JP5804327B2

JP5804327B2 - バイオマスからのエタノールの生産方法

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Publication number: JP5804327B2
Application number: JP2011543349A
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Inventors: 近藤　昭彦; 昭彦近藤; 誠久蓮沼; 智也三田
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Filing date: 2010-11-29
Publication date: 2015-11-04
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Description

本発明は、バイオマスからのエタノールの生産方法に関する。

近年、化石燃料の枯渇が危惧される中、その代替燃料の開発が進められている。中でもバイオマスに由来するバイオエタノールが注目されている。バイオマスは、再生可能な資源であり、地球上に大量に存在し、そして使用しても大気中の二酸化炭素が増えず（カーボンニュートラル）、地球温暖化防止に寄与できるからである。

しかし、現在、生産されているバイオエタノールは、主にトウモロコシやサトウキビを原料としており、食糧との競合が問題となっている。このため、将来的には、食糧と競合しない稲ワラ、麦ワラ、廃材などのリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオエタノールの生産が求められる。

リグノセルロース系バイオマスは、主にセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの３種類の成分から構成される。このうちセルロースは、グルコースまで糖化されると、グルコースを資化できる酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などによるエタノール発酵に利用できる。これに対して、ヘミセルロースは、キシロース、アラビノースなどのペントースまで糖化されても、天然の酵母はキシロース、アラビノースなどの資化能力が極めて低いため、発酵によるエタノール生産への利用が困難である。

そこで、キシロースを資化するために、遺伝子組換え技術を用いて、酵母ピチア・スチピチス（Pichia stipitis）由来のキシロースレダクターゼ（ＸＲ）およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）、ならびに酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来のキシルロキナーゼ（ＸＫ）の遺伝子を酵母に導入し、これらの酵素を過剰発現する酵母が作製されている（非特許文献１および２）。他にも、嫌気性真菌ピロミセス（Piromyces）属またはオルピノマイセス（Orpinomyces）属由来のキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）および酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来のＸＫ遺伝子を酵母に導入して発現させることで、キシロースからのエタノール発酵が可能になった（非特許文献３）。

キシロースからのエタノール発酵が可能になったとはいえ、これを工業化するには種々の問題がある。例えば、キシロースはグルコースと比較して消費速度が遅いこと、エタノール生産速度が遅いこと、エタノール収率が低いことなどの問題がある。さらに、セルロース系バイオマスからのエタノール生産の実用化における最大の問題は、糖化液中の発酵阻害物質の存在である。

セルロース系バイオマスをＣ６糖のグルコースまたはＣ５糖のキシロースやアラビノースなどへと分解（糖化）するには、酵素法、希硫酸法、水熱分解法などが用いられる。酵素法は、多種類、多量の酵素が必要であり、工業化にはコスト的に問題がある。一方、希硫酸法や水熱分解法は、酢酸、ギ酸などの弱酸、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）などのフラン化合物、バニリンなどのフェノール類など、種々の過分解物（副生成物）を生じ、これらの副生成物がキシロースからのエタノール発酵を大きく阻害する発酵阻害物質であることが知られている（非特許文献４〜６）。したがって、コスト的に有利な硫酸法や水熱分解法を用いてバイオマスからのエタノール発酵を実用化するには、バイオマスの過分解物に耐性を有する酵母、またはこれらの発酵阻害物質の存在下でも効率的なエタノール発酵が可能な酵母が求められる。

これまでに発酵阻害物質が酵母に及ぼす影響が調べられてきた（非特許文献４〜６）。フルフラールは、酵母の生存、成長速度、出芽、エタノール収率、バイオマス収率、酵素活性などに大きな影響を及ぼすことがわかった。ＨＭＦは、酵母の細胞内で、脂質の蓄積を引き起こし、タンパク質含有量を減少させ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびピルビン酸デヒドロゲナーゼを阻害することがわかった。フルフラールやＨＭＦに対する耐性遺伝子を探索するため、破壊株のスクリーニング、転写分析などの方法を用いて研究が行われている（非特許文献７および８）。

一方、酢酸やギ酸などの弱酸は、酵母の細胞内のｐＨに影響を及ぼすと考えられている。すなわち、培地中の弱酸は解離してない状態で存在しており、この非解離状態の弱酸が酵母の細胞膜を透過し、ｐＨが中性付近の酵母の細胞質ゾルに侵入すると、アニオンとプロトンとに解離して酵母の細胞内のｐＨを減少させると考えられている（非特許文献４）。細胞内のｐＨが減少すると、ホメオスタシスを維持するためにＡＴＰａｓｅが働き、この結果ＡＴＰが必要になる。嫌気条件下ではエタノール発酵によりＡＴＰが再生される。一般に、グルコースからのエタノール発酵では、酢酸存在下でもあまり発酵能が影響を受けることなくＡＴＰが再生されると考えられる。しかし、キシロースからのエタノール発酵では酢酸存在下では発酵能が低下するため、ＡＴＰの再生効率が低いと考えられる。

また、グルコースは解糖系で資化されてエタノールに変換されるのに対して、キシロースはペントースリン酸経路と解糖系とを経由してエタノールに変換されるため、このペントースリン酸経路が酢酸によって何らかの影響を受けることが考えられる。しかし、ペントースリン酸経路のどの酵素が酢酸によって直接影響を受けているのかはまだ明らかでない。このように、発酵阻害物質の中でも、酢酸、ギ酸などの弱酸に対する対処法は未確立である。

本発明者らは、酵母サッカロマイセス・セレビシエのＭＮ８１４０Ｘ株にＸＲ、ＸＤＨおよびＸＫの遺伝子を導入して得られた株にて発酵培地中の酢酸とｐＨとの関係を調べたところ、酢酸存在下でもｐＨを酸性側から中性側へ調節すると酵母の発酵阻害が起こらないことがわかった。ＸＩおよびＸＫの遺伝子を導入した酵母でも同様の結果が得られたことが報告されている（非特許文献９）。

しかし、セルロース系バイオマスからのエタノール生産の工業化において、ｐＨの調節は、コストを要し、かつ中性付近のｐＨでは他の微生物が混入しやすくなるため、現実的ではない。このため、酢酸存在下（ｐＨが酸性側）でのキシロースからの効率的なエタノール発酵が求められる。

このように、酢酸などの発酵阻害物質の存在下でもキシロースからの効率的なエタノール発酵を実現するための研究が精力的に行われてきたにもかかわらず、発酵阻害物質に対する耐性の酵母への付与、すなわち発酵阻害物質の存在下でキシロースからの効率的なエタノール発酵に成功した例は皆無である。

ところで、トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）およびトランスケトラーゼ（ＴＫＬ）はペントースリン酸経路（図１）に関与し、これらの酵素活性はキシロースの資化速度と関連することが報告されている（非特許文献１０および１１）。また、酵母ピチア・スチピチス由来ＴＡＬ１遺伝子を酵母サッカロマイセス・セレビシエで過剰発現させることでエタノール発酵が促進されることが報告されている（非特許文献１２）。

しかし、酵母におけるＴＡＬおよびＴＫＬの過剰発現と酢酸などの発酵阻害物質に対する耐性との関係は不明であった。

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本発明は、糖化バイオマス中の発酵阻害物質の存在下でも、効率的にエタノールを生産する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ペントースリン酸経路の代謝酵素の遺伝子をキシロース資化性酵母に導入して得られた、該遺伝子を過剰発現する形質転換酵母が、糖化バイオマス中の発酵阻害物質に耐性を有することを見出し、本発明を完成した。

本発明は、バイオマスからのエタノールの生産方法を提供し、該方法は、ペントースリン酸経路の代謝酵素の少なくとも１種の遺伝子を過剰発現するように形質転換されたキシロース資化性酵母を糖化バイオマスと混合し、培養する工程を含む。

１つの実施態様では、上記糖化バイオマスは、発酵阻害物質を含む。

他の実施態様では、上記発酵阻害物質は、酢酸またはギ酸である。

別の実施態様では、上記ペントースリン酸経路の代謝酵素は、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼからなる群より選択される少なくとも１種である。

本発明の方法によれば、糖化バイオマス中の発酵阻害物質の存在下でも、効率的にエタノールを生産できる。このため、食糧と競合しない稲ワラ、麦ワラ、廃材などのリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオエタノールの生産が可能となる。

ペントースリン酸経路を示す概略図である。ＭＮ８１４０Ｘ株を酢酸不在下（０ｍＭ；（ａ））、ならびに３０ｍＭ（ｂ）および６０ｍＭ（ｃ）の酢酸存在下でエタノール発酵させた場合の、発酵液中の基質（キシロース）濃度および生産物（エタノールなど）濃度の経時変化を示すグラフである。ＭＮ８１４０Ｘ株を酢酸不在下（０ｍＭ）、ならびに３０ｍＭおよび６０ｍＭの酢酸存在下でエタノール発酵させた場合の、乾燥酵母菌体１ｍｇあたりのＲ５Ｐ（ａ）、Ｅ４Ｐ（ｂ）およびＳ７Ｐ（ｃ）の蓄積量を示すグラフである。プラスミドｐＧＫ４０４−ＴＡＬ１（ａ）、ｐＧＫ４０４（ｂ）、ｐＧＫ４０５−ＴＫＬ１（ｃ）およびｐＧＫ４０５（ｄ）の構造を示す模式図である。ＰＧＫ４０４／ＴＡＬ１株（ＴＡＬ１過剰発現株）またはＰＧＫ４０４（コントロール）株を酢酸不在下（０ｍＭ；（ａ））および３０ｍＭ（ｂ）の酢酸存在下でエタノール発酵させた場合の、発酵液中の基質（キシロース）濃度および生産物（エタノールなど）濃度の経時変化を示すグラフである。ＰＧＫ４０５／ＴＫＬ１株（ＴＫＬ１過剰発現株）またはＰＧＫ４０５（コントロール）株を酢酸不在下（０ｍＭ；（ａ））および３０ｍＭ（ｂ）の酢酸存在下でエタノール発酵させた場合の、発酵液中の基質（キシロース）濃度および生産物（エタノールなど）濃度の経時変化を示すグラフである。ＰＧＫ４０４／ＴＡＬ１株（ＴＡＬ１過剰発現株）（ａ、ｂ）またはＰＧＫ４０４（コントロール）株（ｃ、ｄ）を１５ｍＭ（ａ、ｃ）および３０ｍＭ（ｂ、ｄ）のギ酸存在下でエタノール発酵させた場合の、発酵液中の基質（キシロース）濃度および生産物（エタノールなど）濃度の経時変化を示すグラフである。

バイオマスとは、生物資源に由来する糖質材料をいう。例えば、トウモロコシなどから得られるデンプン、サトウキビなどから得られる糖蜜（廃糖蜜）が挙げられる。また、コメ、ムギ、トウモロコシ、サトウキビ、木材（パルプ）などの生物材料の処理に際して生じる廃棄物などのリグノセルロース系バイオマスが挙げられる。本発明では、食糧と競合しない点で、好ましくはリグノセルロース系バイオマスを用いる。リグノセルロース系バイオマスとしては、例えば、稲ワラ、麦ワラ、廃材が挙げられる。

バイオマスの糖化とは、多糖体からなるバイオマスを単糖まで分解することをいい、単糖がさらに過分解（酢酸やギ酸などの副生物が生成する）を受けることも含む。本発明で用いる糖化方法としては、例えば、酵素法、希硫酸法、水熱分解法が挙げられる。コストの点で、希硫酸法、水熱分解法が好ましい。

ペントースリン酸経路の代謝酵素としては、例えば、トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）、トランスケトラーゼ（ＴＫＬ）、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ＲＫＩ）、リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ＲＰＥ）が挙げられる（図１参照のこと）。発酵阻害物質の存在下でエタノール発酵に供したキシロース資化性酵母の代謝解析の結果、中間代謝物として顕著な蓄積が確認されたリボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）、エリスロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）およびセドヘプツロース−７−リン酸（Ｓ７Ｐ）の蓄積を解消できる点で、例えば、ＴＡＬ、ＴＫＬが好ましい。

本発明で用いる酵母は、上記ペントースリン酸経路の代謝酵素の遺伝子を導入した形質転換キシロース資化性酵母である。形質転換に用いるキシロース資化性酵母としては、キシロースからエタノール発酵によりエタノールを生産できる酵母であれば、特に制限されない。例えば、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）にキシロース資化能を付与するプラスミドを導入して得られるキシロース資化性酵母が挙げられる。キシロース資化能を付与するプラスミドとしては、例えば、S. Katahiraら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2006年、第72巻、p. 1136-1143の記載に準じて調製することができる。

酵母に遺伝子を導入する方法は特に制限されない。例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法が挙げられる。導入された遺伝子は、プラスミドの形態で存在してもよく、または酵母の染色体に挿入された形態あるいは酵母の染色体に相同組換えにより組み込まれた形態で存在してもよい。

ペントースリン酸経路の代謝酵素の遺伝子を、キシロース資化性酵母に導入するために、好ましくはこれらの代謝酵素の遺伝子をプラスミドに挿入する。プラスミドは、プラスミドの調製および形質転換体の検出を容易にする点で、選択マーカーと大腸菌用の複製遺伝子とを有することが好ましい。選択マーカーとしては、例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ^ｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ^ｒ）が挙げられるが、特に制限されない。栄養要求性遺伝子としては、例えば、Ｎ−（５'−ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）遺伝子、トリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）遺伝子、リンゴ酸β−イソプロピルデヒドロゲナーゼ（ＬＥＵ２）遺伝子、イミダゾールグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ３）遺伝子、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ４）遺伝子、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＵＲＡ１）遺伝子、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）遺伝子が挙げられるが、特に制限されない。酵母用の複製遺伝子は必ずしも必要ない。プラスミドは、ペントースリン酸経路の代謝酵素の遺伝子を酵母で発現させるために適切なプロモーターおよびターミネーターを有することが好ましい。プロモーターおよびターミネーターとしては、例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子、グリセルアルデヒド３’−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子、グリセルアルデヒド３’−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子のプロモーターおよびターミネーターが挙げられるが、特に制限されない。プラスミドは、相同組換えに必要な遺伝子を有することが好ましい。相同組換えに必要な遺伝子としては、Ｔｒｐ１、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＵＲＡ３が挙げられるが、特に制限されない。プラスミドは、必要に応じて分泌シグナル配列を有することが好ましい。以上のようなプラスミドとしては、例えば、R. Yamadaら、Enzyme Microb. Technol.、2009年、第44巻、p. 344-349に記載のｐＩＵ−ＧｌｕＲＡＧ−ＳＢＡ、ｐＩＨ−ＧｌｕＲＡＧ−ＳＢＡが挙げられる。これらのプラスミドのプロモーターとターミネーターとの間にペントースリン酸経路の代謝酵素の遺伝子を挿入する。

キシロース資化性酵母に、ペントースリン酸経路の代謝酵素の遺伝子を有するプラスミドを導入する際は、これらの遺伝子を相同組換えにより染色体に組み込むために、プラスミドを１ヶ所で切断して線状にすることが好ましい。

このようにして、ペントースリン酸経路の代謝酵素の遺伝子を過剰発現する形質転換酵母を作製することができる。ペントースリン酸経路の代謝酵素の遺伝子が過剰発現していることは、ＲＴ−ＰＣＲ法など、当業者に周知の方法により確認できる。

本発明の方法では、糖化バイオマスとペントースリン酸経路の代謝酵素の遺伝子を過剰発現する形質転換酵母とを混合し、形質転換酵母を培養する。糖化バイオマス中には、バイオマスの過分解により生じる酢酸などの発酵阻害物質が存在し得るが、本発明で用いる形質転換酵母は、このような発酵阻害物質に耐性を有するため、エタノール発酵が阻害されることなく進行し、エタノールが培地中に生産される。

形質転換酵母の培養は、当業者に周知の方法により適宜実施できる。培地のｐＨは、好ましくは約４〜約６、最も好ましくは約５である。好気的培養時の培地中の溶存酸素濃度は、好ましくは約０．５〜約６ｐｐｍ、より好ましくは約１〜約４ｐｐｍ、最も好ましくは約２ｐｐｍである。培養温度は、約２０〜約４５℃、好ましくは約２５〜約３５℃、最も好ましくは約３０℃である。酵母菌体量が１０ｇ（湿潤量）／Ｌ以上、好ましくは２５ｇ（湿潤量）／Ｌ、より好ましくは３７．５ｇ（湿潤量）／Ｌ以上になるまで培養することが好ましく、培養時間は約２０〜約５０時間程度である。形質転換酵母は、発酵に供する前に好気的条件下で培養することにより、その菌体量を増加させ得る。

以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（参考例１：酵母ＭＮ８１４０Ｘ株の発酵試験と代謝解析）
（発酵試験）
酵母サッカロマイセス・セレビシエのＭＴ８−１株（ＭＡＴａ）（独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手）およびＮＢＲＣ１４４０株（ＭＡＴα）（独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手）に、キシロース資化能力を付与するプラスミドｐＩＵＸ１Ｘ２ＸＫ（酵母ピチア・スチピチス（Pichia stipitis）由来のキシロースレダクダーゼ（ＸＲ）およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）、ならびに酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来キシルロキナーゼ（ＸＫ）を共発現するプラスミドとして、S. Katahiraら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2006年、第72巻、p. 1136-1143の記載に準じて調製）をそれぞれ酢酸リチウム法により導入し、得られた２つの形質転換酵母をメーティングにより接合させて二倍体形質転換酵母ＭＮ８１４０Ｘ株を作製した。このキシロース資化性酵母ＭＮ８１４０Ｘ株を用いてキシロースからのエタノール発酵を行った。

発酵条件として酢酸の影響を調べた。キシロース初期濃度４０ｇ／Ｌおよび酵母菌体量２．５ｇ／Ｌ（湿重量）を含むＹＰ培地（酵母エキス１０ｇ/Ｌ，バクトペプトン２０ｇ/Ｌ）に、酢酸を添加しないもの（０ｍＭ）、および酢酸濃度が３０ｍＭまたは６０ｍＭとなるように酢酸を添加したものを調製し、酵母の培養を開始した。

培地中のキシロースおよび生産されたエタノールなどを、ＨＰＬＣ（High performance liquid chromatographyシステム；株式会社島津製作所製）により経時的に定量した。ＨＰＬＣの分離用カラムにはShim-pack SPR-Pb（株式会社島津製作所製）を用い、移動層には超純水（日本ミリポア株式会社製Ｍｉｌｌｉ−Ｑによる精製水）を用い、そして検出器には屈折率検出器を用いた。ＨＰＬＣの条件は、流速０．６ｍＬ／分および温度８０℃とした。結果を図２に示す。

図２から明らかなように、酢酸濃度の増加とともに、キシロース消費速度が減少し、それに伴ってエタノール生産速度および生産量ともに減少した。このことから、酢酸の存在によってキシロースからのエタノール発酵が大きく阻害されることがわかる。

（代謝解析）
各酢酸濃度について、培養開始後４時間、６時間および２４時間に酵母菌体（培地５ｍＬ）を回収し、蒸留水で２回洗浄した後、凍結乾燥した。得られた乾燥菌体１０ｍｇを、ガラスビーズ（直径０．５ｍｍ、安井器械株式会社製）３００μｇ、メタノール５００μＬ、超純水１８０μＬ、および緩衝液のピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）２０μＬとともに破砕用チューブに入れ、マルチビーズショッカー（安井器械株式会社製）を用いて破砕した。破砕では、４℃にて６０秒間の破砕（２，５００ｒｐｍ）、次いで６０秒間の冷却からなる破砕サイクルを５回繰り返した。次いで、破砕用チューブを４℃にて３０分間の振とう（１２００ｒｐｍ）に供した後、４℃にて３分間の遠心分離（１５，０００ｒｐｍ）に供し、上清６３０μＬを１．５ｍＬのマイクロチューブに移した。これに超純水２７０μＬを添加して混合した。次いで、マイクロチューブを４℃にて３分間の遠心分離（１５，０００ｒｐｍ）に供し、上清３００μＬ（酵母抽出液）を別の１．５ｍＬのマイクロチューブに移した。この酵母抽出液を乾固させ、乾固物に超純水１０μＬを添加して混合した（酵母抽出液の濃縮）。

この濃縮された酵母抽出液を、ＣＥ−ＴＯＦＭＳ（Capillary Electrophoresis Time-Of-Flight Mass Spectrometer，アジレント・テクノロジー株式会社製）により定性的および定量的に解析した。電気泳動用キャピラリーにはFused Silica Capillary（内径５０μｍ、全長１００ｃｍ）を用い、電気泳動用緩衝液には３０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ１０）を用いた。電気泳動の条件は、電圧３０ｋＶおよび温度２０℃とした。質量分析はＥＳＩ−Ｎｅｇａｔｉｖｅで行い、その条件は、シース液（５０％メタノール）流速８μＬ／分、キャピラリー電圧３．５ｋＶ、フラグメント電圧１００Ｖおよび乾燥ガス流量１０Ｌ／分（３００℃）とした。ソフトフェアにはマスハンターソフトウェアを用いた。

酵母抽出液中の成分を上記ＣＥ−ＴＯＦＭＳによる解析で同定し、各成分のマスクロマトグラフ中のピークエリアを根拠に定量した。定量には、ＰＩＰＥＳを内部標準とし、ペントースリン酸経路の中間代謝物リボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）、エリスロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）およびセドヘプツロース−７−リン酸（Ｓ７Ｐ）について、標準試料を用いて作成した検量線を用いた。酵母菌体内のＲ５Ｐ、Ｅ４ＰおよびＳ７Ｐの蓄積量を図３に示す。

図３から明らかなように、酢酸濃度の増加とともに、Ｒ５Ｐ、Ｅ４ＰおよびＳ７Ｐの蓄積量が増大した。

（実施例１：ＴＡＬ１またはＴＫＬ１過剰発現用プラスミドの作製）
Ｒ５Ｐ、Ｅ４ＰまたはＳ７Ｐの蓄積を抑制するため、これらの代謝に関与すると考えられる酵素であるトランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）またはトランスケトラーゼ（ＴＫＬ）の遺伝子を酵母で過剰に発現させるためのプラスミドを構築した。

ＰＧＫプロモーターおよびＰＧＫターミネーターを有するプラスミドｐＧＫ４０４（図４（ｂ）；J. Ishiiら、J. Biochem.、2009年、第145巻、p. 701-708の記載と同様に調製）のプロモーターとターミネーターとの間に、酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来ＴＡＬ１遺伝子（配列番号１）を挿入して、プラスミドｐＧＫ４０４−ＴＡＬ１を作製した（図４（ａ））。挿入に用いたＴＡＬ１遺伝子は、酵母サッカロマイセス・セレビシエのＭＴ８−１株（ＭＡＴａ）から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーScTAL-SpeI-F（配列番号３）およびScTAL-BamHI-R（配列番号４）を用いて、常法のＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を得、この断片を制限酵素ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩで処理することにより調製した。得られたプラスミドｐＧＫ４０４−ＴＡＬ１は、形質転換体にアンピシリン耐性を付与するＡｍｐ^ｒ遺伝子および相同組換えに必要な酵母由来Ｔｒｐ１遺伝子を有する。

同様に、ＰＧＫプロモーターおよびＰＧＫターミネーターを有するプラスミドｐＧＫ４０５（図４（ｄ）；J. Ishiiら、J. Biochem.、2009年、第145巻、p. 701-708の記載と同様に調製）のプロモーターとターミネーターとの間に、酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来ＴＫＬ１遺伝子（配列番号５）を挿入して、プラスミドｐＧＫ４０５−ＴＫＬ１を作製した（図４（ｃ））。挿入に用いたＴＫＬ１遺伝子は、酵母サッカロマイセス・セレビシエのＭＴ８−１株（ＭＡＴａ）から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーScTKL-SalI-F（配列番号７）およびScTKL-SpeI-R（配列番号８）を用いて、常法のＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を得、この断片を制限酵素ＳａｌＩおよびＳｐｅＩで処理することにより調製した。得られたプラスミドｐＧＫ４０５−ＴＫＬ１は、形質転換体にアンピシリン耐性を付与するＡｍｐ^ｒ遺伝子および相同組換えに必要な酵母由来ＬＥＵ２遺伝子を有する。

（実施例２：ＴＡＬ１またはＴＫＬ１過剰発現株の作製）
実施例１で作製したプラスミドｐＧＫ４０４−ＴＡＬ１またはｐＧＫ４０４を制限酵素ＥｃｏＲＶで処理することにより、Ｔｒｐ１遺伝子内で切断して線状化した。

実施例１で作製したプラスミドｐＧＫ４０５−ＴＫＬ１またはｐＧＫ４０５を制限酵素ＥｃｏＲＶで処理することにより、ＬＥＵ２遺伝子内で切断して線状化した。

酵母サッカロマイセス・セレビシエのＭＴ８−１株（ＭＡＴａ）にプラスミドｐＩＵＸ１Ｘ２ＸＫを導入して得られた形質転換株に、これらの線状化したプラスミドを酢酸リチウム法により導入し、ＭＴ８−１／ｐＩＵＸ１Ｘ２ＸＫ／ｐＧＫ４０４−ＴＡＬ１株（ＰＧＫ４０４／ＴＡＬ１株）、ＭＴ８−１／ｐＩＵＸ１Ｘ２ＸＫ／ｐＧＫ４０４株（ＰＧＫ４０４（コントロール）株）、ＭＴ８−１／ｐＩＵＸ１Ｘ２ＸＫ／ｐＧＫ４０５−ＴＫＬ１株（ＰＧＫ４０５／ＴＫＬ１株）およびＭＴ８−１／ｐＩＵＸ１Ｘ２ＸＫ／ｐＧＫ４０５株（ＰＧＫ４０５（コントロール）株）を作製した。ＰＧＫ４０４／ＴＡＬ１株およびＰＧＫ４０４（コントロール）株はＳＤ−ＵＷ固体培地（アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース（Yeast Nitrogen Base without Amino Acids）［Difco社製］６．７ｇ/Ｌ，グルコース２０ｇ/Ｌ，ウラシル０．０２ｇ/Ｌ，トリプトファン０．０２ｇ/Ｌ）で培養し、ＰＧＫ４０５／ＴＫＬ１株およびＰＧＫ４０５（コントロール）株はＳＤ−ＬＵ固体培地（アミノ酸不含イーストニトロゲン基礎培地（Yeast Nitrogen Base without Amino Acids）［Difco社製］６．７ｇ/Ｌ，グルコース２０ｇ/Ｌ，ロイシン０．１ｇ/Ｌ, ウラシル０．０２ｇ/Ｌ）で培養した。

（実施例３：ＰＧＫ４０４／ＴＡＬ１株またはＰＧＫ４０５／ＴＫＬ１株の酵素活性の測定）
実施例２で作製したＰＧＫ４０４／ＴＡＬ１株、ＰＧＫ４０４（コントロール）株、ＰＧＫ４０５／ＴＫＬ１株またはＰＧＫ４０５（コントロール）株の酵素活性を測定した。

各株について、ＹＰＤ培地（酵母エキス１０ｇ/Ｌ，バクトペプトン２０ｇ/Ｌ，グルコース２０ｇ/Ｌ）で定常期まで好気培養した酵母菌体を４℃にて５分間の遠心分離（５０００ｇ）に供した。上清を除去後、菌体を含む沈殿に１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）および２ｍＭＥＤＴＡを添加して混合した。次いで、混合物を４℃にて５分間の遠心分離（５０００ｇ）に供した。菌体を含む沈殿に１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、２ｍＭ塩化マグネシウムおよび２ｍＭジチオスレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を添加して混合した。さらに、ガラスビーズ（直径０．５ｍｍ安井器械製）を混合し、マルチビーズショッカー（安井器械株式会社製）を用いて４℃にて５分間（２５００ｒｐｍ）、菌体を破砕した。次いで、菌体を含む破砕用チューブを４℃にて３０分間（３００００ｇ）の遠心分離に供し、上清３００μＬ（酵母抽出液）を回収した。この酵母抽出液についてＴＡＬ活性およびＴＫＬ活性を測定した。

ＴＡＬ活性は、H.-U. Bergmeyer 編、「Methods of Enzymatic Analysis」、Academic Press, New York, N.Y. 1974年の方法を用いて、ＮＡＤＨにＴＡＬ（トランスアルドラーゼ）を反応させて生成する酸化物を３４０ｎｍの吸光度で定量することにより測定した。ＴＫＬ活性は、１００ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．８）を用いて、P. M. Bruinenbergら、「An enzymatic analysis of NADPH production and consumption in Candida utilis」、J. Gen. Microbiol.、1983年、第129巻、p. 965-971の方法により測定した。タンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製プロテインアッセイキットを用いて測定した。結果を表１に示す。

表１から明らかなように、ＰＧＫ４０４／ＴＡＬ１株はＰＧＫ４０４（コントロール）株と比較して、ＴＡＬ活性が約２．１倍高く、ＰＧＫ４０５／ＴＫＬ１株はＰＧＫ４０５（コントロール）株と比較して、ＴＫＬ活性が約３．１倍高かった。このことから、ＰＧＫ４０４／ＴＡＬ１株はＴＡＬ１活性が増大し（ＴＡＬ１過剰発現株）、ＰＧＫ４０５／ＴＫＬ１株はＴＫＬ活性が増大している（ＴＫＬ１過剰発現株）ことがわかる。

（実施例４：ＴＡＬ１過剰発現株の代謝解析）
発酵条件として酢酸の影響を調べた。キシロース初期濃度４０ｇ／Ｌおよび酵母菌体量２．５ｇ／Ｌ（湿重量）を含むＹＰ培地（酵母エキス１０ｇ／Ｌ，バクトペプトン２０ｇ／Ｌ）に、酢酸を添加しないもの（０ｍＭ）、および酢酸濃度が６０ｍＭとなるように酢酸を添加したものを調製し、酵母の培養を開始した。

培養開始後２４時間に酵母菌体（培地５ｍＬ）を回収し、−４０℃の冷却槽内にて冷やされた７ｍＬのメタノールを含むポリプロピレンチューブに注いだ。この懸濁液を−２０℃にて５分間の遠心分離（５０００ｇ）に供した。上清を除去後、菌体を含む沈殿に１ｍＭピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）７．５μＬおよび１００ｍＭアジピン酸７．５μＬを添加し、さらに９５℃にて沸騰させた７５％（ｖ／ｖ）エタノールを添加して、ボルテックスミキサーで混合した。次いで、混合物を９５℃にて３分間熱処理後、４℃にて５分間の遠心分離（１５０００ｒｐｍ）に供し、上清３００μＬ（酵母抽出液）を別の１．５ｍＬのマイクロチューブに移した。この酵母抽出液を乾固させ、乾固物に超純水１０μＬを添加して混合した（酵母抽出液の濃縮）。

酵母抽出液中の成分を上記ＣＥ−ＴＯＦＭＳによる解析で同定し、各成分のマスクロマトグラフ中のピークエリアを根拠に定量した。定量には、ＰＩＰＥＳを内部標準とし、ペントースリン酸経路の中間代謝物６−ホスホグルコン酸（６ＰＧ）、リボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）、リブロース−５−リン酸（Ｒｕ５Ｐ）およびセドヘプツロース−７−リン酸（Ｓ７Ｐ）について、標準試料を用いて作成した検量線を用いた。酵母菌体内の６ＰＧ、Ｒ５Ｐ、Ｒｕ５ＰおよびＳ７Ｐの蓄積量を表２に示す。

表２から明らかなように、ＴＡＬ１を過剰発現することにより、ペントースリン酸回路の中間生成物の蓄積が解除された。

（実施例５：ＴＡＬ１またはＴＫＬ１過剰発現株の酢酸存在下での発酵試験）
実施例２で作製したＴＡＬ１過剰発現株、ＴＡＬ１過剰発現株のコントロール株、ＴＫＬ１過剰発現株またはＴＫＬ１過剰発現株のコントロール株を用いて酢酸存在下でのキシロースからのエタノール発酵を行った。

発酵条件に及ぼす酢酸の影響を検討した。キシロース初期濃度４０ｇ／Ｌおよび酵母菌体量２．５ｇ／Ｌ（湿重量）を含むＹＰ培地に、酢酸を添加しないもの（０ｍＭ）、および酢酸濃度が３０ｍＭまたは６０ｍＭとなるように酢酸を添加したものを調製し、酵母の培養を開始した。培地中のキシロースおよび生産されたエタノールなどの定量は、参考例１と同様に行った。結果を図５および６に示す。

図５から明らかなように、ＴＡＬ１過剰発現株はコントロール株と比較して、酢酸不在下では、キシロース消費速度は増加したが、最終的なエタノール生産量は変化しなかった。一方、３０ｍＭの酢酸存在下では、キシロース消費速度、エタノール生産速度および最終的なエタノール生産量ともに大幅に増加し、培養開始後２４時間までのエタノール生産速度は約２倍に増加し、そして最終的なエタノール生産量は約１．２倍に増加した。３０ｍＭの酢酸存在下では、ＴＡＬ１過剰発現株のエタノール収率は理論収率の約８０％であり、これまでに報告されたものを遥かに上回るものであった。

図６から明らかなように、ＴＫＬ１過剰発現株はコントロール株と比較して、酢酸不在下では、キシロース消費速度は増加したが、最終的なエタノール生産量は変化しなかった。一方、３０ｍＭの酢酸存在下では、キシロース消費速度、エタノール生産速度および最終的なエタノール生産量ともに大幅に増加し、培養開始後２４時間までのエタノール生産速度は１．７倍に増加し、そして最終的なエタノール生産量は約１．２倍に増加した。

（実施例６：ＴＡＬ１過剰発現株のギ酸存在下での発酵試験）
実施例２で作製したＴＡＬ１過剰発現株、ＴＡＬ１過剰発現株のコントロール株を用いてギ酸存在下でのキシロースからのエタノール発酵を行った。

発酵条件に及ぼすギ酸の影響を検討した。キシロース初期濃度４０ｇ／Ｌおよび酵母菌体量２．５ｇ／Ｌ（湿重量）を含むＹＰ培地に、ギ酸濃度が１５ｍＭまたは３０ｍＭとなるようにギ酸を添加したものを調製し、酵母の培養を開始した。培地中のキシロースおよび生産されたエタノールなどの定量は、参考例１と同様に行った。結果を図７に示す。

図７から明らかなように、ＴＡＬ１を過剰発現することにより、ギ酸存在下における酵母のエタノール生産能が向上した。

本発明の方法によれば、糖化バイオマス中の発酵阻害物質の存在下でも、効率的にエタノールを生産できる。このため、食糧と競合しない稲ワラ、麦ワラ、廃材などのリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオエタノールの生産が可能となり、化石燃料の代替燃料を提供するとともに地球温暖化防止や食糧問題の解決に寄与できる。

Claims

糖化バイオマスと混合し、培養したときに酢酸に対する耐性およびギ酸に対する耐性を示すキシロース資化性酵母の作製方法であって、
キシロース資化性酵母にペントースリン酸経路の代謝酵素トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を過剰発現させるように形質転換する工程
を含む、方法。
前記酢酸に対する耐性が３０ｍＭ以上の酢酸に対する耐性であり、前記ギ酸に対する耐性が１５ｍＭ以上のギ酸に対する耐性である、請求項１に記載の方法。
請求項１または２に記載の方法で作製された酵母を、発酵阻害物質として少なくとも酢酸またはギ酸を含む糖化バイオマスと混合し、培養する工程を含む、エタノールの生産方法。