TWI438274B - 一種木糖代謝菌之製備方法及該木糖代謝菌 - Google Patents

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Description

一種木糖代謝菌之製備方法及該木糖代謝菌
本發明係關於一種製備Saccharomyces cerevisiae 基因重組菌株之方法，尤其是製備具有快速代謝木糖之基因重組菌株，且該菌株能同時利用葡萄糖及木糖並轉化成酒精。
纖維酒精是現今最具潛力被用來取代石化燃料之替代能源，現階段研發重點即在於如何降低成本，以符合經濟效益。
而纖維酒精生產程序大致可分為原料前處理(pretreatment)、糖化(saccharification)、醱酵(fermentation)及蒸餾等四個主要步驟；在程序設計上則以非同步水解醱酵程序(Separate/Sequential Hydrolysis and Fermentation,SHF)及同步水解醱酵程序(Simultaneous Saccharification and Fermentation,SSF)為目前現有且較成熟之纖維素轉化酒精程序。
於一般纖維生質原料主要含有60~80%的纖維素、半纖維素及15~25%的木質素，其中半纖維素需要先以前處理程序轉化成五碳糖(主要為木糖)後，才能以生物醱酵技術將這些單糖進一步醱酵為酒精。目前最常使用之酒精醱酵菌株為Saccharomyces cerevisiae (釀酒酵母)，因為該釀酒酵母具有高酒精產率，同時該釀酒酵母對於環境抑制物亦具有高耐受力，在工業上已被廣泛應用；但由於該釀酒酵母缺乏代謝木糖之能力，使得目前纖維酒精產製程序的五碳糖醱酵及六碳糖醱酵單元必需利用不同醱酵菌株分開進行，使得纖維酒精產製程序的設備眾多，因此也提高了設備成本，同時亦增加原料流失率，不符經濟效益。
目前文獻常見以Pichia sp.(酵母菌)作為木糖醱酵菌株，因為其具有較高的木糖轉化酒精能力，但Pichia sp.對於酒精濃度及環境抑制物的耐受能力較低，因而在工業上的應用便有所限制。一般纖維原料經由前處理的過程中，即會因為反應條件的不同而產生若干濃度的醋酸(Acetic acid)、糠醛(Furfural)及羥甲基糠醛(Hydroxymethyl furfural)等醱酵抑制物(糠醛0.5~2.0 gL-1 會抑制生產率29~95%及抑制生長速率25~99%；羥甲基糠醛1.0-5.0 gL-1 則會抑制生產率17~91%及抑制生長速率5~99%)，因此現階段前處理所得之木糖水解液通常亦會再經由過鹼化法(Overliming)來移除糠醛，以便將前處理後產出的水解液去毒性(Detoxification)，方能讓Pichia sp.在後續醱酵過程順利進行醱酵；然而，過鹼化法的調理過程中，通常會造成木糖損失，同時會產生硫酸鈣污泥，故需要投入額外之經費與設備方能處理及處置，使生產成本提高。
而Saccharomyces cerevisiae 雖然不能利用木糖，但是卻能代謝其異構物木酮糖(Xylulose)，但是其代謝速率相當緩慢；S. cerevisiae 之基因體中含有木糖代謝途徑所需之基因GRE3 (XR)、ScXYL2 (XDH)、XKS1 (XK)，然而，這些基因在S. cerevisiae 的表現量過低使得木糖無法被利用。
而經由基因工程大量表現上述內源木糖代謝基因後，S. cerevisiae 仍然不能有效利用木糖。為了提升S. cerevisiae 代謝木糖能力，已有研究大量表現來自於Pichia stipitis 的外源木糖代謝基因XYL1 (PsXR)及XYL2 (PsXDH)，是原生可利用木糖生長之菌株，在厭氧情況下能醱酵木糖且酒精轉化率可近理論值。然而，基因重組之S. cerevisiae 經由表現PsXR及PsXDH後，卻產生大量的木糖醇(Xylitol)，因而大幅降低酒精產率。據研究顯示是因為PsXR及PsXDH對於輔因子(Cofactor)依賴性的差異而造成氧化還原不平衡(Redox imbalance)所致。PsXR能利用NADH及NADPH作為輔因子，但主要是NADPH，為NADPH依賴型之酵素，而PsXDH只能利用NAD+ ，為NAD+ 依賴型酵素。因此當PsXR及PsXDH反應進行會造成大量NADH堆積，造成NAD+ 短缺，使得反應無法繼續進行而堆積大量木糖醇。
但是於P. stipitis 本身卻沒有明顯的木糖醇堆積，此乃因為P. stipitis 本身具有一特異複雜的氧化呼吸系統，該系統含有兩種電子傳遞鏈位於其粒線體之中，分別是cytochrome電子傳遞系統及non-cytochrome電子傳遞系統，其中non-cytochrome電子傳遞系統是一種salicyl hydroxamic acid(SHAM) sensitive pathway，這種途徑像是一個氧化還原池，可以提供輔因子來平衡氧化還原態，而其他酵母菌就缺乏這樣的系統。因此這也是即使S. cerevisiae 使用P. stipitis 的木糖代謝基因卻仍然有大量木糖醇堆積之原因。
有鑑於此，相關文獻提出不同策略來解決此一問題，例如PsXDH的表現量必須高於PsXR才能降低木糖醇的堆積並增加酒精產率，或是將PsXDH進行蛋白質工程，改變PsXDH對於輔因子的依賴性，即針對PsXDH進行多點突變，使PsXDH對於NADP+ 活性大為提高，輔因子之依賴性也偏向NADP+ ，如此改變能大幅提高酒精產率及降低木糖醇產生；同時，亦可利用隨機突變方式提高XR之活性或改變輔因子的專一性，亦能大幅提升木糖轉化酒精之效率。此外，近來的相關研究也顯示PsXR、PsXDH及PsXR的活性必須在一定比例能達到木糖代謝之最佳效率。
除上述在主要木糖代謝途徑之基因改良外，木糖代謝速率緩慢仍為一主要瓶頸。通常在同時含有葡萄糖及木糖之共醱酵環境下，Saccharomyces cerevisiae 會先代謝葡萄糖，當葡萄糖代謝至一定濃度以下，才會開始代謝木糖。先前研究顯示葡萄糖濃度要低於25 gL-1 ，S. cerevisiae 才會開始代謝木糖，因為S. cerevisiae 攝取葡萄糖或木糖是利用同一個非專一性糖類傳輸系統，但葡萄糖對於傳輸子之親合性相對於木糖要高出許多，因為對於傳輸子競爭抑制的關係造成木糖代謝速率相對下降。此外，依據相關文獻顯示過量表現五碳糖磷酸代謝途徑酵素TAL，TKL，RPE，RKI亦可提升木糖代謝速率。
而基因改造菌株若需於使用於工業用途，菌株之高環境耐受力及穩定性相當重要。而對於環境抑制物耐受力及穩定性通常可採用馴化方式提升與維持，但若基因改造菌株是利用表現質體製備，則不適於工業用途，因為表現質體容易流失，通常需用昂貴之抗生素或營養缺陷培養基維持，因此基因改造菌株若要穩定表現重組基因必須將所欲轉殖的基因鑲嵌至菌株染色體中，以使導入的基因可於該基因改造菌中穩定的表現。
纖維酒精工業之發展為目前世界各國努力的目標，世界各地雖已有許多研究單位投入纖維酒精共醱酵菌之研發工作，但共醱酵菌株應用於纖維酒精工業需要同時具有高木糖轉化酒精效率，高木糖代謝速率以及對環境抑制物具高耐受力等特性，技術門檻高，因此如何開發出實際在工業應用之代表性菌株即為本發明領域之一大課題。
其中Saccharomyces cerevisiae 之木糖代謝研究至今已約二十年，無論在木糖代謝途徑相關基因之表現、XR-XDH途徑輔因子氧化還原不平衡之改良、置入外源XI木糖代謝途徑以及在木糖傳輸子之製備上等等，均有相關之研究報告，但目前仍未有一完整策略能大幅提升菌株代謝木糖之效率。
依據文獻顯示，Saccharomyces cerevisiae 若有較高之XR及XDH活性有助於提升木糖代謝速率，但XR活性過高會造成木糖醇大量堆積。另外，亦有文獻顯示，XK的活性過高會影響菌株生長。由此可見，木糖代謝途徑並非只有單一限制步驟，而是必須經過各步驟精密配合才能發揮最好的效果。但是要精密的控制各個步驟之活性表現相當困難，因此在製備菌株之過程中若加上以菌株突變或是自然演化方式進行篩選或馴化，通常能獲得更好之結果。現階段之菌株突變篩選或馴化通常是利用菌株整體隨機突變及自然演化方式進行，必須歷經較長時之篩選過程，且未能針對主要需要改良之部分進行調整，效果較差，因此建立一套快速準確之篩選模式亦為目前共醱酵菌株研究領域所需發展之項目。
Saccharomyces cerevisiae 共醱酵菌株應用於纖維酒精工業需要同時具有高木糖轉化酒精產率、高木糖代謝速率及對環境抑制物具高耐受力等特性。目前文獻發表之S. cerevisiae 共醱酵菌株，若以人工合成培養基醱酵，木糖轉化酒精產率約60~80%(0.3~0.4gg-1 )，但木糖代謝速率仍然緩慢，約0.2~1.5 gL-1 h-1 ，若將菌株實際應用在木質纖維水解液(如前處理過後之稻稈、蔗渣、玉米稈等)，又會因為水解液中的抑制物而影響代謝木糖之效率。依據文獻顯示，提高XR活性能增加木糖代謝速率，同時另有研究表示XR除能代謝木糖，亦能代謝水解液之抑制物(如HMF、Furfural)形成對細胞無毒之產物。因此提高目前共醱酵菌株對於木糖代謝速率為必要發展之項目。
本發明之目的係以基因重組方法及同時轉型多個基因表現質體方式來製備能快速代謝木糖之Saccharomyces cerevisiae (釀酒酵母)的共醱酵菌株。本發明以同時轉型多個質體方法配合以具篩選壓力之培養基來篩選菌株，篩選出具最佳木糖代謝基因表現量比例之菌株，達到菌株最佳化及快速篩選之目的。
本發明所製備的S. cerevisiae 基因改造菌株能以纖維木糖水解液進行醱酵，縮短菌株代謝木糖所需時間，同時降低纖維酒精產製程序的時程及成本。
本發明之另一目的係以Saccharomyces cerevisiae 基因改造菌株作為木糖代謝菌，只需一套種菌培養設備；然而，現階段纖維酒精產製程序之五碳糖醱酵及六碳糖醱酵單元為利用不同醱酵菌株分開進行，需要兩套種菌株培養設備才得以同時進行，相較之下本發明提供一種較低設備成本之醱酵菌種。
本發明之再一目的係以Saccharomyces cerevisiae 基因改造菌株作為木糖代謝菌，相較於現階段纖維酒精產製程序常用之木糖醱酵菌株Pichia sp.有較高之環境耐受能力；同時於醱酵時使用的木糖水解液不須經由繁複的去毒性步驟即可進行醱酵，亦可大幅減少木糖水解液去毒性之耗材及設備成本。而S. cerevisiae 同時也是美國食品藥物管理局認定安全之食品(Generally recognized as safe,GRAS)，不會危急人類或環境，因此若以此菌株作為木糖代謝菌係為一安全可靠之選擇。
本發明之木糖代謝菌可以利用人工合成的木糖/葡萄糖培養基進行醱酵(43 gL-1 木糖，10 gL-1 葡萄糖)，在低醱酵起始單位菌體濃度(細胞乾重約0.4~0.6 gL-1 )及低攪拌轉數(150 rpm)情況下，單位時間之木糖消耗速率最高可達1.77 gL-1 h-1 ，總糖酒精產量最高可達0.34 gg-1 ，於目前文獻發表之大多數Saccharomyces cerevisiae 基因改造菌株(多數在高起始菌體濃度及高攪拌速率條件下，木糖消耗速率約0.2~1.5 gL-1 h-1 )，即顯示本發明之木糖代謝菌確實於木糖代謝速率上提供明顯之改善。
本發明之木糖代謝菌亦可利用未去毒性之稻稈纖維木糖水解液進行醱酵(8.6 gL-1 葡萄糖、43.6 gL-1 木糖、5.1 gL-1 阿拉伯糖、糠醛約1.3~1.4 gL-1 、羥甲基糠醛約0.9~1.1 gL-1)，結果顯示在低醱酵起始單位菌體濃度(細胞乾重約0.4-0.6 gL-1 )及低攪拌轉數(150 rpm)情況下，纖維木糖水解液醱酵48小時，木糖利用率約82%，總糖酒精產量最高可達0.36 gg-1 ，單位時間及菌體濃度之木糖消耗速率約0.74 gL-1 h-1 ，其結果顯示本發明之木糖代謝菌亦能以未去毒性之稻稈纖維木糖水解液進行醱酵，木糖消耗速率亦高於目前文獻發表之Saccharomyces cerevisiae 基因改造菌株於纖維水解液之醱酵結果(多數在高起始菌體濃度及高醱酵轉數條件下，木糖消耗速率約0.6 gL-1 h-1 以下)。
基於上述說明，本發明所製備的Saccharomyces cerevisiae 木糖代謝菌能快速代謝木糖，除了能以人工培養基進行醱酵，亦能以高抑制物濃度之纖維木糖水解液進行醱酵，縮短菌株代謝木糖所需時間，降低纖維酒精產製程序之時程及成本，可實際應用在纖維酒精產業及釀酒工業。
為使充分瞭解本發明之目的、特徵及功效，茲藉由下述具體之實施例，並配合所附之圖式，對本發明做一詳細說明，說明如後：
實施例1
製備 Saccharomyces cerevisiae 共醱酵菌株YY5A
A.　製備質體pB-PGK-XYL2
製備質體pB-PGK-XYL2之步驟如下：
(一)　以P. stipitis 染色體作為模板，根據基因序列設計一對引子Y0811/Y0812(見下表1)，以PCR方法增幅合成XYL2 基因，純化後之基因片段以Hind III/Pst I剪切，黏接至質體pBluescriptSKII(Stratagene)之相對選殖位置，而得到質體pBlue-XYL2。
(二)　以質體pAD-GAL4-2.1(Stratagene)為模板，設計一對引子Y0801/Y0802(見下表1)，使用PCR將一段含有ADH1啟動子和終結子之DNA片段增幅合成出來，以Apa I/Sac I剪切，隨之黏接至質體pBluescriptSKII(Stratagene)之相對選殖位置，得到質體pB-ADH-GAL4AD。
(三)　接著以質體pB-ADH-GAL4AD為模板，設計一對引子Y0803/Y0804(見下表1)，將質體pB-ADH-GAL4AD突變增生一個Nde I選殖位置，而得到質體pB-ADH-GAL4ADN。
(四)　另以質體pGG119(逢甲大學趙雲鵬博士提供,Rinji Akada,Isao Hirosawa,Miho Kawahata,Hisahi Hoshida and Yoshinori Nishizawa. 2002. Sets of integrating plasmids and gene disruption cassettes containing improved counter-selection markers designed for repeated use in budding yeast. Yeast. 19:393-402.)為模板，再利用一對引子Y0805/0806(見下表1)將一段含有PGK啟動子的DNA片段增幅出來，使用Apa I/Nde I剪切後，隨之黏接至質體pB-ADH-GAL4ADN，得到質體pB-PGK-GAL4ADN。
(五)　最後以NdeI /Pst I剪切質體pBlue-XYL2，黏接至Nde I/Pst I剪切過之質體pB-PGK-GAL4ADN，得到質體pB-PGK-XYL2(見第1圖)。
B.　製備質體pB-PGK-CXYL1
製備質體pB-PGK-CXYL1之步驟如下：
(一)　以Candida sp. 之染色體作為模板，設計引子對Y0903/Y0904(見下表1)，以PCR方法增幅一段CXYL1 基因，純化後之基因片段以Hind III/Pst I剪切黏接至質體pBluescriptSKII之相對選殖位置，得到質體pBlue-CXYL1。
(二)　將質體pBlue-CXYL1以Nde I/EcoR I剪切，與經Nde I/EcoR I剪切之質體pB-PGK-GAL4ADN接合反應，得到質體pB-PGK-CXYL1(見第2圖)。
C.　製備S. cerevisiae 共醱酵菌株YY5A
製備S. cerevisiae 共醱酵菌株YY5A步驟如下：
(一)　以pB-PGK-CXYL1質體為模板，設計引子對PGKKpnIfw及ADH1KpnI/SacIrv(見下表1)，以PCR方式增幅PGK-CXYL1-ADH1基因片段。再以Kpn I/Sac I剪切PGK-CXYL1-ADH1基因片段，黏接至KpnI/SacI剪切過之pAUR101質體(Takara Bio)，所得之新質體命名為pAURC1(見第3圖)。
(二) pAURC1質體以Stu I限制酵素剪切為線型基因片段後，以電穿孔法進行基因轉殖入S. cerevisiae YY2KL(ADH2::PGK1p-CXYL1-ADH1t,XKS1p::PGKp,HO::PGK1p-XYL2-ADH1t,Mig1::TEFp-TAL1-TEFt，逢甲大學趙雲鵬博士提供)，在含有抗生素Aureobasidin A之YPD培養基進行轉殖株篩選，得到一基因重組菌株命名為YYA1。
(三)　以S. cerevisiae 20270之染色體為模板，設計引子對5SrDNAfw及5SrDNArv(見下表1)，以PCR方式增幅5S rDNA基因片段。再以Bgl II/Kpn I剪切5S rDNA基因片段，黏接至Bgl II/Kpn I剪切過之pGAPZαA質體(Invitrogen)，所得之新質體命名為pGAP5S。
(四)　以pB-PGK-XYL2質體為模板，設計引子對PGKNotIfw及ADH1BamHIrv(見下表1)，以PCR方式增幅PGK-XYL2-ADH1基因片段。再以Not I/BamH I剪切PGK-XYL2-ADH1基因片段，黏接至Not I/BamH I剪切過之pGAP5S質體，所得之新質體命名為p5SXYL2(見第4圖)。
(五)　以Pichia stipitis 之染色體為模板，設計引子對XKfw及XKrv(見下表1)，以PCR方式增幅XK 基因片段。再以Nde I/Pst I剪切XK 基因片段，黏接至Nde I/Pst I剪切過之p5SXYL2質體，所得之新質體命名為p5SXK(見第5圖)。
(六)　再將p5SXK及p5SXYL2質體以Sph I限制酵素剪切為線型基因片段後，同時轉殖入YYA1菌株，在含有抗生素Zeocin之YPX培養基進行轉殖株篩選，選擇數顆生長較快速之菌落進行醱酵測試比較。將轉殖株(A-I)培養於YPD medium(10 gL-1 yeast extract,20 gL-1 glucose,20 gL-1 peptone)，150 rpm，30℃，16 hr。再將10 ml種菌轉移至50 mL新鮮人工合成木糖/葡萄糖溶液(10 gL-1 yeast extract，(42~50 gL-1 xylose/10~13 gL-1 glucose)，20 gL-1 peptone)，在250 mL瓶杯進行醱酵測試，150 rpm，30℃。醱酵結果如第6圖至第8圖，其中以H菌株具有最快之代謝木糖能力及酒精產率，將其命名為YY5A(其中該菌株寄存於中華民國食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 920072)。後續將此菌進一步進行不同葡萄糖/木糖比例之人工培養基及纖維水解液之醱酵測試。
實施例2
人工木糖/葡萄糖混和溶液醱酵測試
首先以人工合成之木糖/葡萄糖溶液為例，說明本發明中Saccharomyces cerevisiae 基因改造菌株YY5A之共醱酵結果。首先，將基因改造菌株培養於YPD medium(10 gL-1 yeast extract,20 gL-1 glucose,20 gL-1 peptone)，150 rpm，30℃，16 hr。再將10 mL種菌轉移至50 mL新鮮人工合成木糖/葡萄糖溶液(10 gL-1 1 yeast extract,43 gL-1 xylose,10 gL-1 glucose,20 gL-1 peptone)，在250 mL瓶杯進行醱酵測試(起始菌體濃度約0.65 gL-1 )，150 rpm，30℃。由第9圖的結果顯示基因改造菌株YY5A在24小時可消耗木糖約42.4 g，木糖利用率為98.7%，木糖消耗速率為1.77 gL-1 h-1 ，能生產約19.4 gL-1 之酒精，酒精產量約0.34 gg-1 。
實施例3
纖維水解液醱酵測試
先將基因改造菌株培養於YPD medium(10 gL-1 yeast extract,20 gL-1 glucose,20 gL-1 peptone)，150 rpm，30℃，16 hr。再將10 mL種菌轉移至50 mL纖維木糖水解液(8.6 gL-1 glucose,43.6 gL-1 xylose,5.1 gL-1 arabinose,1.38 gL-1 furfural, 1.0 gL-1 HMF)，在250 mL瓶杯進行醱酵測試(起始菌體濃度約0.4 gL-1 )，150 rpm，30℃。由第10圖結果顯示在木糖43.6 gL-1 情況下，基因改造菌株48小時可消耗木糖約35.4 g，木糖利用率為81.2%，木糖消耗速率為0.74 gL-1 h-1 ，能生產約17.1 gL-1 之酒精，酒精產量約0.36 gg-1 。
基於上述結果說明本發明製備之Saccharomyces cerevisiae 共醱酵菌株能快速代謝木糖。除了能以人工培養基進行醱酵，亦能以高抑制物濃度之纖維木糖水解液進行醱酵。人工培養基之木糖消耗速率最高可達1.77 gL-1 h-1 ，纖維木糖水解液之木糖消耗速率最高可達0.74 gL-1 h-1 。
本發明在上文中已以較佳實施例揭露，然熟習本項技術者應理解的是，該實施例僅用於描繪本發明，而不應解讀為限制本發明之範圍。應注意的是，舉凡與該實施例等效之變化與置換，均應設為涵蓋於本發明之範疇內。因此，本發明之保護範圍當以申請專利範圍所界定者為準。
第1圖係為本發明中質體pB-PGK-XYL2之基因圖譜。
第2圖係為本發明中質體pB-PGK-CXYL1之基因圖譜。
第3圖係為本發明中質體pAURC1之基因圖譜。
第4圖係為本發明中質體p5SXYL2之基因圖譜。
第5圖係為本發明中質體p5SXK之基因圖譜。
第6圖係本發明中待篩選菌株A~H針對木糖之醱酵結果圖。
第7圖係本發明中待篩選菌株A~H以木糖為基質之木糖醇產率結果圖。
第8圖係本發明中待篩選菌株A~H以木糖為基質之酒精產率結果圖。
第9圖係本發明中YY5A菌株以人工木糖/葡萄糖混和溶液醱酵測試結果圖。
第10圖係本發明中YY5A菌株以纖維水解液醱酵測試結果圖。

Claims (6)

  1. 一種木糖代謝菌之製備方法，其中該木糖代謝菌之菌株係為Saccharomyces cerevisiae (釀酒酵母)，其係於該木糖代謝菌中導入木糖代謝基因，使該木糖代謝菌以木糖為主要的生長碳源，並能同時醱酵葡萄糖及木糖；係同時將兩個木糖代謝基因XK及XYL2以兩個不同的表現質體p5SXK及p5SXYL2轉殖入該木糖代謝菌；並轉殖入該木糖代謝菌之基因係進一步鑲嵌入該木糖代謝菌之染色體，且該木糖代謝菌係寄存於中華民國食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 920072。
  2. 如申請專利範圍第1項之製備方法，其中該木糖代謝菌之木糖來源為經前處理後未去毒性的纖維木糖水解液。
  3. 如申請專利範圍第1項之製備方法，其中該木糖代謝菌包含xyl1、xyl2、xk及tal基因。
  4. 如申請專利範圍第1項之製備方法，其中該木糖代謝菌可同時轉化葡萄糖及木糖為酒精。
  5. 如申請專利範圍第1項之製備方法，其中該葡萄糖及木糖來源為木質纖維素原料。
  6. 一種木糖代謝菌，其係由如申請專利範圍第1項至第5項任一項中所述之方法所製得。
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