452-2에 도입하여 재조합 효모를 제작하였다.
비교예 2
상기 실시예 2~7과 동일한 방법으로 재조합 효모를 제작하되, 상기 제조예 4의 플라스미드를 도입하지 않았다.
비교예 3
상기 실시예 8과 동일한 방법으로 재조합 효모를 제작하되, 상기 제조예 2의 플라스미드를 대체하여 외래 유전자가 도입되지 않은 공벡터 p425GPD를 사용하였다.
비교예 4
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 재조합 효모를 제작하되, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) 유래의 araE 유전자가 도입된 플라스미드를 사용하였다.
비교예 5
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 재조합 효모를 제작하되, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래의 araE 유전자가 도입된 플라스미드를 사용하였다.
비교예 6
상기 실시예 8과 동일한 방법으로 재조합 효모를 제작하되, 칸디다 세하태(Candida shehatae) 유래의 자일로스 환원효소 유전자가 도입된 플라스미드를 사용하였다.
비교예 7
상기 실시예 8과 동일한 방법으로 재조합 효모를 제작하되, 파키솔렌 탄노필러스(Pachysolen tannophilus) 유래의 자일리톨 탈수소효소 유전자가 도입된 플라스미드를 사용하였다.
비교예 8
상기 실시예 8과 동일한 방법으로 재조합 효모를 제작하되, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 유래의 자일룰로스 인산화효소 유전자가 도입된 플라스미드를 사용하였다.
실험예 1 : 효모 내 AraE 단백질의 위치 관찰
상기 실시예 1 및 비교예 1에 따른 재조합 효모 각각에 대해, 공초점 현미경을 이용하여 세포의 형태를 관찰하였고, 그 결과를 도 2에 나타냈다.
도 2를 참고하면, AraE 단백질을 발현하지 않는 효모(비교예 1)는 형광 단백질이 세포 내 전 영역에 분산되어 관찰되었다. 반면, AraE 단백질을 발현하는 효모(실시예 1)는 세포 막 주변에서만 형광 단백질이 관찰되었다.
상기 결과는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 AraE 단백질은 세포막에 존재하여 수송 단백질로 기능할 수 있음을 시사한다.
실험예 2 : AraE 단백질의 자일로스 유입능 시험
AraE 단백질이 자일리톨 유입능을 향상시키는지 확인하고자, 상기 실시예 2~7 및 비교예 2에 따른 재조합 효모 각각에 대해 자일로스를 기질로 하는 회분식 배양을 실시하였다.
20g/L 글루코오스를 탄소원으로 공급한 100mL의 YP 배지(1%(w/v) yeast extract, 2%(w/v) peptone)에 50g/L의 자일로스를 기질로 투입하였다.
각각의 재조합 효모를 배지에 접종하여 250rpm, 30℃ 조건에서 48시간 동안 배양한 후, 자일로스 소모 속도와 자일리톨 생산성을 측정하였고, 결과를 하기 표 2 및 도 4에 나타냈다.
구분 균체 농도
(g/L)		 자일로스
소모량 (g/L)		 자일리톨
생산량 (g/L)		 세포당 자일로스 소모 속도 (g/g h-1) 세포당 자일리톨 생산 속도 (g/g h-1)
실시예 2 5.54 11.62 10.36 0.044 0.039
실시예 3 7.70 14.25 12.53 0.039 0.034
실시예 4 5.68 12.96 10.27 0.048 0.038
실시예 5 5.54 13.62 10.14 0.051 0.038
실시예 6 5.85 9.51 9.35 0.034 0.033
실시예 7 5.90 9.66 9.55 0.034 0.033
비교예 2 5.90 8.88 8.83 0.031 0.031
상기 표 2 및 도 4를 참고하면, AraE 단백질을 발현하는 재조합 효모(실시예 2~7)는 AraE 단백질을 발현하지 않는 재조합 효모(비교예 2)에 비해 자일로스 소모 속도 및 자일리톨 생산 속도가 증가하였다.
상기 결과는 AraE 단백질이 수송 단백질로써 자일로스 유입능을 향상시킬 수 있음을 시사한다.
실험예 3 : AraE 단백질의 존재 여부에 따른 에탄올 생산성 측정
자일로스를 에탄올로 대사할 수 있는 균주에 AraE 단백질이 도입된 경우, 자일로스 유입능 및 에탄올 생산성이 향상되는지 여부를 확인하기 위해, 상기 실시예 8 및 비교예 3에 따른 재조합 효모 각각에 대해 회분식 배양을 실시하였다.
구체적으로, YP 배지(1%(w/v) yeast extract, 2%(w/v) peptone)에 다양한 농도(2%, 4%, 6%, 8%, 및 10%)의 자일로스를 탄소원으로 공급하였다.
각각의 재조합 효모를 접종하여 250rpm, 30℃ 조건에서 48시간 동안 배양한 후, 건조 중량, 자일로스 소모 속도, 및 세포 성장 속도를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 3 및 도 6에 나타냈다.
구분 비성장속도 (h-1) 자일로스 소모 속도 (g/L-h)
자일로스 농도 (%) 실시예 8 비교예 3 실시예 8 비교예 3
2 0.193 0.211 0.450 0.481
4 0.196 0.153 0.506 0.255
6 0.206 0.145 0.533 0.281
8 0.206 0.165 0.622 0.357
10 0.202 0.177 0.464 0.323
상기 표 3 및 도 6을 참고하면, AraE 단백질을 발현하지 않는 재조합 효모(비교예 3)의 경우 자일로스 농도가 증가할수록 세포 성장이 억제되고 자일로스 소모 속도 또한 감소하였다.
반면, AraE 단백질을 발현하는 재조합 효모(실시예 8)는 자일로스 농도가 증가할수록 세포 성장 속도 및 자일로스 소모 속도가 증대되었다. 특히, 자일로스 농도가 4%인 배지에서 AraE 단백질의 발현에 의해 자일로스 소모 속도가 약 2배 이상 증가하였다.
상기 결과는 AraE 단백질이 자일로스 유입능을 향상시키고, 재조합 미생물에서 대사 과정(자일로스 → 에탄올)의 효율이 증가될 수 있음을 시사한다.
실험예 4 : AraE 단백질의 유래에 따른 자일리톨 생산성 측정
AraE 단백질이 유래에 따라 그 기능을 달리하는지, 즉 자일로스 유입능 및 자일리톨 생산성에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해, 상기 실시예 2 및 비교예 4~5에 따른 재조합 효모 각각에 대해 자일로스를 기질로 하는 회분식 배양을 실시하였다. 구체적인 배양 조건은 상기 실험예 2와 동일하게 진행하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
구분 균체 농도
(g/L)		 자일로스
소모량 (g/L)		 자일리톨
생산량 (g/L)		 세포당 자일로스 소모 속도 (g/g h-1) 세포당 자일리톨 생산 속도 (g/g h-1)
실시예 2 5.54 11.62 10.36 0.044 0.039
비교예 4 5.79 10.91 10.21 0.039 0.037
비교예 5 5.81 11.76 9.77 0.042 0.035
상기 표 4를 참고하면, 바실러스 서브틸리스 유래의 AraE 단백질을 발현하는 재조합 효모(실시예 2)는 에스케리키아 콜리(비교예 4) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(비교예 5) 유래의 AraE 단백질을 발현하는 재조합 효모에 비해 자일리톨 생산성이 향상된 것으로 나타났다.
특히, 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 AraE 단백질을 발현하는 재조합 효모(비교예 5)가 세포당 자일로스 소모 속도 대비 자일리톨 생산 속도가 낮아 자일리톨 생산 수율이 낮은 것으로 측정된 반면에, 바실러스 서브틸리스 유래의 AraE 단백질을 발현하는 재조합 효모(실시예 2)는 우수한 수율을 나타내는 것을 확인하였다.
상기 결과는 AraE 단백질의 유래에 따라 자일로스 유입능, 및 이에 따른 자일리톨 생산성에 영향을 미칠 수 있고, 바실러스 서브틸리스 유래의 AraE 단백질이 우수한 효과가 있음을 시사한다.
실험예 5 : 자일로스 환원효소, 자일리톨 탈수소효소, 및 자일룰로스 인산화효소의 유래에 따른 에탄올 생산성 측정
자일로스 환원효소, 자일리톨 탈수소효소, 및 자일룰로스 인산화효소의 유래에 따라 에탄올 생산성에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해, 상기 실시예 8 및 비교예 6~8에 다른 재조합 효모 각각에 대해 회분식 배양을 실시하였다. 구체적인 배양 조건은 상기 실험예 3과 동일하게 진행하였고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
구분 비성장속도 (h-1) 자일로스 소모 속도 (g/L-h)
자일로스 농도 (%) 실시예 8 비교예 6 비교예 7 비교예 8 실시예 8 비교예 6 비교예 7 비교예 8
2 0.193 0.181 0.184 0.175 0.450 0.436 0.441 0.422
4 0.196 0.183 0.191 0.181 0.506 0.467 0.483 0.463
6 0.206 0.182 0.189 0.179 0.533 0.462 0.473 0.451
8 0.206 0.179 0.184 0.171 0.622 0.447 0.466 0.418
10 0.202 0.164 0.179 0.163 0.464 0.416 0.452 0.409
상기 표 5를 참고하면, 자일로스 환원효소 유전자, 자일리톨 탈수소효소 유전자, 및 자일룰로스 인산화효소 유전자가 전부 바실러스 서브틸리스에서 유래한 재조합 효모(실시예 8)가 이들 중 어느 하나라도 타 종에서 유래한 재조합 효모(비교예 6~8)에 비해 높은 비성장속도 및 자일로스 소모 속도를 나타내었다.
특히, 상기 실시예 8의 재조합 효모는 자일로스 농도가 증가함에 따라 비성장속도 및 자일로스 소모 속도가 대체로 증가한 반면, 비교예 6~8의 재조합 효모는 자일로스 농도가 4~8%인 구간에서 비성장속도 및 자일로스 소모 속도가 감소하는 것을 확인하였다.
상기 결과는 자일로스 환훤효소 유전자, 자일리톨 탈수소효소 유전자, 및 자일룰로스 인산화효소 유전자가 전부 바실러스 서브틸리스에서 유래한 재조합 효모에서 대사 효율이 증가될 수 있음을 시사한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOOKMIN UNIVERSITY <120> PRODUCTION OF XYLITOL AND ETHANOL BY RECOMBINANT SACCHAROMYCES CEREVISIAE EXPRESSING ARABINOSE TRANSPORTER <130> 16PP10364 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 464 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 1 Met Lys Asn Thr Pro Thr Gln Leu Glu Pro Asn Val Pro Val Thr Arg 1 5 10 15 Ser His Ser Met Gly Phe Val Ile Leu Ile Ser Cys Ala Ala Gly Leu 20 25 30 Gly Gly Leu Leu Tyr Gly Tyr Asp Thr Ala Val Ile Ser Gly Ala Ile 35 40 45 Gly Phe Leu Lys Asp Leu Tyr Ser Leu Ser Pro Phe Met Glu Gly Leu 50 55 60 Val Ile Ser Ser Ile Met Ile Gly Gly Val Val Gly Val Gly Ile Ser 65 70 75 80 Gly Phe Leu Ser Asp Arg Phe Gly Arg Arg Lys Ile Leu Met Thr Ala 85 90 95 Ala Leu Leu Phe Ala Ile Ser Ala Ile Val Ser Ala Leu Ser Gln Asp 100 105 110 Val Ser Thr Leu Ile Ile Ala Arg Ile Ile Gly Gly Leu Gly Ile Gly 115 120 125 Met Gly Ser Ser Leu Ser Val Thr Tyr Ile Thr Glu Ala Ala Pro Pro 130 135 140 Ala Ile Arg Gly Ser Leu Ser Ser Leu Tyr Gln Leu Phe Thr Ile Leu 145 150 155 160 Gly Ile Ser Ala Thr Tyr Phe Ile Asn Leu Ala Val Gln Arg Ser Gly 165 170 175 Thr Tyr Glu Trp Gly Val His Thr Gly Trp Arg Trp Met Leu Ala Tyr 180 185 190 Gly Met Val Pro Ser Val Ile Phe Phe Leu Val Leu Leu Val Val Pro 195 200 205 Glu Ser Pro Arg Trp Leu Ala Lys Ala Gly Lys Thr Asn Glu Ala Leu 210 215 220 Lys Ile Leu Thr Arg Ile Asn Gly Glu Thr Val Ala Lys Glu Glu Leu 225 230 235 240 Lys Asn Ile Glu Asn Ser Leu Lys Ile Glu Gln Met Gly Ser Leu Ser 245 250 255 Gln Leu Phe Lys Pro Gly Leu Arg Lys Ala Leu Val Ile Gly Ile Leu 260 265 270 Leu Ala Leu Phe Asn Gln Val Ile Gly Met Asn Ala Ile Thr Tyr Tyr 275 280 285 Gly Pro Glu Ile Phe Lys Met Met Gly Phe Gly Gln Asn Ala Gly Phe 290 295 300 Val Thr Thr Cys Ile Val Gly Val Val Glu Val Ile Phe Thr Val Ile 305 310 315 320 Ala Val Leu Leu Ile Asp Lys Val Gly Arg Lys Lys Leu Met Ser Ile 325 330 335 Gly Ser Ala Phe Met Ala Ile Phe Met Ile Leu Ile Gly Thr Ser Phe 340 345 350 Tyr Phe Glu Leu Thr Ser Gly Ile Met Met Ile Val Leu Ile Leu Gly 355 360 365 Phe Val Ala Ala Phe Cys Val Ser Val Gly Pro Ile Thr Trp Ile Met 370 375 380 Ile Ser Glu Ile Phe Pro Asn His Leu Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ile 385 390 395 400 Ala Thr Ile Phe Leu Trp Gly Ala Asn Trp Ala Ile Gly Gln Phe Val 405 410 415 Pro Met Met Ile Asp Ser Phe Gly Leu Ala Tyr Thr Phe Trp Ile Phe 420 425 430 Ala Val Ile Asn Ile Leu Cys Phe Leu Phe Val Val Thr Ile Cys Pro 435 440 445 Glu Thr Lys Asn Lys Ser Leu Glu Glu Ile Glu Lys Leu Trp Ile Lys 450 455 460 <210> 2 <211> 318 <212> PRT <213> Pichia stipitis <400> 2 Met Pro Ser Ile Lys Leu Asn Ser Gly Tyr Asp Met Pro Ala Val Gly 1 5 10 15 Phe Gly Cys Trp Lys Val Asp Val Asp Thr Cys Ser Glu Gln Ile Tyr 20 25 30 Arg Ala Ile Lys Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Asp Gly Ala Glu Asp Tyr 35 40 45 Ala Asn Glu Lys Leu Val Gly Ala Gly Val Lys Lys Ala Ile Asp Glu 50 55 60 Gly Ile Val Lys Arg Glu Asp Leu Phe Leu Thr Ser Lys Leu Trp Asn 65 70 75 80 Asn Tyr His His Pro Asp Asn Val Glu Lys Ala Leu Asn Arg Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Leu Gln Val Asp Tyr Val Asp Leu Phe Leu Ile His Phe Pro 100 105 110 Val Thr Phe Lys Phe Val Pro Leu Glu Glu Lys Tyr Pro Pro Gly Phe 115 120 125 Tyr Cys Gly Lys Gly Asp Asn Phe Asp Tyr Glu Asp Val Pro Ile Leu 130 135 140 Glu Thr Trp Lys Ala Leu Glu Lys Leu Val Lys Ala Gly Lys Ile Arg 145 150 155 160 Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Pro Gly Ala Leu Leu Leu Asp Leu Leu 165 170 175 Arg Gly Ala Thr Ile Lys Pro Ser Val Leu Gln Val Glu His His Pro 180 185 190 Tyr Leu Gln Gln Pro Arg Leu Ile Glu Phe Ala Gln Ser Arg Gly Ile 195 200 205 Ala Val Thr Ala Tyr Ser Ser Phe Gly Pro Gln Ser Phe Val Glu Leu 210 215 220 Asn Gln Gly Arg Ala Leu Asn Thr Ser Pro Leu Phe Glu Asn Glu Thr 225 230 235 240 Ile Lys Ala Ile Ala Ala Lys His Gly Lys Ser Pro Ala Gln Val Leu 245 250 255 Leu Arg Trp Ser Ser Gln Arg Gly Ile Ala Ile Ile Pro Lys Ser Asn 260 265 270 Thr Val Pro Arg Leu Leu Glu Asn Lys Asp Val Asn Ser Phe Asp Leu 275 280 285 Asp Glu Gln Asp Phe Ala Asp Ile Ala Lys Leu Asp Ile Asn Leu Arg 290 295 300 Phe Asn Asp Pro Trp Asp Trp Asp Lys Ile Pro Ile Phe Val 305 310 315 <210> 3 <211> 363 <212> PRT <213> Pichia stipitis <400> 3 Met Thr Ala Asn Pro Ser Leu Val Leu Asn Lys Ile Asp Asp Ile Ser 1 5 10 15 Phe Glu Thr Tyr Asp Ala Pro Glu Ile Ser Glu Pro Thr Asp Val Leu 20 25 30 Val Gln Val Lys Lys Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Ile His Phe Tyr 35 40 45 Ala His Gly Arg Ile Gly Asn Phe Val Leu Thr Lys Pro Met Val Leu 50 55 60 Gly His Glu Ser Ala Gly Thr Val Val Gln Val Gly Lys Gly Val Thr 65 70 75 80 Ser Leu Lys Val Gly Asp Asn Val Ala Ile Glu Pro Gly Ile Pro Ser 85 90 95 Arg Phe Ser Asp Glu Tyr Lys Ser Gly His Tyr Asn Leu Cys Pro His 100 105 110 Met Ala Phe Ala Ala Thr Pro Asn Ser Lys Glu Gly Glu Pro Asn Pro 115 120 125 Pro Gly Thr Leu Cys Lys Tyr Phe Lys Ser Pro Glu Asp Phe Leu Val 130 135 140 Lys Leu Pro Asp His Val Ser Leu Glu Leu Gly Ala Leu Val Glu Pro 145 150 155 160 Leu Ser Val Gly Val His Ala Ser Lys Leu Gly Ser Val Ala Phe Gly 165 170 175 Asp Tyr Val Ala Val Phe Gly Ala Gly Pro Val Gly Leu Leu Ala Ala 180 185 190 Ala Val Ala Lys Thr Phe Gly Ala Lys Gly Val Ile Val Val Asp Ile 195 200 205 Phe Asp Asn Lys Leu Lys Met Ala Lys Asp Ile Gly Ala Ala Thr His 210 215 220 Thr Phe Asn Ser Lys Thr Gly Gly Ser Glu Glu Leu Ile Lys Ala Phe 225 230 235 240 Gly Gly Asn Val Pro Asn Val Val Leu Glu Cys Thr Gly Ala Glu Pro 245 250 255 Cys Ile Lys Leu Gly Val Asp Ala Ile Ala Pro Gly Gly Arg Phe Val 260 265 270 Gln Val Gly Asn Ala Ala Gly Pro Val Ser Phe Pro Ile Thr Val Phe 275 280 285 Ala Met Lys Glu Leu Thr Leu Phe Gly Ser Phe Arg Tyr Gly Phe Asn 290 295 300 Asp Tyr Lys Thr Ala Val Gly Ile Phe Asp Thr Asn Tyr Gln Asn Gly 305 310 315 320 Arg Glu Asn Ala Pro Ile Asp Phe Glu Gln Leu Ile Thr His Arg Tyr 325 330 335 Lys Phe Lys Asp Ala Ile Glu Ala Tyr Asp Leu Val Arg Ala Gly Lys 340 345 350 Gly Ala Val Lys Cys Leu Ile Asp Gly Pro Glu 355 360 <210> 4 <211> 623 <212> PRT <213> Pichia stipitis <400> 4 Met Thr Thr Thr Pro Phe Asp Ala Pro Asp Lys Leu Phe Leu Gly Phe 1 5 10 15 Asp Leu Ser Thr Gln Gln Leu Lys Ile Ile Val Thr Asp Glu Asn Leu 20 25 30 Ala Ala Leu Lys Thr Tyr Asn Val Glu Phe Asp Ser Ile Asn Ser Ser 35 40 45 Val Gln Lys Gly Val Ile Ala Ile Asn Asp Glu Ile Ser Lys Gly Ala 50 55 60 Ile Ile Ser Pro Val Tyr Met Trp Leu Asp Ala Leu Asp His Val Phe 65 70 75 80 Glu Asp Met Lys Lys Asp Gly Phe Pro Phe Asn Lys Val Val Gly Ile 85 90 95 Ser Gly Ser Cys Gln Gln His Gly Ser Val Tyr Trp Ser Arg Thr Ala 100 105 110 Glu Lys Val Leu Ser Glu Leu Asp Ala Glu Ser Ser Leu Ser Ser Gln 115 120 125 Met Arg Ser Ala Phe Thr Phe Lys His Ala Pro Asn Trp Gln Asp His 130 135 140 Ser Thr Gly Lys Glu Leu Glu Glu Phe Glu Arg Val Ile Gly Ala Asp 145 150 155 160 Ala Leu Ala Asp Ile Ser Gly Ser Arg Ala His Tyr Arg Phe Thr Gly 165 170 175 Leu Gln Ile Arg Lys Leu Ser Thr Arg Phe Lys Pro Glu Lys Tyr Asn 180 185 190 Arg Thr Ala Arg Ile Ser Leu Val Ser Ser Phe Val Ala Ser Val Leu 195 200 205 Leu Gly Arg Ile Thr Ser Ile Glu Glu Ala Asp Ala Cys Gly Met Asn 210 215 220 Leu Tyr Asp Ile Glu Lys Arg Glu Phe Asn Glu Glu Leu Leu Ala Ile 225 230 235 240 Ala Ala Gly Val His Pro Glu Leu Asp Gly Val Glu Gln Asp Gly Glu 245 250 255 Ile Tyr Arg Ala Gly Ile Asn Glu Leu Lys Arg Lys Leu Gly Pro Val 260 265 270 Lys Pro Ile Thr Tyr Glu Ser Glu Gly Asp Ile Ala Ser Tyr Phe Val 275 280 285 Thr Arg Tyr Gly Phe Asn Pro Asp Cys Lys Ile Tyr Ser Phe Thr Gly 290 295 300 Asp Asn Leu Ala Thr Ile Ile Ser Leu Pro Leu Ala Pro Asn Asp Ala 305 310 315 320 Leu Ile Ser Leu Gly Thr Ser Thr Thr Val Leu Ile Ile Thr Lys Asn 325 330 335 Tyr Ala Pro Ser Ser Gln Tyr His Leu Phe Lys His Pro Thr Met Pro 340 345 350 Asp His Tyr Met Gly Met Ile Cys Tyr Cys Asn Gly Ser Leu Ala Arg 355 360 365 Glu Lys Val Arg Asp Glu Val Asn Glu Lys Phe Asn Val Glu Asp Lys 370 375 380 Lys Ser Trp Asp Lys Phe Asn Glu Ile Leu Asp Lys Ser Thr Asp Phe 385 390 395 400 Asn Asn Lys Leu Gly Ile Tyr Phe Pro Leu Gly Glu Ile Val Pro Asn 405 410 415 Ala Ala Ala Gln Ile Lys Arg Ser Val Leu Asn Ser Lys Asn Glu Ile 420 425 430 Val Asp Val Glu Leu Gly Asp Lys Asn Trp Gln Pro Glu Asp Asp Val 435 440 445 Ser Ser Ile Val Glu Ser Gln Thr Leu Ser Cys Arg Leu Arg Thr Gly 450 455 460 Pro Met Leu Ser Lys Ser Gly Asp Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ala Ser 465 470 475 480 Pro Gln Pro Glu Gly Asp Gly Thr Asp Leu His Lys Val Tyr Gln Asp 485 490 495 Leu Val Lys Lys Phe Gly Asp Leu Phe Thr Asp Gly Lys Lys Gln Thr 500 505 510 Phe Glu Ser Leu Thr Ala Arg Pro Asn Arg Cys Tyr Tyr Val Gly Gly 515 520 525 Ala Ser Asn Asn Gly Ser Ile Ile Xaa Lys Met Gly Ser Ile Leu Ala 530 535 540 Pro Val Asn Gly Asn Tyr Lys Val Asp Ile Pro Asn Ala Cys Ala Leu 545 550 555 560 Gly Gly Ala Tyr Lys Ala Ser Trp Ser Tyr Glu Cys Glu Ala Lys Lys 565 570 575 Glu Trp Ile Gly Tyr Asp Gln Tyr Ile Asn Arg Leu Phe Glu Val Ser 580 585 590 Asp Glu Met Asn Ser Phe Glu Val Lys Asp Lys Trp Leu Glu Tyr Ala 595 600 605 Asn Gly Val Gly Met Leu Ala Lys Met Glu Ser Glu Leu Lys His 610 615 620

Claims (9)

  1. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 유래한 아라비노스 수송 단백질(arabinose transport protein)을 암호화하는 유전자; 및
    쉐퍼소마이세스 스티피티스(Scheffersomyces stipitis)에서 유래한 자일로스 환원효소(xylose reductase)를 암호화하는 유전자, 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)를 암호화하는 유전자, 및 자일룰로스 인산화효소(xylulose kinase)를 암호화하는 유전자를 포함하는, 자일리톨 및 에탄올 제조용 재조합 효모.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아라비노스 수송 단백질은 AraE 단백질인, 재조합 효모.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 아라비노스 수송 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된, 재조합 효모.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 자일로스 환원효소, 자일리톨 탈수소효소, 및 자일룰로스 인산화효소는 각각 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된, 재조합 효모.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인, 재조합 효모.
  9. (a) 자일로스를 배지에 투입하는 단계; 및
    (b) 자일로스가 투입된 상기 배지에서 제1항, 제2항, 제4항, 제6항 및 제8항 중 어느 한 항의 재조합 효모를 배양하는 단계;를 포함하는, 자일리톨 및 에탄올의 제조방법.
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