ES2643240T3 - Cepas de levaduras capaces de metabolizar xilosa y resistentes a los inhibidores, procedimiento de obtención y uso - Google Patents
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Description
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DESCRIPCION
Cepas de levaduras capaces de metabolizar xilosa y resistentes a los inhibidores, procedimiento de obtencion y uso Campo tecnico
La presente invencion se refiere al campo de las cepas de levaduras capaces de metabolizar la xilosa y que presentan tambien resistencia a al menos un inhibidor de la fermentacion, su procedimiento de obtencion, y uso de estas cepas de levadura para la produccion de un producto de fermentacion en un medio que comprende xilosa, en presencia o no de al menos un inhibidor de la fermentacion.
Antecedentes tecnologicos
El documento PCT/EP2011/071616 describe levaduras para la produccion de alcohol en medios que contienen al menos una pentosa, por expresion de la ruta metabolica XI-XDH. Este documento describe por primera vez la asociacion de un exceso de expresion de la actividad de la xilosa isomerasa (XI) con un exceso de expresion de la actividad de la xilitol deshidrogenasa (XDH) y muestra que el exceso de expresion de la actividad de la xilitol deshidrogenasa permite evitar la inhibicion por el xilitol de la actividad de la xilosa isomerasa. El documento PCT/EP2011/071616 describe, por ejemplo, la cepa de levadura depositada en la CNCM el 5 de octubre de 2011 con el numero I-4538.
La produccion industrial de alcohol por levaduras a partir de hidrolizados lignocelulosicos necesita no solo la maquinaria genetica para metabolizar las pentosas, sino tambien propiedades de resistencia a los inhibidores de la fermentacion presentes en estos hidrolizados lignocelulosicos.
Los inhibidores de la fermentacion son producidos durante el pretratamiento e hidrolisis de la biomasa lignocelulosica. Entre los inhibidores de la fermentacion figuran furaldehndos (furfural, HMF), compuestos fenolicos y acidos organicos (acido acetico, acido levulmico, acido formico).
Se han descrito diferentes medios para contrarrestar el efecto de los inhibidores de la fermentacion, entre los cuales esta la detoxificacion del medio de fermentacion, mejora del procedimiento de fermentacion, o mejora de la resistencia de las levaduras a los inhibidores de la fermentacion. La resistencia de las levaduras a los inhibidores de la fermentacion se ha mejorado, por ejemplo, geneticamente, por evolucion dirigida o por aclimatacion (Almeida y Hahn-Hagerdal, International Sugar Journal, 2009, Vol. 111, n°1323).
Toyoma et al. (Bioresour. Technol., 2011, 12: 7917-7924) describen cepas de levaduras que fermentan la xilosa y resistentes a acidos debiles, como el acido acetico o el acido formico, obteniendose estas cepas aumentando las actividades de transaldolasa (TAL) y formiato deshidrogenasa (FDH).
Sin embargo, parece diffcil proporcionar una cepa de levadura industrial que de levaduras a la vez eficaces para la produccion de alcohol en un medio de fermentacion que comprende al menos una pentosa y resistentes a al menos un inhibidor de la fermentacion.
Existe, por lo tanto, una necesidad real de proporcionar nuevas cepas de levaduras que son capaces de metabolizar al menos una pentosa, por ejemplo xilosa, incluso en presencia de al menos un inhibidor de la fermentacion, tal como el acido acetico, dando dichas cepas de levaduras, levaduras eficaces para la produccion de alcohol, incluso en presencia de al menos un inhibidor de la fermentacion.
Resumen de la invencion
Un objeto de la invencion se refiere a la levadura depositada el 24 de mayo de 2012 en la CNCM con el numero I- 4627.
Otro objeto de la invencion se refiere a un procedimiento de obtencion de una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico, que comprende las etapas de:
- cruce de la cepa de levadura depositada el 5 de octubre de 2011 en la CNCM con el numero I-4538 con la cepa de levadura depositada el 24 de mayo de 2012 en la CNCM con el numero I-4627, para obtener al menos un hforido,
- seleccion de al menos un hfbrido capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico.
El presente documento describe tambien una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico, que se puede obtener por el procedimiento definido anteriormente.
Se describe tambien en esta memoria una cepa de levadura derivada de una cepa de levadura tal como se ha definido anteriormente, caracterizada porque dicha cepa de levadura derivada es capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico.
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Tambien se describe en esta memoria una levadura obtenida por cultivo de una cepa de levadura tal como se ha definido anteriormente o por cultivo de una cepa de levadura derivada como se ha definido anteriormente.
Otro objeto de la invencion se refiere a un procedimiento de produccion de al menos un producto de fermentacion que comprende una etapa de fermentacion, en condiciones anaerobias, por una levadura tal como se ha definido anteriormente.
Otro objeto de la invencion se refiere al uso de una levadura como se ha definido anteriormente para la produccion de al menos un producto de fermentacion, preferiblemente en un medio de fermentacion que comprende xilosa y/o al menos un inhibidor de la fermentacion.
Otros objetos de la invencion se refieren a un cultivo que comprende una cepa de levadura tal como se ha definido anteriormente, y un pan de levadura que comprende una cepa de levadura tal como se ha definido anteriormente.
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1: Produccion de etanol (en g/kg de medio de fermentacion) con el transcurso del tiempo (en horas) en el
medio de fermentacion YFGX-Ac, a 32°C, de la cepa de levadura I-4538 (rombo), la cepa de levadura H1
(cuadrado), la cepa de levadura ED1 (triangulo), la cepa de levadura ED2 (cfrculo) y la cepa de levadura ED3 (cruz).
Figura 2: Produccion de etanol (en g/kg de medio de fermentacion) con el transcurso del tiempo (en horas) en el medio A, a 32°C, por la cepa de levadura I-4538 (rombo), la cepa de levadura ED1 (triangulo) y la cepa de levadura ED2(drculo).
Figura 3: Produccion de etanol (en g/kg de medio de fermentacion) con el transcurso del tiempo (en horas) en el
medio A, a 35°C, por la cepa de levadura I-4538 (rombo), la cepa de levadura ED1 (triangulo), la cepa de
levadura ED2 (cfrculo) y la cepa de levadura ED3 (cruz).
Figura 4: Produccion de etanol (en g/kg de medio de fermentacion) con el transcurso del tiempo (en horas) en el medio B, a 35°C, por la cepa de levadura I-4538 (rombo), la cepa de levadura ED1 (triangulo), la cepa de levadura ED2 (cfrculo) y la cepa de levadura ED3 (cruz).
Definiciones
La expresion “cepa de levadura” designa una poblacion relativamente homogenea de celulas de levadura.
Una cepa de levadura se obtiene a partir del aislamiento de un clon, siendo un clon una poblacion de celulas obtenida a partir de una sola celula de levadura.
Por gen “exogeno” se entiende un gen que no esta presente de forma natural en una cepa de levadura de la especie considerada.
Por gen “endogeno” se entiende un gen que esta presente de forma natural en una cepa de levadura de la especie considerada.
Una xilosa isomerasa o XI indica en esta memoria una enzima capaz de transformar en una sola etapa la D-xilosa en D-xilulosa y que corresponde a la clase EC 5.3.1.5.
Una xilitol deshidrogenasa o XDH indica en esta memoria una enzima capaz de transformar en una sola etapa el xilitol en D-xilulosa y que corresponde a la clase EC 1.11.9.
La xilosa reductasa o XR indica en esta memoria una enzima capaz de transformar en una sola etapa la D-xilosa en xilitol y que corresponde a la clase EC 1.1.1.307.
Una D-xiluloquinasa o XKS indica en esta memoria una enzima capaz de transformar en una sola etapa la D-xilulosa en D-xilulosa-5-fosfato y que corresponde a la clase EC 2.7.1.17.
El gen GRE3 codifica una enzima aldosa reductasa que corresponde a la clase EC1.1.1.21.
El gen RPE1 codifica una enzima D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa que corresponde a la clase EC5.1.3.1.
El gen RKI1 codifica una enzima ribosa-5-fosfato cetol-isomerasa que corresponde a la clase EC 5.3.1.6.
El gen TKL1 codifica una enzima transcetolasa que corresponde a la clase EC 2.2.1.1.
El gen TAL1 codifica una enzima transaldolasa que corresponde a la clase EC 2.2.1.2.
Una cepa de levadura prototrofa es una cepa de levadura capaz de crecer en un medio mmimo. En particular, una cepa de levadura prototrofa es capaz de sintetizar todos los aminoacidos y bases necesarios para su crecimiento.
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Un medio mmimo es un medio que comprende una fuente de carbono (CxHyOz), una fuente de nitrogeno mineral, una fuente de potasio, una fuente de fosforo, una fuente de azufre, una fuente de magnesio, una fuente de calcio, una fuente de hierro, una fuente de oligoelementos y agua.
Un ejemplo de medio mmimo es el medio YNB (Yeast Nitrogen Base) al que se anade una fuente de carbono (por ejemplo, un azucar) y una fuente de nitrogeno mineral (por ejemplo sulfato amonico).
El medio YNB comprende por litro: biotina 2 |jg, pantotenato de calcio 400 |jg, acido folico 2 |jg, inositol 2000 |jg, niacina 400 jig, acido p-aminobenzoico 200 jig, hidrocloruro de piridoxina 400 jig, riboflavina 200 jig, hidrocloruro de tiamina 400 jig, acido borico 500 jig, sulfato de cobre 40 jig, yoduro de potasio 100 jig, cloruro ferrico 200 jig,
sulfato de manganeso 400 jig, molibdato de sodio 200 jig, sulfato de zinc 400 jig, fosfato de potasio monobasico 1 g, sulfato de magnesio 500 mg, cloruro sodico 100 mg, cloruro de calcio 100 mg, sulfato amonico 5 g/l, pH final 5,4.
Por la expresion “cepa de levadura derivada”, se indica una cepa de levadura derivada por uno o varios cruces y/o por mutacion y/o por transformacion genetica.
Una cepa de levadura derivada por cruce se puede obtener por cruce de una sola cepa de levadura segun la invencion con la misma cepa de levadura, con otra cepa de levadura segun la invencion o con otra cepa de levadura cualquiera.
Una cepa de levadura derivada por mutacion puede ser una cepa de levadura que ha sufrido al menos una mutacion espontanea en su genoma o al menos una mutacion inducida por mutagenesis. La o las mutaciones de una cepa derivada pueden ser silenciosas o no.
Por la expresion “mutagenesis” se designa a la vez la mutagenesis aleatoria obtenida por aplicacion de radiacion (por ejemplo, UV) o por agentes qmmicos mutagenos, y la mutagenesis de insercion o dirigida, por transposicion o por integracion de un fragmento de ADN exogeno.
Una cepa de levadura derivada por transformacion genetica es una cepa de levadura en la que se ha introducido una secuencia de ADN que preferiblemente es aportada por un plasmido o integrada directamente en el genoma.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion tiene por objeto proporcionar una cepa de levadura capaz de metabolizar al menos una pentosa, en particular xilosa, incluso en presencia de al menos un inhibidor de la fermentacion, tal como el acido acetico.
Una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa con el significado de la invencion, es una cepa de levadura capaz de producir etanol en un medio que comprende xilosa, en condiciones anaerobias.
En particular, una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa es una cepa de levadura capaz de convertir la xilosa en etanol, es decir, capaz de fermentar la xilosa.
La conversion de la xilosa en etanol es resultado de la isomerizacion directa o indirecta de xilosa en xilulosa, seguido del uso de la xilulosa asf obtenida en la parte no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato.
Una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa con el significado de la invencion, es una cepa de levadura que convierte al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 90% de la xilosa en etanol en 60 horas en un medio de fermentacion que comprende 55 g de glucosa y 45 g de xilosa por kg de medio de fermentacion, en condiciones anaerobias.
La siembra de la cepa de levadura usada para medir el porcentaje de xilosa convertida en etanol preferiblemente es de 0,25 g en materia seca/kg de medio de fermentacion.
La duracion de 60 horas se calcula a partir de la siembra de la cepa de levadura en el medio de fermentacion.
El medio de fermentacion usado para medir el porcentaje de xilosa convertido en etanol preferiblemente es un medio sintetico.
Un medio sintetico es un medio cuya composicion qmmica exacta es conocida.
Un medio sintetico usado en esta memoria comprende una fuente de carbono, una fuente de nitrogeno, una fuente de fosforo, asf como las vitaminas y minerales esenciales para el crecimiento de una cepa de levadura.
El medio de fermentacion usado para medir el porcentaje de xilosa convertido en etanol preferiblemente es el medio sintetico YFGX que comprende 55 g/kg de glucosa, 45 g/kg de xilosa, 10 g/kg de extracto de levadura, 10 g/kg de peptona, 2000 ppm de acido acetico, pH ajustado a 5 con KOH.
En el medio YFGX, el acido acetico presente en una concentracion de 2000 ppm a pH 5 no tiene efecto inhibidor.
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La fermentacion se lleva a cabo preferiblemente a 32°C, con agitacion moderada, por ejemplo, 90 rpm.
La agitacion es moderada para que no sea oxigenante.
El pH del medio preferiblemente se controla, por ejemplo, mediante la capacidad de tamponamiento de una pareja de acido/base, por ejemplo, la capacidad de tamponamiento de acido acetico/acetato en el medio YFGX.
La cantidad de etanol presente en el medio de fermentacion se mide por cualquier medio adecuado conocido para el experto en la tecnica.
Puede ser una medicion directa del etanol producido o una medicion indirecta por un parametro correlacionado con la produccion de etanol, tal como la perdida de masa.
Por ejemplo, la produccion de alcohol se puede medir por cromatograffa, en concreto por HPLC (cromatograffa lfquida de alto rendimiento), un kit enzimatico (por ejemplo, el kit de valoracion de etanol de Boehringer) o una valoracion mediante dicromato potasico.
La cantidad de xilosa presente en el medio de fermentacion se mide por cualquier medio adecuado conocido para el experto en la tecnica, preferiblemente por cromatograffa, en concreto por HPLC.
El uso de un medio de fermentacion que comprende a la vez glucosa y xilosa permite evaluar la conversion de la xilosa en etanol a partir de una cantidad de biomasa comparable para las diferentes cepas de levaduras evaluadas. En efecto, las cepas de levaduras fermentan primero la glucosa de la mezcla de glucosa y xilosa, y despues la glucosa y la xilosa.
La capacidad de metabolizar la xilosa en presencia de al menos un inhibidor de la fermentacion se califica como resistencia a dicho inhibidor de la fermentacion.
En el marco de la presente invencion, el inhibidor de la fermentacion es preferiblemente el acido acetico.
Es la forma no ionizada del acido acetico, a partir de una determinada concentracion llamada concentracion toxica, la responsable de su toxicidad y por lo tanto de su efecto inhibidor.
Por ejemplo, una concentracion de 4000 ppm de acido acetico a pH 4,4 es una concentracion toxica para las cepas que no son resistentes al acido acetico, tales como la cepa de levadura I-4538.
Durante la fermentacion en condiciones anaerobias, el efecto inhibidor del acido acetico se traduce en concreto en un retraso del inicio de la conversion de los azucares en biomasa y en etanol.
La resistencia al acido acetico se mide en esta memoria en relacion con el retraso del inicio de la conversion de los azucares en etanol, es decir, el retraso del inicio de la fermentacion alcoholica.
La curva de fermentacion alcoholica que representa la cantidad de alcohol producido en funcion del tiempo consta en general de tres fases:
- una fase de latencia, en el transcurso de la cual no hay produccion de etanol,
- una fase de produccion de alcohol, y
- una fase de meseta, que corresponde al final de la fermentacion.
El retraso del inicio de la fermentacion alcoholica corresponde en esta memoria a la abscisa en el origen de la recta que representa la derivada maxima de la velocidad de produccion de alcohol.
De forma mas sencilla, el retraso del inicio de la fermentacion alcoholica corresponde en esta memoria a la abscisa en el origen de la recta que corresponde a la pendiente de la fase de produccion de alcohol.
Una cepa de levadura resistente al acido acetico se define en esta memoria como una cepa de levadura que tiene un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica inferior a 30 horas, preferiblemente inferior a 29 horas, mas preferiblemente inferior a 28 horas en un medio de fermentacion que comprende 4000 ppm de acido acetico a pH 4,4.
El medio de fermentacion usado para evaluar la resistencia al acido acetico es preferiblemente un medio sintetico, mas preferiblemente el medio YFAc.
La composicion del medio YFAc es la siguiente: 150 g/kg de glucosa, 5 g/kg de extracto de levadura, 4,7 g/kg de DAP (fosfato diamonico), 11,5 g/kg de acido cffrico, 4 g/kg de acido acetico, 13,5 g/kg de citrato sodico, 1 ml/kg de Tween 80, 2 ml/kg de ZnSO4 (10,6 g/l), 2,5 ml/kg de MgSO4'7H2O (400 g/l), 1 ml/kg de tiamina (18,24 g/l), 1 ml/kg de piridoxina (5,28 g/l), 1 ml/kg de biotina (1,76 g/l), 1 ml/kg de pantotenato (3,8 g/l), 2,5 ml/kg de acido nicotmico (8 g/l), 1 ml/kg de mesoinositol (50 g/l), 1 ml/kg de riboflavina (1 g/), 1 ml/kg de para-aminobenzoato
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(1,2 g/l), pH ajustado a 4,4 con KOH.
La siembra de la cepa de levadura usada para evaluar la resistencia al acido acetico es, preferiblemente, 0,25 g de materia seca/kg de medio de fermentacion.
El tiempo t=0 de la curva de fermentacion alcoholica corresponde al momento de la siembra de la cepa de levadura en el medio de fermentacion.
La fermentacion alcoholica se lleva a cabo en condiciones anaerobias, preferiblemente a 32°C y con agitacion moderada, por ejemplo 90 rpm.
La agitacion es moderada para que no sea oxigenante.
El pH del medio preferiblemente esta controlado, por ejemplo, mediante la capacidad de tamponamiento de una pareja de acido/base, por ejemplo, la capacidad de tamponamiento de acido acetico/acetato en el medio YFAc.
En el medio de fermentacion YFAc, una cepa de levadura que no es resistente al acido acetico puede tener un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica de al menos 40 h.
Los autores de la invencion han intentado obtener una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa, incluso en presencia de acido acetico, partiendo de una cepa de levadura eficaz en terminos de conversion de la xilosa en etanol.
Esta cepa de levadura eficaz en terminos de conversion de la xilosa en etanol elegida como cepa de partida a mejorar con el fin de conferirle un caracter de resistencia al acido acetico es la cepa de levadura I-4538 depositada conforme al tratado de Budapest el 5 de octubre de 2011 ante la CNCM (Coleccion Nacional de Cultivos de Microorganismos), 25, ruedu Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, Francia.
La cepa de levadura I-4538 convierte al menos 90% de la xilosa en etanol en 60 horas en el medio de fermentacion YFGX que comprende 55 g de glucosa y 45 g de xilosa por kg de medio.
Sin embargo, la cepa de levadura I-4538 es particularmente sensible al acido acetico: tiene un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica de al menos 40 horas en un medio de fermentacion YFAc que comprende 4000 ppm de acido acetico a pH 4,4.
La cepa de levadura I-4538 es una cepa de Saccharomyces cerevisiae obtenida por evolucion dirigida a partir de una cepa de levadura geneticamente modificada por:
- insercion de al menos una copia de un gen exogeno que codifica una xilosa isomerasa (XI) de Clostridium phytofermentans bajo el control del promotor pADH1 y del terminador CYC1,
- insercion de al menos una copia de un gen exogeno que codifica una xilitol deshidrogenasa (XDH) de Pichia stipitis bajo el control del promotor pADH1 y del terminador CYC1,
- al menos una copia del gen endogeno TAL1 situado bajo el control del promotor pPGK1,
- al menos una copia del gen endogeno TKL1 situado bajo el control del promotor pTDH3,
- al menos una copia del gen endogeno RPE1 situado bajo el control del promotor pTDH3,
- al menos una copia del gen endogeno RKI1 situado bajo el control del promotor pTDH3,
- insercion de al menos una copia de un gen endogeno que codifica una xiluloquinasa (XKS1) bajo el control del promotor pADH1 y del terminador CYC1, y
- eliminacion de al menos una copia del marco abierto de lectura del gen endogeno GRE3 que codifica una aldosa reductasa.
La cepa de levadura I-4538 esta desprovista de cualquier marcador de seleccion residual.
La cepa de levadura I-4538 no comprende gen que codifique una XR de origen exogeno, ni gen araA, araB o AraD.
El gen exogeno que codifica una xilosa isomerasa (XI) de Clostridium phytofermentans es el gen de secuencia optimizada SEQ iD NO: 3 descrita en el documento DE102008031350.
El gen exogeno que codifica una xilitol deshidrogenasa (XDH) de Pichia stipitis es el gen de la secuencia de referencia X55392.1 en Genbank.
Los promotores pADH1, pPGK1 y pTDH3 son promotores de Saccharomyces cerevisiae.
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El terminador CYC1 es un promotor de Saccharomyces cerevisiae.
La cepa de levadura I-4538 es una cepa de levadura industrial que es aneuploide.
La cepa de levadura I-4538 es prototrofa.
Con el fin de conferir una propiedad de resistencia al acido acetico a la cepa de levadura I-4538, pero sin modificar sensiblemente su capacidad para metabolizar la xilosa, los autores de la invencion han elegido usar la tecnica de cruce de cepas.
Segun el conocimiento de los autores de la invencion, es la primera vez que se usa la tecnica de cruce para mejorar una cepa de levadura aneuploide geneticamente modificada.
En efecto, el experto en la tecnica no consideraria en primer lugar usar la tecnica del cruce, cuando la cepa de levadura de partida:
- consta de no menos de ocho modificaciones geneticas que a priori deben ser transferidas a los segregados seleccionados,
- es una cepa de levadura aneuploide y existen problemas de segregacion en ausencia de diploidfa estricta, y
- ha sufrido una etapa de mutagenesis en el marco de una evolucion dirigida, lo que puede estar en el origen de las dificultades para los cruces, en particular en caso de traslocacion cromosomica, en el origen de los problemas de germinacion.
Se han realizado cruces entre la cepa de levadura I-4538 y cepas de levaduras resistentes al acido acetico y no modificadas geneticamente, es decir no tienen la maquinaria genetica necesaria para la fermentacion de la xilosa.
Las cepas de levaduras resistentes al acido acetico usadas para los cruces tienen un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica inferior a 14 h en el medio de fermentacion YFAc.
Los resultados de los cruces no han sido concluyentes: si el caracter de resistencia al acido acetico se transferia bien a los hnbridos, estos eran claramente menos eficaces que la cepa I-4538 de partida para convertir la xilosa en etanol.
En el menor caso, los hnbridos obtenidos convertfan 40% de la xilosa en etanol en 60 horas en el medio de fermentacion YFGX que comprende 55 g de glucosa y 45 g de xilosa por kg de medio.
Los autores de la invencion han intentado mejorar la fermentacion de la xilosa de estos hnbridos por evolucion dirigida, pero sin mas exito.
Los autores de la invencion han puesto entonces de manifiesto que, para transferir el caracter de resistencia al acido acetico por cruce, sin perder la capacidad de metabolizar eficazmente la xilosa, era necesario cruzar la cepa de levadura I-4538 con una cepa de levadura resistente al acido acetico que tenga una dotacion genetica cercana, es decir que tengan tambien la maquinaria genetica para metabolizar la xilosa, pero sin ser necesariamente eficaz para metabolizar la xilosa.
La cepa de levadura usada, que es a la vez resistente al acido acetico y que tambien tiene la maquinaria genetica para metabolizar la xilosa, es la cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada con el numero I-4627 conforme al tratado de Budapest el 24 de mayo de 2012 ante la CNCM (Coleccion Nacional de Cultivos de Microorganismos), 25, ruedu Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, Francia.
Asf pues, mediante el cruce de la cepa de levadura I-4538 con la cepa de levadura I-4627, los autores de la invencion han obtenido cepas de levaduras a la vez eficaces para metabolizar la xilosa y resistentes al acido acetico.
La presente invencion tiene asf por objeto la cepa de levadura depositada en la CNCM con el numero I-4627.
La cepa I-4627 constituye una de las dos cepas de partida para obtener las cepas de levaduras segun la invencion.
La cepa de levadura I-4627 es una nueva cepa de levadura, obtenida por un procedimiento original de cruce de una cepa de levadura aneuploide resistente al acido acetico y no modificada geneticamente con una cepa de levadura aneuploide geneticamente modificada.
La cepa de levadura I-4627 se ha obtenido de la siguiente forma:
- seleccion de una cepa de levadura resistente al acido acetico, es decir que tiene un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica inferior a 14 h en el medio de fermentacion YFAc,
- seleccion de una cepa de levadura geneticamente modificada por:
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- insercion de al menos una copia de un gen exogeno que codifica una xilosa isomerasa (XI) de Clostridium phytofermentans bajo el control del promotor pADH1 y del terminador CYC1,
- insercion de al menos una copia de un gen exogeno que codifica una xilitol deshidrogenasa (XDH) de Pichia stipitis bajo el control del promotor pADHI y del terminador CYC1,
- al menos una copia del gen endogeno TAL1 situado bajo el control del promotor pPGKI,
- al menos una copia del gen endogeno TKL1 situado bajo el control del promotor pTDH3,
- al menos una copia del gen endogeno RPE1 situado bajo el control del promotor pTDH3,
- al menos una copia del gen endogeno RKI1 situado bajo el control del promotor pTDH3,
- insercion de al menos una copia de un gen endogeno que codifica una xiluloquinasa (XKS1) bajo el control del promotor pADHI y del terminador CYC1, y
- eliminacion de al menos una copia del marco de lectura abierto del gen endogeno GRE3 que codifica una aldosa reductasa.
- cruce de dicha cepa de levadura resistente al acido acetico con dicha cepa de levadura geneticamente modificada, para obtener un tnbrido,
- evolucion dirigida de dicho tnbrido para obtener la cepa de levadura I-4627.
La cepa de levadura I-4627 consta de al menos una copia un gen exogeno que codifica una xilosa isomerasa (XI) de Clostridium phytofermentans bajo el control del promotor pADHI y del terminador CYC1, al menos una copia de un gen exogeno que codifica una xilitol deshidrogenasa (XDH) de Pichia stipitis, bajo el control del promotor pADHI y del terminador CYC1, al menos una copia del gen endogeno TAL1 situado bajo el control del promotor pPGKI, al menos una copia del gen endogeno TKL1 situado bajo el control de promotor pTDH3, al menos una copia del gen endogeno RPE1 situado bajo el control del promotor pTDH3, al menos una copia del gen endogeno RKI1 situado bajo el control del promotor pTDH3, al menos una copia de un gen endogeno que codifica una xiluloquinasa (XKSl) bajo el control del promotor pADH1 y del terminador CYC1 y al menos una copia del marco de lectura abierto del gen endogeno GRE3 que codifica una aldosa reductasa eliminada.
Como para la cepa de levadura I-4538, el gen exogeno que codifica la xilosa isomerasa (XI) de Clostridium phytofermentanses el gen de secuencia optimizada SEQ ID NO: 3 descrito en el documento DE102008031350 y el gen exogeno que codifica una xilitol deshidrogenasa (XDH) de Pichia stipitis es el gen de la secuencia de referencia X55392.1 de Genbank.
La cepa de levadura I-4627 esta desprovista de cualquier marcador de seleccion residual.
La cepa de levadura I-4627 no comprende gen que codifique una XR de origen exogeno ni gen araA, araB o AraD.
La cepa de levadura I-4627 es una cepa de levadura industrial y es aneuploide.
La cepa de levadura I-4627 es prototrofa.
La resistencia al acido acetico de la cepa de levadura -4627 es inferior a la de la cepa de levadura resistente al acido acetico de partida usada para el cruce, pero su resistencia al acido acetico es sobradamente aceptable para una aplicacion industrial.
Asf, la cepa de levadura I-4627 tiene un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica inferior a 20 horas en el medio de fermentacion YFAc.
Con respecto al rendimiento frente a la xilosa, la cepa de levadura I-4627 convierte aproximadamente 60% de la xilosa en etanol, en condiciones anaerobias, en 60 horas, en el medio de fermentacion YFGX que comprende 55 g de glucosa y 45 g de xilosa por kg de medio.
La cepa de levadura I-4627 es, por lo tanto, una cepa de levadura original que tiene una resistencia al acido acetico y que tiene la maquinaria genetica para metabolizar la xilosa, pero que no es capaz de metabolizar la xilosa con el significado de la invencion, es decir que es incompatible para un uso industrial con el fin de producir etanol.
Los autores de la invencion han procedido entonces al cruce de la cepa de levadura I-4538 con la cepa de levadura I-4627, con el fin de obtener una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico.
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La presente invencion tiene asf por objeto un procedimiento de obtencion de una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico, que comprende las etapas de:
- cruce de la cepa de levadura depositada en la CNCM con el numero I-4538 con la cepa de levadura depositada en la CNCM con el numero I-4627, para obtener al menos un hforido,
- seleccion de al menos un hforido capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico, para obtener una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico.
Como se ha definido antes la cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico segun la invencion tiene las siguientes propiedades:
- convierte al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 90% de la xilosa en etanol en 60 horas en el medio de fermentacion YFGX que comprende 55 g de glucosa y 45 g de xilosa por kg de medio de fermentacion, en condiciones anaerobias, y
- tiene un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica inferior a 30 horas, preferiblemente inferior a 29 horas, mas preferiblemente inferior a 28 horas, en un medio de fermentacion YFAc que comprende 4000 ppm de acido acetico a pH 4,4.
La etapa del cruce se lleva a cabo segun las tecnicas clasicas, como las que se ensenan en el capftulo 7 “Sporulation and Hydridization of Yeast” de R.R. Fowell, de la obra de referencia “The Yeasts”, Volumen 1, editado por A.H. Rose y J. S. Harrison, 1969-Academic Press.
Con el fin de mejorar la eficacia del procedimiento de obtencion de una cepa de levadura segun la invencion, es particularmente ventajoso llevar a cabo una seleccion a nivel de los segregados procedentes de la cepa de levadura I-4538 y/o a nivel de los segregados procedentes de la cepa de levadura I-4627.
Los segregados de la cepa de levadura I-4538 usados para el cruce se seleccionan preferiblemente basandose en su capacidad para metabolizar la xilosa.
Los segregados de la cepa de levadura I-4627 usados para el cruce se seleccionan basandose en su resistencia al acido acetico.
El procedimiento como se define anteriormente, se puede caracterizar porque dicha etapa de cruce comprende:
- una etapa de esporulacion de la cepa de levadura depositada en la CNCM con el numero I-4538, para obtener al menos un segregado X,
- una etapa opcional de evaluacion de la conversion de la xilosa en etanol por al menos un segregado X,
- una etapa de esporulacion de la cepa de levadura depositada en la CNCM con el numero I-4627, para obtener al menos un segregado Y,
- una etapa opcional de evaluacion de la resistencia al acido acetico de al menos un segregado Y,
- una etapa de hibridacion de al menos un segregado X con al menos un segregado Y, siendo capaz dicho segregado X de convertir xilosa en etanol y/o teniendo dicho segregado Y una resistencia al acido acetico, para obtener al menos un hubrido.
Las etapas de esporulacion, evaluacion de la conversion de xilosa en etanol y de evaluacion de la resistencia al acido acetico se pueden llevar a cabo en cualquier orden deseado, a partir del momento en que se ha realizado la esporulacion de una cepa de levadura dada antes de la evaluacionde sus segregados.
Por ejemplo, un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, se puede caracterizar porque dicha etapa de cruce comprende:
- una etapa de esporulacion de la cepa de levadura depositada en la CNCM con el numero I-4538, para obtener al menos un segregado X,
- una etapa opcional de medicion del porcentaje de xilosa convertido en etanol por al menos un segregado X, en condiciones anaerobias, en 60 horas en un medio de fermentacion que comprende 55 g de glucosa y 45 g de xilosa por kg de dicho medio.
- una etapa de esporulacion de la cepa de levadura depositada en la CNCM con el numero I-4627, para obtener al menos un segregado Y,
- una etapa opcional de medicion del retraso del inicio de la fermentacion alcoholica de al menos un segregado Y en dicho medio de fermentacion que comprende 4000 ppm de acido acetico a pH 4,4.
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- una etapa de hibridacion de al menos un segregado X con al menos un segregado Y, convirtiendo el segregado X al menos 60% de la xilosa en etanol en 60 horas y/o teniendo el segregado Y un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica inferior a 30 horas, para obtener al menos un hubrido.
Las etapas de esporulacion, medicion del porcentaje de xilosa convertido en etanol y la medicion del retraso del inicio de la fermentacion alcoholica se pueden llevar a cabo en cualquier orden deseado, a partir del momento en el que se ha realizado la esporulacion de una cepa de levadura dada antes de la medicion del parametro de seleccion aplicado a los segregados de esta cepa.
La siembra usada para medir el porcentaje de xilosa convertido en etanol por al menos un segregado de la cepa de levadura I-4538 es preferiblemente 0,25 g de materia seca/kg de medio de fermentacion.
El medio de fermentacion usado para medir el porcentaje de xilosa convertido en etanol por al menos un segregado de la cepa de levadura I-4538 es preferiblemente el medio de fermentacion YFGX.
Los segregados de la cepa de levadura I-4538 son menos eficaces de forma natural que la cepa aneuploide de partida para metabolizar la xilosa. Es por esto que el criterio de seleccion aplicado relativo a la conversion de la xilosa en etanol es menos exigente que la capacidad de la cepa de levaduraI-4538 de partida.
Por lo tanto, un segregado de la cepa de levadura I-4538 se puede seleccionar si convierte, en condiciones anaerobias, al menos 60% de la xilosa en etanol en 60 horas en un medio de fermentacionque comprende 55 g de glucosa y 45 g de xilosa por kg de dicho medio, preferiblemente al menos 65% de la xilosa, mas preferiblemente todavfa al menos 70% de la xilosa.
Con el fin de optimizar la duracion de la etapa de seleccion de los segregados, se puede medir la conversion de la xilosa en etanol de los segregados de la cepa de levadura I-4538 con una duracion mas corta, porejemplo en 48 horas.
Por lo tanto, un segregado de la cepa de levadura I-4538 se puede seleccionar si convierte, en condiciones anaerobias, al menos 60% de la xilosa en etanol en 48 horas en un medio de fermentacionque comprende 55 g de glucosa y 45 g de xilosa por kg de dicho medio, preferiblemente al menos 65% de la xilosa, mas preferiblemente todavfa al menos 70% de la xilosa.
Un segregado de la cepa de levadura I-4627 se puede seleccionar si tiene un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica inferior a 30 horas, preferiblemente inferior a 29 horas, mas preferiblemente inferior a 28 horas, en un medio de fermentacion que comprende 4000 ppm de acido acetico a pH 4,4.
Sin embargo, de forma sorprendente, la mayona de los segregados de la cepa de levadura I-4627 son mas resistentes al acido acetico que la cepa de levadura de partida I-4627, es decir, que su retraso del inicio de la fermentacion alcoholica es inferior al de la cepa de levadura de partida -4627.
El criterio de seleccion aplicado relativo a la resistencia al acido acetico es, por lo tanto, preferiblemente mas exigente.
Por lo tanto, un segregado de la cepa de levadura I-4627 se puede seleccionar si tiene un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica inferior a 25 horas, preferiblemente inferior a 20 horas.
El medio de fermentacion usado para medir el retraso del inicio de la fermentacion alcoholica de al menos un segregado de la cepa de levadura I-4627 es preferiblemente el medio de fermentacion YFAc.
La siembra usada para medir el retraso del inicio de la fermentacion alcoholica de al menos un segregado de la cepa de levadura I-4627 es preferiblemente 0,25 g de materia seca/kg de medio de fermentacion.
Los segregados de la cepa de levadura I-4627 se pueden seleccionar ademas segun su capacidad para convertir la xilosa en etanol.
Sin embargo, de forma sorprendente, los mejores hubridos se han obtenido a partir de los segregados de la cepa I-4627 seleccionados unicamente basandose en su resistencia al acido acetico.
Preferiblemente, la etapa de hibridacion se lleva a cabo con:
- al menos un segregado X que convierte al menos 60% de la xilosa en etanol, preferiblemente al menos 65% de la xilosa, mas preferiblemente todavfa al menos 70% de la xilosa, en 60 horas, preferiblemente en 48 horas, y
- al menos un segregado Y que tiene un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica inferior a 30 horas, preferiblemente inferior a 29 horas, mas preferiblemente inferior a 28 horas, mas preferiblemente inferior a 25 horas, mas preferiblemente inferior a 20 horas.
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Los hubridos asf obtenidos a continuacion se seleccionan basandose en dos criterios: su capacidad para metabolizar la xilosa y su resistencia al acido acetico.
Un procedimiento como se ha definido anteriormente, se puede caracterizar porque dicha etapa de seleccion de al menos un hubrido capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico, comprende las etapas de:
- medicion del porcentaje de xilosa convertido en etanol por al menos un hubrido en condiciones anaerobias, en 60 horas, en un medio de fermentacion que comprende 55 g de glucosa y 45 g de xilosa por kg de medio de fermentacion,
- medicion del retraso del inicio de la fermentacion alcoholica de al menos un hubrido en un medio de fermentacion que comprende 4000 ppm de aado acetico a pH 4,4,
- seleccion de al menos un hubrido que convierte al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 90% de xilosa en etanol en 60 horas y cuyo retraso del inicio de la fermentacion alcoholica es inferior a 30 horas, preferiblemente inferior a 29 horas, mas preferiblemente inferior a 28 horas, para obtener una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico.
El orden de las etapas de medicion del porcentaje de xilosa convertido en etanol y de la medicion del retraso
del inicio de la fermentacion alcoholica no tiene importancia: se pueden llevar a cabo una despues de otra, en
una direccion u otra, o al mismo tiempo.
Las condiciones de medicion del porcentaje de conversion de la xilosa en etanol y del retraso del inicio de la fermentacion alcoholica son como las que se han definido anteriormente.
Se describe en esta memoria un procedimiento de obtencion de una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico, que comprende las etapas de:
- cruce de la cepa de levadura depositada en la CNCM con el numero I-4538 con la cepa de levadura depositada en la CNCM con el numero I-4627, comprendiendo dicha etapa de cruce las etapas de:
- esporulacion de la cepa de levadura depositada en la CNCM con el numero I-4538, para obtener al menos un segregado X,
- medicion del porcentaje de xilosa convertido en etanol por al menos un segregado X, en 60
horas, preferiblemente en 48 horas, en un medio de fermentacion que comprende 55 g de
glucosa y 45 g de xilosa por kg de dicho medio,
- seleccion de al menos un segregado X que convierte al menos 60% de la xilosa en etanol en 60 horas, preferiblemente en 48 horas,
- esporulacion de la cepa de levadura depositada en la CNCM con el numero I-4627, para obtener al menos un segregado Y,
- medicion del retraso del inicio de la fermentacion alcoholica de al menos un segregado Y en dicho medio de fermentacion que comprende 4000 ppm de acido acetico a pH 4,4,
- seleccion de al menos un segregado Y que tiene un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica inferior a 30 horas,
- hibridacion de la menos un segregado X que convierte al menos 60% de la xilosa en etanol en 60 horas, preferiblemente en 48 horas, con al menos un segregado Y que tiene un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica inferior a 30 horas, para obtener al menos un hubrido,
- seleccion de al menos un hubrido capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico, comprendiendo dicha etapa de seleccion las etapas de:
- medicion del porcentaje de xilosa convertido en etanol por al menos un hubrido, en condiciones anaerobias, en 60 horas, en un medio de fermentacion que comprende 55 g de glucosa y 45 g de xilosa por kg de medio de fermentacion,
- medicion del retraso del inicio de la fermentacion alcoholica de dicho al menos un hubrido en un medio de fermentacion que comprende 4000 ppm de acido acetico a pH 4,4,
- seleccion de al menos un hubrido que convierte al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 90% de la xilosa en etanol en 60 horas y cuyo retraso del inicio de la fermentacion alcoholica es inferior a 30 horas, preferiblemente inferior a 29 horas, mas preferiblemente inferior a 28 horas,
para obtener una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico.
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Como se ha indicado anteriormente, el orden de las etapas de cruce no importa, al igual que el orden de las etapas de seleccion de al menos un fubrido.
Preferiblemente, la etapa de hibridacion se realizaentre:
- al menos un segregado X que convierte al menos 60% de la xilosa en etanol, preferiblemente al menos 65% de la xilosa, mas preferiblemente todavfa al menos 70% de la xilosa, en 60 horas, preferiblemente en 48 horas, y
- al menos un segregado Y que tiene un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica inferior a 30 horas, preferiblemente inferior a 29 horas, mas preferiblemente inferior a 28 horas, mas preferiblemente todavfa inferior a 25 horas, mas preferiblemente todavfa inferior a 20 horas.
El procedimiento puede comprender opcionalmente una etapa de evolucion dirigida.
La etapa de evolucion dirigida se puede llevar a cabo con un hubrido no seleccionado durante la etapa de seleccion del procedimiento de obtencion de una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico tal como se ha definido anteriormente, con el fin de hacer dicho hubrido capaz de metabolizar la xilosa en etanol y/o de hacerlo resistente al acido acetico.
Se describe tambien en esta memoria un procedimiento como se ha definido anteriormente de obtencion de una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico, que comprende las etapas de:
- cruce de la cepa de levadura depositada en la CNCM con el numero I-4538 con la cepa de levadura depositada en la CNCM con el numero I-4627, para obtener al menos un hubrido,
- evolucion dirigida de al menos un hubrido,
- seleccion de al menos un hfbrido capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico, para obtener una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico.
La etapa de evolucion dirigida comprende las siguientes subetapas:
- mutagenesis, para obtener mutantes, y
- multiplicacion de los mutantes, en cultivos dclicos, en condiciones de hipoxia, en un medio de cultivo que consta de xilosa y/o un inhibidor de la fermentacion.
Para simplificar, los mutantes obtenidos tras la etapa de evolucion dirigida se consideran todavfa hubridos.
La expresion “en condiciones de hipoxia” significa en condiciones de deficiencia de oxfgeno.
Una deficiencia de oxfgeno se define en esta memoria por un porcentaje de oxfgeno inferior a 20% del aire.
La etapa de mutagenesis preferiblemente es una mutagenesis llamada moderada, es decir, obtenida por exposicion de las celulas de levadura a una radiacion UV a 254 nm comprendida de 100 a 500 J/cm2, por ejemplo 300 J/cm2.
Estas condiciones dan lugar a una tasa de mortalidad de solo 7% a 16% de la poblacion de celulas sometidas a la radiacion UV.
La tasa de mortalidad se determina extendiendo en placas de medio cuya fuente de carbono es glucosa, un volumen identico de la suspension celular antes y despues de mutagenesis, y contando el numero de colonias despues de 48 horas de crecimiento.
La multiplicacion de mutantes en cultivos dclicos, en condiciones de hipoxia, en un medio de cultivo que comprende xilosa y/o un inhibidor, comprende, por ejemplo:
a) el cultivo de la poblacion celular sometida a mutagenesis, en un medio de cultivo, con agitacion, en condiciones de hipoxia, preferiblemente a 32°C,
b) la extraccion de un volumen del cultivo obtenido en la etapa a), por ejemplo un ml, y vuelta a sembrar en un medio de cultivo de la misma composicion que en el etapa a),
repitiendose las etapas a) y b) al menos 3 veces, preferiblemente al menos 4 veces, por ejemplo, 6 veces, 7 veces u 8 veces.
Cuando un inhibidor de la fermentacion esta presente en el medio de cultivo durante la multiplicacion de los mutantes, se trata preferiblemente del acido acetico.
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La multiplicacion de mutantes en cultivos dclicos en condiciones de hipoxia se puede llevar a cabo en un medio de cultivo que comprende xilosa y en ausencia de acido acetico.
El medio de cultivo para la multiplicacion de mutantes comprende, por ejemplo, 7% de xilosa. Un ejemplo de medio de cultivo para la multiplicacion de mutantes es el medio YFX de la siguiente composicion: 70 g/kg de xilosa, 5 g/kg de extracto de levadura, 4,7 g/kg de DAP (fosfato diamonico), 11,5 g/kg de acido dtrico, 13,5 g/kg de citrato sodico, 1 ml/kg de Tween 80, 2 ml/kg de ZnSO4 (10,6 g/l), 2,5 ml/kg de MgSO4-7H2O (400 g/l), 1 ml/kg de tiamina (18,24 g/l), 1 ml/kg de piridoxina (5,28 g/l), 1 ml/kg de biotina (1,76 g/l), 1 ml/kg de pantotenato (3,8 g/l), 2,5 ml/kg de acido nicotmico (8 g/l), 1 ml/kg de mesoinositol (50 g/l), 1 ml/kg de riboflavina (1 g/l), 1 ml/kg de para- aminobenzoato (a 1,2 g/l), pH ajustado a 4,4 con KOH.
Las condiciones de hipoxia se obtienen, por ejemplo, gracias a una sobrepresion parcial en el equipo usado (por ejemplo, matraces o fermentadores) debido a una sobrepresion resultado de la produccion del producto CO2 durante la fermentacion, y a la ausencia de aireacion.
Preferiblemente, la duracion del cultivo a) es tal que se ha consumido la totalidad de la xilosa del medio.
La duracion de un cultivo es, por ejemplo, de 1 semana a 48 horas.
El numero de cultivos realizado es variable, por ejemplo, de 5 a 20.
La etapa de evolucion dirigida puede comprender una subetapa de seleccion de mutantes no deficientes respiratorios.
Un mutante no deficiente respiratorio es un mutante capaz de multiplicarse, en metabolismo oxidativo.
En particular, un mutante no deficiente respiratorio puede multiplicarse, en condiciones aerobias, a 30°C, en un medio que contiene glicerol como la unica fuente de carbono, por ejemplo, un medio que comprende 20 g/kg de glicerol, 5 g/kg de sulfato de amonio y 1,7 g/kg del medio YNB (Yeast Notrogen Base), por ejemplo, el medio YNB de Difco.
Cuando el medio de cultivo no comprende inhibidor de fermentacion, se puede llevar a cabo una subetapa de multiplicacion en un medio de cultivo que comprende acido acetico, despues de algunas o de cada subetapa de multiplicacion en cultivos dclicos, con el fin de verificar que el medio todavfa contiene al menos un mutante resistente al acido acetico.
La duracion de la multiplicacion en un medio de cultivo que comprende acido acetico, preferiblemente es superior a 20 h e inferior a 75 h.
Por ejemplo, la duracion de la subetapa de multiplicacion en un medio de cultivo que comprende acido acetico, esta comprendida entre 70 h y 75 h.
Tambien se puede llevar a cabo una etapa de seleccion de mutantes que tienen un velocidad de crecimiento adecuada, por cultivo en un medio que comprende glucosa, por ejemplo, un medio que comprende 20 g/l de glucosa, y seleccion de mutantes que tienen la velocidad de crecimiento adecuada.
Una etapa de evolucion dirigida se puede llevar a cabo tambien a partir del tubrido seleccionado tras la etapa de seleccion del procedimiento de obtencion de una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico como se ha definido anteriormente, por ejemplo, con el fin de mejorar mas su capacidad de metabolizar la xilosa y/o su resistente al acido acetico.
Se describe en esta memoria una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico, que se puede obtener por el procedimiento como se ha definido anteriormente.
La cepa de levadura H1 se ha obtenido asf por el procedimiento de obtencion de una cepa de levadura tal como se ha definido anteriormente (vease el ejemplo 1).
La cepa de levadura H1 convierte al menos 90% de la xilosa en etanol en condiciones anaerobias en 60 horas, en el medio YFGX y tiene un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica inferior a 22 h en el medio de fermentacion YFAc.
Se describe tambien en esta memoria una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico, obtenida por el procedimiento tal como se ha definido anteriormente, que se elige entre la cepa de levadura depositada en la CNCM con el numero I-4624, la cepa de levadura depositada en la CNCM con el numero I-4625 y la cepa de levadura depositada en la CNCM con el numero I-4626.
Las cepas I-4624, I-4625 y I-4626 son cepas de Saccharomyces cerevisiae depositadas conforma el Tratado de Budapest el 24 de mayo de 2012 ante la CNCM (Coleccion Nacional de Cultivos de Microorganismos), 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, Francia.
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La cepa de levadura numero I-4624 convierte al menos 90% de la xilosa en etanol en condiciones anaerobias en 60 horas en el medio YFGX y tiene un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica inferior a 23 horas en el medio YFAc.
La cepa de levadura numero I-4625 convierte al menos 90% de la xilosa en etanol en condiciones anaerobias en 60 horas en el medio YFGX y tiene un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica inferior a 23 horas en el medio YFAc.
La cepa de levadura numero I-4626 convierte al menos 90% de la xilosa en etanol en condiciones anaerobias en 60 horas en el medio YFGX y tiene un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica inferior a 27 horas en el medio YFAc.
Se describe tambien en esta memoria una cepa de levadura derivada de una cepa de levadura segun la invencion que comparte las mismas propiedades.
Por lo tanto, una cepa de levadura derivada de una cepa de levadura segun la invencion, se caracteriza porque dicha cepa de levadura derivada es capaz de metabolizar la xilosa y es resistente al acido acetico.
Una cepa de levadura derivada es tal como se ha definido anteriormente en las definiciones.
Se describe tambien en esta memoria una levadura obtenida por cultivo de una cepa de levadura tal como se ha definido anteriormente o por cultivo de una cepa de levadura derivada tal como se ha definido anteriormente.
Las levaduras se obtienen por cultivo de una cepa de levadura segun la invencion o de una cepa de levadura derivada, en concreto como se describe en el libro de referencia “Yeast Technology”, 2a edicion, 1991, G. Reed y T.W. Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.
La multiplicacion de las levaduras, a escala industrial, comprende en general al menos las dos primeras etapas del conjunto de las siguientes etapas:
- multiplicacion de una cepa de levadura en varias fases, primero en semi-anaerobiosis, y despues en aerobiosis,
- separacion por centrifugacion de la levadura asf producida de su medio de cultivo, para obtener una crema de levaduras lfquida que contiene aproximadamente entre 12 y 25% de materia seca, incluso una cantidad mas elevada de materia seca si la crema de levaduras se mezcla con productos osmolitos,
- filtracion de la crema de levaduras lfquida asf obtenida, en general en un filtro rotatorio con vacfo, para obtener una levadura fresca deshidratada que contiene de 26% a 35% de materia seca,
- amasado de dicha levadura fresca deshidratada, para obtener una masa homogenea,
- extrusion de la levadura asf obtenida, para obtener:
- una levadura prensada en forma de panes de levadura fresca o de levadura fresca desmigajada, que contiene aproximadamente 30% de materia seca, o
- una levadura en forma de partfculas, en general granulos, si la levadura esta destinada a ser secada,
- opcionalmente, secado de forma cuidadosa, en una corriente de aire caliente, por ejemplo, por fluidizacion, de las partfculas de levadura obtenidas por extrusion para obtener levadura seca.
La etapa de secado preferiblemente es un secado rapido cuidadoso en presencia de un emulsionante.
Entre los emulsionantes que se pueden usar durante la etapa de secado, se puede elegir el monoestearato de sorbitan, usado, por ejemplo, en una concentracion de aproximadamente 1,0% (en peso respecto al peso de levadura seca).
Las levaduras segun la invencion se pueden usar en cualquier forma posible.
Por ejemplo, una levadura tal como se ha definido anteriormente, se puede caracterizar porque esta en forma de crema de levadura, levadura prensada, levadura seca o levadura congelada.
Las levaduras descritas en esta memoria tienen las mismas propiedades que la cepa de levadura a partir de la que se obtienen por cultivo, concretamente:
- las levaduras descritas en esta memoria son capaces de metabolizar la xilosa, y
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- las levaduras descritas en esta memoria con resistentes al acido acetico.
Las levaduras descritas en esta memoria son particularmente interesantes para la produccion de alcohol industrial, por ejemplo destinado a los biocarburantes o a las industrias qmmicas.
Se describe tambien en esta memoria un procedimiento de produccion de al menos un producto de fermentacion que comprende una etapa de fermentacion, en condiciones anaerobias, para una levadura tal como se ha definido anteriormente, en un medio de fermentacion.
El producto de fermentacion se elige en concreto entre el etanol, un metabolito obtenido a partir del etanol o un metabolito secundario.
Un producto de fermentacion preferido es el etanol.
La produccion de etanol se obtiene por fermentacion alcoholica.
El experto en la materia sabe determinar las condiciones adecuadas para una fermentacion alcoholica.
A modo de ejemplo, se puede hacer referencia a las condiciones de fermentacion alcoholica descritas en el libro de referencia “Yeast Technology”, 2a edicion, 1991, G. Reed y T.W. Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.
El medio de fermentacion comprende los siguientes elementos: al menos una fuente de carbono fermentable, al menos una fuente de nitrogeno, al menos una fuente de azufre, al menos una fuente de fosforo, al menos una fuente de vitaminas y/o al menos una fuente de minerales.
La fuente de carbono es aportada, por ejemplo, en forma de un azucar inmediatamente asimilable por la levadura, una pentosa tal como xilosa, glicerol, etanol y/o una mezcla de los mismos.
La fuente de carbono es aportada preferiblemente por un azucar inmediatamente asimilable por la levadura, y por la xilosa.
Un azucar inmediatamente asimilable por la levadura es, por ejemplo, un azucar simple del tipo glucosa, fructosa o galactosa, un disacarido del tipo sacarosa y/o una mezca de estos azucares.
La fuente de carbono puede ser aportada en forma de un jarabe de glucosa, un jarabe de fructosa, melazas, EP2 (Aguas madre procedentes de la 2a cristalizacion del azucar), un hidrolizado de toda o parte de una materia vegetal y/o de mezcla de los mismos.
La fuente de nitrogeno es aportada, por ejemplo, en forma de sulfato amonico, hidroxido amonico, fosfato diamonico, amoniaco, urea y/o una combinacion de los mismos.
La fuente de azufre es aportada, por ejemplo, en forma de sulfato amonico, sulfato de magnesio, acido sulfurico y/o una combinacion de los mismos.
La fuente de fosforo es aportada, por ejemplo, en forma de acido fosforico, fosfato potasico, fosfato diamonico, fosfato monoamonico y/o una combinacion de los mismos.
La fuente de vitaminas es aportada, por ejemplo, en forma de melaza, hidrolizado de levadura, solucion de vitamina pura o una mezcla de vitaminas puras y/o una combinacion de los mismos.
La fuente de vitaminas aporta a la levadura el conjunto de vitaminas en cantidades al menos equivalentes a las recomendadas en las obras de referencia. Se pueden asociar varias fuentes de vitaminas.
La fuente de minerales es aportada, por ejemplo, en forma de melaza, una mezcla de sales minerales y/o su combinacion.
La fuente de minerales aporta a la levadura el conjunto de los macroelementos y oligoelementos en las cantidades al menos equivalentes a las recomendadas en las obras de referencia. Se pueden asociar varias fuentes de minerales.
Una misma sustancia puede aportar varios elementos diferentes.
Se describe tambien en esta memoria un procedimiento tal como se ha definido anteriormente de produccion de al menos un producto de fermentacion, preferiblemente etanol, que comprende una etapa de fermentacion en condiciones anaerobias, por una levadura tal como se ha definido anteriormente, en un medio de fermentacion que comprende xilosa y/o al menos un inhibidor de fermentacion.
El inhibidor de la fermentacion se elige, por ejemplo, entre un acido organico, furfural, HMF (hidroxi-metil- furfural), uno o varios compuestos fenolicos, la presion osmotica.
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El acido organico se elige, por ejemplo, entre el acido acetico, acido lactico, acido formico, acido levul^nico Dicho al menos un inhibidor de la fermentacion es preferiblemente el acido acetico.
La presion osmotica existe por ejemplo en un hidrolizado de todo o parte de una materia vegetal. La presion osmotica proviene entonces en concreto de la carga salina aportada en el curso del procedimiento de obtencion de dicho hidrolizado.
El medio de fermentacion es tal como se ha definido anteriormente.
El medio de fermentacion comprende, preferiblemente, al menos 0,2% de xilosa, estando expresado el porcentaje en peso/peso del medio de fermentacion.
Un medio de fermentacion preferido comprende de 2% a 7% de xilosa.
El medio de fermentacion puede comprender ademas un azucar inmediatamente asimilable por la levadura, por ejemplo, glucosa.
El medio de fermentacion comprende, por ejemplo, de 2 a 7% de xilosa y de 0,5% a 15% de glucosa.
El medio de fermentacion puede comprender xilosa, glucosa y acido acetico.
Se describe tambien en esta memoria un procedimiento tal como se ha definido anteriormente de produccion de al menos un producto de fermentacion, preferiblemente etanol, caracterizado porque dicho medio de fermentacion comprende al menos un hidrolizado de todo o parte de una materia vegetal.
Un hidrolizado de todo o parte de una materia vegetal se puede obtener por una etapa de tratamiento previo de la materia vegetal, por ejemplo, a temperatura elevada y en presencia de acidos o disolventes organicos, opcionalmente seguido de hidrolisis parcial o total de los polfmeros de azucar, por vfa enzimatica y/o qmmica y/o termica.
El hidrolizado de todo o parte de una materia vegetal comprende, por lo tanto, una mezcla de azucares procedentes de la hidrolisis de los polfmeros de azucares tales como la celulosa, hemicelulosa y el almidon.
Un medio de fermentacion tambien puede comprender un hidrolizado de todo o parte de una materia vegetal y sacarosa.
Se describe tambien en esta memoria el uso de una levadura tal como se ha definido anteriormente, para la produccion de al menos un producto de fermentacion, preferiblemente en un medio de fermentacion que comprende xilosa y/o al menos un inhibidor dela fermentacion.
El producto de fermentacion es tal como se ha definido anteriormente.
Preferiblemente, el producto de fermentacion es etanol.
El medio de fermentacion es tal como se ha definido anteriormente.
El inhibidor de fermentacion es tal como se ha definido anteriormente.
Otras caractensticas y ventajas de la invencion apareceran todavfa mejor con la lectura de los ejemplos de realizaciones siguientes, que ilustran la invencion sin limitarla, y para la comprension de las mismas se remitira a los dibujos adjuntos.
Ejemplo 1: Obtencion de una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico
Material y metodos
(i) Medio de fermentacion
El medio de propagacion usado para la propagacion de una cepa de levadura comprende 10 g/kg de extracto de levadura, 10 g/kg de peptona y 20 g/kg de glucosa.
El medio de cultivo YFGX descrito a continuacion se usa para medir la conversion de la xilosa en etanol.
El medio de cultivo YFAc descrito a continuacion se usa para medir la resistencia al acido acetico.
El medio de cultivo YFGX-Ac descrito a continuacion se usa para evaluar las cepas de levaduras en un medio de cultivo que contiene a la vez xilosa, glucosa y un inhibidor de la fermentacion, el acido acetico.
- YFGX YFGX-Ac
- Glucosa
- 55 g/kg 55 g/kg
- Xilosa
- 45 g/kg 45 g/kg
- Extracto de levadura
- 10 g/kg 10 g/kg
- Peptona
- 10 g/kg 10 g/kg
- Acido acetico
- 2000 ppm 8000 ppm
- Ajuste del pH con KOH
- Ph 5 pH 5
En el medio YFGX, la concentracion de acido acetico de 2000 ppm a pH 5 no tiene efecto inhibidor.
En cambio, en el medio YFGX-Ac, la concentracion de acido acetico de 8000 ppm a pH 5 tiene un efecto inhibidor.
- YFAc
- Glucosa
- 150 g/kg
- Extracto de levadura
- 5 g /kg
- DAP (fosfato diamonico)
- 4,7 g/kg
- Acido dtrico
- 11,5 g/kg
- Acido acetico
- 4 g /kg
- Citrato sodico
- 13,5 g/kg
- Tween 80
- 1 ml/kg
- ZnSO4 (10,6 g/l)
- 2 ml/kg
- MgSO4-7H2O (400 g/l)
- 2,5 ml/kg
- Tiamina (18,24 g/l) Vit B1
- 1 ml/kg
- Piridoxina (5,28 g/l) Vit B6
- 1 ml/kg
- Biotina (1,76 g/l)
- 1 ml/kg
- Pantotenato (3,8 g/l)
- 1 ml/kg
- Acido nicotmico (8 g/l)
- 2,5 ml /kg
- Mesoinositol (50 g/l)
- 1 ml/kg
- Riboflavina (1 g/l)
- 1 ml/kg
- para-aminobenzoato (1,2 g/l)
- 1 ml/kg
- Ajuste del pH a 4,4 con KOH
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- YFX
- Xilosa
- 70 g/kg
- Extracto de levadura
- 5 g /kg
- DAP (fosfato diamonico)
- 4,7 g/kg
- Acido dtrico
- 11,5 g/kg
- Citrato sodico
- 13,5 g/kg
- Tween 80
- 1 ml/kg
- ZnSO4 (10,6 g/l)
- 2 ml/kg
- MgSO4-7H2O (400 g/l)
- 2,5 ml/kg
- Tiamina (18,24 g/l) Vit B1
- 1 ml/kg
- Piridoxina (5,28 g/l) Vit B6
- 1 ml/kg
- Biotina (1,76 g/l)
- 1 ml/kg
- Pantotenato (3,8 g/l)
- 1 ml/kg
- Acido nicotmico (8 g/l)
- 2,5 ml /kg
- Mesoinositol (50 g/l)
- 1 ml/kg
- Riboflavina (1 g/l)
- 1 ml/kg
- para-aminobenzoato (1,2 g/l)
- 1 ml/kg
- Ajuste del pH a 4,4 con KOH
(ii) Propagacion de la cepa de levadura
La propagacion de la cepa de levadura se lleva a cabo en dos tiempos: una etapa de precultivo seguida de una etapa de cultivo.
10 El precultivo se lleva a cabo por siembra de un inoculo de la cepa de levadura en 5 ml de medio de propagacion definido anteriormente.
Despues de 24 h de cultivo a 30°C en un medio aireado por agitacion, se extraen 2 ml de este precultivo y se siembran en 50 ml de medio de propagacion.
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Este cultivo se lleva a cabo durante 24 h a 30°C en un medio aireado por agitacion.
La medicion de la conversion de la xilosa en etanol yde la resistencia al acido acetico se realizan en celulas de levadura procedentes de este cultivo.
(iii) Medicion de la conversion de xilosa en etanol
Para determinar la conversion de la xilosa en etanol, se siembran 0,25 g de materia seca de la cepa de levadura propagada como se ha indicado antes, por kg de medio YFGX. La fermentacion se lleva a cabo a 32°C, en condiciones anaerobias, con agitacion moderada. Las concentraciones de etanol asf como de xilosa y glucosa se miden por HPLC.
Despues se usa la siguiente formula para obtener la tasa de conversion de la xilosa en etanol:
en la que [xilosa]inicial corresponde a la concentracion en xilosa del medio en el momento de la siembra de la levadura y [xilosa]final a la concentracion en xilosa en el medio de cultivo a las 60 horas (a partir de la siembra).
(iv) Medicion de la resistencia al acido acetico
La resistencia al acido acetico de una cepa de levadura se determina por el retraso del inicio de la fermentacion alcoholica.
Se siembran 0,25 g de materia seca de la cepa de levadura propagada cono se ha indicado antes, por kg de medio YFAc.
La fermentacion se lleva a cabo en condiciones anaerobias, a 32°C, con agitacion moderada.
La produccion de etanol se mide de forma indirecta por medicion de la perdida de masa del matraz de fermentacion, estando esta perdida de masa directamente correlacionada con la produccion de alcohol.
Se realiza la curva de fermentacion alcoholica que indica la perdida de masa en funcion del tiempo.
Se determina el punto de interseccion entre el eje de abscisa y la derivada maxima de la perdida de masa: corresponde al retraso del inicio de la fermentacion.
Cabe senalar que la derivada maxima de la perdida de masa da el mismo resultado que la derivada maxima de la velocidad de produccion de alcohol, si la curva de fermentacion alcoholica indica la produccion de alcohol en funcion del tiempo en lugar de la perdida de masa en funcion del tiempo. Cuanto mas limitada es la duracion obtenida, mas pequeno es el retraso del inicio de la fermentacion y mas resistente es la cepa de levadura al acido acetico.
(v) Cruce
Las cepas de partida usadas para el cruce son la cepa de levaduraI-4538 y la cepa de levadura I-4627.
Etapa 1: Crecimiento de la cepa de levadura
Se siembra un inoculo de la cepa de partida (conservado a -80°C) en la superficie del agar de una placa de Petri de medio A
La composicion del medio A es la siguiente: 10 g de extracto de levadura, 10 g de peptona, 20 g de glucosa, 20 g de agar, pH 6,2 +/-0,2, agua csp 1 litro.
Despues la placa de Petri se incuba durante 24 horas a 30°C.
Etapa 2: Esporulacion en el medio 2
Se siembra un inoculo del cultivo precedente en la superficie del agar de una placa de Petri de medio B.
La composicion del medio B es la siguiente: 6,5 g de acetato sodico, 15 g de agar, pH 6,5-7, agua csp 1 litro.
La placa de Petri se incuba durante 96 horas a 25°C. La biomasa obtenida en la superficie de la placa despues se recoge en 500 pl de agua esteril. A 100 pl de esta suspension se le anaden 25 pl de zimoliasa. La suspension se incuba durante 30 minutos a 30°C antes de extender en placa de agar de medio 1. Preferiblemente, la diseccion de las tetradas se realiza 20 minutos mas tarde.
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Etapa 3: Diseccion de las tetradas
Las tetradas son diseccionadas en el micromanipulador SINGER, y despues la placa de Petri se incuba durante 48 horas a 30°C.
Etapa 4: Conservacion de los segregados
Los segregados a continuacion se conservan a -80°C en medio 1 que comprende 20% de glicerol.
Etapa 5: Seleccion de segregados de la cepa de levadura I-4538
Los segregados de la cepa de levadura I-4538 se seleccionan segun su capacidad para convertir la xilosa en etanol.
La conversion de la xilosa se mide como en (iii), a partir de un segregado propagado como en (ii) para la cepa de levadura, excepto que la medicion se realiza a las 48 horas en lugar de a las 60 horas.
Los segregados seleccionados convertfan al menos 70% de la xilosa en 48 horas.
El tipo sexual Mat a o Mat alfa de los segregados seleccionados se determina por PCR.
Etapa 6: Seleccion de los segregados de la cepa I-4627
Los segregados de la cepa de levadura I-4627 se seleccionan segun su resistencia al acido acetico.
La resistencia al acido acetico se evalua como en (iv), a partir de un segregado propagado como en (ii) para la cepa de levadura.
Los segregados seleccionados tienen un retraso del inicio de la fermentacion inferior a 25 horas.
El tipo sexual Mat a o Mat alfa de los segregados seleccionados se determina por PCR.
Etapa 7: Cruce de los hforidos
Se siembra un inoculo de un segregado haploide Mat alfa en la superficie del agar de una placa de Petri de medio A. Se ha mezclado un inoculo de un segregado haploide Mat a en la reserva de la cepa de Mat alfa.
La composicion del medio A es la siguiente: 10 g de extracto de levadura, 10 g de peptona, 20 g de glucosa, 20 g
de agar, pH 6,2 +/-0,2, agua csp 1 litro.
Despues la placa de Petri se incuba durante 24 horas a 30°C. Se siembra un inoculo de la mezcla en la
superficie del agar de una placa de Petri de medio A. Esta etapa se repite 5 veces.
Durante la ultima siembra, se lleva a cabo el estriado de las celulas de modo que se obtengan colonias aisladas. De cada colonia aislada se extraen y cultivan celulas de levadura, se extrae su ADN genomico y se lleva a cabo una PCR de este ADN genomico, con el fin de verificar que los alelos Mat a y Mat alfa estan presentes en una misma celula de levadura.
Las celulas de levadura que tienen los alelos Mat a y Mat alfa se llaman hubridos.
A continuacion se seleccionan los hubridos basandose en dos criterios: su capacidad para metabolizar la xilosa y su resistencia al acido acetico, que se evaluan como se ha indicado en (iii) y (iv). Los hubridos seleccionados son los siguientes:
- los hfbridos que tienen un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica inferior a 30 horas,
- los hfbridos que convierten al menos 60% de la xilosa en 60 horas.
(vi) Evolucion dirigida
La evolucion dirigida es la combinacion de una etapa de mutagenesis por UV seguida de un enriquecimiento en un medio de fermentacion en el que la xilosa constituye la unica fuente de carbono.
Etapa 1: Durante la mutagenesis por UV, 15 ml de una suspension de celulas de levadura al 5% (en g de materia seca por 100 g de la suspension) se ponen en una placa de Petri de 9 cm. La placa de Petri se coloca despues bajo radiacion UV de 300 J/cm2 a 254 nm.
Etapa 2: Las celulas de levadura irradiadas despues se inoculan a la altura de 1 g de materia seca/kg de medio YFX. Despues de 96 horas de multiplicacion en condiciones de hipoxia a 32°C, se usan 100 pl de medio de cultivo para inocular en 50 ml de un medio de glicerol que comprende 20 g/kg de glicerol, 5 g/kg de sulfato amonico y 1,7 g/kg de medio YNB (Yeast Nitrogen Base) de Difco. Este segundo cultivo se lleva a cabo en condiciones aerobias y a 30°C
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durante 48 horas.
Despues se extrae 1 ml de este cultivo para inocular en 170 ml de medio YFX.
Este ciclo se repite 8 veces.
Resultados
Se obtienen varios tubridos por cruce de la cepa I-4538 con la cepa I-4627, entre los cuales estan los hubridos H1 y H2.
El hubrido H2 que no es capaz de metabolizar la xilosa con el significado de la invencion pero presenta una resistencia al acido acetico, se somete a una etapa de evolucion dirigida: se obtiene entonces los hubridos ED1, ED2 y ED3, que corresponden respectivamente a las cepas de levadura I-4624, I-4626 y I-4625.
La tabla 1 indica el porcentaje de xilosa convertido en etanol a las 60 horas en el medio YFGX y el retraso del inicio de la fermentacion alcoholica en el medio YFAc (en horas) de diferentes cepas de levaduras:
- el testigo Ac que es una cepa de levadura no modificada geneticamente resistente al acido acetico y que, por lo tanto, no es capaz de metabolizar la xilosa,
- la cepa de levadura de partida I-4538 que es muy eficaz para la produccion de alcohol, pero no es resistente al acido acetico,
- la cepa de levadura de partida I-4627 que es resistente al acido acetico, pero no es capaz de metabolizar la xilosa con el significado de la invencion,
- el hfbrido H1 que es una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa y que es resistente al acido acetico,
- el hfbrido H2 que no es capaz de metabolizar la xilosa con el significado de la invencion, pero presenta resistencia al acido acetico,
- los hfbridos ED1, ED2 y ED3, que son capaces de metabolizar la xilosa y son resistentes al acido acetico.
Tabla 1
- Cepas de levadura
- Porcentaje de xilosa convertida en etanol a las 60 horas en el medio YFGX Retraso del inicio de la fermentacion alcoholica en el medio YFAc (enhoras)
- Testigo Ac
- 0 12
- I-4538
- 95 40
- I-4627
- 60 18
- H1
- 95 20
- H2
- 60 25
- ED1 (I-4624)
- 95 22
- ED2 (I-4626)
- 95 26
- ED3 (I-4625)
- 95 22
Por otro lado, la produccion de etanol de las cepas de levadura se evalua en el medio de fermentacion YFGX-Ac que comprende a la vez glucosa, xilosa y acido acetico como inhibidor de la fermentacion.
Las cepas de levadura H1, ED1, ED2 y ED3, tienen una produccion de alcohol claramente mejorada con respecto a la cepa de levadura original I-4538 en este medio YFGX-Ac (vease la figura 1).
Ejemplo 2: Produccion de alcohol en medio de aplicacion real a partir de cepas de levadura segun la invencion
Material y metodos
La produccion de alcohol de las cepas de levaduras ED1, ED2 y ED3, se evalua en medio de aplicacion real.
La produccion de alcohol de la cepa de levadura original -4538 tambien se evalua a modo de comparacion.
La evaluacion de la produccion de alcohol de las cepas de levaduras se leva a cabo en dos medios de aplicacion diferentes:
- el medio A que comprende:
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- un sustrato hemicelulosico que corresponde a la fase Ifquida obtenida despues de separacion solido/Kquido de la biomasa que se ha sometido a un pretratamiento y una hidrolisis termoqmmica, de una paja de trigo y que comprende mayoritariamente xilosa (48 g/kg), otros azucares en pequena cantidad, as^ como inhibidores de la fermentacion procedentes del pretratamiento fisicoqmmico de la biomasa lignocelulosica, y
- nutrientes (fuentes de nitrogeno y fosforo),
- el medio B que corresponde al medio A anterior complementado con glucosa, con el fin de imitar un hidrolizado de la biomasa lignocelulosica cuya fraccion hemicelulosica se ha hidrolizado y cuya fraccion celulosica se habna hidrolizado parcialmente.
El pH inicial de los medios A y B se ajusta a pH 5,5.
El fermentador se inocula con 1,5 g/kg de materia seca de la cepa de levadura que se va a evaluar.
La fermentacion alcoholica se lleva a cabo a 35°C.
Se lleva a cabo tambien una fermentacion a 32°C con el medio A.
Resultados
Los resultados obtenidos con el medio A a 32°C y 35°C se dan respectivamente en las figuras 2 y 3, y los resultados con el medio B a 35°C se dan en la figura 4.
Cabe destacar que en la figura 3, los puntos se detienen a las 60 h para la cepa de levadura I-4538, puesto que ya se ha alcanzado la fase de meseta.
Los hubridos ED1 y ED2 muestran una ventaja real en el medio de aplicacion A a 32°C con respecto a la cepa de levadura original I-4538.
Los hubridos ED1, ED2 y ED3 muestran una ventaja real en el medio de aplicacion A a 35°C con respecto a la cepa de levadura original I-4538. En efecto, incluso si la produccion de etanol es mejor en las primeras 60 horas para la cepa de levadura I-4538, la cantidad de etanol producida maxima es de 6,3 g por kg de medio, mientras que se obtienen cantidades de etanol superiores a 10 g/kg con los hubridos ED1, ED2 y ED3.
Los hfbridos ED1 y ED2 muestran de nuevo una ventaja real en el medio de aplicacion B a 35°C con respecto a la cepa de levadura I-4538. El hfbrido ED3 esta un poco en retroceso en este medio de aplicacion.
Claims (14)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. - Cepa de levadura depositada el 24 de mayo de 2012 en la CNCM con el numero I-4627.
- 2. - Procedimiento de obtencion de una cepa de levadura capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico, que comprende las etapas de:- cruce de la cepa de levadura depositada el 5 de octubre de 2011 en la CNCM con el numero I-4538 con la cepa de levadura depositada el 24 de mayo de 2012 en la CNCM con el numero I-4627, para obtener al menos un tubrido,- seleccion de al menos un hfbrido capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico.
- 3. - Procedimiento segun la reivindicacion 2, caracterizado porque dicha etapa de cruce comprende:- una etapa de esporulacion de la cepa de levadura depositada el 5 de octubre de 2011 en la CNCM con el numero I-4538, para obtener al menos un segregado X,- una etapa de esporulacion de la cepa de levadura depositada el 24 de mayo de 2012 en la CNCM con el numero I-4627, para obtener al menos un segregado Y,- una etapa de hibridacion de al menos un segregado X con al menos un segregado Y, siendo capaz dicho segregado X de convertir xilosa en etanol y/o teniendo dicho segregado Y una resistencia al acido acetico, para obtener al menos un hubrido.
- 4. - Procedimiento segun la reivindicacion 2 o la reivindicacion 3, caracterizado porque dicha etapa de cruce comprende:- una etapa de esporulacion de la cepa de levadura depositada el 5 de octubre de 2011 en la CNCM con el numero I-4538, para obtener al menos un segregado X,- una etapa de esporulacion de la cepa de levadura depositada el 24 de mayo de 2012 en la CNCM con el numero I-4627, para obtener al menos un segregado Y,- una etapa de hibridacion de al menos un segregado X con al menos un segregado Y, convirtiendo dicho segregado X al menos 60% de la xilosa en etanol en 60 horas y/o teniendo el segregado Y un retraso del inicio de la fermentacion alcoholica inferior a 30 horas, para obtener al menos un hubrido.
- 5. - Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque dicha etapa de seleccion de al menos un hubrido capaz de metabolizar la xilosa y resistente al acido acetico, comprende las etapas de:- medicion del porcentaje de xilosa convertido en etanol por al menos un tubrido en condiciones anaerobias, en 60 horas, en un medio de fermentacion que comprende 55 g de glucosa y 45 g de xilosa por kg de dicho medio,- medicion del retraso del inicio de la fermentacion alcoholica de al menos un hubrido en un medio de fermentacion que comprende 4000 ppm de acido acetico a pH 4,4,- seleccion de al menos un hfbrido que convierte al menos 70% de la xilosa en etanol en 60 horas y cuyo retraso del inicio de la fermentacion alcoholica es inferior a 30 horas.
- 6. - Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, que comprende ademas una etapa de evolucion dirigida.
- 7. - Cepa de levadura elegida entre la cepa de levadura depositada el 24 de mayo de 2012 en la CNCM con el numero I-4624, cepa de levadura depositada el 24 de mayo de 2012 en la CNCM con el numero I-4625 y cepa de levadura depositada el 24 de mayo de 2012 en la CNCM con el numero I-4626.
- 8. - Procedimiento de produccion de al menos un producto de fermentacion que comprende una etapa de fermentacion en condiciones anaerobias por una cepa de levadura segun la reivindicacion 7 en un medio de fermentacion.
- 9. - Procedimiento segun la reivindicacion 8, caracterizado porque dicho medio de fermentacion comprende xilosa y/o al menos un inhibidor de la fermentacion.
- 10. - Procedimiento segun la reivindicacion 8 o la reivindicacion 9, caracterizado porque dicho medio de fermentacion comprende al menos un hidrolizado de todo o parte de una materia vegetal.
- 11. - Uso de una cepa de levadura segun la reivindicacion 7, para la produccion de un producto de fermentacion, preferiblemente en un medio de fermentacion que comprende xilosa y/o al menos un inhibidor dela fermentacion.
- 12. - Un cultivo que comprende una cepa de levadura segun la reivindicacion 7.
- 13. - Un pan de levadura que comprende una cepa de levadura segun la reivindicacion 7.
- 14. - Cultivo segun la reivindicacion 12, caracterizado porque esta en forma de levadura seca. 5
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