ES2904836T3 - Cepas de levaduras recombinantes para la fermentación de pentosa - Google Patents

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Abstract

Una célula de Saccharomyces recombinante que es capaz de fermentar xilosa y que comprende un gen heterólogo que codifica una xiluloquinasa (XK), en donde la XK: - proporciona una actividad enzimática para convertir D-xilulosa en xilulosa 5-fosfato al menos dos veces la proporcionada por XK de S. cerevisiae descrita como SEQ ID NO: 32, y - proporciona una tasa de crecimiento anaerobio de la célula recombinante en xilosa que es mayor que la proporcionada por XK de S. cerevisiae de SEQ ID NO: 32, y en donde la XK tiene una identidad de secuencia de al menos 80 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o una identidad de secuencia de al menos 80 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

Description

DESCRIPCIÓN
Cepas de levaduras recombinantes para la fermentación de pentosa
Campo de la Invención
En esta memoria se describen células y cepas de levaduras recombinantes modificadas genéticamente capaces de fermentar pentosas, así como la preparación y uso de células y cepas de este tipo.
Referencia a un Listado de Secuencias
Esta solicitud contiene un Listado de Secuencias en formato legible por computadora.
Antecedentes
La producción de bioetanol a partir de material de alimentación renovable mediante la levadura de panadería Saccharomyces cerevisiae se ha convertido en una alternativa atractiva a los combustibles fósiles, pero el uso de materiales de alimentación lignocelulósicos para tales fines plantea desafíos. Por ejemplo, una fracción sustancial de material lignocelulósico consiste en pentosas tales como xilosa y arabinosa. Las especies nativas de Saccharomyces no pueden fermentar estas pentosas, pero las técnicas de ingeniería genética para proveer a Saccharomyces de esta capacidad están bien establecidas (Kim et al., 2013). Éstas incluyen la expresión heteróloga de xilosa reductasa (XR) y xilitol deshidrogenasa (XDH) de levaduras que fermentan de forma natural xilosa, tales como Scheffersomyces (Pichia) stipitisy diversas especies de Candida, así como la sobre-expresión de xiluloquinasa (XK) y las cuatro enzimas en la ruta no oxidativa de la pentosa fosfato (PPP), a saber, transcetolasa (TKL), transaldolasa (TAL), ribosa-5-fosfato cetol-isomerasa (RKI) y D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (RPE). Se ha descubierto que la modificación de la preferencia de co-factor de S. stipitis XR hacia NADH en sistemas de este tipo proporciona ventajas metabólicas, así como mejora el crecimiento anaerobio, y se ha informado que el reemplazo de XR/XDH por XI heterólogo reduce el subproducto de xilitol no deseado. Estas y otras modificaciones se han descrito, p. ej., en los documentos WO2009/017441, WO2010/059095, WO2012/135110, Karhumaa et al., 2005; Karhumaa et a l, 2007; Kuyper et al, 2005).
En general, se considera necesario un cierto grado de sobre-expresión de XK para la formación de etanol, que dirige el metabolismo de la xilosa hacia el metabolismo central (Chang y Ho, 1988; Eliasson et al., 2001), y se han utilizado o propuesto XK de diversas especies, p. ej., S. cerevisiae, E. coli, Pichia stipitis y P. tannophilus (documentos WO 95/13362; US 2009/0246857). También se ha informado que XK reduce la producción de subproductos de xilitol y acetato no deseados (Johansson et al., 2001; Parachin et al., 2011; Matsushika et al., 2011). Varios investigadores han llegado a la conclusión, sin embargo, que es necesario limitar los niveles de XK, ya que la sobre-expresión de XK inhibió el crecimiento de S. cerevisiae en xilosa (Jin et al., 2003; Matsushika et al., 2011), redujo el consumo de xilosa (Johansson et al., 2001) o ATP drenado (Eliasson et al., 2001), lo que sugiere que se necesitan niveles de XK moderados o bajos para una fermentación óptima de xilosa. Sin embargo, una menor actividad de XK podría limitar el flujo metabólico.
Algunas especies de levadura son capaces de fermentar de forma natural xilosa, p. ej., Pichia stipites, Spathaspora passalidarum, Candida jeffriesii y Candida tenuis (Nguyen et al., 2006; documento US 2012/270289 A1; Wohlbach et al., 2011). Wohlbach y sus colaboradores aplicaron un enfoque genómico comparativo para identificar genes implicados en el metabolismo de la xilosa en Spathaspora passalidarum y Candida tenuis,, y encontraron que una Cten aldo/ceto reductasa, CtAKR, mejoró significativamente el consumo de xilosa en cepas de S. cerevisiae modificadas por ingeniería tanto durante el crecimiento aerobio como anaerobio, aunque esto no resultó en una producción mejorada de etanol. Hou (2012) encontró luego que la capacidad de Spathaspora passalidarum de utilizar xilosa en condiciones anaerobias se deba posiblemente al equilibrio de cofactores en la ruta XR-XDH.
Los hidrolizados lignocelulósicos contienen mezclas complejas de otros compuestos, muchos de los cuales inhiben la fermentación, el crecimiento o la viabilidad microbiana. Cuando el material lignocelulósico se calienta durante el pretratamiento, algunos de los azúcares se deshidratan a furanos tales como furfural (de pentosas) y HMF (de hexosas), que son tóxicos para la mayoría de los microorganismos. Además, cuando la hemicelulosa se hidroliza para liberar los azúcares monoméricos, se forma ácido acético por desacetilación de esta fracción. Se forman más ácidos si el hidrolizado lignocelulósico que contiene furfural y HMF se calienta adicionalmente, ya que estos compuestos pueden degradarse en ácidos fórmico y levulínico, que son inhibidores de microorganismos incluso más potentes que el ácido acético. La toxicidad y acidez del material lignocelulósico pretratado e hidrolizado presenta una fuerte limitación sobre el microorganismo fermentador.
El documento WO 2009/017441 describe un mutante de alcohol deshidrogenasa (ADH1) de S. cerevisiae, que era capaz de reducir HMF.
Mollapour y Piper (Molecular Microbiology (2001) 42(4):919-930) describen que el gen YME2p de la levadura de descomposición alimentaria Zygosaccharomyces bailii, expresado heterólogamente en células de S. cerevisiae, podría permitir el crecimiento de este último en benzoato, sorbato y fenilalanina.
Con el fin de examinar más a fondo los factores que mejoran la utilización de xilosa, Karhumaa et a/.(2009) compararon el proteoma de la cepa mutante de S. cerevisiae TMB 3400, que tiene buenas propiedades de fermentación de xilosa, con el de su cepa parental. Aunque se encontró que aumentó el nivel de acetaldehído deshidrogenasa (Ald6) y algunas otras proteínas, los cambios más significativos detectados por el análisis de proteomas fueron niveles de XR, XDH y TKL1 incrementados de 6 a 10 veces en el mutante, lo que estaba de acuerdo con conocimientos previos de la ingeniería racional del metabolismo de la xilosa en levaduras.
El documento WO 2010/059095 describe que niveles incrementados de fosfoglucomutasa obtenidos por sobre­ expresión constitutiva del gen PGM2 con un promotor constitutivo mejoraron la producción de etanol a partir de xilosa.
Tiwari et al. (2008) describe que PGM1, PGM2 codifican isoenzimas secundarias y principales de fosfoglucomutasa y, además, señala que el producto proteico de YMR278w exhibe actividad fosfoglucomutasa, designando YMR278w como pGm 3. Sin embargo, PGM3 ahora también se ha denominado PRM15 (Xu et al., 2013, Walther et al., 2012), ya que la enzima, aparte de la actividad fosfoglucomutasa, también tiene una actividad fosforribomutasa significativa (Xu et al., 2013).
A pesar de estos y otros avances en la técnica, todavía existe la necesidad de cepas de levadura mejoradas que proporcionen una producción rentable de etanol y otros productos de fermentación a partir de pentosas tales como xilosa.
Sumario
En esta memoria se describen células de levadura recombinantes mejoradas para la producción de etanol y otros productos de fermentación. Esto se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de xiluloquinasas (XKs) que, incluso si están presentes o se expresan en actividades altas de XK, tienen una o más propiedades mejoradas, tales como altas tasas de crecimiento aerobio o anaerobio, consumo incrementado de xilosa y/o producción de etanol mejorada.
Por consiguiente, en un aspecto es una célula de Saccharomyces recombinante que es capaz de fermentar xilosa y que comprende un gen heterólogo que codifica una xiluloquinasa (XK), en donde la XK:
- proporciona una actividad enzimática para convertir D-xilulosa en xilulosa 5-fosfato al menos dos veces la proporcionada por XK de S. cerevisiae descrita como SEQ ID NO: 32, y
- proporciona una tasa de crecimiento anaerobio de la célula recombinante en xilosa que es mayor que la proporcionada por XK de S. cerevisiae de SEQ ID NO: 32, y
- en donde la XK tiene una identidad de secuencia de al menos 80 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o una identidad de secuencia de al menos 80 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. Un aspecto es un procedimiento para producir una célula de Saccharomyces recombinante que comprende transformar una célula de Saccharomyces con uno o más vectores que comprenden genes que codifican
- una XK que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o con una identidad de secuencia de al menos 80 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, tal como al menos 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 22 o con una identidad de secuencia de al menos 80 % con SEQ ID NO: 22, tal como al menos 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22,
- una XR, y
- una XDH y, opcionalmente, secuencias reguladoras para expresar los genes en la célula huésped.
En un aspecto, es un método para producir un producto de fermentación, que comprende poner en contacto la célula recombinante de la invención con un medio que comprende una fuente de carbono que comprende xilosa o arabinosa en condiciones anaerobias, y
(b) aislar el producto de fermentación del medio.
Estos y otros aspectos y aspectos de las divulgaciones se describen con más detalle más adelante.
Breve Descripción de las Figuras
Fig. 1: Curvas para el crecimiento aerobio sobre xilosa para C5LTe1035 (rombos) y C5LTe1042 (triángulos). Fig. 2: Curvas sobre el crecimiento anaerobio de la cepa C5LTe1042 ("+") en comparación con la cepa de control C5LTe1035 ("-").
Fig. 3: Curvas sobre el crecimiento anaerobio de la cepa C5LTe1043 ("+") en comparación con la cepa de control C5LTe1035 ("-").
Fig. 4: Curvas sobre el crecimiento anaerobio de la cepa C5LTe1040 ("+") en comparación con la cepa de control C5LTe1035 ("-").
Fig. 5: Gráfico que muestra la fermentación de xilosa por parte de las cepas C5LTe1035 (línea discontinua) y C5LTe1042 (línea continua). Glucosa: círculos, Xilosa: cuadrados, Xilitol: estrellas, Biomasa: línea. Fig. 6: Gráfico que muestra la fermentación de xilosa por parte de las cepas C5LTe1036 (línea discontinua) y C5LTe1048 (línea continua). Glucosa: círculos, Xilosa: cuadrados, Xilitol: estrellas, Biomasa: línea.
Fig. 7: Gráfico que muestra la fermentación de xilosa por parte de 5 cepas C5LTe1204 (línea discontinua) y C5LTe1208 (línea continua). Glucosa: círculos, Xilosa: cuadrados, Xilitol: estrellas, Biomasa: línea.
Fig. 8: Gráfico que muestra un resumen del consumo de xilosa y la producción de etanol en la fermentación anaerobia de xilosa de 50 g/l de xilosa y 20 g/l de glucosa en medio mineral dentro de las 72 horas posteriores a la fermentación.
Fig. 9: Gráfico que muestra el cambio en la DO (620 nm) en experimentos en microplacas de células que crecen sobre xilosa en presencia de diversas concentraciones de ácidos acético (A) y fórmico (B) (g/g, eje vertical).
Fig. 10: Gráfico que muestra los resultados de fermentación de la fermentación de xilosa en presencia de ácido acético con las cepas C5LTe1202 (A) y C5LTe1212 (B).
Fig. 11: Gráfico que muestra los perfiles de fermentación de las cepas C5LTe1202 y C5LTe1212 en medio mineral en presencia de ácido acético.
Fig. 12: Gráfico que muestra la superposición de los perfiles de consumo de xilosa (A) y producción de etanol (B) de las cepas C5LTe1202 y C5LTe1212.
Fig. 13: Gráfico que muestra los perfiles de fermentación de las cepas C5Lte1202 (A) y C5Lte1212 (B) en medio mineral en presencia de ácido fórmico.
Fig. 14: Gráfico que muestra los resultados de fermentación de la fermentación de xilosa en presencia de ácido fórmico con las cepas C5LTe1202 y C5LTe1212.
Fig. 15: Gráfico que muestra la superposición de los perfiles de consumo de xilosa (A) y producción de etanol (B) de las cepas C5LTe1202 y C5LTe1212.
Fig. 16: Representación gráfica de las características de crecimiento (medidas como cambio en la DO a 620 nm) de las cepas C5LTe1202 (curva superior) y C5LTe1212 (curva inferior).
Fig. 17: Gráfico que muestra el crecimiento aerobio en xilosa de clones que expresan diversos genes glicolíticos. Se muestra la DO normalizada (620 nm) para los clones con los genes expresados.
Fig. 18: Gráfico que muestra el crecimiento aerobio en xilosa de clones que expresan diversos genes glicolíticos. Se muestra la DO normalizada (620 nm) para los clones con los genes expresados, las barras negras y las barras rayadas representan los resultados de dos experimentos independientes.
Fig. 19: Gráfico que muestra el crecimiento anaerobio de C5LTe1051 ("x") en comparación con la cepa de control C5LTe1035 ("-").
Fig. 20: Gráfico que muestra el crecimiento anaerobio de C5LTe1052 en comparación con la cepa de control C5LTe1035.
Fig. 21: Gráfico que muestra el crecimiento anaerobio de C5LTe1054 en comparación con la cepa de control C5LTe1035.
Fig. 22: Gráfico que muestra el crecimiento anaerobio de C5LTe1055 en comparación con la cepa de control C5LTe1035.
Fig. 23: Gráficos de fermentación de la fermentación de xilosa por las cepas MC2 (A), MC3 (B), MC4 (C), MC11 (D), MC14 (E) y MC22 (F) en comparación con la cepa de control (G). Símbolos: rombo - xilosa, cuadrado - xilitol, triángulo - glicerol, estrella - etanol.
Fig. 24: Representación gráfica del crecimiento anaerobio en xilosa de la cepa de control y cepas portadoras de PGM1 y PGM3.
Fig. 25: Representación gráfica de xilosa consumida tras la fermentación en medio mineral durante 120 h con cepa de control y cepas portadoras de PGM1 y PGM3.
Fig. 26: Representación gráfica de etanol producido tras la fermentación en medio mineral durante 120 h con cepa de control y cepas portadoras de PGM1 y PGM3.
Definiciones
El término "ruta", la expresión "ruta biometabólica" y similares en esta memoria se refiere a una ruta enzimática presente en una célula, típicamente una célula de levadura, que convierte o procesa un sustrato inicial en un producto intermedio o final en una serie de reacciones catalizadas por enzimas.
El término "gen" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que es capaz de expresarse como una proteína específica, tal como una enzima, que opcionalmente incluye secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificantes 5') y siguen (secuencias no codificantes 3') a la secuencia codificante.
El término "transformación" se refiere a la transferencia de una secuencia de ácido nucleico tal como, p. ej., un gen, a una célula huésped, típicamente una célula huésped de levadura, dando como resultado una herencia genéticamente estable.
Tal como se utiliza en esta memoria, "recombinante" se refiere a una célula huésped a la que se ha transferido una secuencia de ácido nucleico, tal como un gen, típicamente mediante transformación.
Una "levadura" es cualquiera de diversos hongos eucarióticos unicelulares pequeños del filo Ascomycota que se reproducen por fisión o gemación y que son capaces de fermentar hidratos de carbono en alcohol y dióxido de carbono. . Preferiblemente, una célula de levadura, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una célula de un género seleccionado del grupo que consiste en Saccharomyces, Rhodotorula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Rhodosporidium, Candida, Yarrowia, Lipomyces, Cryptococcus, y Dekkera sp.
Una ruta metabólica, proteína, polipéptido, enzima, secuencia de ácido nucleico o gen puede ser «heterólogo» o «extraño» a una célula huésped, lo que significa que la ruta, enzima, secuencia de ácido nucleico o gen no se encuentra normalmente en la célula huésped. típicamente una célula huésped de levadura de una clasificación taxonómica específica. "Endógeno" se refiere a una ruta, proteína, polipéptido, enzima, ácido nucleico o gen normalmente presente en la célula huésped, típicamente una célula huésped de levadura de una clasificación taxonómica específica.
La expresión "gen heterólogo" se define en esta memoria como un gen que no es nativo de la célula huésped; un gen nativo, en el que se han realizado modificaciones estructurales en la región codificante; un gen nativo, cuya expresión está alterada cuantitativamente (p. ej., "sobre-expresado") como resultado de una manipulación del a Dn mediante técnicas de ADN recombinante, p. ej., un promotor diferente (extraño); o un gen en una célula huésped que tiene una o más copias extra de la secuencia codificante para alterar cuantitativamente la expresión. Para evitar dudas, tal como se utiliza en esta memoria, un gen de Saccharomyces descrito se considerará un "gen heterólogo" cuando se exprese en un huésped de Saccharomyces, siempre que el gen no esté en su forma nativa y esté alterado por cualquier medio como se describe arriba (p. ej., transformado en el huésped).
Tal como se utiliza en esta memoria, un gen "sobre-expresado" que codifica una enzima significa que la enzima se produce a un nivel más alto de actividad enzimática específica en comparación con la célula huésped no modificada en condiciones idénticas. Por lo general, esto significa que la proteína enzimáticamente activa (o proteínas en el caso de enzimas de múltiples subunidades) se produce en mayores cantidades, o más bien a un nivel de estado estable más alto en comparación con la célula huésped no modificada en condiciones idénticas. Típicamente, esto es el resultado de que el ARNm que codifica la proteína enzimáticamente activa se produce en mayores cantidades, o de nuevo más bien a un nivel de estado estable más alto en comparación con la célula huésped no modificada en condiciones idénticas. Por lo tanto, la sobre-expresión de una enzima se determina preferiblemente midiendo el nivel de actividad específica de la enzima en la célula huésped utilizando ensayos enzimáticos apropiados tal como se describe en esta memoria. Alternativamente, la sobre-expresión de la enzima puede determinarse indirectamente cuantificando el nivel de estado estable específico de la proteína enzimática, p. ej., utilizando anticuerpos específicos para la enzima, o cuantificando el nivel estable específico del ARNm que codifica la enzima. Este último puede ser particularmente adecuado para enzimas de la ruta de la pentosa fosfato para las que los ensayos enzimáticos no son fácilmente factibles, ya que los sustratos para las enzimas no están disponibles comercialmente. Preferiblemente, en las células huésped descritas en esta memoria, un gen heterólogo se sobre-expresa por al menos un factor 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 o 20 en comparación con una célula huésped que es genéticamente idéntica excepto por la modificación genética que provoca la sobre-expresión. Debe entenderse que estos niveles de sobre-expresión pueden aplicarse al nivel de estado estable de la actividad de la enzima, al nivel de estado estable de la proteína de la enzima, así como al nivel de estado estable de la transcripción que codifica la enzima.
El término "aislado" significa una sustancia en una forma o entorno que no se encuentra en la naturaleza. Ejemplos no limitantes de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia que se produce de forma no natural, (2) cualquier sustancia que incluya, pero no se limite a cualquier célula huésped, enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que esté eliminado, al menos parcialmente, de uno o más o todos los constituyentes que se producen de forma natural con los que está asociado en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre en relación con la sustancia que se encuentra en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada aumentando la cantidad de la sustancia en relación con otros componentes con los que está asociada de forma natural.
La expresión "enlazada operativamente" significa una configuración en la que una secuencia de control está colocada en una posición apropiada con respecto a la secuencia codificante de un polinucleótido de manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante.
Una "variante" de una enzima de referencia, tal como se utiliza en esta memoria, es similar en su secuencia de aminoácidos a la enzima de referencia, tal como una enzima "parental" o de tipo salvaje, que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 30 %, tal como en al menos 40 %, tal como al menos 50 %, tal como al menos 60 %, tal como al menos 70 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 % de la secuencia de aminoácidos de la referencia. Variantes enzimáticas se pueden preparar mediante una amplia diversidad de diferentes técnicas de mutagénesis bien conocidas por los expertos en la técnica. Además, los kits de mutagénesis también están disponibles de muchos proveedores comerciales de biología molecular. Hay métodos disponibles para realizar sustituciones específicas en aminoácidos definidos (dirigidas al sitio), mutaciones específicas o aleatorias en una región localizada del gen (regio-específica) o mutagénesis aleatoria en todo el gen (p.ej., mutagénesis de saturación). Los expertos en la técnica conocen numerosos métodos adecuados para generar variantes enzimáticas, que incluyen, pero no se limitan a mutagénesis dirigida al sitio de ADN de cadena sencilla o ADN de doble cadena utilizando PCR, mutagénesis en casete, síntesis de genes, PCR propensa a errores, mezcla aleatoria y saturación química.
Tal como se utiliza en esta memoria, un "fragmento" de una enzima de referencia tal como una enzima parental o de tipo salvaje comprende un segmento de la secuencia de aminoácidos de la enzima de referencia. La secuencia de aminoácidos del fragmento comprende típicamente al menos 50 %, tal como al menos 60 %, tal como al menos 70 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 % de la secuencia de aminoácidos de la enzima de referencia, que carece de una porción N-terminal, una porción C-terminal, o tanto una porción N-terminal como C-terminal de la referencia. Típicamente, un fragmento es uno catalíticamente activo, conservando al menos la actividad enzimática de la enzima de referencia, aunque también se incluyen fragmentos que tienen una actividad enzimática mejorada, termoestabilidad mejorada, dependencia de co-factores alterada o similares. El fragmento puede diseñarse y expresarse utilizando métodos recombinantes, simplemente omitiendo las secuencias codificantes para las porciones N-terminal y/o C-terminal relevantes.
Un "ortólogo" de una enzima de referencia de tipo salvaje de un organismo particular puede identificarse fácilmente como similar en su secuencia de aminoácidos a la enzima de referencia aunque esté codificado por un gen de otro organismo. Ortólogos preferidos son los ortólogos de levadura, que pueden identificarse fácilmente, p. ej., buscando en bases de datos públicas de secuencias genómicas o seleccionando colecciones EST para secuencias de ácido nucleico que se hibridan con la secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje que codifica la enzima de referencia en condiciones de hibridación moderadas o rigurosas. Típicamente, el ortólogo tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 30 %, tal como al menos 40 %, tal como al menos 50 %, tal como al menos 60 %, tal como al menos 70 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 % de la secuencia de aminoácidos de la enzima de referencia, y es catalíticamente activa de manera que al menos retiene la actividad enzimática de la enzima de referencia, aunque también se incluyen ortólogos que tienen una actividad enzimática mejorada, termoestabilidad mejorada, dependencia de cofactores alterada, o similares.
La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad de la secuencia".
Para los fines descritos en esta memoria, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (Rice et a/., 2000), preferiblemente versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales utilizados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). La salida de Needle marcada como "identidad más larga" (obtenida utilizando la opción -nobrief) se utiliza como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:
(Residuos Idénticos x100yLongitud de la Secuencia de Referencia-Número Total de Huecos en
Alineamiento}
Para los fines descritos en esta memoria, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales utilizados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4). La salida de Needle marcada como "identidad más larga" (obtenida utilizando la opción -nobrief) se utiliza como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:
(Desoxirribonucleótidos Idénticos x 100)/[Long¡tud de la Secuencia de Referencia - Número Total de
Huecos en Alineamiento)
Las variantes, los fragmentos y ortólogos de enzimas de referencia tal como se describen en esta memoria son típicamente "catalíticamente activos", lo que significa que al menos conservan la actividad enzimática de la enzima de referencia, aunque también se incluyen las variantes, los fragmentos y ortólogos que tienen una actividad enzimática mejorada, termoestabilidad mejorada, dependencia de co-factores alterada, afinidad mejorada, tasa catalítica mejorada o similares. Por ejemplo, una variante, fragmento u ortólogo catalíticamente activo de XK de Sp. passalidarum (SEQ ID NO: 6) o XK de K. marxianus (SEQ ID NO: 22) tiene por lo tanto, p. ej., al menos dos veces la actividad enzimática de XK de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 32) para convertir D-xilulosa en xilulosa 5-fosfato, preferiblemente cuando se mide de acuerdo con el Ejemplo 7, y proporciona una tasa de crecimiento anaerobio de una S. cerevisiae recombinante u otra célula de levadura en xilosa que es mayor que la proporcionada por una XK de S. cerevisiae, preferiblemente cuando se mide de acuerdo con Ejemplo 8. En otro ejemplo, una variante funcional, fragmento u ortólogo de YME2p de Zygosaccharomyces bailii (SEQ ID NO: 50) proporciona, por lo tanto, uno o más, preferiblemente todos de un crecimiento anaerobio incrementado, una tasa de consumo de xilosa incrementada y una tasa de producción de etanol incrementada de una célula de levadura recombinante en presencia de ácido fórmico y/o ácido acético, preferiblemente cuando se mide de acuerdo con el Ejemplo 14 o 13, respectivamente. En otro ejemplo, una variante catalíticamente activa, fragmento u ortólogo de levadura de S. cerevisiae ENO1, PFK2, PFK26, PGI1, GPM1 o TPI1 proporciona, por lo tanto,uno o más, preferiblemente todos, de un crecimiento aerobio incrementado en xilosa, una tasa de crecimiento anaerobio incrementada en xilosa, una tasa de consumo incrementada de xilosa y una tasa de producción de etanol incrementada a partir de xilosa, preferiblemente cuando se mide de acuerdo con los Ejemplos 17, 18, 23 y/o 24. En otro ejemplo, una variante, fragmento u ortólogo catalíticamente activo de S. cerevisiae PGM3/PRM15 proporciona uno o más, preferiblemente todos de un crecimiento anaerobio incrementado en xilosa, una tasa de consumo incrementada de xilosa y una tasa de producción incrementada de etanol a partir de xilosa, preferiblemente cuando se mide de acuerdo con el Ejemplo 26 y/o 27 y, típicamente, actividad fosfoglucomutasa sustancialmente conservada o mejorada, actividad fosforribomutasa, o ambas. La actividad fosfoglucomutasa y la actividad fosforribomutasa se pueden determinar como se conoce en la técnica (p. ej., véase Xu et al., 2013).
La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en esta memoria incluye aspectos que están dirigidos a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que se refiere a "aproximadamente X" incluye el aspecto "X". Cuando se utiliza en combinación con valores medidos, "aproximadamente" incluye un intervalo que abarca al menos la incertidumbre asociada con el método de medición del valor particular, y puede incluir un intervalo de más o menos dos desviaciones estándar alrededor del valor establecido.
Tal como se utiliza en esta memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "o" y "el", "la" incluyen referentes en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se entiende que los aspectos descritos en esta memoria incluyen aspectos "que consisten" y/o "que consisten esencialmente en".
A menos que se defina de otro modo o que se indique claramente por el contexto, todos los términos y las expresiones técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica.
Descripción Detallada
Células recombinantes
La Tabla 1 que figura más adelante resume algunos resultados clave de los Ejemplos. Cuando se ensayan en extractos celulares de células de S. cerevisiae recombinantes capaces de fermentar xilosa, los extractos de aquellas células que sobre-expresan XK de Sp. passalidarium (SEQ ID NO: 6) tenían una actividad XK consistentemente más alta que las cepas de control que sobre-expresan XK de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 32). Sorprendentemente, la tasa de crecimiento anaerobio en xilosa de las células que sobre-expresan XK de cualquiera de Sp. passalidarium o K. marxianus (SEQ ID NO: 22) fue, no obstante, mayor que las de las cepas de control que sobre-expresan XK de S. cerevisiae o XK de E. coli (SEQ ID NO: 18). Además, la célula que sobre-expresa XK de Sp. passalidarium también proporcionó un mayor consumo de xilosa y producción de etanol en la fermentación en xilosa que las correspondientes cepas de control de XK de S. cerevisiae.
T l 1 R m n l n r i m ri n l E m l .
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Por consiguiente, en un aspecto de la divulgación es una célula de levadura Saccharomyces recombinante , opcionalmente una célula de S. cerevisiae, que es capaz de fermentar xilosa y que comprende un gen heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad xiluloquinasa (XK) enzimática.
En un aspecto de la divulgación, es una célula de levadura Saccharomyces recombinante, opcionalmente una célula de S. cerevisiae, que es capaz de fermentar xilosa y que comprende un gen heterólogo que codifica una xiluloquinasa (XK) que proporciona una actividad enzimática para convertir D-xilulosa en xilulosa 5-fosfato que es más alta que la proporcionada por XK de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 32) y aún proporciona una tasa de crecimiento anaerobio que es más alta que la proporcionada por XK de S. cerevisiae, XK de E. coli, o ambas.
En un aspecto de la divulgación, es una célula de Saccharomyces recombinante que es capaz de fermentar xilosa y que comprende un gen heterólogo que codifica una xiluloquinasa (XK), en donde la XK tiene una actividad enzimática de XK que es mayor que la de XK de S. cerevisiae, y proporciona una tasa de crecimiento anaerobio de la célula recombinante en xilosa que es mayor que la proporcionada por una XK de S. cerevisiae.
En un aspecto de la divulgación es una célula de levadura Saccharomyces recombinante, opcionalmente una célula de S. cerevisiae, que es capaz de fermentar xilosa y que comprende un gen heterólogo que codifica una xiluloquinasa (XK) que comprende SEQ ID NO: 6 o una variante catalíticamente activa de la misma como de define en las reivindicaciones.
En aspectos separados y específicos de la divulgación de cualquier aspecto mencionado anteriormente, la XK proporciona una actividad enzimática de XK que es al menos 1,1, p. ej., al menos 1,2, al menos 1,5, al menos 1,7, al menos dos veces (2), al menos 2,5 o al menos 3 veces la proporcionada por XK de S. cerevisiae. En un aspecto de la divulgación, la XK tiene una actividad enzimática para convertir D-xilulosa en xilulosa 5-fosfato al menos dos veces la de XK de S. cerevisiae. En un aspecto de la divulgación, la XK proporciona, además, una tasa de crecimiento aerobio de la célula en xilosa que es más alta que la proporcionada por XK de S. cerevisiae, XK de E. coli, o ambas. Por ejemplo, la XK puede proporcionar una tasa de crecimiento aerobio que es 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 o 1,5 veces la proporcionada por XK de S. cerevisiae. Adicionalmente, la XK puede proporcionar un mayor consumo de xilosa, una mayor producción de etanol, o ambas, de la célula recombinante que la proporcionada por XK de S. cerevisiae, XK de E. coli, o ambas.
Ventajosamente, la actividad, las tasas de crecimiento anaerobio y aerobio de XK, y el consumo de xilosa y la producción de etanol, pueden testarse en los ensayos y construcciones de cepas de acuerdo con los Ejemplos. Por ejemplo, en un aspecto de la divulgación, la actividad enzimática para convertir D-xilulosa en xilulosa 5-fosfato se mide de acuerdo con el Ejemplo 7. En un aspecto adicional o alternativo de la divulgación, la tasa de crecimiento anaerobio se puede medir de acuerdo con el Ejemplo 9. Asimismo, la tasa de crecimiento aerobio se puede medir de acuerdo con el Ejemplo 8, y/o el consumo de xilosa y la producción de etanol se pueden medir de acuerdo con el Ejemplo 10. En estos ensayos, las cepas recombinantes pueden prepararse, por ejemplo, a partir de C5LTe1000 o una cepa de S. cerevisiae de laboratorio equivalente o similar o disponible comercialmente, por ejemplo CEN.PK o s288c, y luego testarse en forma de células vivas o extractos de células como se describe. Típicamente, para la realización de ensayos de prueba de este tipo, células de S. cerevisiae se transforman con genes que codifican mXR de P. stipitis con una mutación N272D, XDH de P. stipitis, la XK a examinar o XK de control de S. cerevisiae o E. coli, y TAL1, TKL1 y RKI1 de S. cerevisiae, de modo que cada uno de los genes está integrado cromosómicamente y enlazado operativamente a un promotor constitutivo.
En un aspecto de la divulgación, la XK comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 o una variante o fragmento catalíticamente activo de la misma como de define en las reivindicaciones.
En un aspecto de la divulgación, la XK es una variante catalíticamente activa de SEQ ID NO: 6, que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos al menos 98 %, tal como al menos 99 % idéntica a SEQ ID NO: 6. En un aspecto de la divulgación, la XK es una variante de SEQ ID NO: 22, que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos al menos 98 %, tal como al menos 99 % idéntica a SEQ ID NO: 6. En un aspecto de la divulgación, la XK es un fragmento (p. ej., un fragmento catalíticamente activo) de SEQ ID NO: 6 correspondiente a al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de la secuencia de aminoácidos de la enzima de longitud completa. En un aspecto de la divulgación, la XK es un fragmento (p. ej., un fragmento catalíticamente activo) de SEQ Id NO: 22 correspondiente a al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de la secuencia de aminoácidos de la enzima de longitud completa.
La Tabla 2 que figura más adelante resume adicionalmente algunos resultados clave de los Ejemplos. Sorprendentemente, la expresión del gen YME2 heterólogo (es decir, la sobre-expresión del gen YME2) en células de S. cerevisiae recombinantes capaces de fermentar xilosa dio como resultado una mayor tasa de crecimiento anaerobio, un consumo de xilosa más eficiente y una mayor producción de etanol en la fermentación en xilosa.
Tabla 2 Resumen de las cepas construidas y testadas en presencia de ácido fórmico como se describe en los Ejemplos. Los experimentos de crecimiento y fermentación reseñados aquí se llevaron a cabo en xilosa y bajo condiciones anaerobias.
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Por consiguiente, en un aspecto de la divulgación es una célula de levadura Saccharomyces recombinante , opcionalmente una célula de S. cerevisiae, que es capaz de fermentar xilosa y que comprende un gen heterólogo que codifica un polipéptido Yme2p que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID ID NO: 50 o una variante, fragmento u ortólogo de levadura de la misma catalíticamente activa, en donde el polipéptido Yme2p proporciona una tolerancia incrementada de la célula recombinante al ácido fórmico, ácido acético o ambos. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido Yme2p proporciona, además, (a) un crecimiento anaerobio incrementado, (b) una tasa de consumo de xilosa incrementada, (c) una tasa de producción de etanol incrementada o (d) una combinación de dos o todos los (a) a (c), de la célula recombinante en presencia de ácido fórmico. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido Yme2p proporciona, además, (a) una tasa de consumo de xilosa incrementada, (b) una tasa de producción de etanol incrementada o (c) una combinación de (a) y (b), de la célula recombinante en presencia de ácido acético.
Ventajosamente, el crecimiento anaerobio, el consumo de xilosa, la tasa de producción de etanol o la combinación se pueden medir de acuerdo con los Ejemplos 13 o 14. Notablemente, estos Ejemplos demuestran que la fermentación de xilosa en presencia de ácido fórmico o acético mejoró en levaduras que sobre-expresan YME2. Específicamente, el consumo de xilosa y la producción de etanol aumentaron en un 13 % y un 12 %, respectivamente, en presencia de ácido acético, y en un 7 % y 12 %, respectivamente, en presencia de ácido fórmico. El ácido fórmico es común en los hidrolizados lignocelulósicos y contribuye en gran medida a la toxicidad de hidrolizados de este tipo.
En un aspecto separado de la divulgación, el polipéptido Yme2p comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 o una variante funcional, fragmento u ortólogo de levadura de la misma, proporciona un consumo de xilosa que es al menos 5 %, p. ej., al menos 10 % más alta, una producción de etanol que es al menos 5 %, p. ej., al menos 10% más alta, o ambas, de la célula recombinante cuando se testa de acuerdo con el Ejemplo 14. En estos ensayos, las cepas recombinantes pueden prepararse, por ejemplo, a partir de TMB 3000 o una cepa de S. cerevisiae de laboratorio equivalente o similar o disponible comercialmente, y luego testarse como se describe. Típicamente, para la realización de ensayos de prueba de este tipo, células de S. cerevisiae se transforman con genes que codifican mXR de P. stipitis con una mutación N272D, XDH de P. stipitis, el polipéptido Yme2p a examinar y XK, TAL1, TKL1 y RKI1 de S. cerevisiae, de modo que cada uno de los genes está integrado cromosómicamente y enlazado operativamente a un promotor constitutivo.
En un aspecto de la divulgación, el polipéptido Yme2p comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 o una variante funcional, fragmento u ortólogo de levadura de la misma. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido Yme2p es una variante funcional u ortólogo de levadura de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, tal como al menos 60 %, tal como al menos 70 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos al menos 98 %, tal como al menos 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido Yme2p es un fragmento funcional de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 correspondiente a al menos 50 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de la secuencia de aminoácidos de la enzima de longitud completa.
Las Tablas 3 y 8 que figuran a continuación resumen adicionalmente algunos resultados clave de los Ejemplos, que demuestran que la sobre-expresión de genes que codifican ENO1, PFK2, PFK26, PGI1, GPM1 o TPI1 en células de S. cerevisiae recombinantes capaces de fermentar xilosa dio como resultado una mayor tasa de crecimiento anaerobio, más consumo eficiente de xilosa y/o una producción de etanol incrementada en la fermentación en xilosa.
Tabla 3 Resumen de las cepas construidas y testadas como se describe en los Ejemplos. Véase también la Tabla 8 para obtener resultados sobre el consumo de xilosa la roducción de etanol.
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Por consiguiente, en un aspecto, es una célula de levadura recombinante tal como una célula de Saccharomyces , opcionalmente una célula de S. cerevisiae, que es capaz de fermentar xilosa y que comprende un gen heterólogo que codifica una enolasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID ID NO: 132 ( ENO1), un polipéptido de la subunidad beta de fosfofructoquinasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134 (PFK2), una 6-fosfofructo-2-quinasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136 (PFK26), una glucosa-6-fosfato isomerasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138 (PGI1), una fosfoglicerato mutasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 140 (GPM1), una triosa-fosfato isomerasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 142 (TPI1), o una variante, fragmento u ortólogo de levadura catalíticamente activo de una cualquiera de ENO1, PFK2, PFK26, PGI1, GPM1 y TPI1, o una combinación de cualquiera de dos o más de ENO1, PFK2, PFK26, PGI1, GPM1 y TPI1 de la misma, tal como tres, cuatro, cinco o todas las de ENO1, PFK2, PFK26, PGI1, GPM1 y TPI1. En un aspecto de la divulgación, el gen heterólogo o la combinación proporciona una tasa de crecimiento anaerobio incrementada en xilosa, una tasa de crecimiento aerobio incrementada en xilosa, una producción incrementada de etanol a partir de xilosa, o una combinación de dos cualquiera o todas las mismas. Ventajosamente, la tasa de crecimiento anaerobio se puede medir de acuerdo con el Ejemplo 23, el crecimiento aerobio se puede medir de acuerdo con el Ejemplo 5 y/o la producción de etanol se puede medir de acuerdo con el Ejemplo 24.
En un aspecto separado de la divulgación, el ENO1, PFK2, PFK26, PGI1, GPM1, TPI1 o la variante, el fragmento o el ortólogo de levadura catalíticamente activo de cualquiera de los mismos, proporciona un rendimiento de etanol a partir de xilosa que es al menos 5 %, p. ej., al menos 10 % más alto, al menos 15 % más alto o al menos 20 % más alto, de la célula recombinante cuando se testa de acuerdo con el Ejemplo 12. En estos ensayos, las cepas recombinantes pueden prepararse, por ejemplo, a partir de CEN.PK o una cepa de S. cerevisiae de laboratorio equivalente o similar o disponible comercialmente, y luego testarse como se describe. Típicamente, para la realización de ensayos de prueba de este tipo, células de S. cerevisiae se transforman con genes que codifican mXR de P. stipitis con una mutación N272D, XDH de P. stipitis, ENO1, PFK2, PFK26, PGI1, GPM1 o TPI1 a examinar y XK, TAL1, TKL1 y RKI1 de S. cerevisiae, de modo que cada uno de los genes está integrado cromosómicamente y enlazado operativamente a un promotor constitutivo.
En un aspecto de la divulgación, la célula comprende un gen heterólogo que codifica una enolasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132 o una variante, fragmento u ortólogo de levadura catalíticamente activo de la misma. En un aspecto de la divulgación, la variante o el ortólogo de levadura catalíticamente activo tiene una identidad de secuencia de al menos 80 %, p. ej., al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132. En un aspecto de la divulgación, el gen heterólogo codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132.
En un aspecto de la divulgación, la célula comprende un gen heterólogo que codifica un polipéptido de la subunidad beta de fosfofructoquinasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134 o una variante, fragmento u ortólogo de levadura catalíticamente activo de la misma. En un aspecto de la divulgación, la variante o el ortólogo de levadura catalíticamente activo tiene una identidad de secuencia de al menos 80 %, p. ej., al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134. En un aspecto de la divulgación, el gen heterólogo codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134.
En un aspecto de la divulgación, la célula comprende un gen heterólogo que codifica una 6-fosfofructo-2-quinasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136 o una variante, fragmento u ortólogo de levadura catalíticamente activo de la misma. En un aspecto de la divulgación, la variante o el ortólogo de levadura catalíticamente activo tiene una identidad de secuencia de al menos 80 %, p. ej., al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136. En un aspecto de la divulgación, el gen heterólogo codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136.
En un aspecto de la divulgación, la célula comprende un gen heterólogo que codifica una glucosa-6-fosfato isomerasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138 o una variante, fragmento u ortólogo de levadura catalíticamente activo de la misma. En un aspecto de la divulgación, la variante o el ortólogo de levadura catalíticamente activo tiene una identidad de secuencia de al menos 80 %, p. ej., al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138. En un aspecto de la divulgación, el gen heterólogo codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138.
En un aspecto de la divulgación, la célula comprende un gen heterólogo que codifica una fosfoglicerato mutasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 140 o una variante, fragmento u ortólogo de levadura catalíticamente activo de la misma. En un aspecto de la divulgación, la variante o el ortólogo de levadura catalíticamente activo tiene una identidad de secuencia de al menos 80 %, p. ej., al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 140. En un aspecto de la divulgación, el gen heterólogo codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 140.
En un aspecto de la divulgación, la célula comprende un gen heterólogo que codifica una triosa-fosfato isomerasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 142 o una variante, fragmento u ortólogo de levadura catalíticamente activo de la misma. En un aspecto de la divulgación, la variante o el ortólogo de levadura catalíticamente activo tiene una identidad de secuencia de al menos 80 %, p. ej., al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 142. En un aspecto de la divulgación, el gen heterólogo codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 142.
En un aspecto de la divulgación, el gen heterólogo codifica un fragmento de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132, 134, 136, 138, 140 o 142 correspondiente a al menos 50 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de la secuencia de aminoácidos de longitud completa.
La Tabla 4 que figura a continuación resume adicionalmente algunos resultados clave de los Ejemplos, que demuestran que la sobre-expresión de PGM3 en células de S. cerevisiae recombinantes capaces de fermentar xilosa dio como resultado una mayor tasa de crecimiento anaerobio y más consumo eficiente de xilosa y una producción de etanol incrementada en la fermentación anaerobia de xilosa.
T l 4 R m n l n r i m ri n l E m l .
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Por consiguiente, en un aspecto, es una célula de levadura Saccharomyces recombinante, opcionalmente una célula de S. cerevisiae, que es capaz de fermentar xilosa y que comprende un gen heterólogo que codifica una fosfoglucomutasa y/o una fosforribomutasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID ID NO: 150 (PGM3) o una variante o fragmento catalíticamente activo de la misma. En un aspecto de la divulgación, el gen heterólogo o la combinación proporciona una tasa de crecimiento anaerobio incrementada en xilosa, un consumo de xilosa incrementado, una producción incrementada de etanol a partir de xilosa, o una combinación de dos cualquiera o todas las mismas.
En un aspecto separado de la divulgación, la PGM3 o el fragmento o variante catalíticamente activo proporciona una tasa de crecimiento anaerobio de la célula recombinante que es al menos 10 %, p. ej., al menos 20 %, al menos 50 %, al menos 80 % o al menos 100 % más alta que un control relevante que no comprende el gen PGM3 heterólogo (en el que la PGM3 no se sobre-expresa), (p. ej., cuando se testa de acuerdo con el Ejemplo 26). En un aspecto de la divulgación, la PGM3 o el fragmento o variante catalíticamente activo proporciona, también o alternativamente, una tasa de consumo de xilosa en la fermentación anaerobia que es al menos 10 %, p. ej., al menos 20 %, al menos 50 %, al menos 80 % o al menos 100 % más alta que un control relevante que no comprende el gen PGM3 heterólogo (en el que la PGM3 no se sobre-expresa), (p. ej., cuando se testa de acuerdo con el Ejemplo 27). En un aspecto de la divulgación, la PGM3 o el fragmento o variante catalíticamente activo proporciona, también o alternativamente, un rendimiento en etanol en la fermentación anaerobia que es al menos 10 %, p. ej., al menos 20 %, al menos 50 %, al menos 80 % o al menos 100 % más alto que un control relevante que no comprende el gen PGM3 heterólogo (en el que la PGM3 no se sobre-expresa), (p. ej., cuando se testa de acuerdo con el Ejemplo 27). En estos ensayos, las cepas recombinantes pueden prepararse, por ejemplo, a partir de CEN.PK o una cepa de S. cerevisiae de laboratorio equivalente o similar o disponible comercialmente, y luego testarse como se describe. Típicamente, para la realización de ensayos de prueba de este tipo, células de S. cerevisiae se transforman con genes que codifican mXR de P. stipitis con una mutación N272D, XDH de P. stipitis, la PGM3 o el fragmento o variante catalíticamente activo a examinar y XK, TAL1, TKL1 y RKI1 de S. cerevisiae, de modo que cada uno de los genes está integrado cromosómicamente y enlazado operativamente a un promotor constitutivo.
En un aspecto de la divulgación, la célula comprende un gen heterólogo que codifica una PGM3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150 o una variante o fragmento catalíticamente activo de la misma. En un aspecto de la divulgación, la variante catalíticamente activa tiene una identidad de secuencia de al menos 30 %, tal como al menos 50 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos al menos 98 %, tal como al menos 99 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150. En un aspecto de la divulgación, el gen heterólogo codifica una PGM3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150.
En un aspecto de la divulgación, el gen heterólogo que codifica PGM3 o un fragmento o variante catalíticamente activo codifica un fragmento de SEQ ID NO: 150 correspondiente a al menos 50 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de la secuencia de aminoácidos de longitud completa.
El experto en la materia es muy consciente de que las variantes y fragmentos de una secuencia enzimática se pueden modificar reemplazando, insertando o suprimiendo aminoácidos utilizando técnicas recombinantes estándares al tiempo que se mantiene, o incluso se mejora, la actividad enzimática de interés. Aunque variantes de este tipo incluyen las que tienen secuencias de aminoácidos con una o más sustituciones conservadoras o no conservadoras con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 22, 50, 132, 134, 136, 138, 140, 142 y/o 150, las sustituciones conservadoras son típicamente de mayor interés. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "sustitución conservadora" se refiere a la sustitución de un residuo por otro residuo que generalmente no altera la actividad específica del polipéptido codificado. Una sustitución conservadora ejemplar es una sustitución que está dentro del mismo grupo de aminoácidos de carácter básico (arginina, lisina e histidina), aminoácidos de carácter ácido (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina, prolina, cisteína y metionina). Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica son bien conocidas en la técnica. Los intercambios que ocurren con más frecuencia son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly, así como estos a la inversa. En algún aspecto de las divulgaciones, las sustituciones son de un porcentaje bajo, típicamente menos de aproximadamente 10 %, más típicamente menos de 5 % y a menudo menos de aproximadamente 2 % de los aminoácidos de la secuencia polipeptídica, con un aminoácido seleccionado de forma conservadora del mismo grupo de sustitución conservadora. En un aspecto preferido de la divulgación, la XK comprende la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto preferido de la divulgación, la XK comprende la SEQ ID NO: 22. En otro aspecto preferido de la divulgación, la Yme2p comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. En otro aspecto preferido de la divulgación, la enzima comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134, 136, 138, 140, 142 o 150.
Aminoácidos esenciales de las enzimas pueden identificarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081 -1085). En la última técnica, se introducen mutaciones individuales de alanina en cada uno de los residuos de la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se analizan para determinar la actividad enzimática para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también se puede determinar mediante análisis físico de la estructura, según se determina mediante técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcaje por fotoafinidad, junto con la mutación de los aminoácidos del sitio de contacto putativo. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol.
224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, Fe BS Lett. 309: 59-64. Las identidades de los aminoácidos esenciales también se pueden inferir del análisis de identidades con otras enzimas que están relacionadas con las enzimas referenciadas.
Puede determinarse una guía adicional sobre la relación estructura-actividad de las enzimas en esta memoria utilizando técnicas de alineamiento de secuencia múltiple (MSA) bien conocidas en la técnica. Basándose en las enseñanzas de esta memoria, el experto en la técnica podría realizar alineamientos similares con cualquier número de enzimas descritas en esta memoria o conocidas en la técnica. Alineamientos de este tipo ayudan al experto en la técnica a determinar dominios potencialmente relevantes (p. ej., dominios de unión o dominios catalíticos), así como qué residuos de aminoácidos se conservan y no se conservan entre las diferentes secuencias enzimáticas. Se aprecia en la técnica que cambiar un aminoácido que se conserva en una posición particular entre la enzima descrita resultará más probablemente en un cambio en la actividad biológica (Bowie et al., 1990, Science 247: 1306-1310: "Residuos que están directamente implicados en funciones proteicas tales como la unión o la catálisis estarán sin duda entre las más conservadas”). Por el contrario, la sustitución de un aminoácido que no está muy conservado entre las enzimas no alterará probable o significativamente la actividad biológica.
Se pueden realizar y testar sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos únicos o múltiples utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o mezcla aleatoria, seguidos de un procedimiento de rastreo relevante, tales como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; documentos WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que pueden utilizarse incluyen PCR propensa a errores, presentación de fagos (p. ej., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; Patente de EE.UU. N° 5.223.409; documento WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
Métodos de mutagénesis / mezcla aleatoria pueden combinarse con métodos de selección automatizados de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos mutagenizados clonados expresados por células huésped (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican enzimas activas (p. ej., xiluloquinasas) pueden recuperarse de las células huésped y secuenciarse rápidamente utilizando métodos estándares en la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido.
Las células huésped para preparar las células recombinantes de la invención son células huésped de Saccharomyces, tales como células de Saccharomyces cerevisiae, bayanus o carlsbergensis. Preferiblemente, la célula de levadura es una célula de Saccharomyces cerevisiae. Células adecuadas pueden, por ejemplo, derivarse de cepas disponibles comercialmente y cepas industriales poliploides o aneuploides, incluyendo, pero no limitadas a las de Superstart™, THERMOSACC®, etc. (Lallemand); RED STAR y ETHANOL RED® (Fermentis/Lesaffre); FALI (AB Mauri); la mejor levadura de panadería, levadura comprimida de panadería, etc. (levadura de Fleishmann); BIOFERM AFT, XP, CF y XR (North American Bioproducts Corp.); Turbo Yeast (Gert Strand AB); y FERMIOL® (Ds M Specialties). Otras cepas de levadura útiles están disponibles de depósitos biológicos tales como American Type Culture Collection (ATCC) o Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), tales como, p. ej., BY4741 (p. ej., ATCC 201388); Y108-1 (ATCC PTA.10567) y NRRL YB-1952 (ARS Culture Collection). Todavía otras cepas de S. cerevisiae adecuadas como células huésped DBY746, [Alpha][Eta]22, S150-2B, GPY55-15Ba, CEN.PK, USM21, TMB3500, TMB3400, VTT-A-63015, VTT-A-85068, Vt T-c-79093 y sus derivados, así como Saccharomyces sp. 1400, 424A (LNH-ST), 259A (LNH-ST) y derivados de las mismas.
Como se mencionó previamente, algunas células de levadura de tipo salvaje, p.ej., células de Saccharomyces no pueden fermentar xilosa de forma natural. Sin embargo, ahora está dentro del nivel de habilidad en la técnica aplicar tecnología de ingeniería genética para preparar células de Saccharomyces recombinantes que sean capaces de fermentar xilosa. Por ejemplo, las enzimas XR y XDH de levaduras que fermentan xilosa de forma natural, tales como Scheffersomyces (Pichia) stipitis y diversas especies de Candida pueden expresarse en células de Saccharomyces para proporcionar esta capacidad y/o una enzima XI adecuada para la expresión en una célula huésped de levadura. Además, se contempla el uso de variantes catalíticamente activas de XR y/o XDH. Por ejemplo, existen variantes de XR de P. stipitis que cambian la preferencia de cofactor de la XR de NADPH a NADH. A estas variantes se las alude en esta memoria como variantes XR "que prefieren NADH" e incluyen, pero no se limitan a N272D, K270R y P275Q. Aún otras variantes de XR y XK se describen en el documento WO 2012/135110. En cuanto a XI, XI del hongo Piromyces sp. (Kuyper et al., 2005) u otras fuentes (Madhavan et al., 2009) se han expresado en células huésped de S. cerevisiae. Aún se han descrito otras XI adecuadas para la expresión en levaduras en los documentos US 2012/0184020 (una XI de Ruminococcus flavefaciens), w O 2011/078262 (varias XIs de Reticulitermes speratus y Mastotermes darwiniensis) y WO 2012/009272 (construcciones y células fúngicas que contienen una XI de Abiotrophia defectiva). Opcionalmente, también se pueden lograr mejoras adicionales en la fermentación de xilosa mediante la adaptación de la cepa a condiciones selectivas, de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica. Adicionalmente, la capacidad fermentativa de xilosa de una célula de levadura también se puede incrementar, al aumentar el flujo de la ruta de la pentosa-fosfato (PPP) al sobre-expresar uno o más genes que codifican enzimas de la ruta no oxidativa, que incluye TAL (EC 2.2.1.2), TKL (EC 2.2.1.1), RKI (EC 5.3.1.6) and RPE (EC 5.1.3.4) (Karhumaa et a l, 2005). Preferiblemente, en las células de levadura de la invención, los genes que codifican TAL, TKL y RKI están sobre­ expresados. Típica, aunque no necesariamente, los genes endógenos de la PPP están sobre-expresados. Un flujo incrementado en la PPP puede medirse mediante análisis de flujo metabólico con glucosa marcada con 13C como se describe, p. ej., en van Winden et al. (2005, FEMS Yeast Research 5:559-568).
Por consiguiente, en un aspecto de la divulgación, la célula recombinante comprende un gen heterólogo que codifica una transaldolasa (TAL), un gen heterólogo que codifica una transcetolasa (TKL) y/o un gen heterólogo que codifica una ribosa 5-fosfato cetol-isomerasa (RKI). En algún aspecto de las divulgaciones, la célula recombinante comprende un gen heterólogo que codifica una transaldolasa (TAL), un gen heterólogo que codifica una transcetolasa (TKL) y un gen heterólogo que codifica una ribosa 5-fosfato cetol-isomerasa (RKI).
En un aspecto de la divulgación, la célula recombinante comprende un gen heterólogo que codifica una xilosa reductasa (XR), un gen heterólogo que codifica una xilitol deshidrogenasa (XDH) y/o un gen heterólogo que codifica una xilosa isomerasa (XI). XRs preferidas son XR de Pichia stipitis y sus variantes que prefieren NADH, tales como XR de Pichia stipites que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas de N272D, K270R y P275Q. La más preferida es XR(N272D) de Pichia stipitis. XDHs preferidas son XDH de Pichia stipitis y variantes catalíticamente activas de la misma. TALs, TKLs y RKIs preferidas son aquellas que son endógenas a la célula.
La codificación específica o secuencias de aminoácidos para las diversas S. cerevisiae u otras enzimas de levaduras o fúngicas a las que se alude arriba pueden identificarse en la bibliografía y en bases de datos bioinformáticas bien conocidas por la persona experta, tales como el sistema de información enzimática integral BRENDA, disponible en www.brenda-enzymes.org, KEGG (www.genome.jp/kegg/kegg2.html/), UniProt (http://ca.expasy.org/sprot/), Metacyc (www.metacyc.com/), y la base de datos del genoma de Saccharomyces (www.yeastgenome.org). También se pueden preparar secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de XR, XDH, XK, TAL, TKL y RKI particulares como se describe en los Ejemplos, o se proporcionan en el listado de secuencias adjunto.
En otro aspecto, es un método para aumentar la tolerancia de una célula de levadura tal como una célula de Saccharomyces al ácido fórmico, que comprende transformar la célula con un gen que codifica un polipéptido Yme2p que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 o una variante, fragmento u ortólogo de levadura catalíticamente activo de la misma, y expresar el gen.
En un aspecto de la divulgación, cada uno del gen o genes heterólogos en la célula recombinante de acuerdo con la invención está operativamente enlazado a un promotor inducible, uno regulado o uno constitutivo. Opcionalmente, uno o más, opcionalmente todos, los genes se integran en el genoma de la célula. En un aspecto específico de la divulgación, el gen que codifica una XK está operativamente enlazado a un promotor constitutivo endógeno a la célula. Técnicas recombinantes relacionadas se describen con más detalle más adelante.
Las cepas o clones de las células recombinantes de cualquiera de los aspectos precedentes de las divulgaciones también se proporcionan en la divulgación. Un "clon" en este contexto se refiere a un número de células que se derivan todas de la misma célula madre por división celular.
Métodos recombinantes
La divulgación también se refiere a vectores que comprenden genes que codifican una XK como se describe en los aspectos precedentes que pueden utilizarse para transformar una célula de levadura Saccharomyces, tal como una célula de S. cerevisiae. La célula huésped de levadura puede ser capaz de fermentar, de forma natural, xilosa o puede transformarse con genes que proporcionan esta capacidad, tal como se describió arriba.
Por consiguiente, en un aspecto se describe un procedimiento para producir una célula recombinante descrita en esta memoria (una célula de Saccharomyces), que comprende transformar la célula con un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una XK que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 o una variante o fragmento catalíticamente activo de cualquiera de las mismas.
En un aspecto de la divulgación, el procedimiento comprende transformar la célula con un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una XK que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 o una variante o fragmento catalíticamente activo de cualquiera de las mismas; un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una XR, y un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una XDH. Los genes heterólogos pueden estar en forma de uno o más vectores.
En un aspecto de la divulgación, el procedimiento comprende transformar la célula con un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una XK que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 o una variante o fragmento catalíticamente activo de cualquiera de las mismas; y un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una XI. Los genes heterólogos pueden estar en forma de uno o más vectores.
En un aspecto, es un vector que comprende un gen que codifica una xiluloquinasa (XK) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 22 o una variante o fragmento catalíticamente activo de cualquiera de las mismas como de define en las reivindicaciones.
En algunos aspectos de la divulgación, el vector comprende, además, un gen que codifica una xilosa reductasa (XR), un gen que codifica una xilitol deshidrogenasa (XDH) y/o un gen que codifica una xilosa isomerasa (XI). El vector puede comprender, además, secuencias reguladoras para expresar los genes en una célula huésped de levadura Saccharomyces o Saccaromyces cerevisiae.
La invención también se refiere a vectores que comprenden genes que codifican una Yme2p como se describe en los aspectos precedentes que pueden utilizarse para transformar una célula de levadura Saccharomyces, tal como una célula de S. cerevisiae. La célula huésped de levadura puede ser capaz de fermentar, de forma natural, xilosa o puede transformarse con genes que proporcionan esta capacidad, tal como se describió arriba.
Por consiguiente, en un aspecto, es un procedimiento para producir una célula recombinante descrita en esta memoria (una célula de Saccharomyces), que comprende transformar la célula con un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una Yme2p que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 o una variante o fragmento catalíticamente activo de cualquiera de las mismas.
En un aspecto de la divulgación, el procedimiento comprende transformar la célula con un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una Yme2p que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 o una variante o fragmento catalíticamente activo de cualquiera de las mismas; un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una XR, y un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una XDH. Los genes heterólogos pueden estar en forma de uno o más vectores.
En un aspecto de la divulgación, el procedimiento comprende transformar la célula con un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una Yme2p que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 o una variante o fragmento catalíticamente activo de cualquiera de las mismas; y un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una XI. Los genes heterólogos pueden estar en forma de uno o más vectores.
En un aspecto, es un vector que comprende un gen que codifica una Yme2p que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 o una variante o fragmento catalíticamente activo de cualquiera de las mismas en algunos aspectos de la divulgación, el vector comprende, además, un gen que codifica una xilosa reductasa (XR), un gen que codifica una xilitol deshidrogenasa (XDH) y/o un gen que codifica una xilosa isomerasa (XI). El vector puede comprender, además, secuencias reguladoras para expresar los genes en una célula huésped de levadura Saccharomyces o Saccaromyces cerevisiae.
La invención también se refiere a vectores que comprenden genes que codifican un polipéptido ENO1, PFK2, PFK26, PGI1, GPM1, TPI1 o una variante, fragmento u ortólogo de levadura catalíticamente activo del mismo como se describe en los aspectos precedentes de las divulgaciones que se pueden utilizar para transformar una célula de levadura Saccharomyces, tal como una célula de S. cerevisiae. La célula huésped de levadura puede ser capaz de fermentar de forma natural xilosa, o puede transformarse con genes que proporcionan esta capacidad, como se describió arriba.
Por consiguiente, en un aspecto, es un procedimiento para producir una célula recombinante descrita en esta memoria (una célula de Saccharomyces), que comprende transformar la célula con uno o más genes heterólogos (p. ej., vectores) que codifican ENO1, PFK2, PFK26, PGI1, GPM1, TPI1 o una variante, fragmento u ortólogo de levadura catalíticamente activo de cualquiera de los mismos.
En un aspecto de la divulgación, el procedimiento comprende transformar la célula con uno o más genes heterólogos (p. ej., vectores) que codifican e NO1, PFK2, PFK26, PGI1, GPM1, TPI1 o una variante catalíticamente activa, fragmento u ortólogo de levadura de cualquiera de los mismos; un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una XR, y un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una XDH. En algún aspecto de las divulgaciones, el procedimiento comprende, además, transformar la célula con un gen heterólogo que codifica una xilulosa quinasa (XK). Los genes heterólogos pueden estar en forma de uno o más vectores.
En un aspecto de la divulgación, el procedimiento comprende transformar la célula con uno o más genes heterólogos (p. ej., vectores) que codifican ENO1, PFK2, PFK26, PGI1, GPM1, TPI1 o una variante, fragmento u ortólogo de levadura catalíticamente activo de cualquiera de los mismos; y un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una XI. En algún aspecto de las divulgaciones, el procedimiento comprende, además, transformar la célula con un gen heterólogo que codifica una xilulosa quinasa (XK). Los genes heterólogos pueden estar en forma de uno o más vectores.
En otro aspecto, es un vector que comprende uno o más genes heterólogos que codifican ENO1, PFK2, PFK26, PGI1, GPM1, TPI1 o una variante funcional, fragmento u ortólogo de levadura de cualquiera de los mismos. En algún aspecto de las divulgaciones, el vector comprende, además, un gen que codifica una xilosa reductasa (XR), un gen que codifica una xilitol deshidrogenasa (XDH). En algún aspecto de las divulgaciones, el procedimiento comprende, además, transformar la célula con un gen heterólogo que codifica una xilulosa quinasa (XK) y/o un gen que codifica una xilosa isomerasa (XI). El vector puede comprender, además, secuencias reguladoras para expresar los genes en una célula huésped de levadura Saccharomyces o Saccaromyces cerevisiae.
La invención también se refiere a vectores que comprenden genes que codifican un polipéptido PGM3 o una variante o fragmento catalíticamente activo de los mismos como se describe en los aspectos precedentes y un aspecto de las divulgaciones que puede utilizarse para transformar una célula de levadura Saccharomyces, tal como una célula de S. cerevisiae. La célula huésped de levadura puede ser capaz de fermentar, de forma natural, xilosa o puede transformarse con genes que proporcionan esta capacidad, tal como se describió arriba.
Por consiguiente, en un aspecto, es un procedimiento para producir una célula recombinante descrita en esta memoria (una célula de Saccharomyces), que comprende transformar la célula con un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica la PGM3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150 o una variante o fragmento catalíticamente activo de la misma.
En un aspecto de la divulgación, el procedimiento comprende transformar la célula con un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una PGM3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150 o una variante o fragmento catalíticamente activo de cualquiera de las mismas; un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una XR, y un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una XDH. Los genes heterólogos pueden estar en forma de uno o más vectores.
En un aspecto de la divulgación, el procedimiento comprende transformar la célula con un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una PGM3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150 o una variante o fragmento catalíticamente activo de cualquiera de las mismas; y un gen heterólogo (p. ej., un vector) que codifica una XI. Los genes heterólogos pueden estar en forma de uno o más vectores.
En otro aspecto, es un vector que comprende un gen que codifica la PGM3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150 o una variante o fragmento funcional de la misma. En algún aspecto de las divulgaciones, el vector comprende, además, un gen que codifica una xilosa reductasa (XR), un gen que codifica una xilitol deshidrogenasa (XDH) y/o un gen que codifica una xilosa isomerasa (XI). El vector puede comprender, además, secuencias reguladoras para expresar los genes en una célula huésped de levadura Saccharomyces o Saccaromyces cerevisiae.
Los expertos en la técnica conocen muchos métodos para la modificación genética, incluyendo la transformación de células huésped de levadura, y pueden utilizarse para crear las presentes células recombinantes, algunas de las cuales se ejemplifican más adelante. Técnicas de ADN recombinante estándar y de clonación molecular, útiles para transformar células microbianas con una secuencia de ácido nucleico o gen deseado o manipular de otro modo la célula microbiana, se describen, p. ej., en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); y por Silhavy, T. J., Bennan, M. L. y Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995; y por Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience (1987). Métodos adicionales utilizados aquí se encuentran en Enzymology, Volumen 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Parte A, 2004, Christine Guthrie y Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, Calif.).
La sobre-expresión de un gen se puede lograr aumentando el número de copias del gen que codifica la enzima en la célula, p. ej., integrando copias adicionales del gen en el genoma de la célula, expresando el gen de un vector de expresión episomal multicopia o introduciendo un vector de expresión episomal que comprende múltiples copias del gen; regulando al alza el gen endógeno y similares. En un aspecto preferido de la divulgación, el gen se introduce en la célula microbiana mediante, p. ej., a través de transformación con uno o más vectores de expresión. Por ejemplo, para una célula huésped de levadura, el nivel de una enzima expresada de manera recombinante en la célula puede aumentarse clonando uno o más genes recombinantes en un plásmido multicopia de la manera descrita por Mumberg et al. (1995).
El gen puede sintetizarse o clonarse a partir de un organismo huésped en el que la secuencia de ADN correspondiente es endógena (véanse, p. ej., los Ejemplos 1-5). Los procedimientos de clonación estándares utilizados en ingeniería genética pueden utilizarse para reubicar una secuencia de ácido nucleico desde su ubicación natural a un sitio diferente en donde se reproducirá. Los procedimientos de clonación pueden implicar la escisión y el aislamiento de un fragmento de ADN deseado que comprende la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, la inserción del fragmento en una molécula de vector y la incorporación del vector recombinante en una célula huésped en la que se replicarán múltiples copias o clones de la secuencia de ADN. Una secuencia de ADN aislada puede manipularse de una diversidad de maneras para proporcionar la expresión del polipéptido de interés. La manipulación de la secuencia de ADN antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión y de la célula huésped.
Por ejemplo, para aumentar la probabilidad de que, p. ej., un gen de una enzima bacteriana se exprese en una célula de levadura, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia heteróloga puede adaptarse para optimizar su uso de codones al de la célula de levadura. La adaptabilidad de una enzima que codifica una secuencia de nucleótidos al uso de codones de la célula huésped puede expresarse como índice de adaptación de codones (CAI). El CAI se define en esta memoria como una medida de la adaptabilidad relativa del uso de codones de un gen hacia el uso de codones de genes altamente expresados. La adaptabilidad relativa (w) de cada uno de los codones es la relación entre el uso de cada uno de los codones al del codón más abundante para el mismo aminoácido. El CAI se define como la media geométrica de estos valores de adaptabilidad relativa. Se excluyen los codones no sinónimos y los codones de terminación (que dependen del código genético). Los valores de CAI varían de 0 a 1, indicando los valores más altos una proporción más alta de los codones más abundantes (véase Sharp y Li, 1987, Nucleic Acids Research 15; 1281-1295; véase también: Jansen et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31 (8):2242-51). Una secuencia de nucleótidos adaptada u "optimizada" tiene preferiblemente un CAI de al menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 o 0,7.
La secuencia de nucleótidos que se ha de introducir en el ADN de la célula huésped puede integrarse en vectores que comprenden la secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. La secuencia de control puede ser una secuencia de promotor apropiada, una secuencia de nucleótidos que es reconocida por una célula huésped para la expresión de la secuencia de nucleótidos. La secuencia de promotor contiene secuencias de control de la transcripción, que median en la expresión de la secuencia codificante. El promotor puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección, incluyendo promotores nativos, mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares homólogos o heterólogos a la célula huésped. El promotor puede ser un promotor débil o un promotor fuerte que sea constitutivo o esté regulado en el huésped a utilizar. Generalmente, se prefieren promotores constitutivos fuertes para la sobre-expresión de los genes. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los genes y construcciones de vectores de la presente invención en una célula huésped de levadura son promotores obtenidos, por ejemplo, de los genes para enolasa (ENO1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinasa (GAL1) de S. cerevisiae, alcohol deshidrogenasa 2 (ADH2) de S. cerevisiae, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (TDH1) de S. cerevisiae, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (TDH3) de S. cerevisiae, alcohol deshidrogenasa 1 (ADH1) de S. cerevisiae, 3-fosfoglicerato quinasa (PGK1) de S. cerevisiae o citocromo C (CYC1) de S. cerevisiae (Karhumaa et al, 2005), factor de elongación de la traducción 1 alfa (TEF1/TEF2) (Mumberg et al., 1995), PDC1 piruvato descarboxilasa (PDC1), piruvato quinasa (PYK1) y el promotor HXT7 constitutivo truncado (Hauf et al. Enzym Microb Technol (2000) 26:688-698.) Otros vectores y promotores adecuados para uso en la expresión de levaduras se describen adicionalmente en el documento EP A-73.657 expedido a Hitzeman, que se incorpora con ello como referencia. Promotores preferidos para sobre-expresar un gen que codifica una XK en una célula de levadura recombinante de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a promotores PGK1, TPI1, HXT7, TDH3, ADH2 y TEF2. Preferiblemente, el promotor para sobre-expresar un gen que codifica una XK de acuerdo con la invención es TPI1. Promotores para sobre-expresar los genes que codifican una XR, una XDH, una XI, una TAL, una TKL y una RPI en una célula de levadura recombinante de acuerdo con la invención se seleccionan preferiblemente por separado de los siguientes: PGK1, TDH3, TEF2, PDC1, HXT truncado, TPI1 y PYK1.
Los vectores arriba descritos pueden comprender un gen que codifica el polipéptido enzimático, un promotor y señales de parada de la transcripción y traducción, así como otras secuencias de ADN reguladoras o estructurales conocidas por una persona experta en la técnica. El vector puede ser cualquier vector o ácido nucleico (p.ej., un plásmido, virus, vector de integración o fragmento de integración), que puede ser convenientemente sometido a procedimientos recombinantes y que puede provocar la expresión del gen en la célula huésped de levadura. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que se ha de introducir el vector. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados y pueden contener cualquier medio para asegurar la auto-replicación.
Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el o los cromosomas en los que se ha integrado. El sistema de vector puede ser un solo vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos, que juntos contienen el ADN total que se ha de introducir en el genoma de la célula huésped, o un transposón. El vector también puede ser un vector de integración que comprende únicamente el gen o parte del gen a integrar. Para la integración, el vector puede depender de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés o cualquier otro elemento del vector para la integración estable del vector en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. Puede insertarse más de una copia de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés en la célula huésped para amplificar la expresión de la secuencia de ADN.
Opcionalmente, los vectores de la presente invención pueden contener uno o más marcadores seleccionables, que permiten una fácil selección de células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocidas o virus, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares. Vectores de expresión útiles para células de levadura incluyen, por ejemplo, el plásmido de 2 [mu] (micras) y derivados del mismo, los vectores Yip, YEp e YCp descritos por Gietz y Sugino (1988. "New yeast vectors constructed with in vitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites", Gene 74:527-534), los vectores descritos en Mumberg et al. (1995, supra), el vector YEplac-HXT (Karhumaa et al., 2005), el vector POT1 (Pat. de EE.UU. N° 4.931.373), el vector pJS037 descrito en Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996, los vectores pPICZ A, B o C (Invitrogen).
Para lograr la sobre-expresión de un gen endógeno, también se pueden utilizar métodos de reemplazo de promotor para intercambiar los elementos de control transcripcional endógeno del gen por otro promotor (véase, p. ej., Mnaimneh et al. (2004) Cell 118(1 ):31 -44). Pueden realizarse deleciones de elementos de control de ADN que evitan una alta expresión de un gen diana endógeno utilizando recombinación mitótica como se describe en Wach et al. ((1994) Yeast 10:1793-1808). Este método implica preparar un fragmento de ADN que contiene un marcador seleccionable entre regiones genómicas que puede ser tan cortas como de 20 pb y que se une a una secuencia de ADN diana. Este fragmento de ADN se puede preparar mediante amplificación por PCR del gen marcador seleccionable utilizando como cebadores oligonucleótidos que se hibridan con los extremos del gen marcador y que incluyen las regiones genómicas que pueden recombinarse con el genoma de la levadura. El fragmento de ADN lineal puede transformarse eficazmente en una célula y recombinarse en el genoma, dando como resultado el reemplazo del gen, incluyendo la deleción de la secuencia de ADN diana (como se describe en Methods in Enzymology, v194, pp 281-301 (1991)).
Para levaduras, tal como para Saccharomyces cerevisiae, las secuencias de ADN que rodean una secuencia codificante del gen diana se pueden identificar, p. ej., en la secuencia completa del genoma coordinado por Genome Project ID9518 de Genome Projects coordinado por NCBI (National Center for Biotechnology Information) con identificación de GOPID n° 13838. Ejemplos adicionales de secuencias genómicas de levadura incluyen las de Yarrowia lipolytica, GOPIC n° 13837 y de Candida albicans, que está incluida en GPID n° 10771, n° 10701 y n° 16373. Se han secuenciado y anotado completamente genomas adicionales y están disponibles públicamente para las siguientes cepas de levadura Candida glabrata CBS 138, Kluyveromyces lactis NRRL Y-1140, Pichia stipitis CBS 6054 y Schizosaccharomyces pombe 972h-, disponible en http://biocyc.org/.
Métodos de fermentación
En un aspecto, es un método para producir un producto de fermentación, que comprende poner en contacto la célula recombinante de uno cualquiera de los aspectos precedentes y aspecto de las divulgaciones con un medio que comprende una fuente de carbono que comprende xilosa y/o arabinosa bajo condiciones anaerobias, y recuperar o aislar el producto de fermentación del medio.
El producto de fermentación puede ser o comprender, por ejemplo, al menos uno de etanol, butanol, isobutanol, isopentanol, lactato, acetato de isoamilo, glicerol, sorbitol, manitol, xilitol, arabinitol; 3-hidroxibutirolactona; gas hidrógeno; ácido L-ascórbico, ácido 2,5-furano dicarboxílico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido aspártico, ácido glutárico, ácido glutámico, ácido itacónico, ácido levulínico; ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico u otro 1,4-diácido; un ácido graso, una molécula derivada de un ácido graso; un isoprenoide, una molécula derivada de isoprenoide; y un alcano.
Sin embargo, se contempla que también se pueden producir otros productos de fermentación utilizando los métodos de la presente invención. Preferiblemente, la fuente de carbono comprende xilosa y el producto de fermentación comprende etanol.
En algún aspecto de las divulgaciones, el medio, es decir, el medio de fermentación, es material de alimentación de un procedimiento de sacarificación celulósica y/o material de alimentación de un procedimiento de pretratamiento de hemicelulosa. Materiales de alimentación de este tipo incluyen, pero no se limitan a hidratos de carbono (p. ej., lignocelulosa, xilanos, celulosa, almidón, etc.), otros azúcares (p. ej., glucosa, xilosa, arabinosa, etc.) y otras composiciones. Composiciones de medios de fermentación adecuadas para el crecimiento de levaduras son bien conocidas en la técnica y existen diversos textos de referencia que proporcionan recetas para estos medios.
Típicamente, la fermentación tiene lugar bajo condiciones que se sabe que son adecuadas para generar el producto de fermentación. Condiciones de fermentación adecuadas para generar los productos de fermentación deseados son bien conocidas en la técnica y cualquier método adecuado encuentra uso en la presente invención. En algún aspecto de las divulgaciones, el procedimiento de fermentación se lleva a cabo en condiciones aerobias o microaerófilas (es decir, en los casos en los que la concentración de oxígeno es menor que la del aire), o anaerobias. En algún aspecto de las divulgaciones, la fermentación se realiza en condiciones anaerobias (es decir, sin oxígeno detectable), o menos de aproximadamente 5, aproximadamente 2,5 o aproximadamente 1 mmol/L/h de oxígeno. En ausencia de oxígeno, el NADH producido en la glicólisis no puede oxidarse por fosforilación oxidativa. Bajo condiciones anaerobias, la célula huésped puede utilizar piruvato o un derivado del mismo como aceptor de electrones e hidrógeno para generar NAD+.
El procedimiento de fermentación se realiza típicamente a una temperatura que es óptima para la célula fúngica recombinante. Por ejemplo, en algún aspecto de las divulgaciones, el procedimiento de fermentación se realiza a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 42 °C. Típicamente, el procedimiento se lleva a cabo a una temperatura que es menor que aproximadamente 38 °C, menor que aproximadamente 35 °C, menor que aproximadamente 33 °C o menor que aproximadamente 38 °C, pero al menos aproximadamente 20 °C, 22 °C o 25 °C. El Ejemplo 10 describe un ensayo ejemplar para evaluar el consumo de xilosa y/o la producción de etanol durante la fermentación de un medio de fermentación que contiene xilosa.
En algún aspecto de las divulgaciones, las células recombinantes de la presente invención se cultivan bajo condiciones de fermentación discontinua o continua. La fermentación por lotes clásica es un sistema cerrado, en donde la composición del medio se establece al comienzo de la fermentación y no está sujeta a alteraciones artificiales durante la fermentación. Una variación del sistema discontinuo es una fermentación por lotes alimentados, que también encuentra uso en la presente invención. En esta variación, el sustrato se añade en incrementos a medida que avanza la fermentación. Los sistemas de alimentación por lotes son útiles cuando es probable que la represión de catabolitos inhiba el metabolismo de las células y/o cuando es deseable tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. Las fermentaciones por lotes y por lotes alimentados son comunes y bien conocidas en la técnica. La fermentación continua es un sistema abierto en que una fermentación definida mantiene generalmente el cultivo a una densidad alta constante en que las células están principalmente en fase de crecimiento logarítmico. Los sistemas de fermentación continua se esfuerzan por mantener condiciones de crecimiento en estado estable. Los métodos para modular los nutrientes y los factores de crecimiento para los procedimientos de fermentación continua, así como las técnicas para modular los nutrientes y los factores de crecimiento para los procedimientos de fermentación continua, así como las técnicas para maximizar la velocidad de formación del producto, son bien conocidos en la técnica de la microbiología industrial.
Ejemplos
Ejemplo 1: Construcción de una cepa de S. cerevisiae modificada genéticamente que sobre-expresa tres de los genes en la ruta de la pentosa fosfato (TAL1 (transaldolasa), TKL1 (transcetolasa) y RKI1 (ribosa 5-fosfato cetilisomerasa)
Cepas, medios y técnicas genéticas
Para la subclonación se utilizó la cepa DH5a de Escherichia coli (Life Technologies, Rockville, MD, EE.UU.). Se cultivó E. coli en medio LB (Ausubel et al., 1995). Se utilizaron para la inoculación células de levadura de placas YPD recién estriadas (Ausubel et al., 1995). El ADN plasmídico se preparó con el kit GeneJETTM Plasmid Miniprep (Fermentas UAB, Vilnius, Lituania). La extracción de ADN en gel de agarosa se realizó con el kit de extracción en gel QIAquick® (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Se utilizaron cebadores de MWG-Biotech AG (Ebersberg, Alemania) y ADN Polimerasa de Pfu y dNTP de Fermentas (Vilnius, Lituania) para las reacciones de cadena de la polimerasa (PCR). La purificación del producto de PCR se realizó con el Kit de Secuenciación del Ciclo E.Z.N.A.® (Omega Bio-tek Inc., Doraville, GA, EE.UU.). La secuenciación fue realizada por MWG-Biotech AG (Ebersberg, Alemania). Se utilizaron endonucleasas de restricción, fosfatasa alcalina termosensible FastAP y ADN ligasa T4 de Fermentas (Vilnius, Lituania) para la manipulación del ADN. Las células de E. coli DH5a competentes se transformaron como se describe en otra parte (Inoue et al., 1990) y las células de E. coli transformadas se seleccionaron en placas LB (Ausubel et al., 1995) que contenían 100 mg/l de ampicilina (IBI Shelton Scientific Inc. , Shelton, CT, EE.UU.). Cepas de E. coli se cultivaron en medio LB que contenía 100 mg/l de ampicilina para amplificaciones de plásmido. Las cepas de levadura se transformaron con el método del acetato de litio (Gietz y Schiestl, 2007) y las cepas de levadura transformadas se seleccionaron en placas YPD con un pH ajustado a 7,5 que contenía 50 pg/ml de zeocina (Invitrogen, Groningen, Países Bajos).
Construcción de YIpTALTKL que contiene el gen transaldolasa (TAL1) de S. cerevisiae
El plásmido pB3 PGK TAL1 (Johansson y Hahn-Hagerdal, 2002) que contiene el gen transaldolasa (TAL1) de S. cerevisiae bajo el control del promotor PGK1 y el terminador GCY1 de S. cerevisiae se digirió con las enzimas de restricción Xcml y Ehel, y los extremos del fragmento resultante se hicieron romos mediante el uso de ADN polimerasa de T4 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) y el vector se volvió a ligar, dando como resultado YIpTAL. Las orientaciones y secuencias correctas de las inserciones se verificaron mediante análisis de restricción y secuenciación. Construcción de YIpTAL que contiene el gen transaldolasa (TAL1) y el gen transcetolasa (TKL1) de S. cerevisiae
El casete de ADN PGKp-TKL1-GCYt que contiene el gen transcetolasa (TKL1) de S. cerevisiae bajo el control del promotor de PGK1 y el terminador GCY1 de S. cerevisiae se amplificó por PCR teniendo como molde el plásmido pB3 PGK TKL1 (Johansson y Hahn-Hagerdal, 2002) y utilizando los cebadores FwdTKL y RevTKL identificados por GGT ACCGAGCTCTAACT GAT CT ATCCAAAACT G (SEQ ID NO: 1) y GGTACCGATCAGCATGCGATCGCTCGACATTTGATATAC (SEQ ID NO: 2),
que incluían el sitio de restricción Kpnl en los extremos del casete de ADN amplificado. El producto de PCR PGKp-TKL1-GCYt se digirió luego con la enzima de restricción Kpnl. El fragmento de ADN purificado resultante se insertó en el plásmido YlpTAL, que también se había escindido con la enzima de restricción KpnI y que se había desfosforilado. El plásmido resultante se denominó YlpTALTKL. Las orientaciones y secuencias correctas de las inserciones se verificaron mediante análisis de restricción y secuenciación.
Construcción de YlpTTR que contiene el gen de transaldolasa (TAL1). el gen de transcetolasa (TKL1) y el gen de ribosa 5-fosfato cetilisomerasa (RKI1) de S. cerevisiae
El casete de ADN PGKp-RKI1-GCYt que contiene el gen ribosa 5-fosfato cetol isomerasa (RKI1) de S. cerevisiae bajo el control del promotor de PGK1 y el terminador GCY1 de S. cerevisiae se amplificó por PCR teniendo como molde el plásmido pB3 PGK RKI1 (Johansson y Hahn-Hagerdal, 2002) y utilizando los cebadores FwdRKI y RevRKI identificados por 5'-CCGCGGGAGCTCTAACTGATCTATCCAAAACTG-3' (SEQ ID NO: 3) y 5'-CCGCGGGATCAGCATGCGATCGCTCGACATTTGATATAC-3' (SEQ ID NO: 4) que incluían el sitio de restricción SacIl en los extremos del casete de ADN amplificado. El producto de PCR PGKp-RKI1-GCYt se digirió luego con la enzima de restricción SacIl. El fragmento de ADN purificado resultante se insertó en el plásmido YlpTALTKL, que también se había escindido con la enzima de restricción KpnI y que se había desfosforilado. El plásmido resultante se denominó YlpTTR. Las orientaciones y secuencias correctas de las inserciones se verificaron mediante análisis de restricción y secuenciación.
Construcción de C5LTe1001 que contiene YlpTTR
YlpTTR se escindió con Spel dentro del gen RKI1 y se transformó en la cepa C5LTe1000. Esto resultó en la cepa C5LTe1001. La cepa C5LTe1000 se depositó de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest el 4 de noviembre de 2014 en DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Alemania, bajo el número de acceso de DSMZ DSM 29597.
Ejemplo 2: Cepas, Medios y Técnicas Genéticas
Para la subclonación se utilizó la cepa NEB 5-alfa de Escherichia coli (New England BioLabs, Ipswich, MA, EE.UU.). Se cultivó E. coli en medio LB (Ausubel et al., 1995). Se utilizaron para la inoculación células de levadura de placas YPD recién estriadas (Ausubel et al., 1995). El ADN plasmídico se preparó con el kit GeneJETTM Plasmid Miniprep (Fermentas UAB, Vilnius, Lituania). La extracción de ADN en gel de agarosa se realizó con el kit de extracción en gel QIAquick® (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Se utilizaron cebadores de Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemania) y ADN Polimerasa de alta fidelidad Phusion Hot Start II y dNTP de Fermentas (Vilnius, Lituania) para las reacciones de cadena de la polimerasa (PCR). La purificación del producto de PCR se realizó con el Kit de Secuenciación del Ciclo E.Z.N.A.® (Omega Bio-tek Inc., Doraville, GA, EE.UU.). La secuenciación fue realizada por Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemania). Se utilizaron endonucleasas de restricción de Fermentas (Vilnius, Lituania) para la manipulación del ADN. Las células de E. coli competentes se transformaron como se describe en otra parte (Inoue et al., 1990) y las células de E. coli transformadas se seleccionaron en placas LB (Ausubel et al., 1995) que contenían 100 mg/l de ampicilina (IBI Shelton Scientific Inc. , Shelton, CT, EE.UU.). Cepas de E. coli se cultivaron en medio LB que contenía 100 mg/l de ampicilina para amplificaciones de plásmido. Las cepas de levadura se transformaron con el método del acetato de litio (Gietz y Schiestl, 2007) y las cepas de levadura transformadas se seleccionaron en placas base de nitrógeno de levadura (YNB) (base de nitrógeno de levadura Difco de 6,7 g/l sin aminoácidos; Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, EE.UU.) complementado con 40 g/l de xilosa y tamponado a pH 5,5 con 10,21 g/l de hidrógeno-ftalato de potasio.
Ejemplo 3: Construcción de una cepa de S. cerevisiae que sobre-expresa tres de los genes en la ruta de la pentosa fosfato y que expresa un gen de xilulosa quinasa de Spathaspora passalidarum, un gen de xilitol deshidrogenasa (x Dh) de Scheffersomyces stipitis y un gen de xilosa reductasa de Scheffersomyces stipitis mutada (XR)(N272D))
Cepas, medios y técnicas genéticas
Se utilizaron las cepas, los medios y las técnicas genéticas descritos en el Ejemplo 2.
Construcción del gen sintético de xilulosa quinasa que codifica xilulosa quinasa de Spathaspora passalidarum basado en el Código de Acceso NCBI XP 007373112 bajo el control del promotor TPI1 y el terminador PGK1 de S. cerevisiae
El gen completo de la xilulosa quinasa de Spathaspora passalidarum (XKsp) fue sintetizado y ensamblado por Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemania). El uso de codones en la secuencia se optimizó basándose en la tabla de uso de codones de levadura de la base de datos de uso de codones Kazusa. El promotor TPI1 de S. cerevisiae y el terminador PGK1 de S. cerevisiae también se incluyeron en la construcción sintética; el promotor TPI1 antes del codón de inicio ATG y el terminador PGK1 después del codón de parada. La secuencia de nucleótidos del promotor TPI1, el terminador XKsp y PGK1 se identifica como SEQ ID NO: 5, que muestra la secuencia de ADN sintetizada. La secuencia de aminoácidos correspondiente de la región codificante de XKsp se identifica en SEQ ID NO: 6. El plásmido que alberga se denominó pC5e0022.
Construcción de pC5e0049 que contiene un gen de xilulosa quinasa de Spathaspora passalidarum, un gen de xilitol deshidrogenasa de Scheffersomyces stipitis (XDH) y un gen mutado de xilosa reductasa de Scheffersomyces stipitis (XR (N272D))
El casete de ADN TPI1p-XKsp-PGK1t se amplificó por PCR teniendo como molde el plásmido pC5e0022 y utilizando los siguientes cebadores.
TPI1p_fwd (SEQ ID NO: 7):
5'-TCTTC CACAC CTGCA GTATA TCTAG GAACC CATCA G-3'
reverse-PGK1t (SEQ ID NO: 8):
5'-ATCAG TTAGA CTGCA GGAAC ATAGA AATAT CGAAT GGGAA-3'
El fragmento de ADN purificado resultante se insertó en el plásmido YlpDR7 (Runquist et al. 2010 ), que contenía un gen de xilitol deshidrogenasa (XDH) de Scheffersomyces stipitis bajo el control del promotor PGK1 y el terminador PGK1 de S. cerevisiae y una xilosa reductasa de Scheffersomyces stipitis mutada (XR(N272D)) bajo el control del promotor TDH3 y el terminador ADH1 de S. cerevisiae. YlpDR7, que había sido escindido con la enzima de restricción PstI y el fragmento de ADN, se insertó mediante clonación In-Fusion (Clontech, California, CA, EE.UU.). El plásmido resultante se denominó pC5e0049. Las orientaciones y secuencias correctas de las inserciones se verificaron mediante análisis de restricción y secuenciación.
Construcción de C5LTe1042 que contiene YlpTTR y pC5e0049
El plásmido pC5e0049 se digirió con la enzima de restricción EcoRV dentro del gen URA3 y después de ello se transformó en la cepa C5LTe1001. Esto resultó en la cepa C5LTe1042.
Ejemplo 4: Construcción de una cepa de S. cerevisiae que sobre-expresa tres de los genes en la ruta de la pentosa fosfato y un gen de xilulosa quinasa (XK) y que expresa un gen de xilitol deshidrogenasa (XDH) de Scheffersomyces stipitis y un gen mutado de xilosa reductasa de Scheffersomyces stipitis (XR(N272D))
Cepas, medios y técnicas genéticas
Se utilizaron las cepas, los medios y las técnicas genéticas descritos en el Ejemplo 2.
Construcción de pC5e0024 que contiene un gen de xilulosa quinasa de S. cerevisiae, un gen de xilitol deshidrogenasa (XDH) de Scheffersomyces stipitis y un gen de xilosa reductasa de Scheffersomyces stipitis (XR(N272D))
El promotor TPI1 de S. cerevisiae (TPI1 p) se amplificó por PCR teniendo como molde el plásmido pC5e0022 y utilizando los siguientes cebadores.
TPI1p_fwd (SEQ ID NO: 9):
5 -TCTTC CACAC CTGCA GTATA TCTAG GAACC CATCA G-3'
R_TPI1p (SEQ ID NO: 10):
5 -CTGTC TCTGA ATTAC TGAAC ACAAC ATTTT TAGTT TATGT ATGTG TTT-3'
El terminador PGK1 de S. cerevisiae (PGK1t) se amplificó por PCR teniendo como molde el plásmido pC5e0022 y utilizando los siguientes cebadores.
fwdS_PGK1t (SEQ ID NO: 11):
5'-GCGAACTGGAAAAGACTCTCATCTAAAGATCTCCCATGTCTCTACTGG-3'
reverse_PGK1t (SEQ ID NO: 12):
5'-ATCAGTTAGACTGCAGGAACATAGAAATATCGAATGGGAA-3'
El gen de xilulosa quinasa de S. cerevisiae (Xkcere; SEQ ID NO: 31), que codifica XK de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 32) se amplificó por PCR teniendo como molde el plásmido YlpXK (Lonn et al., 2003) y utilizando los siguientes cebadores
XKcere_fwd (SEQ ID NO: 13):
5'-AAACACATACATAAACTAAAAATGTTGTGTTCAGTAATTCAGAGACAG-3'
XKcere_rev (SEQ ID NO: 14):
5'-CCAGTAGAGACATGGGAGATCTTTAGATGAGAGTCTTTTCCAGTTCGC-3'
El casete de ADN TPI1p-XKcere-PGK1t se amplificó mediante PCR por PCR de extensión por solapamiento teniendo como molde los tres fragmentos de ADN purificados TPI1 p, PGK1t y XKcere utilizando los siguientes cebadores TPI1p_fwd (SEQ ID NO: 15):
5'-TCTTCCACACCTGCAGTATATCTAGGAACCCATCAG-3'
reverse_PGK1t (SEQ ID NO: 16):
5'-ATCAGTTAGACTGCAGGAACATAGAAATATCGAATGGGAA-3'
El fragmento de ADN purificado resultante se insertó en el plásmido YlpDR7 (Runquist et al. 2010), que había sido escindido con la enzima de restricción Pstl. El fragmento de ADN se insertó mediante clonación In-Fusion (Clontech, California, CA, EE.UU.). El plásmido resultante se denominó pC5e0024. Las orientaciones y secuencias correctas de las inserciones se verificaron mediante análisis de restricción y secuenciación.
Construcción de C5LTe1035 que contiene YlpTTR y pC5e0024
El plásmido pC5e0024 se escindió con la enzima de restricción EcoRV dentro del gen URA3 y después de ello se transformó en la cepa C5LTe1001. Esto resultó en la cepa C5LTe1035.
Ejemplo 5: Construcción de una cepa de S. cerevisiae que sobre-expresa tres de los genes en la ruta de la pentosa fosfato y que expresa un gen de xilulosa quinasa (XK) de Escherichia coli, un gen de xilitol deshidrogenasa (XDH) de Scheffersomyces stipitis y un gen mutado de xilosa reductasa de Scheffersomyces stipitis (XR)(N272D))
Cepas, medios y técnicas genéticas
Se utilizaron las cepas, los medios y las técnicas genéticas descritos en el Ejemplo 2.
Construcción del gen sintético de xilulosa quinasa que codifica xilulosa quinasa de Escherichia coli basado en el Código de Acceso NCBI YP 001460359 bajo el control del promotor TPI1 y el terminador PGK1 de S. cerevisiae
El gen completo de xilulosa quinasa de E. coli (XKcoli) fue sintetizado y ensamblado por Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemania). El uso de codones en la secuencia se optimizó basándose en la tabla de uso de codones de levadura de la base de datos de uso de codones Kazusa. El promotor TPI1 de S. cerevisiae y el terminador PGK1 de S. cerevisiae también se incluyeron en la construcción sintética; el promotor TPI1 antes del codón de inicio ATG y el terminador PGK1 después del codón de parada. La secuencia de nucleótidos del promotor TPI1, el terminador XKcoli y PGK1 se identifica como SEQ ID NO: 17, que muestra la secuencia de ADN sintetizada. La secuencia de aminoácidos correspondiente de la región codificante de XKcoli se identifica en SEQ ID NO: 18. El plásmido que alberga se denominó pC5e0012.
Construcción de pC5e0046 que contiene un gen de xilulosa quinasa de E. coli, un gen de xilitol deshidrogenasa (XDH) de Scheffersomyces stipitis y un gen mutado de xilosa reductasa de Scheffersomyces stipitis (XR(N272D))
El casete de ADN TPI1p-XKcoli-PGK1t se amplificó por PCR teniendo como molde el plásmido pC5e0012 y utilizando los siguientes cebadores.
TPI1p_fwd (SEQ ID NO: 19):
5'-TCTTCCACACCTGCAGTATATCTAGGAACCCATCAG-3'
reverse-PGK1t (SEQ ID NO: 20):
5'-ATCAGTTAGACTGCAGGAACATAGAAATATCGAATGGGAA-3'.
El fragmento de ADN purificado resultante se insertó en el plásmido YlpDR7 (Runquist et al. 2010 ), que contenía un gen de xilitol deshidrogenasa (XDH) de Scheffersomyces stipitis bajo el control del promotor PGK1 y el terminador PGK1 de S. cerevisiae y una xilosa reductasa de Scheffersomyces stipitis mutada (XR(N272D)) bajo el control del promotor TDH3 y el terminador ADH1 de S. cerevisiae. YlpDR7, que había sido escindido con la enzima de restricción PstI y el fragmento de ADN, se insertó mediante clonación In-Fusion (Clontech, California, CA, EE.UU.). El plásmido resultante se denominó pC5e0046. Las orientaciones y secuencias correctas de las inserciones se verificaron mediante análisis de restricción y secuenciación.
Construcción de C5LTe1040 que contiene YlpTTR y pC5e0046
El plásmido pC5e0046 se digirió con la enzima de restricción EcoRV dentro del gen URA3 y después de ello se transformó en la cepa C5LTe1001. Esto resultó en la cepa C5LTe1040.
Ejemplo 6: Construcción de una cepa de S. cerevisiae que sobre-expresa tres de los genes en la ruta de la pentosa fosfato y que expresa un gen de xilulosa quinasa (XK) de Kluyveromyces marxianus, un gen de xilitol deshidrogenasa (XDH) de Scheffersomyces stipitis y un gen mutado de xilosa reductasa de Scheffersomyces stipitis (XR)(N272D))
Cepas, medios y técnicas genéticas
Se utilizaron las cepas, los medios y las técnicas genéticas descritos en el Ejemplo 2.
Construcción del gen sintético de xilulosa quinasa que codifica la xilulosa quinasa de Kluyveromyces marxianus basado en el Código de Acceso de NCBI ADW23548
El gen completo de xilulosa quinasa de Kluyveromyces marxianus (XKmarx) fue sintetizado y ensamblado por Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemania). El uso de codones en la secuencia se optimizó basándose en la tabla de uso de codones de levadura de la base de datos de uso de codones Kazusa. La secuencia de nucleótidos de XKmarx se identifica como SEQ ID NO: 21, que muestra la secuencia de ADN sintetizada. La secuencia de aminoácidos correspondiente de la región codificante de XKmarx se identifica en SEQ ID NO: 22. El plásmido que alberga se denominó pC5e0043.
Construcción de pC5e0051 que contiene un gen de xilulosa quinasa de Kluyveromyces marxianus, un gen de xilitol deshidrogenasa (XDH) de Scheffersomyces stipitis y un gen mutado de xilosa reductasa de Scheffersomyces stipitis (XR(N272D))
El promotor TPI1p de S. cerevisiae (TPI1p) se amplificó por PCR teniendo como molde el plásmido pC5e0022 y utilizando los siguientes cebadores.
TPI1p_fwd (SEQ ID NO: 23):
5'-TCTTCCACACCTGCAGTATATCTAGGAACCCATCAG-3'
Rev_TPI1p (SEQ ID NO: 24):
5'-GCCTAAGTAATATGGAGTCGACATTTTTAGTTTATGTATGTGTTT-3'.
El terminador PGK1 de S. cerevisiae (PGK1t) se amplificó por PCR teniendo como molde el plásmido pC5e0022 y utilizando los siguientes cebadores.
PGK1t_forS (SEQ ID NO: 25):
5'-CTTTAGCACAATCTCAGGGTCAATAAAGATCTCCCATGTCTCTACTGG-3'
reverse_PGK1t (SEQ ID NO: 26):
5'-ATCAGTTAGACTGCAGGAACATAGAAATATCGAATGGGAA-3'
El gen de quinasa de Kluyveromyces marxianus (XKmarx) se amplificó por PCR teniendo como molde el plásmido pC5e0043 y utilizando los siguientes cebadores
XKmarx_fwd (SEQ ID NO: 27):
5'-AAACACATACATAAACTAAAAATGTCGACTCCATATTACTTAGGC-3'
XKmarx_rev (SEQ ID NO: 28):
5'-CCAGTAGAGACATGGGAGATCTTTATTGACCCTGAGATTGTGCTAAAG-3'
El casete de ADN TPI1p-XKmarx-PGK1t se amplificó mediante PCR por PCR de extensión por solapamiento teniendo como molde los tres fragmentos de ADN purificados TPI1p, PGK1t y XKmarx utilizando los siguientes cebadores: TPI1p_fwd (SEQ ID NO: 29):
5'-TCTTCCACACCTGCAGTATATCTAGGAACCCATCAG-3'
reverse_PGK1t (SEQ ID NO: 30):
5'-ATCAGTTAGACTGCAGGAACATAGAAATATCGAATGGGAA-3'
El fragmento de ADN purificado resultante se insertó en el plásmido YlpDR7 (Runquist et al. 2010), que había sido escindido con la enzima de restricción Pstl. El fragmento de ADN se insertó mediante clonación In-Fusion (Clontech, California, CA, EE.UU.). El plásmido resultante se denominó pC5e0051. Las orientaciones y secuencias correctas de las inserciones se verificaron mediante análisis de restricción y secuenciación.
Construcción de C5LTe1043 que contiene YlpTTR y pC5e0051
El plásmido pC5e0051 se digirió con la enzima de restricción EcoRV dentro del gen URA3 y después de ello se transformó en la cepa C5LTe1001. Esto resultó en la cepa C5LTe1043.
Ejemplo 7: Ensayos de actividad enzimática
Se prepararon extractos celulares para ensayos de actividad a partir de cultivos discontinuos aerobios de crecimiento exponencial. Las células se recogieron por centrifugación, se lavaron con agua estéril, se resuspendieron en una cantidad apropiada de reactivo Y-PER (Pierce; Rockford, III., EE.UU.) y se procesaron de acuerdo con las instrucciones. Las concentraciones de proteínas se determinaron con el Ensayo de Proteínas Bradford (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) frente a un patrón de albúmina de suero bovino. Se midieron la xilulosa quinasa (XK) y la xilitol deshidrogenasa (XDH) como se describe por Shamanna y Sanderson (1979). La actividad de XK se determinó en dos pasos. Primero, se determinó la actividad de XDH en ausencia de ATP, y luego se determinó la suma de las actividades de XK y XDH en presencia de ATP, siendo la actividad de XK la diferencia. Todas las mediciones de la actividad enzimática se realizaron a 30 °C. Las actividades específicas se expresan como unidades por miligramo de proteína. Una unidad de actividad enzimática se define como 1 pmol de sustrato convertido por minuto.
Como se muestra en la Tabla 5, las cepas C5LTe1042, C5LTe1048 y C5LT1208 tenían mayor actividad XK que sus correspondientes cepas de control. Todas las cepas con un gen XK heterólogo tenían una mayor actividad de XK en comparación con la cepa C5LTe1000 de tipo salvaje.
T l A ivi XK n n r i .
Figure imgf000031_0001
Ejemplo 8: Crecimiento aerobio en xilosa
Las células se cultivaron en medio YPD (extracto de levadura, peptona y 20 g/l de glucosa) durante la noche y se inocularon en medio mineral con xilosa como única fuente de carbono (13,4 g/l de base nitrogenada de levadura y 50 g/l de xilosa, tamponada con 10,2 g/l de hidrógeno-ftalato de potasio a pH 5,5). La DO de partida a 620 nm fue de alrededor de 0,1. El crecimiento se midió mediante el aumento de la DO a 620 nm. La tasa máxima de crecimiento específico se calculó a partir de intervalos de 8 a 30 horas, y fueron 0,16 h-1 para C5LTe1035 y 0,19 h-1 para C5LTe1042. Véase la Fig. 1, que muestra las curvas del crecimiento aerobio en xilosa para C5LTe1035 y C5LTe1042.
En conclusión, las cepas C5LTe1042, C5LTe1048 y C5LT1208 crecieron más que sus correspondientes cepas de control.
Ejemplo 9: Crecimiento anaerobio en xilosa
Se analizaron cepas de levadura para determinar el crecimiento anaerobio en xilosa en cultivos de levadura en microplacas de 96 pocillos. Antes de los experimentos, la levadura se cultivó en precultivos semi-aerobios en medio YNB con 50 g/l de xilosa, en microplacas, durante la noche. Para medir el crecimiento anaerobio, las células se inocularon en 200 pl del mismo medio en el que se había añadido una solución de ergosterol y Tween80 a una concentración final de 0,03 y 1,2 g/l, respectivamente. Se añadieron 50 pl de aceite mineral en la parte superior de cada uno de los pocillos para mantener el cultivo anaerobio. Se añadieron 20 pl de células pre-cultivadas. Se siguió el crecimiento en Multiskan FC (Thermo Scientific) a 30 °C y se midió el crecimiento como aumento de la DO (620 nm).
En conclusión, las cepas con XK de K. marxianus o XK de S. passalidarium crecen más rápido y más bajo condiciones anaerobias que la cepa de control con XK de S. cerevisiae. Véase la Fig.2, que muestra las curvas sobre el crecimiento anaerobio de C5LTe1042 en comparación con la cepa de control C5LTe1035, Fig.3, que muestra las curvas sobre el crecimiento anaerobio de C5LTe1043 en comparación con la cepa de control C5LTe1035, y la Fig.4, que muestra las curvas sobre el crecimiento anaerobio de C5LTe1040 en comparación con la cepa de control C5LTe1035.
Ejemplo 10: Fermentación anaerobia en xilosa
Las células se cultivaron previamente en medio mineral con glucosa como fuente de carbono (YNB 6,7 g/l y 20 g/l de glucosa). A continuación, las células se inocularon en fermentadores (Applikon) a una concentración de biomasa de partida de aproximadamente 0,15 g/l de peso seco celular. La mezcladura se fijó a 200 rpm y la salida de gas se cerró con una esclusa de agua. El medio de fermentación consistía en YNB (6,7 g/l) con 50 g/l de xilosa y 20 g/l de glucosa, complementado con Tween80 (1,2 g/l) y ergosterol (0,03 g/l). El pH se controló a 5,5 con KOH.
Las concentraciones de glucosa, xilosa, etanol, glicerol y xilitol se determinaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (Waters, Milford, MA, EE.UU.). Los compuestos se separaron con una columna basada en copolímero Shodex SUGAR SP0810 Pb2+ (Showa Denko America, NY, EE.UU.) precedida por una columna de protección Micro-Guard Carbo-C (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). La separación se realizó a 80 °C, con H2O a un caudal de 0,6 ml min-1 como fase móvil. Los compuestos se cuantificaron mediante detección del índice de refracción (Waters). Se realizó una curva de calibración de siete puntos para cada uno de los compuestos para calcular las concentraciones. Véase la Fig. 5, que muestra la fermentación de xilosa por parte de las cepas C5LTe1035 (línea discontinua) y C5LTe1042 (línea continua). Glucosa: círculos, Xilosa: cuadrados, Xilitol: estrellas, Biomasa: línea. Véase también la Fig. 6, que muestra la fermentación de xilosa por parte de las cepas C5LTe1036 (línea discontinua) y C5LTe1048 (línea continua). Glucosa: círculos, Xilosa: cuadrados, Xilitol: estrellas, Biomasa: línea. Y véase también la Fig. 7, que muestra la fermentación de xilosa por parte de las cepas C5LTe1204 (línea discontinua) y C5LTe1208 (línea continua). Glucosa: círculos, Xilosa: cuadrados, Xilitol: estrellas, Biomasa: línea.
Tabla 6 Sumario del consumo de xilosa la producción de etanol en la fermentación anaerobia de xilosa de 50 /l de
Figure imgf000032_0001
En conclusión, estos datos demuestran que las cepas C5LTe1042, C5LTe1048 y C5LT1208 que llevan XK de S. passalidarium consumieron más xilosa y produjeron más etanol que sus correspondientes cepas de control C5LTe1035, C5LTe1036 y C5LT1204, respectivamente.
Ejemplo 11: Construcción de una cepa de S. cerevisiae que sobre-expresa tres de los genes en la ruta de la pentosa fosfato y un gen de xilulosa quinasa (XK) y que expresa un gen de xilitol deshidrogenasa (XDH) de Scheffersomyces stipitis y un gen mutado de xilosa reductasa de Scheffersomyces stipitis (XR(N272D))
Cepas, medios y técnicas genéticas
Se utilizaron para la inoculación células de levadura de placas YPD recién estriadas (Ausubel et al., 1995). El ADN plasmídico se preparó con el kit GeneJETTM Plasmid Miniprep (Fermentas UAB, Vilnius, Lituania). La extracción de ADN en gel de agarosa se realizó con el kit de extracción en gel QIAquick® (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Se utilizaron cebadores de Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemania) y ADN Polimerasa de alta fidelidad Phusion Hot Start II y dNTP de Fermentas (Vilnius, Lituania) para las reacciones de cadena de la polimerasa (PCR). La purificación del producto de PCR se realizó con el Kit de Secuenciación del Ciclo E.Z.N.A.® (Omega Bio-tek Inc., Doraville, GA, EE.UU.). La secuenciación fue realizada por Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemania). Se utilizaron endonucleasas de restricción de Fermentas (Vilnius, Lituania) para la manipulación del ADN. Células de E. coli competentes se transformaron como se describe en otra parte (Inoue et al., 1990) y las células de E. coli transformadas se seleccionaron en placas LB (Ausubel et al., 1995) que contenían 100 mg/l de ampicilina (IBI Shelton Scientific Inc., Shelton, CT, EE.UU.). Cepas de E. coli se cultivaron en medio LB que contenía 100 mg/l de ampicilina para amplificaciones de plásmido. Las cepas de levadura se transformaron con el método del acetato de litio (Gietz et al., 2007) y las cepas de levadura transformadas se seleccionaron en placas base de nitrógeno de levadura (YNB) (base de nitrógeno de levadura Difco de 6,7 g/l sin aminoácidos; Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, EE.UU.) complementado con 40 g/l de xilosa y tamponado a pH 5,5 con 10,21 g/l de hidrógeno-ftalato de potasio.
Construcción de C5LTe1201 que contiene YlpTTR
YlpTTR se escindió con Spel dentro del gen RKI1 y se transformó en la cepa TMB 3000, una cepa robusta de Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae (Lindén et al., 1992). Esto resultó en la cepa \ C5LTe1201.
Construcción de C5LTe1202 que contiene YlpTTR y pC5e0024
El plásmido pC5e0024 se escindió con la enzima de restricción EcoRV dentro del gen URA3 y después de ello se transformó en la cepa C5LTe1201. Esto resultó en la cepa C5LTe1202.
Ejemplo 12: Preparación del plásmido pC50042 y C5LTe1212 transformante
Generación de fragmentos
YME2-PGK1t fue sintetizado y ensamblado por Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemania) y el plásmido que lo alberga se denominó pEX-A1-YME2. El fragmento YME2-PGK1t se generó mediante PCR utilizando el plásmido pEX-A1-YME2 como molde y los siguientes cebadores (Eurofins MWG Operon):
5'-GATCCCCGGGCTGCAATGTTGCCCATTTCTGGACCTT-3' (SEQ ID NO: 45)
5'-CGCTGCAGGTCGACGTGTTACATGCGTACACGCGTCT-3' (SEQ ID NO: 46)
El vector pUG6-HXT7’p se generó mediante PCR utilizando el plásmido pUG6-HXT-PGM2 (documento WO2010/059095 A1) como molde y los siguientes cebadores (Eurofins m W g Operon):
5'-CGTCGACCTGCAGCGTAC -3' (SEQ ID NO: 47)
5'-TGCAGCCCGGGGATCCTTTTT-3' (SEQ ID NO: 48)
Los tres productos de PCR se purificaron utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen, Venlo, Países Bajos) y se determinó la concentración de ADN.
SEQ ID NO: 49 muestra la secuencia de ácido nucleico para el gen de tolerancia YME2 optimizado en codones, mientras que la SEQ ID NO: 50 muestra la secuencia de aminoácidos codificada.
Clonación In-Fusion y transformación de E.coli
El fragmento YME2-PGK1t y el vector pUG6-HXT7’p se introdujeron en células competentes NEB5a de E. coli (New England Biolabs, Ipswich Ma , EE.UU.) utilizando el kit de clonación In-Fusion HD (Clontech, Mountain View CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones de procedimiento del fabricante. Los transformantes se seleccionaron en placas de agar LB que contenían 100 gg/mL de ampicilina y se incubaron durante la noche.
Se seleccionaron al azar cuatro colonias y se cultivaron durante la noche en LB que contenía 100 gg/mL de ampicilina. El ADN plasmídico se preparó utilizando el kit GeneJET Plasmid MiniPrep (Thermo Scientific, Walthman MA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante y se determinó la concentración.
El ADN plasmídico se digirió con las enzimas de restricción Xhol y Smal (Thermo Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante. Todos los clones evaluados que contenían el plásmido YME2 mostraron los fragmentos de tamaño esperado (1904 y 3105 pb) y uno de ellos fue elegido para ser secuenciado (Eurofins MWG Operon) utilizando los siguientes cebadores:
5'-CCTGCGTGTTCTTCTGAGGTTC-3' (SEQ ID NO: 21)
5'-ATATTGTCGTTAGAACGCGG-3' (SEQ ID NO: 22)
La secuencia obtenida fue la predicha cuando se utilizaron herramientas de clonación in silico y el plásmido se denominó pC5e0042.
Integración genómica del plásmido linearizado pC50042 en C5LTe1202
Se linearizaron 5 gg de plásmido con Bmrl (New England Biolabs) siguiendo el procedimiento de instrucciones del fabricante y se mantuvieron en hielo hasta su uso en el sistema de transformación.
La cepa C5LTe1202 se transformó utilizando un método basado en acetato de litio (Gietz y Schiestl, 2007) y se utilizaron 20 gL de pC50042 linearizado en el sistema de transformación. Las placas de agar YPD complementadas con 20 g/L de glucosa y 500 mg/L de geneticina se incubaron aeróbicamente a 30 °C y se seleccionó el transformante C5LTe1212 después de 2 días.
Ejemplo 13: Toxicidad del ácido fórmico en levaduras que crecen sobre xilosa
El efecto inhibidor de los ácidos acético y fórmico sobre las células que crecen sobre xilosa se demostró inicialmente con la cepa C5LTe1202.
Medio mineral complementado con 110 g/L de xilosa, tampón ftalato de potasio 50 mM y que contiene las concentraciones (en g/L) de inhibidores individuales indicados en la Fig. 9. Se siguió el crecimiento anaerobio en Multiskan FC (Thermo Scientific) a 30 °C y se midió el crecimiento como incremento de la DO (620 nm). El incremento de DO después de 60 horas de cultivo se eligió para estimar la tolerancia a inhibidores lignocelulósicos simples, ya que no se puede observar un crecimiento exponencial cuando se utiliza una alta concentración inicial de xilosa. Ejemplo 14: Fermentación en presencia de ácido acético
Se utilizaron células cultivadas en condiciones aerobias durante la noche en medio YNB complementado con 20 g/L de glucosa para inocular un matraz de suero que contenía 30 mL de medio YNB complementado con glucosa (20 g/L) y xilosa (50 g/L) como fuente de carbono y ácido acético (8 g/L) a una concentración inicial de 1 g de peso seco celular/L.
Las concentraciones de glucosa, xilosa, etanol, glicerol, xilitol y ácido acético se determinaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (Waters, Milford, MA, EE.UU.). Los compuestos se separaron con una columna basada en copolímero Shodex SUGAR SP0810 Pb2+ (Showa Denko America, NY, EE.UU.) o una columna Rezex H+ precedida por una columna de protección Micro-Guard Carbo-C (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). La separación se realizó a 80 °C, con H2O a un caudal de 0,6 ml min-1 como fase móvil. Los compuestos se cuantificaron mediante detección del índice de refracción (Waters). Se realizó una curva de calibración de siete puntos para cada uno de los compuestos para calcular las concentraciones.
Los resultados se presentan gráficamente en la Fig. 10, la Fig. 11 y la Fig. 12. En conclusión, se consumió más xilosa y se produjo más etanol en la cepa C5LTe1212 que expresa el gen YME2.
Ejemplo 15: Características de fermentación y crecimiento en presencia de ácido fórmico
Se utilizaron células cultivadas en condiciones aerobias durante la noche en medio YNB complementado con 20 g/L de glucosa para inocular un matraz de suero que contenía 30 mL de medio YNB complementado con glucosa (20 g/L) y xilosa (50 g/L) como fuente de carbono y ácido fórmico (4,5 g/L) a una concentración inicial de 1 g de CDW/L. Se analizaron glucosa, xilosa, etanol, xilitol, glicerol y acetato utilizando HPLC (Waters) utilizando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 7.
Los resultados se muestran gráficamente en la Fig. 13, la Fig. 14 y la Fig. 15. En conclusión, se consumió más xilosa y se produjo más etanol en la cepa C5LTe1212 que expresa el gen YME2.
En otro experimento de tolerancia, se utilizaron células cultivadas durante la noche en medio YNB complementado con 50 g/L de xilosa para inocular una placa de microtitulación que contenía medio YNB complementado con 110 g/L de xilosa como fuente de carbono y 4,5 g/L de ácido fórmico. La Fig. 16 muestra una representación gráfica de las características de crecimiento anaerobio (medidas como cambio en la DO a 620 nm) de las cepas C5LTe1202 (curva superior) y C5LTe1212 (curva inferior).
Para concluir, la sobre-expresión del gen YME2 mejora claramente la tolerancia tanto al ácido fórmico como al ácido acético. La fermentación de xilosa en presencia de ácido fórmico o acético mejoró en levaduras que sobre-expresan YME2. Específicamente, el consumo de xilosa y la producción de etanol aumentaron en un 13 % y un 12 %, respectivamente, en presencia de ácido acético, y en un 7 % y 12 %, respectivamente, en presencia de ácido fórmico.
El ácido fórmico es común en los hidrolizados lignocelulósicos y contribuye en gran medida a la toxicidad de hidrolizados de este tipo.
Ejemplo 16: Construcción y selección de cepas MC
Para este ejemplo, se testaron determinados genes de S. cerevisiae que codifican enzimas en las rutas principales del metabolismo central.
La cepa de levadura C5LTe1101 se construyó transformando la cepa de levadura TMB 3043 (Karhumaa et al. 2005) en su locus ura3 con un fragmento de ADN que contiene el gen URA3, TDH3p-XYL1(N272D)-ADH1t y PGK1p-XYL2-PGK1t. La selección se realizó en placas de YNB (base nitrogenada de levadura 6,7 g/l y 20 g/l de glucosa, 20 g/l de agar) complementadas con 200 mg/L de leucina. Para C5LTe1101 se transformaron fragmentos de ADN obtenidos con PCR con los cebadores mostrados en la Tabla 7 junto con el plásmido p245GPD (Mumberg et al., 1995) linearizado con Smal. Se construyó una cepa de control transformándola con el plásmido p245GPD no linearizado. La selección se realizó en placas de agar YNB con 20 g/l de glucosa como fuente de carbono. Las colonias seleccionadas se analizaron mediante PCR de colonias y se eligieron clones con productos de PCR que indicaban el tamaño correcto de la inserción de plásmido.
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Figure imgf000040_0001
Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de ENO1 se muestran en las SEQ ID NOs: 131 y 132, respectivamente. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de PFK2 se muestran en las SEQ ID NOs: 133 y 134, respectivamente. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de PFK26 se muestran en las SEQ ID NOs: 135 y 136, respectivamente. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de PGI1 se muestran en las SEQ ID NOs: 137 y 138, respectivamente. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de GMP1 se muestran en las SEQ ID NOs: 139 y 140, respectivamente. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de TPI1 se muestran en las SEQ ID NOs: 141 y 142, respectivamente.
Ejemplo 17: Crecimiento aerobio en xilosa
El crecimiento aerobio en xilosa se midió en medio mineral (base nitrogenada de levadura, 13,4 g/l, xilosa 50 g/l) en cultivos de 5 ml en tubos Falcon de 50 ml. Se tomaron muestras y se midió la DO a 620 nm. Véase la Fig. 17: Para mayor claridad, el resultado se presenta como una DO normalizada, frente al promedio de todos los resultados, para la Do en un intervalo de 48 h. Los valores superiores a 1 indican que la cepa es mejor que el promedio de las cepas en el experimento.
Ejemplo 18: Crecimiento anaerobio en xilosa
Se analizaron cepas de levadura para determinar el crecimiento anaerobio en xilosa en cultivos de levadura en microplacas de 96 pocillos. Antes de los experimentos, la levadura se cultivó en precultivos semi-aerobios en medio YNB con 50 g/l de xilosa, en microplacas, durante la noche. Para medir el crecimiento anaerobio, las células se inocularon en 200 pl del mismo medio en el que se había añadido una solución de ergosterol y Tween80 a una concentración final de 0,03 y 1,2 g/l, respectivamente. Se añadieron 50 pl de aceite mineral en la parte superior de cada uno de los pocillos para mantener el cultivo anaerobio. Se añadieron 20 pl de células pre-cultivadas. Se siguió el crecimiento en Multiskan FC (Thermo Scientific) a 30 °C y se midió el crecimiento como aumento de la DO (620 nm). Véase la Fig. 18: Para mayor claridad, el resultado se presenta como una DO normalizada, frente al promedio de todos los resultados, para la DO en un intervalo de 80 h. Los valores superiores a 1 indican que la cepa es mejor que el promedio de las cepas en el experimento.
Ejemplo 19: Construcción de una cepa de S. cerevisiae que sobre-expresa una enolasa, tres de los genes en la ruta de la pentosa fosfato y un gen de xilulosa quinasa (XK) y que expresa un gen de xilitol deshidrogenasa (XDH) de Scheffersomyces stipitis y un gen mutado de xilosa reductasa de Scheffersomyces stipitis (XR(N272D))
En este ejemplo, se utilizaron las cepas, los medios y las técnicas genéticas arriba descritos, excepto que las cepas de levadura se transformaron con el método del acetato de litio (Gietz y Schiestl, 2007) y las cepas de levadura transformadas se seleccionaron en placas YPD que contenían 500 pg mL-1 de geneticina (Gibco Invitrogen, Paisley, Reino Unido).
Construcción de pC5e0057 que contiene el gen enolasa (ENO1) de S. cerevisiae
El plásmido pUG6 HXT-PGM2 (documento WO2010059095 (A1)) contiene el promotor HXT7’ truncado y el terminador PGK1 de S. cerevisiae en pUG6. El casete de ADN HXT7’ p-pUG6-PGK1t se amplificó por PCR teniendo como molde el plásmido pUG6 HXT-PGM2 y utilizando los siguientes cebadores
2_fwd:
5'-TGCAGCCCGGGGATCCTTTTT-3' (SEQ ID NO: 93)
2_rev:
5'-AGGAATTCTAGATCTCCCATGTCTCT-3' (SEQ ID NO: 94).
El gen enolasa (ENO1) completo de S. cerevisiae se amplificó por PCR, teniendo como molde ADN genómico de CEN.PK y utilizando los siguientes cebadores.
EN1_fwd
5'-GATCCCCGGGCTGCAATGGCTGTCTCTAAAGTTTACGC-3' (SEQ ID NO: 95)
EN1_rev
5'-AGATCTAGAATTCCTTTATAATTTGTCACCGTGGTGG-3' (SEQ ID NO: 96)
Los dos fragmentos de ADN se condensaron juntos mediante clonación In-Fusion (Clontech, California, CA, EE.UU.). El plásmido resultante se denominó pC5e0057. Las orientaciones y secuencias correctas de las inserciones se verificaron mediante análisis de restricción y secuenciación.
Construcción de C5LTe1051 que sobre-expresa el gen que codifica ENO1 y es capaz de crecer únicamente en xilosa
El plásmido pC5e0057 se digirió con la enzima de restricción KpnI dentro del gen ENO1 y después de ello se transformó en la cepa C5LTe1035. Esto resultó en la cepa C5LTe1051.
Ejemplo 20: Construcción de una cepa de S. cerevisiae que sobre-expresa una 6-fosfofructoquinasa, tres de los genes en la ruta de la pentosa fosfato y un gen de xilulosa quinasa (XK) y que expresa un gen de xilitol deshidrogenasa (XDH) de Scheffersomyces stipitis y un gen mutado de xilosa reductasa de Scheffersomyces stipitis (XR(N272D))
En este ejemplo, se utilizaron las cepas, los medios y las técnicas genéticas arriba descritos, excepto que las cepas de levadura se transformaron con el método del acetato de litio (Gietz y Schiestl, 2007) y las cepas de levadura transformadas se seleccionaron en placas YPD que contenían 500 gg mL-1 de geneticina (Gibco Invitrogen, Paisley, Reino Unido).
Construcción de pC5e0058 que contiene un gen de la subunidad beta de 6-fosfofructoquinasa (PFK2) de S. cerevisiae
El plásmido pUG6 HXT-PGM2 (documento 2010/059095 (A1)) contiene el promotor HXT7’ truncado y el terminador PGK1 de S. cerevisiae en pUG6. El casete de ADN HXT7’p-pUG6-PGK1t se amplificó por PCR teniendo como molde pUG6 HXT-PGM2 y utilizando los siguientes cebadores.
2_fwd:
5'-TGCAGCCCGGGGATCCTTTTT-3' (SEQ ID NO: 97)
2_rev:
5'-AGGAATTCTAGATCTCCCATGTCTCT-3' (SEQ ID NO: 98)
El gen de la subunidad beta de 6-fosfofructoquinasa (PFK2) completo de S. cerevisiae se amplificó por PCR, teniendo como molde ADN genómico de CEN.PK y utilizando los siguientes cebadores.
PF2_fwd
5'-GATCCCCGGGCTGCAATGACTGTTACTACTCCTTTTGTGAATG-3' (SEQ ID NO: 99)
PF2_rev:
5'-AGATCTAGAATTCCTTTAATCAACTCTCTTTCTTCCAACC-3' (SEQ ID NO: 100)
Los dos fragmentos de ADN se condensaron juntos mediante clonación In-Fusion (Clontech, California, CA, EE.UU.). El plásmido resultante se denominó pC5e0058. Las orientaciones y secuencias correctas de las inserciones se verificaron mediante análisis de restricción y secuenciación.
Construcción de C5LTe1052 que sobre-expresa el gen que codifica PFK2 y es capaz de crecer únicamente en xilosa
El plásmido pC5e0058 se digirió con la enzima de restricción KpnI dentro del gen PFK2 y después de ello se transformó en la cepa C5LTe1035, resultando en la cepa C5LTe1052.
Ejemplo 21: Construcción de una cepa de S. cerevisiae que sobre-expresa una glucosa-6-fosfato isomerasa, tres de los genes en la ruta de la pentosa fosfato y un gen de xilulosa quinasa (XK) y que expresa un gen de xilitol deshidrogenasa (XDH) de Scheffersomyces stipitis y un gen mutado de xilosa reductasa de Scheffersomyces stipitis (XR(N272D))
En este ejemplo, se utilizaron las cepas, los medios y las técnicas genéticas arriba descritos, excepto que las cepas de levadura se transformaron con el método del acetato de litio (Gietz y Schiestl, 2007) y las cepas de levadura transformadas se seleccionaron en placas YPD que contenían 500 gg mL-1 de geneticina (Gibco Invitrogen, Paisley, Reino Unido).
Construcción de pC5e0060 que contiene un gen de glucosa-6-fosfato isomerasa (PGI1) de S. cerevisiae El plásmido pUG6 HXT-PGM2 (documento WO2010/059095 (A1)) contiene el promotor HXT7’ truncado y el terminador PGK1 de S. cerevisiae en pUG6. El casete de ADN HXT7’p-pUG6-PGK1t se amplificó por PCR teniendo como molde pUG6 HXT-PGM2 y utilizando los siguientes cebadores.
2_fwd:
5'-TGCAGCCCGGGGATCCTTTTT-3' (SEQ ID NO: 101)
2_rev:
5'-AGGAATTCTAGATCTCCCATGTCTCT-3' (SEQ ID NO: 102)
El gen de glucosa-6-fosfato isomerasa (PGI1) completo de S. cerevisiae se amplificó por PCR, teniendo como molde ADN genómico de CEN PK y utilizando los siguientes cebadores.
PG1_fwd:
5'-GATCCCCGGGCTGCAATGTCCAATAACTCATTCACTAACTTCA-3' (SEQ ID NO: 103)
PG1_rev:
5'-AGATCTAGAATTCCTTCACATCCATTCCTTGAATTG-3' (SEQ ID NO: 104)
Los dos fragmentos de ADN se condensaron juntos mediante clonación In-Fusion (Clontech, California, CA, EE.UU.). El plásmido resultante se denominó pC5e0060. Las orientaciones y secuencias correctas de las inserciones se verificaron mediante análisis de restricción y secuenciación.
Construcción de C5LTe1054 que sobre-expresa el gen que codifica PGI1 y es capaz de crecer únicamente en xilosa
El plásmido pC5e0060 se digirió con la enzima de restricción KpnI dentro del gen PGI1 y después de ello se transformó en la cepa C5LTe1035. Esto resultó en la cepa C5LTe1054.
Ejemplo 22: Construcción de una cepa de S. cerevisiae que sobre-expresa una 6-fosfofructo-2-quinasa, tres de los genes en la ruta de la pentosa fosfato y un gen de xilulosa quinasa (XK) y que expresa un gen de xilitol deshidrogenasa (XDH) de Scheffersomyces stipitis y un gen mutado de xilosa reductasa de Scheffersomyces stipitis (XR(N272D))
En este ejemplo, se utilizaron las cepas, los medios y las técnicas genéticas arriba descritos, excepto que las cepas de levadura se transformaron con el método del acetato de litio (Gietz y Schiestl, 2007) y las cepas de levadura transformadas se seleccionaron en placas YPD que contenían 500 pg mL-1 de geneticina (Gibco Invitrogen, Paisley, Reino Unido).
Construcción de pC5e0060 que contiene un gen de 6-fosfofructo-2-quinasa (PFK26) de S. cerevisiae
El plásmido pUG6 HXT-PGM2 (documento WO2010/059095 (A1)) contiene el promotor HXT7’ truncado y el terminador PGK1 de S. cerevisiae en pUG6. El casete de ADN HXT7’p-pUG6-PGK1t se amplificó por PCR teniendo como molde pUG6 HXT-PGM2 y utilizando los siguientes cebadores.
2_fwd:
5'-TGCAGCCCGGGGATCCTTTTT-3' (SEQ ID NO: 105)
2_rev:
5'-AGGAATTCTAGATCTCCCATGTCTCT-3' (SEQ ID NO: 106)
El gen de 6-fosfofructo-2-quinasa (PFK26) completo de S. cerevisiae se amplificó por PCR, teniendo como molde ADN genómico de CEN PK y utilizando los siguientes cebadores.
PF26_fwd:
5'-GATCCCCGGGCTGCAATGTTCAAACCAGTAGACTTCTCTGA-3' (SEQ ID NO: 107)
PF26_rev:
5'-AGATCTAGAATTCCTTTAAACGTGACTTTGGCTGC-3' (SEQ ID NO: 108)
Los dos fragmentos de ADN se condensaron juntos mediante clonación In-Fusion (Clontech, California, CA, EE.UU.). El plásmido resultante se denominó pC5e0061. Las orientaciones y secuencias correctas de las inserciones se verificaron mediante análisis de restricción y secuenciación.
Construcción de C5LTe1055 que sobre-expresa el gen que codifica PFK26 y es capaz de crecer únicamente en xilosa
El plásmido pC5e0061 se digirió con la enzima de restricción KpnI dentro del gen PFK26 y después de ello se transformó en la cepa C5LTe1035. Esto resultó en la cepa C5LTe1055.
Ejemplo 23: Crecimiento anaerobio en xilosa
Se analizaron cepas de levadura para determinar el crecimiento anaerobio en xilosa en cultivos de levadura en microplacas de 96 pocillos. Antes de los experimentos, la levadura se cultivó en pre-cultivos semi-aerobios en medio YNB con 50 g/l de xilosa, en microplacas, durante la noche. Para la medición del crecimiento anaerobio, las células se inocularon en 250 ql del mismo medio en el que se había añadido una solución de ergosterol y Tween80® a una concentración final de 0,03 y 1,2 g/l, respectivamente. Se añadieron 50 ql de aceite mineral en la parte superior de cada uno de los pocillos para mantener el cultivo anaerobio. Se añadieron 10 ql de células pre-cultivadas. Se siguió el crecimiento en Multiskan FC (Thermo Scientific) a 30 °C y se midió el crecimiento como aumento de la DO (620 nm). Los datos se muestran gráficamente en la Fig. 19, la Fig. 20, la Fig. 21 y la Fig. 22.
En conclusión, las cepas con el gen que codifica ENO1 o el gen que codifica PFK2 o el gen que codifica PGI1 o el gen que codifica PFK26 crecen más rápido y más bajo condiciones anaerobias que la cepa de control sin sobre-expresión de cualquiera de estos cuatro genes.
Ejemplo 24: Fermentación en matraz con suero
Procedimiento de fermentación:
Se utilizaron células cultivadas en condiciones aerobias durante la noche en medio YNB complementado con 20 g/L de glucosa para inocular un matraz de agitación que contenía 50 mL de medio YNB complementado con xilosa (70 g/L) como fuente de carbono. Cuando las células crecían exponencialmente, se utilizaron para inocular un frasco con suero que contenía 30 mL de medio YNB complementado con xilosa (55 g/L) y una solución de ergosterol y Tween80 con una concentración final de 0,03 y 1,2 g/l, respectivamente. Se añadieron 7 ml de aceite mineral en la parte superior de cada uno de los matraces con suero para mantener el cultivo anaerobio. Las concentraciones de xilosa, etanol, glicerol y xilitol se determinaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (Waters, Milford, MA, EE.UU.). Los resultados se muestran en la Tabla 8 y la Fig. 23. De manera notable, todas las cepas elegidas que llevaban genes sobre-expresados consumieron más xilosa y produjeron más etanol que la cepa de control sin genes sobre­ expresados.
Tabla 8
Figure imgf000044_0001
Ejemplo 25: Preparación de cepas que portan PGM1 y PGM3
La cepa de levadura C5LTe1101 se construyó transformando la cepa de levadura TMB 3043 (Karhumaa et al. 2005) en su locus ura3 con un fragmento de ADN que contiene el gen URA3, TDH3p-XYL1 (N272D)-ADH1t y PGK1p-XYL2 PGK1t. La selección se realizó en placas de YNB (base nitrogenada de levadura 6,7 g/l y 20 g/l de glucosa, 20 g/l de agar) complementadas con 200 mg/L de leucina.
C5LTe1101 se transformó con fragmentos de ADN obtenidos con los siguientes cebadores de PCR específicos para PGM1
5'-CTAGAACTAGTGGATCCCCCATGAACGATAGCCAAAACTGC-3' (SEQ ID NO: 143)
5'-ATATCGAATTCCTGCAGCCCTTATTGGGGGGAAGTGTATTG-3' (SEQ ID NO: 144)
y con fragmentos de ADN obtenidos con los siguientes cebadores de PCR específicos para PGM3
5'-CTAGAACTAGTGGATCCCCCATGTTGCAAGGAATTTTAGAAACCG-3' (SEQ ID NO: 145)
5'-ATATCGAATTCCTGCAGCCCTCAAAATTTTGTAACTATATTCATTTCATCTG-3' (SEQ ID NO: 146)
junto con el plásmido p245GPD (Mumberg et al) linearizado con Smal. La selección se realizó en placas de agar YNB 5 con 20 g/l de glucosa como fuente de carbono. Las colonias seleccionadas se analizaron mediante PCR de colonias y se eligieron clones con productos de PCR que indicaban el tamaño correcto de la inserción de plásmido.
Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de PGM1 se muestran en las SEQ ID NOs: 147 y 148, respectivamente. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de PGM3 se muestran en las SEQ ID NOs: 149 y 150, respectivamente.
Ejemplo 26: Crecimiento anaerobio de cepas que portan PGM1 y PGM3
Se analizaron cepas de levadura obtenidas en el Ejemplo 25 para determinar el crecimiento anaerobio en xilosa en cultivos de levadura en microplacas de 96 pocillos. Antes de los experimentos, la levadura se cultivó en precultivos semi-aerobios en medio YNB con 50 g/l de xilosa, en microplacas, durante la noche. Para la medición del crecimiento anaerobio, las células se inocularon en 250 gl del mismo medio en el que se había añadido una solución de ergosterol y Tween80 a una concentración final de 0,03 y 1,2 g/l, respectivamente. Se añadieron 50 gl de aceite mineral en la parte superior de cada uno de los pocillos para mantener el cultivo anaerobio. Se añadieron 10 gl de células pre­ cultivadas. Se siguió el crecimiento en Multiskan FC (Thermo Scientific) a 30 °C y se midió el crecimiento como aumento de la DO (620 nm). Las curvas de crecimiento se presentan en la Fig.24.
Ejemplo 27: Fermentación a pequeña escala de cepas que portan PGM1 y PGM3
Se utilizaron células cultivadas en condiciones aerobias durante la noche en medio YNB complementado con 20 g/L de glucosa para inocular un matraz de suero que contenía 30 mL de medio YNB complementado con glucosa (20 g/L) y xilosa (50 g/L) como fuente de carbono y ácido fórmico (4,5 g/L) a una concentración inicial de 1 g de CDW/L. Las concentraciones de glucosa, xilosa, etanol, glicerol y xilitol se determinaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (Waters, Milford, MA, EE.UU.). Los compuestos se separaron con una columna basada en copolímero Shodex SUGAR SP0810 Pb2+ (Showa Denko America, NY, EE.UU.) precedida por una columna de protección Micro-Guard Carbo-C (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). La separación se realizó a 80 °C, con H2O a un caudal de 0,6 ml min-1 como fase móvil. Los compuestos se cuantificaron mediante detección del índice de refracción (Waters). Se realizó una curva de calibración de siete puntos para cada uno de los compuestos para calcular las concentraciones. Los resultados se presentan gráficamente en la Fig. 25 (consumo de xilosa) y la Fig. 26 (producción de etanol), así como en la Tabla 4.
En conclusión, estos datos demuestran que las cepas que portan PGM1 o PGM3 consumieron más xilosa y produjeron más etanol que la cepa de control.
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SECUENCIAS
[0217]
SEQ ID NO: 5 - Gen XK artificial de Spathaspora passalidarum
Gen XK artificial de Spathaspora passalidarum con promotor TPI1 delante del codón de inicio ATG y el terminador PGK1 detrás del codón de parada, y que codifica la región basada en la secuencia de aminoácidos de NCBI Código de Acceso XP007373112:
TATATCTAGGAACCCATCAGGTTGGTGGAAGATTACCCGTTCTAAGACTTTTCAGCTTCCTCTATTGA
TGTTACACCTGGACACCCCTTTTCTGGCATCCAGTTTTTAATCTTCAGTGGCATGTGAGATTCTCCGA
AATTAATTAAAGCAATCACACAATTCTCTCGGATACCACCTCGGTTGAAACTGACAGGTGGTTTGTTA
CGCATGCTAATGCAAAGGAGCCTATATACCTTTGGCTCGGCTGCTGTAACAGGGAATATAAAGGGCAG
CATAATTTAGGAGTTTAGTGAACTTGCAACATTTACTATTTTCCCTTCTTACGTAAATATTTTTCTTT
TTAATT CTAAATCAATCTTT TTCAATTTTTTGTTTGTATTCTTTTCTTGCT TAAATCTATAACTACAA
AAAACACATACATAAACTAAAAATGACAGTAGAACTACCCGCTTCAGAACCTTTGTTTCTTGGGTTTG
ATCTTAGCACTCAACAGTTGAAAATCATAGTGACAAACCAGAAATTAGCTGCACTAAAATCTTACAAC
GTTGAATTCGATGTGGCATTTAAGGAGAAATATGGGATAACCAAGGGAGTCCTAACGAACAAAGAGGA
CGGAGAAGTGGTTTCTCCAGTTGGTATGTGGTTAGATTCCATAAACCATGTATTCGACCAAATGAAAC
AAGATGACTTTCCGTTCAATCAAGTTGCAGGCATTTCAGGCTCTTGTCAACAACATGGTTCTGTGTTT
TGGTCACATGAAGCTGAGAAGCTTTTATCAGGTTTACAGAAGGATCAAGATCTGTCGACTCAACTAAA
GGACGCTTTATCTTGGGACAAAAGTCCCAATTGGCAAGATCATTCGACTTTAGAGGAAAGTAAGGCTT
TCGTAGATGCTGTAGGGAGGGAAGAGTTAGCCGATATTACTGGTAGTAGAGATCACTTAAGATTCACT
GGATTGCAAATTAGGAAGTTTGCCACTAGATCACATCCCGATAAGTATGCGAATACTAGTAGAATCTC
ACTGGTTAGCTCCTTCATAACAAGTGTTCTTCTGGGTGAGATTACCGAATTGGAAGAATCTGATGCTT
GTGGCATGAACTTGTATGACATCAAAGCCGGTGATTTCAATGAAGAATTGTTGGCTCTAGCAGCCGGT
GTTCATCCTAAAGTTGACAACATAACGAAAGATGATCCGAAATATAAAGCCGGAATTGAGGACATCAA
AGCGAAACTTGGGAAGATCTCCCCAATTACATATAAAAGCTCCGGATCCATTGCTTCATATTACGTTG
AAAAGTACGGTTTGAATCCTAAGTGCCAGATTTACAGCTTTACCGGTGACAATTTGGCTACAATCTTG
AGTTTGCCATTACAGCCTAACGATTGCTTGATTTCGTTAGGTACTTCGACTACGGTCTTGCTAATCAC
TAAGAATTACCAACCTTCTTCTCAATATCACTTGTTTAAGCATCCAACCATACCAGATGGATATATGG GCATGATCTGCTATTGCAATGGCTCTTTGGCCAGAGAGAAGATAAGAGATGAAGTTAATGAATACTAT AAGGTGGAAGATAAGAAGAGTTGGGATAAATTTAGTGAAATTCTGGATAAGTCGACCAAATTCGATAA TAAGCTGGGTATTTTCTTTCCGTTAGGTGAAATCGTTCCACAGGCAAAGGCACAAACTGTCAGAGCAG TATTGGAGAATGACAAAGTCATAGAAGTAGGTTTGGATACACACGGATTTGATATTGATCACGACGCA AGAGCTATTGTCGAAAGCCAAGCCTTATCTTGTAGACTTAGAGCTGGCCCTATGTTATCCAAATCATC ACGTGCTTCCGTCACATCACCAACGGAGTTAAAAGGCGTATACCATGACATAGTGGCCAAATATGGTG ACCTGTACACAGATGGTAAACAACAAACCTATGAGTCACTTACATCTAGGCCAAATCGTTGTTTCTAT GTTGGCGGCGGGAGCAATAACATTTCCATCATTAGTAAAATGGGTTCTATTCTAGGTCCTGTTCACGG TAACTTTAAAGTCGATATTCCAAACGCGTGTTCTCTAGGTGGAGCATACAAAGCATCCTGGTCTTATG AATGTGAACAGAAAGGTGAATGGATTAATTATGACCAATACATAAATCAGTTATTGAAAGAATTGAAG TCATTTAACGTGGAGGACAAATGGTTAGAATACTTTGATGGAGTTGCGCTTTTGGCTAAGATGGAAGA AACCCTGTTGAAATAAAGATCTCCCATGTCTCTACTGGTGGTGGTGCTTCTTTGGAATTATTGGAAGG TAAGGAATTGCCAGGTGTTGCTTTCTTATCCGAAAAGAAATAAATTGAATTGAATTGAAATCGATAGA TCAATTTTTTTCTTTTCTCTTTCCCCATCCTTTACGCTAAAATAATAGTTTATTTTATTTTTTGAATA TTTTTTATTTATATAGGTATATATAGAGTATTATTTATGTTTTAATGATTATTAAGATTTTTATTAAA AAAAAATTCGCTCCTCTTTTAATGCCTTTATGCAGTTTTTTTTTCCCATTCGATATTTCTATGTTC SEQ ID NO: 6 - XK de Soathasoora oassalidarum MTVELPASEPLFLGFDLSTQQLKIIVTNQKLAALKSYNVEFDVAFKEKYGITKGVLTNKEDGEVVSPV GMWLDSINHVFDQMKQDDFPFNQVAGISGSCQQHGSVFWSHEAEKLLSGLQKDQDLSTQLKDALSWDK SPNWQDHSTLEESKAFVDAVGREELADITGSRDHLRFTGLQIRKFATRSHPDKYANTSRISLVSSFIT SVLLGEITELEESDACGMNLYDIKAGDFNEELLALAAGVHPKVDNITKDDPKYKAGIEDIKAKLGKIS PITYKSSGSIASYYVEKYGLNPKCQIYSFTGDNLATILSLPLQPNDCLISLGTSTTVLLITKNYQPSS QYHLFKHPTIPDGYMGMICYCNGSLAREKIRDEVNEYYKVEDKKSWDKFSEILDKSTKFDNKLGIFFP LGEIVPQAKAQTVRAVLENDKVIEVGLDTHGFDIDHDARAIVESQALSCRLRAGPMLSKSSRASVTSP TELKGVYHDIVAKYGDLYTDGKQQTYESLTSRPNRCFYVGGGSNNISIISKMGSILGPVHGNFKVDIP NACSLGGAYKASWSYECEQKGEWINYDQYINQLLKELKSFNVEDKWLEYFDGVALLAKMEETLLK SEQ ID NO: 17 - Gen xilulosa quinasa artificial de Escherichia coli
Gen xilulosa quinasa artificial de Escherichia coli con promotor TPI1 delante del codón de inicio ATG y el terminador pGk 1 detrás del codón de parada, y que codifica la región basada en la secuencia de aminoácidos de NCBI Código de Acceso Y P 001460359: TATATCTAGGAACCCATCAGGTTGGTGGAAGATTACCCGTTCTAAGACTTTTCAGCTTCCTCTATTGA TGTTACACCTGGACACCCCTTTTCTGGCATCCAGTTTTTAATCTTCAGTGGCATGTGAGATTCTCCGA AATTAATTAAAGCAATCACACAATTCTCTCGGATACCACCTCGGTTGAAACTGACAGGTGGTTTGTTA CGCATGCTAATGCAAAGGAGCCTATATACCTTTGGCTCGGCTGCTGTAACAGGGAATATAAAGGGCAG CATAATTTAGGAGTTTAGTGAACTTGCAACATTTACTATTTTCCCTTCTTACGTAAATATTTTTCTTT TTAATTCTAAATCAATCTTTTTCAATTTTTTGTTTGTATTCTTTTCTTGCTTAAATCTATAACTACAA AAAACACATACATAAACTAAAAATGTATATCGGCATTGATTTGGGTACTTCTGGCGTAAAGGTTATCC TGCTGAATGAACAGGGTGAAGTGGTTGCCTCACAAACGGAAAAGTTGACTGTATCTAGGCCACATCCT TTGTGGAGCGAACAAGATCCAGAACAGTGGTGGCAAGCTACAGATAGAGCAATGAAAGCGTTAGGTGA CCAGCATTCCTTACAGGACGTTAAAGCCTTGGGGATTGCTGGCCAAATGCATGGTGCGACACTGCTTG ATGCCCAACAAAGGGTCTTAAGGCCTGCAATACTGTGGAATGATGGACGTTGTGCTCAGGAGTGTACC TTATTGGAAGCAAGAGTGCCTCAATCCAGGGTGATAACCGGTAACTTGATGATGCCTGGATTTACAGC CCCAAAATTGTTATGGGTTCAAAGACACGAACCAGAGATCTTCCGTCAAATCGACAAGGTCTTATTAC CGAAGGACTACTTGAGACTACGTATGACTGGTGAATTCGCTTCAGACATGAGTGACGCAGCAGGAACC ATGTGGTTGGATGTCGCGAAAAGAGATTGGAGTGACGTTATGTTACAAGCTTGCGATCTATCTAGAGA TCAAATGCCAGCTCTGTATGAGGGCTCAGAAATTACCGGTGCATTATTACCTGAAGTCGCTAAAGCAT GGGGTATGGCTACTGTCCCAGTTGTTGCCGGTGGTGGTGACAATGCCGCAGGAGCTGTTGGAGTTGGT ATGGTGGATGCAAATCAAGCGATGTTGTCTCTTGGCACATCAGGCGTCTATTTTGCCGTATCGGAAGG GTTTCTGTCGAAACCAGAATCAGCCGTACATTCCTTTTGTCACGCTCTTCCACAAAGATGGCATCTAA TGAGCGTGATGCTTTCTGCAGCATCATGCTTGGATTGGGCCGCTAAATTGACGGGTTTGAGTAATGTT CCGGCACTTATAGCAGCTGCACAACAAGCAGATGAAAGTGCTGAACCCGTTTGGTTCTTGCCCTATCT TTCCGGAGAGAGAACACCACACAACAATCCTCAAGCCAAAGGTGTGTTCTTTGGGTTAACTCACCAAC ATGGTCCAAACGAATTGGCGAGAGCAGTATTGGAAGGAGTAGGGTATGCTCTTGCTGATGGTATGGAT GTTGTCCATGCATGTGGCATAAAGCCGCAATCTGTTACGCTTATTGGAGGTGGTGCCAGAAGCGAATA CTGGAGACAAATGTTAGCCGATATTTCCGGTCAACAACTAGACTACAGAACAGGAGGCGATGTAGGGC CAGCTTTGGGTGCTGCTAGATTGGCTCAGATTGCTGCTAACCCTGAGAAGTCGTTGATTGAGCTACTA CCTCAGTTACCCTTAGAACAGTCTCATCTACCAGATGCCCAGAGATATGCTGCGTACCAACCTAGAAG AGAGACTTTTCGTAGGTTATACCAGCAATTACTACCCTTGATGGCGTAAAGATCTCCCATGTCTCTAC TGGTGGTGGTGCTTCTTTGGAATTATTGGAAGGTAAGGAATTGCCAGGTGTTGCTTTCTTATCCGAAA AGAAATAAATTGAATTGAATTGAAATCGATAGATCAATTTTTTTCTTTTCTCTTTCCCCATCCTTTAC GCTAAAATAATAGTTTATTTTATTTTTTGAATATTTTTTATTTATATACGTATATATAGACTATTATT TATCTTTTAATGATTATTAAGATTTTTATTAAAAAAAAATTCGCTCCTCTTTTAATGCCTTTATGCAG TTTTTTTTTCCCATTCGATATTTCTATGTTC SEQ ID NO: 18 - Xilulosa guinasa de Escherichia coli MYIGIDLGTSGVKVILLNEQGEVVASQTEKLTVSRPHPLWSEQDPEQWWQATDRAMKALGDQHSLQDV KALGIAGQMHGATLLDAQQRVLRPAILWNDGRCAQECTLLEARVPQSRVITGNLMMPGFTAPKLLWVQ RHEPEIFRQIDKVLLPKDYLRLRMTGEFASDMSDAAGTMWLDVAKRDWSDVMLQACDLSRDQMPALYE GSEITGALLPEVAKAWGMATVPVVAGGGDNAAGAVGVGMVDANQAMLSLGTSGVYFAVSEGFLSKPES AVHSFCHALPQRWHLMSVMLSAASCLDWAAKLTGLSNVPALIAAAQQADESAEPVWFLPYLSGERTPH NNPQAKGVF FGLTHQHGPNELARAVLEGVGYALADGMDVVHACGIKPQSVTLIGGGARS EYWRQMLAD ISGQQLDYRTGGDVGPALGAARLAQIAANPEKSLIELLPQLPLEQSHLPDAQRYAAYQPRRETFRRLY QQLLPLMA SEQ ID NO: 21 - Gen xilulosa guinasa de Kluweromvces marxianus
Gen xilulosa quinasa artificial de Kluyveromyces marxianus, con región codificante basada en la secuencia de aminoácidos de NCBI Código de Acceso ADW23548:
ATGTCGACTCCATATTACTTAGGCTTTGATTTGTCAACTCAGCAGTTGAAATGTCTAGCAATAGATGA TCAGTTAAACATCGTGACTTCAGTTAGCATTGAATTTGACCGTAATTTCCCAGCTTACAACACAAAGA AAGGGGTATACATCAAGAATGGTGGTGTGATAGACGCACCAGTTGCTATGTGGTTAGAAGCTGTTGAT TTATGCTTTAGTCAGCTTGCTGAAAGAATCGACTTGAAGAGAGTTCAATCAATGTCAGGTTCTTGCCA ACAACATGGCACCGTCTACTGGAACTGTGAGCATCTACCAAGTAACCTTGATCCTGCTTCAACCTTGA GAGAGCAACTTCAAGGCAGTTTATCAAGACCAGTTGCACCCAATTGGCAAGATCATTCCACCAAGAAA CAATGTGATGAATTGGCAGAATCGGTAGGAGGACCTGAAGAACTAGCAAGGATTACAGGTTCTGGAGC ACACTATAGATTTTCCGGTTCCCAAATTGCCAAAATCCATGAAACTGAACCTGAAGTCTATGAGGCTA CTAAACGTATTTCGTTGGTAAGTAGCTTTCTAGCGTCTGTTTTAGTAGGTGACATTGTGCCCTTGGAA GAAGCGGATGCTTGTGGCATGAACTTATACGATCTATCCAAACACGACTTTGACGAAACATTACTGGC TGTCGTTGACCATGATACAGCGAGATTGAGAAGGAAACTATCAGATCCACCCGTTGGAGCTCCTACCA GAGAAAGTCCTCTGACCTCCTTGGGTAAAGTCTCTAAGTACTTTCAGGACAAATATGGGGTTAACTGT GAATGTGAGATCTTCCCGTTTACTGGCGATAACCTGGCAACGATTTGTTCCCTACCTTTGCAAAAGAA TGATGTCTTGATTAGTCTAGGTACTTCGACCACGATTTTGTTGGTAACTGACCAATATCACTCTTCTC CCAATTATCACTTGTTTATACATCCGACAGTGCCAGGTTATTACATGGGTATGATTTGCTATTGCAAT GGGTCTTTGGCTCGTGAGAGAGTAAGAGATGATCTGGCTGGACCACAAGCCTCTCAAGCTCCTGGGGA GCAAGTTCCATGGACTCAATTCAATGACGCATTACTGGATGACTCATTGAGCAATGACAATGAGATAG GCCTTTACTTCCCTCTTGGTGAGATTGTCCCAAATGTTGATGCCGTCACCAAAAGATGGACATTCGAA AGAAAAGAGAACCATTCGAACAAAAGTATCGTTCTTCACGAGTTGGATCAATTCACGCCAAAGAGGAA AGATGCAAAGAACATAGTGGAAAGTCAGGCCTTAAGCTGTAGAGTGCGTATCTCTCCATTGCTGTCTG ATGAAACAGATGCCTTAAGCGAAACTCAAGTGTTGTCAAAGAAGGAGAATACCCAAGTTACGTTTGAC TACGATGCATTTCCGTTGTGGACGTATGCCAAAAGACCGAATAGAGCGTTCTTTGTTGGTGGTGCCTC CAAGAATGATGCCATAGTCAGGACAATGGCAAATGTAATAGGTGCTAGGAATGGAAATTATAGACTTG AAACTCCCAATTCCTGTGCTTTAGGAGGCTGTTATAAAGCGATGTGGTCATGGTTAAAGGTACATGAA CCTACAACTACACCATCTTTCGATGTTTGGTTAAACGCAAGCTTTAACTGGCAGAGAGATTGCGAATT CGTGTGCCAGTCTGACGCCGCTAAGTGGGAACAATCTAATGGTAAAATTCAAGCTTTATCAGAAGCTG AAGCCTATGTTAAAGCTTTAGCACAATCTCAGGGTCAA SEQ ID NO: 22 - Xilulosa quinasa de Ktuyveromyces marxianus
MSTPYYLGFDLSTQQLKCLAIDDQLNIVTSVSIEFDRNFPAYNTKKGVYIKNGGVIDAPVAMWLEAVD LCFSQLAERIDLKRVQSMSGSCQQHGTVYWNCEHLPSNLDPASTLREQLQGSLSRPVAPNWQDHSTKK QCDELAESVGGPEELARITGSGAHYRFSGSQIAK1HETEPEVYEATKRISLVSSFLASVLVGDIVPLE EADACGMNLYDLSKHDFDETLLAVVDHDTARLRRKLSDPPVGAPTRESPLTSLGKVSKYFQDKYGVNC ECEIFPFTGDNLATICSLPLQKNDVLISLGTSTTILLVTDQYHSSPNYHLF1HPTVPGYYMGMICYCN GSLARERVRDDLAGPQASQAPGEQVPWTQFNDALLDDSLSNDNEIGLY FPLGEIVPNVDAVTKRWT FE RKENHSNKSIVLHELDQFTPKRKDAKNIVESQALSCRVRISPLLSDETDALSETQVLSKKENTQVTFD YDAFPLWTYAKRPNRAFFVGGASKNDAIVRTMANVIGARNGNYRLETPNSCALGGCYKAMWSWLKVHE PTTTPSFDVWLNASFNWQRDCEFVCQSDAAKWEQSNGKIQALSEAEAYVKALAQSQGQ SEQ ID NO: 31 - Gen xilulosa quinasa (XKS1) de Saccharomvces cerevisiae ATGTTGTGTTCAGTAATTCAGAGACAGACAAGAGAGGTTTCCAACACAATGTCTTTAGACTCATACTA TCTTGGGTTTGATCTTTCGACCCAACAACTGAAATGTCTCGCCATTAACCAGGACCTAAAAATTGTCC ATTCAGAAACAGTGGAATTTGAAAAGGATCTTCCGCATTATCACACAAAGAAGGGTGTCTATATACAC GGCGACACTATCGAATGTCCCGTAGCCATGTGGTTAGAGGCTCTAGATCTGGTTCTCTCGAAATATCG CGAGGCTAAATTTCCATTGAACAAAGTTATGGCCGTCTCAGGGTCCTGCCAGCAGCACGGGTCTGTCT ACTGGTCCTCCCAAGCCGAATCTCTGTTAGAGCAATTGAATAAGAAACCGGAAAAAGATTTATTGCAC TACGTGAGCTCTGTAGCATTTGCAAGGCAAACCGCCCCCAATTGGCAAGACCACAGTACTGCAAAGCA ATGTCAAGAGTTTGAAGAGTGCATAGGTGGGCCTGAAAAAATGGCTCAATTAACAGGGTCCAGAGCCC ATTTTAGATTTACTGGTCCTCAAATTCTGAAAATTGCACAATTAGAACCAGAAGCTTACGAAAAAACA AAGACCATTTCTTTAGTGTCTAATTTTTTGACTTCTATCTTAGTGGGCCATCTTGTTGAATTAGAGGA GGCAGATGCCTGTGGTATGAACCTTTATGATATACGTGAAAGAAAATTCAGTGATGAGCTACTACATC TAAT TGATAGTTCTTC TAAGGATAAAACTAT CAGACAAAAATTAAT GAGAGCACCCATGAAAAAT TTG ATAGCGGGTACCATCTGTAAATATTTTATTGAGAAGTACGGTTTCAATACAAACTGCAAGGTCTCTCC CATGACTGGGGATAATTTAGCCACTATATGTTCTTTACCCCTGCGGAAGAATGACGTTCTCGTTTCCC TAGGAACAAGTACTACAGTTCTTCTGGTCACCGATAAGTATCACCCCTCTCCGAACTATCATCTTTTC ATTCATCCAACTCTGCCAAACCATTATATGGGTATGATTTGTTATTGTAATGGTTCTTTGGCAAGGGA GAG GATAAGAGACGAG TTAAACAAAGAACGG GAAAATAATTATGAGAAGAC TAACGATTGGAC TCTTT TTAATCAAGCTGTGCTAGATGACTCAGAAAGTAGTGAAAATGAATTAGGTGTATATTTTCCTCTGGGG GAGATCGTTCCTAGCGTAAAAGCCATAAACAAAAGGGTTATCTTCAATCCAAAAACGGGTATGATTGA AAGAGAGGTGGCCAAGTTCAAAGACAAGAGGCACGATGCCAAAAATATTGTAGAATCACAGGCTTTAA GTTGCAGGGTAAGAATATCTCCCCTGCTTTCGGATTCAAACGCAAGCTCACAACAGAGACTGAACGAA GATACAATCGTGAAGTTTGATTACGATGAATCTCCGCTGCGGGACTACCTAAATAAAAGGCCAGAAAG GACTTTTTTTGTAGGTGGGGCTTCTAAAAACGATGCTATTGTGAAGAAGTTTGCTCAAGTCATTGGTG CTACAAAGGGTAATTTTAGGCTAGAAACACCAAACTCATGTGCCCTTGGTGGTTGTTATAAGGCCATG TGGTCATTGTTATATGACTCTAATAAAATTGCAGTTCCTTTTGATAAATTTCTGAATGACAATTTTCC ATGGCATGTAATGGAAAGCATATCCGATGTGGATAATGAAAATTGGGATCGCTATAATTCCAAGATTG TCCCCTTAAGCGAACTGGAAAAGACTCTCATCTAA SEQ ID NO: 32 - Xiluloquinasa de Saccharomyces cerevisiae
MLCSVIQRQTREVSNTMSLDSYYLGFDLSTQQLKCLAINQDLKIVHSETVEFEKDLPHYHTKKGVY1H GDTIECPVAMWLEALDLVLSKYREAKFPLNKVMAVSGSCQQHGSVYWSSQAESLLEQLNKKPEKDLLH YVSSVAFARQTAPNWQDHSTAKQCQEFEECIGGPEKMAQLTGSRAHFRFTGPQILKIAQLEPEAYEKT KTISLVSNFLTSILVGHLVELEEADACGMNLYDIRERKFSDELLHLIDSSSKDKTIRQKLMRAPMKNL IAGTICKYFIEKYGFNTNCKVSPMTGDNLATICSLPLRKNDVLVSLGTSTTVLLVTDKYHPSPNYHLF
1HPTLPNHYMGMICYCNGSLARERIRDELNKERENNYEKTNDWTLFNQAVLDDSESSENELGVYFPLG EIVPSVKAINKRVIFNPKTGMIEREVAKFKDKRHDAKNIVESQALSCRVRISPLLSDSNASSQQRLNE DTIVKFDYDESPLRDYLNKRPERTFFVGGASKNDAIVKKFAQVIGATKGNFRLETPNSCALGGCYKAM WSLLYDSNKIAVPFDKFLNDNFPWHVMESISDVDNENWDRYNSKIVPLSELEKTLI*
SEQ ID NO: 49 - Gen YME2 de Zvaosaccharomvces bailiioptimizado de codones
ATGTTGCCCATTTCTGGACCTTCCAACATGCTGCATGGCCTCGTTTCAGCCCGTTGTGCAGGGGGTTG GAGGCCACTTATCTCGCATTTGCGTAGGGGAGTTTTTCCTAAGATGCTTACCATGACAGGTATTGGGG CCAAGAGATTTGTCTCCAGCGAAATACAGGAGAAAGACGAACAAGCTGGTGAGTCTACTACTGCTACA GATACTGGTATCATTCATAAAACGGAGCAGGAGACCCTAGTATATTTCGACAACGTCTATCCACGGAC CGCATCTCTATGGAGCCCTGCGCAATGGTACAATCTACTTCTAACTAATCAATCGAGGGAGGCTGTTA GGCAAAAGATCAGCGGTTCGATCCCGCTAGAGACCATTTTTTGGCTTCATTGA
SEQ ID NO: 50- YME2 de Zvaosaccharomvces bailii
MLPISGPSNMLHGLVSARCAGGWRPLISHLRRGVFPKMLTMTGIGAKRFVSSEIQEKDEQAGESTTATDT GI1HKTEQETLVYFDNVYPRTASLWSPAQWYNLLLTNQSREAVRQKISGSIPLETIFWLH
SEQ ID NO: 131 - ADN de ENQ1 de Saccharomvces cerevisiae
ATGGCTGTCTCTAAAGTTTACGCTAGATCCGTCTACGACTCCCGTGGTAACCCAACCGTCGAAGTCGAAT TAACCACCGAAAAGGGTGTTTTCAGATCCATTGTCCCATCTGGTGCTTCTACCGGTGTCCACGAAGCTTT GGAAATGAGAGATGGTGACAAATCCAAGTGGATGGGTAAGGGTGTTTTGCACGCTGTTAAGAACGTCAAC GATGTCATTGCTCCAGCTTTCGTTAAGGCTAACATTGATGTTAAGGACCAAAAGGCCGTCGATGACTTCT TGATTTCTTTGGACGGTACTGCCAACAAATCCAAGTTGGGTGCTAACGCTATCTTGGGTGTTTCTTTGGC TGCTTCCAGAGCTGCCGCTGCTGAAAAGAATGTCCCATTATACAAGCACTTGGCTGACTTGTCTAAGTCC AAGACCTCTCCATACGTTTTGCCAGTTCCATTCTTGAACGTTTTGAACGGTGGTTCCCACGCTGGTGGTG CTTTGGCTTTGCAAGAATTTATGATTGCTCCAACTGGTGCTAAGACCTTCGCTGAAGCTTTGAGAATTGG TTCCGAAGTTTACCACAACTTGAAGTCTTTGACCAAGAAGAGATACGGTGCTTCTGCCGGTAACGTCGGT GACGAAGGTGGTGTTGCTCCAAACATTCAAACTGCTGAAGAAGCTTTGGACTTGATTGTTGACGCTATCA AGGCTGCTGGTCACGACGGTAAGATCAAGATCGGTTTGGACTGTGCTTCCTCTGAATTCTTCAAGGACGG TAAGTACGACTTGGACTTCAAGAATCCAAACTCTGACAAATCCAAGTGGTTGACTGGTCCTCAATTGGCT GAC TTGTACCACTCCTT GATGAAGAGATACCCAAT TGTCTCCATCGAAGAT CCATTTGCTGAAGAT GACT GGGAAGCTTGGTCTCACTTCTTCAAGACCGCTGGTATTCAAATTGTTGCTGATGACTTGACTGTCACCAA CCCAAAGAGAATTGCTACCGCTATCGAAAAGAAGGCTGCCGACGCTTTGTTGTTGAAGGTCAACCAAATC GGTACCTTGTCTGAATCCATCAAGGCTGCTCAAGACTCTTTCGCTGCCGGTTGGGGTGTTATGGTTTCCC ACAGATCTGGTGAAACTGAAGACACTTTCATTGCTGACTTGGTCGTCGGTTTGAGAACTGGTCAAATCAA GACTGGTGCTCCAGCTAGATCCGAAAGATTGGCTAAATTGAACCAATTGTTGAGAATCGAAGAAGAATTA GGTGACAACGCTGTTTTCGCTGGTGAAAACTTCCACCACGGTGACAAATTATAA SEQ ID NO: 132 - ENQ1 de Saccharomvces cerevisiae
MAVSKVYARSVYDSRGNPTVEVELTTEKGVFRSIVPSGASTGVHEALEMRDGDKSKWMGKGVLHAVKNVN DVIAPAFVKANIDVKDQKAVDDFLISLDGTANKSKLGANAILGVSLAASRAAAAEKNVPLYKHLADLSKS KTSPYVLPVPFLNVLNGGSHAGGALALQEFMIAPTGAKTFAEALRIGSEVYHNLKSLTKKRYGASAGNVG DEGGVAPNIQTAEEALDLIVDAIKAAGHDGKIKIGLDCASSEFFKDGKYDLDFKNPNSDKSKWLTGPQLA DLYHSLMKRYPIVSIEDPFAEDDWEAWSHFFKTAGIQIVADDLTVTNPKRIATAIEKKAADALLLKVNQI GTLSESIKAAQDSFAAGWGVMVSHRSGETEDTFIADLVVGLRTGQIKTGAPARSERLAKLNQLLRIEEEL GDNAVFAGENFHHGDKL*
SEQ ID NO: 133 - ADN de PFK2 de Saccharomvces cerevisiae
ATGACTGTTACTACTCCTTTTGTGAATGGTACTTCTTATTGTACCGTCACTGCATATTCCGTTCAATCTT ATAAAGCTGCCATAGATTTTTACACCAAGTTTTTGTCATTAGAAAACCGCTCTTCTCCAGATGAAAACTC CACTTTATTGTCTAACGATTCCATCTCTTTGAAGATCCTTCTACGTCCTGATGAAAAAATCAATAAAAAT GTTGAGGCTCATTTGAAGGAATTGAACAGTATTACCAAGACTCAAGACTGGAGATCACATGCCACCCAAT CCTTGGTATTTAACACTTCCGACATCTTGGCAGTCAAGGACACTCTAAATGCTATGAACGCTCCTCTTCA AGGCTACCCAACAGAACTATTTCCAATGCAGTTGTACACTTTGGACCCATTAGGTAACGTTGTTGGTGTT ACTTCTACTAAGAACGCAGTTTCAACCAAGCCAACTCCACCACCAGCACCAGAAGCTTCTGCTGAGTCTG GTCTTTCCTCTAAAGTTCACTCTTACACTGATTTGGCTTACCGTATGAAAACCACCGACACCTATCCATC TCTGCCAAAGCCATTGAACAGGCCTCAAAAGGCAATTGCCGTCATGACTTCCGGTGGTGATGCTCCAGGT ATGAACTCTAACGTTAGAGCCATCGTGCGTTCCGCTATCTTCAAAGGTTGTCGTGCCTTTGTTGTCATGG AAGGTTATGAAGGTTTGGTTCGTGGTGGTCCAGAATACATCAAGGAATTCCACTGGGAAGACGTCCGTGG TTGGTCTGCTGAAGGTGGTACCAACATTGGTACTGCCCGTTGTATGGAATTCAAGAAGCGCGAAGGTAGA TTATTGGGTGCCCAACATTTGATTGAGGCCGGTGTCGATGCTTTGATCGTTTGTGGTGGTGACGGTTCTT TGACTGGTGCTGATCTGTTTAGATCAGAATGGCCTTCTTTGATCGAGGAATTGTTGAAAACAAACAGAAT TTCCAACGAACAATACGAAAGAATGAAGCATTTGAATATTTGCGGTACTGTCGGTTCTATTGATAACGAT ATGTCCACCACGGATGCTACTATTGGTGCTTACTCTGCCTTGGACAGAATCTGTAAGGCCATCGATTACG TTGAAGCCACTGCCAACTCTCACTCAAGAGCTTTCGTTGTTGAAGTTATGGGTAGAAACTGTGGTTGGTT AGCTTTATTAGCTGGTATCGCCACTTCCGCTGACTATATCTTTATTCCAGAGAAGCCAGCCACTTCCAGC GAATGGCAAGATCAAATGTGTGACATTGTCTCCAAGCACAGATCAAGGGGTAAGAGAACCACCATTGTTG TTGTTGCAGAAGGTGCTATCGCTGCTGACTTGACCCCAATTTCTCCAAGCGACGTCCACAAAGTTCTAGT TGACAGATTAGGTTTGGATACAAGAATTACTACCTTAGGTCACGTTCAAAGAGGTGGTACTGCTGTTGCT TACGACCGTATCTTGGCTACTTTACAAGGTCTTGAGGCCGTTAATGCCGTTTTGGAATCCACTCCAGACA CCCCATCACCATTGATTGCTGTTAACGAAAACAAAATTGTTCGTAAACCATTAATGGAATCCGTCAAGTT GACCAAAGCAGTTGCAGAAGCCATTCAAGCTAAGGATTTCAAGAGAGCTATGTCTTTAAGAGACACTGAG TTCATTGAACATTTAAACAATTTCATGGCTATCAACTCTGCTGACCACAACGAACCAAAGCTACCAAAGG ACAAGAGACTGAAGATTGCCATTGTTAATGTCGGTGCTCCAGCTGGTGGTATCAACTCTGCCGTCTACTC GATGGCTACTTACTGTATGTCCCAAGGTCACAGACCATACGCTATCTACAATGGTTGGTCTGGTTTGGCA AGACATGAAAGTGTTCGTTCTTTGAACTGGAAGGATATGTTGGGTTGGCAATCCCGTGGTGGTTCTGAAA TCGGTACTAACAGAGTCACTCCAGAAGAAGCAGATCTAGGTATGATTGCTTACTATTTCCAAAAGTACGA ATTTGATGGTTTGATCATCGTTGGTGGTTTCGAAGCTTTTGAATCTTTACATCAATTAGAGAGAGCAAGA GAAAGTTATCCAGCTTTCAGAATCCCAATGGTCTTGATACCAGCTACTTTGTCTAACAATGTTCCAGGTA CTGAATACTCTTTGGGTTCTGATACCGCTTTGAATGCTCTAATGGAATACTGTGATGTTGTTAAACAATC CGCTTCTTCAACCAGAGGTAGAGCCTTCGTTGTCGATTGTCAAGGTGGTAACTCAGGCTATTTGGCCACT TACGCTTCTTTGGCTGTTGGTGCTCAAGTCTCTTATGTCCCAGAAGAAGGTATTTCTTTGGAGCAATTGT CCGAGGATATTGAATACTTAGCTCAATCTTTTGAAAAGGCAGAAGGTAGAGGTAGATTTGGTAAATTGAT TTTGAAGAGTACAAACGCTTCTAAGGCTTTATCAGCCACTAAATTGGCTGAAGTTATTACTGCTGAAGCC GATGGCAGATTTGACGCTAAGCCAGCTTATCCAGGTCATGTACAACAAGGTGGTTTGCCATCTCCAATTG ATAGAACAAGAGCCACTAGAATGGCCATTAAAGCTGTCGGCTTCATCAAAGACAACCAAGCTGCCATTGC TGAAGCTCGTGCTGCCGAAGAAAACTTCAACGCTGATGACAAGACCATTTCTGACACTGCTGCTGTCGTT GGTGTTAAGGGTTCACATGTCGTTTACAACTCCATTAGACAATTGTATGACTATGAAACTGAAGTTTCCA TGAGAATGCCAAAGGTCATTCACTGGCAAGCTACCAGACTCATTGCTGACCATTTGGTTGGAAGAAAGAG AGTTGATTAA SEQ ID NO: 134 - PFK2 de Saccharomvces cerevisiae
MTVTTPFVNGTSYCTVTAY SVQSYKAAIDFYTKFLSLENRSSPDENSTLLSNDSISLKILLRPDEKINKN VEAHLKELNSITKTQDWRSHATQSLVFNTSDILAVKDTLNAMNAPLQGYPTELFPMQLYTLDPLGNVVGV TSTKNAVSTKPTPPPAPEASAESGLSSKVHSYTDLAYRMKTTDTYPSLPKPLNRPQKAIAVMTSGGDAPG MNSNVRAIVRSAIFKGCRAFVVMEGYEGLVRGGPEYIKEFHWEDVRGWSAEGGTNIGTARCMEFKKREGR LLGAQHLIEAGVDALIVCGGDGSLTGADLFRSEWPSLIEELLKTNRISNEQYERMKHLNICGTVGSIDND MSTTDATIGAYSALDRICKAIDYVEATANSHSRAFVVEVMGRNCGWLALLAGIATSADYIFIPEKPATSS EWQDQMCDIVSKHRSRGKRTTIVVVAEGAIAADLTPISPSDVHKVLVDRLGLDTRITTLGHVQRGGTAVA YDRILATLQGLEAVNAVLESTPDTPSPLIAVNENKIVRKPLMESVKLTKAVAEAIQAKDFKRAMSLRDTE FIEHLNNFMAINSADHNEPKLPKDKRLKIAIVNVGAPAGGINSAVY SMATYCMSQGHRPYAIYNGWSGLA RHESVRSLNWKDMLGWQSRGGSEIGTNRVTPEEADLGMIAYYFQKYEFDGLIIVGGFEAFESLHQLERAR ESYPAFRIPMVLIPATLSNNVPGTEYSLGSDTALNALMEYCDVVKQSASSTRGRAFVVDCQGGNSGYLAT YASLAVGAQVSYVPEEGISLEQLSEDIEYLAQSFEKAEGRGRFGKLILKSTNASKALSATKLAEVITAEA DGRFDAKPAYPGHVQQGGLPSPIDRTRATRMAIKAVGFIKDNQAAIAEARAAEENFNADDKTISDTAAVV GVKGSHVVYNSIRQLYDYETEVSMRMPKV1HWQATRLIADHLVGRKRVD*
SEQ ID NO: 135 - ADN de PFK26 de Saccharomvces cerevisiae
ATGTTCAAACCAGTAGACTTCTCTGAAACATCTCCTGTGCCGCCTGATATTGATCTTGCTCCTACACAAT CTCCACACCATGTGGCACCTAGTCAAGACTCCAGTTATGATCTTTTATCCCGGAGTTCCGATGATAAAAT TGATGCTGAAAAGGGTCCGCATGATGAATTATCTAAGCACTTACCACTTTTTCAGAAAAGACCTTTGAGC GATACTCCTATATCGAGCAATTGGAACTCTCCTGGAATCACTGAAGAAAATACACCTTCTGACTCTCCTG AAAATAGCGCTACTAATTTGAAATCGCTACATCGATTGCATATTAACGACGAAACGCAACTAAAAAATGC TAAAATTCCCACAAACGATACTACTGACTACATGCCTCCTTCAGATGGAGCAAATGAGGTAACTCGGATT GATTTGAAAGACATTAAATCACCTACGAGACACCATAAAAGAAGACCTACCACCATCGATGTTCCTGGTT TAACAAAGTCTAAAACATCTCCAGATGGTCTCATATCAAAGGAAGATAGTGGATCAAAGTTAGTGATTGT CATGGTCGGACTGCCAGCTACGGGAAAGTCATTTATTACAAATAAATTATCCAGATTTTTAAATTATTCT TTATACTATTGTAAAGTGTTTAATGTCGGTAACACTAGAAGGAAGTTTGCTAAGGAGCATGGCCTAAAGG ACCAGGATTCAAAGTTTTTCGAGCCGAAAAACGCCGACTCTACTAGGTTGAGAGACAAATGGGCCATGGA TACTCTGGATGAATTGCTAGATTATTTATTAGAAGGTTCAGGATCTGTGGGAATTTTTGATGCTACAAAT ACCTCTCGTGAAAGAAGAAAAAACGTTCTGGCTAGAATCAGAAAGAGAAGTCCTCATTTGAAGGTTTTAT TTTTAGAATCTGTTTGTTCGGATCATGCACTGGTACAGAAAAATATTAGACTCAAATTATTTGGTCCAGA TTACAAAGGTAAAGATCCTGAAAGCTCTTTAAAAGATTTTAAAAGTCGCCTGGCAAACTACTTGAAAGCC TATGAACCAATTGAGGATGACGAAAATTTGCAGTACATCAAAATGATAGATGTGGGAAAGAAAGTCATCG CATACAATATTCAAGGGTTTTTAGCTTCGCAGACGGTATATTATTTGTTAAATTTCAATTTGGCTGACAG ACAAATTTGGATAACGAGAAGTGGCGAGAGCGAAGATAATGTTAGTGGCCGTATAGGCGGAAATTCCCAT TTGACTCCTCGTGGTCTAAGATTTGCTAAAAGTCTACCAAAATTCATTGCCAGACAGAGAGAAATATTTT ATCAAAATCTCATGCAACAAAAAAAGAATAATGAAAATACAGATGGGAACATTTATAATGACTTTTTCGT TTGGACCAGCATGCGTGCTAGGACTATAGGGACTGCTCAATATTTCAACGAAGATGATTATCCTATCAAA CAAATGAAAATGTTAGATGAGTTAAGTGCAGGTGATTATGATGGTATGACATATCCAGAAATTAAAAACA ACTTTCCTGAAGAATTCGAAAAAAGACAGAAAGATAAGTTGAGATACAGATACCCTGGTATTGGCGGTGA ATCGTATATGGACGTTATTAATAGACTCAGACCTGTTATCACAGAACTAGAAAGAATCGAGGATAACGTT CTTATTATTACACACCGGGTGGTGGCAAGAGCCTTATTGGGTTATTTTATGAACTTGAGTATGGGTATTA TTGCCAATTTGGATGTCCCATTACATTGTGTATATTGCCTAGAACCAAAACCATATGGAATCACTTGGTC ATTATGGGAGTATGATGAAGCATCGGATTCATTTTCTAAGGTCCCACAAACGGACTTGAATACCACCAGA GTAAAGGAGGTTGGCCTTGTTTATAATGAAAGAAGATATTCTGTTATACCAACAGCTCCGCCAAGTGCAA GAAGCAGCTTTGCAAGTGACTTTTTGTCAAGAAAAAGATCTAATCCTACTTCTGCATCTTCATCCCAGAG TGAATTATCAGAACAACCCAAGAATAGCGTTAGTGCTCAAACTGGCAGCAATAATACCACTCTCATTGGG AGCAACTTTAACATCAAGAATGAAAATGGTGATTCGAGAATACCATTATCTGCACCACTTATGGCCACTA ATACTTCTAATAACATCTTAGATGGTGGAGGTACCTCAATTTCGATACATCGTCCCAGGGTTGTTCCAAA TCAAAACAACGTGAATCCTCTTTTGGCTAACAACAATAAAGCGGCTTCTAATGTACCTAATGTAAAGAAG TCAGCGGCTACACCAAGGCAAATTTTTGAAATAGATAAAGTGGACGAAAAGTTATCCATGTTGAAAAATA AAAGTTTTCTATTACATGGAAAGGATTATCCTAATAATGCTGATAATAATGACAACGAAGATATAAGGGC AAAAACCATGAATCGCAGCCAAAGTCACGTTTAA SEQ ID NO: 136 - PFK26 de Saccharomvces cerevisiae
MFKPVDFSETSPVPPDIDLAPTQSPHHVAPSQDSSYDLLSRSSDDKIDAEKGPHDELSKHLPLFQKRPLS DTPISSNWNSPGITEENTPSDSPENSATNLKSLHRLHINDETQLKNAKIPTNDTTDYMPPSDGANEVTRI DLKDIKSPTRHHKRRPTTIDVPGLTKSKTSPDGLISKEDSGSKLVIVMVGLPATGKSFITNKLSRFLNYS LYYCKVFNVGNTRRKFAKEHGLKDQDSKFFEPKNADSTRLRDKWAMDTLDELLDYLLEGSGSVGIFDATN TSRERRKNVLARIRKRSPHLKVLFLESVCSDHALVQKNIRLKLFGPDYKGKDPESSLKDFKSRLANYLKA YEPIEDDENLQYIKMIDVGKKVIAYNIQGFLASQTVYYLLNFNLADRQIWITRSGESEDNVSGRIGGNSH LTPRGLRFAKSLPKFIARQREIFYQNLMQQKKNNENTDGNIYNDFFVWTSMRARTIGTAQYFNEDDYPIK QMKMLDELSAGDYDGMTYPEIKNNFPEEFEKRQKDKLRYRYPGIGGESYMDVINRLRPVITELERIEDNV LIITHRVVARALLGYFMNLSMGIIANLDVPLHCVYCLEPKPYGITWSLWEYDEASDSFSKVPQTDLNTTR VKEVGLVYNERRYSVIPTAPPSARSSFASDFLSRKRSNPTSASSSQSELSEQPKNSVSAQTGSNNTTLIG SNFNIKNENGDSRIPLSAPLMATNTSNNILDGGGTSIS1HRPRVVPNQNNVNPLLANNNKAASNVPNVKK SAATPRQIFEIDKVDEKLSMLKNKSFLLHGKDYPNNADNNDNEDIRAKTMNRSQSHV*
SEQ ID NO: 137 - ADN de PGM de Saccharomyces cerevisiae ATGTCCAATAACTCATTCACTAACTTCAAACTGGCCACTGAATTGCCAGCCTGGTCTAAGTTGCAAAAAA TTTATGAATCTCAAGGTAAGACTTTGTCTGTCAAGCAAGAATTCCAAAAAGATGCCAAGCGTTTTGAAAA ATTGAACAAGACTTTCACCAACTATGATGGTTCCAAAATCTTGTTCGACTACTCAAAGAACTTGGTCAAC GATGAAATCATTGCTGCATTGATTGAACTGGCCAAGGAGGCTAACGTCACCGGTTTGAGAGATGCTATGT TCAAAGGTGAACACATCAACTCCACTGAAGATCGTGCTGTCTACCACGTCGCATTGAGAAACAGAGCTAA CAAGCCAATGTACGTTGATGGTGTCAACGTTGCTCCAGAAGTCGACTCTGTCTTGAAGCACATGAAGGAG TTCTCTGAACAAGTTCGTTCTGGTGAATGGAAGGGTTATACCGGTAAGAAGATCACCGATGTTGTTAACA TCGGTATTGGTGGTTCCGATTTGGGTCCAGTCATGGTCACTGAGGCTTTGAAGCACTACGCTGGTGTCTT GGATGTCCACTTCGTTTCCAACATTGACGGTACTCACATTGCTGAAACCTTGAAGGTTGTTGACCCAGAA ACTACTTTGTTTTTGATTGCTTCCAAGACTTTCACTACCGCTGAAACTATCACTAACGCTAACACTGCCA AGAACTGGTTCTTGTCGAAGACAGGTAATGATCCATCTCACATTGCTAAGCATTTCGCTGCTTTGTCCAC TAACGAAACCGAAGTTGCCAAGTTCGGTATTGACACCAAAAACATGTTTGGTTTCGAAAGTTGGGTCGGT GGTCGTTACTCTGTCTGGTCGGCTATTGGTTTGTCTGTTGCCTTGTACATTGGCTATGACAACTTTGAGG CTTTCTTGAAGGGTGCTGAAGCCGTCGACAACCACTTCACCCAAACCCCATTGGAAGACAACATTCCATT GTTGGGTGGTTTGTTGTCTGTCTGGTACAACAACTTCTTTGGTGCTCAAACCCATTTGGTTGCTCCATTC GACCAATACTTGCACAGATTCCCAGCCTACTTGCAACAATTGTCAATGGAATCTAACGGTAAGTCTGTTA CCAGAGGTAACGTGTTTACTGACTACTCTACTGGTTCTATCTTGTTTGGTGAACCAGCTACCAACGCTCA ACACTCTTTCTTCCAATTGGTTCACCAAGGTACCAAGTTGATTCCATCTGATTTCATCTTAGCTGCTCAA TCTCATAACCCAATTGAGAACAAATTACATCAAAAGATGTTGGCTTCAAACTTCTTTGCTCAAGCTGAAG CTTTAATGGTTGGTAAGGATGAAGAACAAGTTAAGGCTGAAGGTGCCACTGGTGGTTTGGTCCCACACAA GGTCTTCTCAGGTAACAGACCAACTACCTCTATCTTGGCTCAAAAGATTACTCCAGCTACTTTGGGTGCT TTGATTGCCTACTACGAACATGTTACTTTCACTGAAGGTGCCATTTGGAATATCAACTCTTTCGACCAAT GGGGTGTTGAATTGGGTAAAGTCTTGGCTAAAGTCATCGGCAAGGAATTGGACAACTCCTCCACCATTTC TACCCACGATGCTTCTACCAACGGTTTAATCAATCAATTCAAGGAATGGATGTGA SEQ ID NO: 138 - PGM de Saccharomyces cerevisiae MSNNSFTNFKLATELPAWSKLQKIYESQGKTLSVKQEFQKDAKRFEKLNKTFTNYDGSKILFDYSKNLVN DEIIAALIELAKEANVTGLRDAMFKGEHINSTEDRAVYHVALRNRANKPMYVDGVNVAPEVDSVLKHMKE FSEQVRSGEWKGYTGKKITDVVNIGIGGSDLGPVMVTEALKHYAGVLDVHFVSNIDGTHIAETLKVVDPE TTLFLIASKTFTTAETITNANTAKNWFLSKTGNDPSHIAKHFAALSTNETEVAKFGIDTKNMFGFESWVG GRYSVWSAIGLSVALYIGYDNFEAFLKGAEAVDNHFTQTPLEDNIPLLGGLLSVWYNNFFGAQTHLVAPF DQYLHRFPAYLQQLSMESNGKSVTRGNVFTDY STGSILFGEPATNAQHSFFQLVHQGTKLIPSDFILAAQ SHNPIENKLHQKMLASNFFAQAEALMVGKDEEQVKAEGATGGLVPHKVFSGNRPTTSILAQKITPATLGA LIAYYEHVTFTEGAIWNINSFDQWGVELGKVLAKVIGKELDNSSTISTHDASTNGLINQFKEWM* SEQ ID NO: 139 - ADN de GPM1 de Saccharomyces cerevisiae
ATGCCAAAGTTAGTTTTAGTTAGACACGGTCAATCCGAATGGAACGAAAAGAACTTATTCACCGGTTGGG TTGATGTTAAATTGTCTGCCAAGGGTCAACAAGAAGCCGCTAGAGCCGGTGAATTGTTGAAGGAAAAGAA GGTCTACCCAGACGTCTTGTACACTTCCAAGTTGTCCAGAGCTATCCAAACTGCTAACATTGCTTTGGAA AAGGCTGACAGATTATGGATTCCAGTCAACAGATCCTGGAGATTGAACGAAAGACATTACGGTGACTTAC AAGGTAAGGACAAGGCTGAAACTTTGAAGAAGTTCGGTGAAGAAAAATTCAACACCTACAGAAGATCCTT CGATGTTCCACCTCCCCCAATCGACGCTTCTTCTCCATTCTCTCAAAAGGGTGATGAAAGATACAAGTAC GTTGACCCAAATGTCTTGCCAGAAACTGAATCTTTGGCTTTGGTCATTGACAGATTGTTGCCATACTGGC AAGATGTCATTGCCAAGGACTTGTTGAGTGGTAAGACCGTCATGATCGCCGCTCACGGTAACTCCTTGAG AGGTTTGGTTAAGCACTTGGAAGGTATCTCTGATGCTGACATTGCTAAGTTGAACATCCCAACTGGTATT CCATTGGTCTTCGAATTGGACGAAAACTTGAAGCCATCTAAGCCATCTTACTACTTGGACCCAGAAGCTG CCGCTGCTGGTGCCGCTGCTGTTGCCAACCAAGGTAAGAAATAA SEQ ID NO: 140 - GPM1 de Saccharomvces cerevisiae
MPKLVLVRHGQSEWNEKNLFTGWVDVKLSAKGQQEAARAGELLKEKKVYPDVLYTSKLSRAIQTANIALE KADRLWIPVNRSWRLNERHYGDLQGKDKAETLKKFGEEKFNTYRRSFDVPPPPIDASSPFSQKGDERYKY VDPNVLPETESLALVIDRLLPYWQDVIAKDLLSGKTVMIAAHGNSLRGLVKHLEGISDADIAKLNIPTGI PLVFELDENLKPSKPSYYLDPEAAAAGAAAVANQGKK SEQ ID NO: 141 - ADN de TPI1 de Saccharomvces cerevisiae
ATGGCTAGAACTTTCTTTGTCGGTGGTAACTTTAAATTAAACGGTTCCAAACAATCCATTAAGGAAATTG TTGAAAGATTGAACACTGCTTCTATCCCAGAAAATGTCGAAGTTGTTATCTGTCCTCCAGCTACCTACTT AGACTACTCTGTCTCTTTGGTTAAGAAGCCACAAGTCACTGTCGGTGCTCAAAACGCCTACTTGAAGGCT TCTGGTGCTTTCACCGGTGAAAACTCCGTTGACCAAATCAAGGATGTTGGTGCTAAGTGGGTTATTTTGG GTCACTCCGAAAGAAGATCTTACTTCCACGAAGATGACAAGTTCATTGCTGACAAGACCAAGTTCGCTTT AGGTCAAGGTGTCGGTGTCATCTTGTGTATCGGTGAAACTTTGGAAGAAAAGAAGGCCGGTAAGACTTTG GATGTTGTTGAAAGACAATTGAACGCTGTCTTGGAAGAAGTTAAGGACTGGACTAACGTCGTTGTCGCTT ACGAACCAGTCTGGGCCATTGGTACCGGTTTGGCTGCTACTCCAGAAGATGCTCAAGATATTCACGCTTC CATCAGAAAGTTCTTGGCTTCCAAGTTGGGTGACAAGGCTGCCAGCGAATTGAGAATCTTATACGGTGGT TCCGCTAACGGTAGCAACGCCGTTACCTTCAAGGACAAGGCTGATGTCGATGGTTTCTTGGTCGGTGGTG CTTCTTTGMGCCAGMTTTGTTGATATCATCAACTCTAGAMCTAA SEQ ID NO: 142 - TPI1 de Saccharomvces cerevisiae
MARTFFVGGNFKLNGSKQSIKEIVERLNTASIPENVEVVICPPATYLDYSVSLVKKPQVTVGAQNAYLKA SGAFTGENSVDQIKDVGAKWVILGHSERRSYFHEDDKFIADKTKFALGQGVGVILCIGETLEEKKAGKTL DVVERQLNAVLEEVKDWTNVVVAYEPVWAIGTGLAATPEDAQD1HASIRKFLASKLGDKAASELRILYGG SANGSNAVT FKDKADVDGFLVGGASLKPEFVDIINSRN SEQ ID NO: 147 - ADN de PGM1 de Saccharomvces cerevisiae
ATGTCACTTCTAATAGATTCTGTACCAACAGTTGCTTATAAGGACCAAAAACCGGGTACTTCAGGTTTAC GTAAGAAGACCAAGGTTTTCATGGATGAGCCTCATTATACTGAGAACTTCATTCAAGCAACAATGCAATC TATCCCTAATGGCTCAGAGGGAACCACTTTAGTTGTTGGAGGAGATGGTCGTTTCTACAACGATGTTATC ATGAACAAGATTGCCGCAGTAGGTGCTGCAAACGGTGTCAGAAAGTTAGTCATTGGTCAAGGCGGTTTAC TTTCAACACCAGCTGCTTCTCATATAATTAGAACATACGAGGAAAAGTGTACCGGTGGTGGTATCATATT AACTGCCTCACACAACCCAGGCGGTCCAGAGAATGATTTAGGTATCAAGTATAATTTACCTAATGGTGGG CCAGCTCCAGAGAGTGTCACTAACGCTATCTGGGAAGCGTCTAAAAAATTAACTCACTATAAAATTATAA AGAACTTCCCCAAGTTGAATTTGAACAAGCTTGGTAAAAACCAAAAATATGGCCCATTGTTAGTGGACAT AATTGATCCTGCCAAAGCATACGTTCAATTTCTGAAGGAAATTTTTGATTTTGACTTAATTAAAAGCTTC TTAGCGAAACAGCGCAAAGACAAAGGGTGGAAGTTGTTGTTTGACTCCTTAAATGGTATTACAGGACCAT ATGGTAAGGCTATATTTGTTGATGAATTTGGTTTACCGGCAGAGGAAGTTCTTCAAAATTGGCACCCTTT ACCTGATTTCGGCGGTTTACATCCCGATCCGAATCTAACCTATGCACGAACTCTTGTTGACAGGGTTGAC CGCGAAAAAATTGCCTTTGGAGCAGCCTCCGATGGTGATGGTGATAGGAATATGATTTACGGTTATGGCC CTGCTTTCGTTTCGCCAGGTGATTCTGTTGCCATTATTGCCGAATATGCACCCGAAATTCCATACTTCGC CAAACAAGGTATTTATGGCTTGGCACGTTCATTTCCTACATCCTCAGCCATTGATCGTGTTGCAGCAAAA AAGGGATTAAGATGTTACGAAGTTCCAACCGGCTGGAAATTCTTCTGTGCCTTATTTGATGCTAAAAAGC TATCAATCTGTGGTGAAGAATCCTTCGGTACAGGTTCCAATCATATCAGAGAAAAGGACGGTCTATGGGC CATTATTGCTTGGTTAAATATCTTGGCTATCTACCATAGGCGTAACCCTGAAAAGGAAGCTTCGATCAAA ACTATTCAGGACGAATTTTGGAACGAGTATGGCCGTACTTTCTTCACAAGATACGATTACGAACATATCG AATGCGAGCAGGCCGAAAAAGTTGTAGCTCTTTTGAGTGAATTTGTATCAAGGCCAAACGTTTGTGGCTC CCACTTCCCAGCTGATGAGTCTTTAACCGTTATCGATTGTGGTGATTTTTCGTATAGAGATCTAGATGGC TCCATCTCTGAAAATCAAGGCCTTTTCGTAAAGTTTTCGAATGGGACTAAATTTGTTTTGAGGTTATCCG GCACAGGCAGTTCTGGTGCAACAATAAGATTATACGTAGAAAAGTATACTGATAAAAAGGAGAACTATGG CCAAACAGCTGACGTCTTCTTGAAACCCGTCATCAACTCCATTGTAAAATTCTTAAGATTTAAAGAAATT TTAGGAACAGACGAACCAACAGTCCGCACATAG SEQ ID NO: 148 - PGM1 de Saccharomyces cerevisiae
MSLLIDSVPTVAYKDQKPGTSGLRKKTKVFMDEPHYTENFIQATMQSIPNGSEGTTLVVGGDGRFYNDVI MNKIAAVGAANGVRKLVIGQGGLLSTPAASHIIRTYEEKCTGGGIILTASHNPGGPENDLGIKYNLPNGG PAPESVTNAIWEASKKLTHYKIIKNFPKLNLNKLGKNQKYGPLLVDIIDPAKAYVQFLKEIFDFDLIKSF LAKQRKDKGWKLLFDSLNGITGPYGKAIFVDEFGLPAEEVLQNWHPLPDFGGLHPDPNLTYARTLVDRVD REKIAFGAASDGDGDRNMIYGYGPAFVSPGDSVAIIAEYAPEIPYFAKQGIYGLARSFPTSSAIDRVAAK KGLRCYEVPTGWKFFCALFDAKKLSICGEESFGTGSNHIREKDGLWAIIAWLNILAIYHRRNPEKEASIK TIQDEFWNEYGRTFFTRYDYEHIECEQAEKVVALLSEFVSRPNVCGSHFPADESLTVIDCGDFSYRDLDG SISENQGLFVKFSNGTKFVLRLSGTGSSGATIRLYVEKYTDKKENYGQTADVFLKPVINSIVKFLRFKEI LGTDEPTVRT SEQ ID NO: 149 - ADN de PGM3 de Saccharomyces cerevisiae

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Una célula de Saccharomyces recombinante que es capaz de fermentar xilosa y que comprende un gen heterólogo que codifica una xiluloquinasa (XK), en donde la XK:
- proporciona una actividad enzimática para convertir D-xilulosa en xilulosa 5-fosfato al menos dos veces la proporcionada por XK de S. cerevisiae descrita como SEQ ID NO: 32, y
- proporciona una tasa de crecimiento anaerobio de la célula recombinante en xilosa que es mayor que la proporcionada por XK de S. cerevisiae de SEQ ID NO: 32, y
en donde la XK tiene una identidad de secuencia de al menos 80 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o una identidad de secuencia de al menos 80 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
2. La célula recombinante de la reivindicación 1, en donde la XK tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o una identidad de secuencia de al menos 90 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
3. La célula recombinante de la reivindicación 1, en donde la XK tiene una identidad de secuencia de al menos 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o una identidad de secuencia de al menos 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
4. Un procedimiento para producir una célula de Saccharomyces recombinante, que comprende transformar una célula de Saccharomyces con uno o más vectores que comprenden genes que codifican
- una XK que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 80 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, tal como al menos 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 80 % con SEQ ID NO: 22, tal como al menos 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22,
- una XR, y
- una XDH y, opcionalmente, secuencias reguladoras para expresar los genes en la célula huésped.
5. La célula recombinante de la reivindicación 1, que se deriva de una célula de Saccharomyces cerevisiae.
6. La célula recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende un gen heterólogo que codifica una transaldolasa (TAL), un gen heterólogo que codifica una transcetolasa (TKL) y un gen heterólogo que codifica una ribosa 5-fosfato cetol-isomerasa (RKI), y
(a) un gen heterólogo que codifica una xilosa reductasa (XR) y un gen heterólogo que codifica una xilitol deshidrogenasa (XDH), y/o
(b) un gen heterólogo que codifica una xilosa isomerasa (XI).
7. Un método para producir un producto de fermentación, que comprende
(a) poner en contacto la célula recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 con un medio que comprende una fuente de carbono que comprende xilosa o arabinosa bajo condiciones anaerobias, y
(b) aislar el producto de fermentación del medio.
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