JP6236634B2 - バイオマスからのエタノールの生産方法 - Google Patents
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Description
本発明の酵母は、酢酸応答転写因子の遺伝子を導入した形質転換キシロース資化性酵母である。形質転換に用いるキシロース資化性酵母としては、キシロースからエタノール発酵によりエタノールを生産できる酵母である限り、特に限定されない。例えば、酵母サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)にキシロース資化能を付与するプラスミドを導入して得られるキシロース資化性酵母が挙げられる。キシロース資化能を付与するプラスミドとしては、例えば、S. Katahiraら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2006年、第72巻、p. 1136-1143の記載に準じて調製することができる。
本発明のバイオマスからのエタノールの生産方法では、糖化バイオマスと酢酸応答転写因子遺伝子を過剰発現する形質転換酵母とを混合し、該形質転換酵母を培養する。糖化バイオマス中には、バイオマスの過分解により生じる酢酸などの発酵阻害物質が存在し得るが、本発明の形質転換酵母は、このような発酵阻害物質に耐性を有するため、エタノール発酵が阻害されることなく進行し、エタノールが培養液中に生産される。
(Haa1過剰発現用プラスミドの作製)
Haa1遺伝子を酵母で過剰に発現させるためのプラスミドを構築した。
酵母サッカロマイセス・セレビシエのBY4741株(インビトロジェン)に、キシロース資化能力を付与するプラスミドpIUX1X2XK(酵母ピチア・スチピチス(Pichia stipitis)由来のキシロースレダクダーゼ(XR)およびキシリトールデヒドロゲナーゼ(XDH)、ならびに酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来キシルロキナーゼ(XK)を共発現するプラスミドとして、S. Katahiraら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2006年、第72巻、p. 1136-1143の記載に準じて調製)をそれぞれ酢酸リチウム法により導入し、キシロース資化性形質転換酵母BY4741XU株を作製した。
pRS425pTDH3/Haa1株(Haa1過剰発現株)におけるHaa1遺伝子の発現を以下のようにして調べた。発酵液(キシロース50g/L、酵母エキス10g/L、バクトペプトン20g/L、カザミノ酸カルシウム1.0g/L、酵母40g/L:合計量50mL)を調製し、30℃にて1時間培養し、酵母菌体をサンプリングした。コントロール株としてpRS425pTDH3(コントロール)株を用いた。得られたサンプルからRNAを抽出し、cDNA合成後に定量PCRにより、Haa1過剰発現株とコントロール株とにおいてHaa1発現の相対値を算出した。コントロール遺伝子としてアクチン遺伝子を用い、比較Ct法にて算出した。結果を以下の表1に示す。
Haa1過剰発現株またはコントロール株を用いて酢酸存在下でのキシロースからのエタノール発酵を行った。Haa1過剰発現株またはコントロール株をSD培地にて1日間前培養し、次いでSD培地にて2日間本培養した後、発酵に供した。キシロース初期濃度50g/Lおよび酵母菌体量40g/L(湿重量)を含むYP培地に、酢酸を添加しないもの(0mM)、および酢酸濃度が30mMまたは60mMとなるように酢酸を添加したものを調製し、酵母の発酵培養を開始した。発酵試験の概要を表2に示す。
Haa1過剰発現株またはコントロール株を用いてギ酸存在下でのキシロースからのエタノール発酵を行った。本実施例におけるエタノール発酵は、キシロース初期濃度50g/Lおよび酵母菌体量40g/L(湿重量)を含むYP培地に、ギ酸を添加しないもの(0mM)、およびギ酸濃度が20mMとなるようにギ酸を添加したものを発酵培養に用いた以外は、実施例1と同様にして行った。発酵試験の概要を表3に示す。
Haa1過剰発現株およびコントロール株を用いて、フルフラール存在下での生育培養試験を行った。以下の表4に示す組成の培養液を調製し、酵母の培養を開始した。培養は、30℃にて、70rpmの振盪下にて行った。生育菌体量は、波長600nmでの吸光度測定(OD600)により経時的に測定した。
Haa1過剰発現、PHO13欠損、キシロース資化性酵母(以下、「Haa1過剰発現PHO13欠損株」という)を、実施例1に記載のHaa1過剰発現株についてPHO13欠損を、K. Fujitomiら、Bioresour. Technol.、2012年、第111巻、p. 161-166に記載の手順に準じて行うことにより得た。他方、実施例1に記載のコントロール株(pRS425pTDH3株)についても同様にPHO13欠損を行うことにより、PHO13欠損キシロース資化性酵母(以下、「PHO13欠損コントロール株」という)を得た。
Haa1過剰発現PHO13欠損株およびPHO13欠損コントロール株を用いて、実施例1と同様にして、酢酸存在下でのキシロースからのエタノール発酵試験を行った。但し、添加する酢酸の濃度を0mM、50mMおよび100mMとし、パントテン酸カルシウム1.6g/Lに代えてパントテン酸カルシウム1.0g/Lとした。
Haa1過剰発現PHO13欠損株およびPHO13欠損コントロール株を用いて、実バイオマスでのキシロースからのエタノール発酵試験を行った。以下の表7に示す組成の培養液を調製し、酵母の培養を開始した。培養は、30℃にて、120rpmの振盪下にて行った。実バイオマス(C5糖化液)は、水熱前処理した稲わら分解液に、糖化酵素(ペクチナーゼGアマノ:天野エンザイム株式会社製)を1(w/w)%になるように添加し、50℃にて150rpmの条件で2日間、糖化処理することにより作製した。生産されたエタノールを、実施例1と同様にして経時的に定量した。
Claims (12)
- バイオマスからのエタノールの生産方法であって、
酢酸応答転写因子の遺伝子を過剰発現するように形質転換されたキシロース資化性酵母を糖化バイオマスと混合し、培養する工程
を含み、そして
該酢酸応答転写因子がHaa1である、方法。 - 前記形質転換キシロース資化性酵母が、PHO13遺伝子を欠損した酵母である、請求項1に記載の方法。
- 前記糖化バイオマスが、発酵阻害物質を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記発酵阻害物質が、酢酸、ギ酸、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラールおよびバニリンからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項3に記載の方法。
- 酢酸応答転写因子の遺伝子を過剰発現するように形質転換されたキシロース資化性酵母であって、該酢酸応答転写因子がHaa1である、酵母。
- PHO13遺伝子を欠損した、請求項5に記載の酵母。
- 糖化バイオマスと混合し、培養したときに酢酸に対する耐性およびギ酸に対する耐性を示すキシロース資化性酵母の作製方法であって、該キシロース資化性酵母に酢酸応答転写因子の遺伝子を過剰発現させるように形質転換する工程を含み、そして
該酢酸応答転写因子がHaa1である、方法。 - 前記キシロース資化性酵母がPHO13遺伝子を欠損した酵母である請求項7に記載の方法。
- 前記酢酸応答転写因子の遺伝子のプロモータがTDHプロモータである請求項7または8に記載の方法。
- 前記酢酸に対する耐性が30mM以上の酢酸に対する耐性であり、前記ギ酸に対する耐性が15mM以上のギ酸に対する耐性である、請求項7から9のいずれかに記載の方法。
- 前記酢酸に対する耐性が40mM以上の酢酸に対する耐性であり、前記ギ酸に対する耐性が20mM以上のギ酸に対する耐性である、請求項7から9のいずれかに記載の方法。
- 請求項7から11のいずれかに記載の方法により作製された酵母を、発酵阻害物質として少なくとも酢酸またはギ酸を含む糖化バイオマスと混合し、培養する工程を含む、エタノールの生産方法。
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