CN113416739B

CN113416739B - 鲁氏酵母菌基因在提高微生物产hdmf的产量中的应用

Info

Publication number: CN113416739B
Application number: CN202110701428.9A
Authority: CN
Inventors: 戴凌燕; 李志江; 张东杰; 刘微; 潘百玲; 邓景致
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2021-06-24
Filing date: 2021-06-24
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2041-06-24
Also published as: CN113416739A

Abstract

本发明公开鲁氏酵母菌基因在提高微生物产HDMF的产量中的应用，涉及微生物领域；所述鲁氏酵母菌基因为QOR基因，或FBA基因和TPI基因的组合；所述QOR基因、FBA基因和TPI基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑3所示；本发明利用QOR基因，或FBA基因和TPI基因的组合制备的工程菌可大幅提高天然HDMF产量，比化学合成法生产的HDMF香气更好、安全性更高；所述工程菌在分别添加外源1,4‑萘醌和D‑果糖于YPD培养基中，还可进一步提高HDMF产量，降低了生产成本；同时，生产目标产物时对生产环境要求更低、能耗低、污染小，对环境更加友好，并且合成步骤简单。

Description

鲁氏酵母菌基因在提高微生物产HDMF的产量中的应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是涉及鲁氏酵母菌基因在提高微生物产HDMF的产量中的应用。

背景技术

4-羟基-2,5-二甲基-3[2H]-呋喃酮(4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone,HDMF)，分子式为C₆H₈O₃，分子量是128.13。HDMF是一种广泛存在于天然产物中的香料化合物，具有类似红糖、烘烤食品的浓郁香气，浓度较低时呈清新的草莓、菠萝香气，故又称草莓酮或菠萝酮。HDMF作为香料和增香剂，因其低阈值、低风险和高效果的特点，被广泛用于食品、饮料以及日化产品中。GB2760-2011、美国食用香料制造协会(FEMA No.3174)和欧洲理事会(COE No.536)均认可HDMF为食用安全香料，是高品质的甜味香料与增香剂。

HDMF虽然广泛存在于天然产物中，但由于其含量很低，不能满足日常所需，所用的多为化学合成产品，存在安全问题。在欧美国家，将物理方法和生物合成法生产的香料称天然的、安全的调味剂和芳香剂。生物合成法生产的HDMF与化学合成的HDMF相比，前者具有香气浓郁、安全性高等优点，目前为止，天然生产的HDMF具有不可替代性。随着人们对天然产品的需求量不断提高以及HDMF的广泛应用，市场上对HDMF的需求量已经供不应求，主要源于食品领域对天然HDMF的需求量日益增加。因此，大量生产天然的HDMF是目前研究的主要方向，并且具有良好的发展前景。

目前，直接提取法、化学合成法和微生物合成三种生产方法是HDMF生产的主要方法，HDMF的天然提取法就是从大自然中的一些水果或一些植物中直接提取分离，但该方法的提取含量较低，并且分离、提取成本较高，因此天然提取法不适用于大量生产天然HDMF。关于HDMF的化学合成方法已得到广泛研究，但化学合成的HDMF存在合成步骤繁琐、产物的香气不纯正、产率不高以及存在大量溶剂残留等的问题，不宜用于食品、饮料等产品中。生物合成法在食品生产中应用比较广泛，因此利用微生物合成法生产HDMF已成为最主要的合成方法，其步骤简单且合成的HDMF香味纯正安全性高。

目前研究发现鲁氏酵母菌为可生产HDMF的主要微生物。鲁氏酵母菌可代谢生产大量的醇，例如甘油、乙醇、异丁醇、异戊醇和阿拉伯糖醇，其中一些醇类物质不仅是调味剂，还是其他重要风味物质的前体物或反应物，因此，传统发酵食品的酿造过程中，风味物质的形成与鲁氏酵母菌的添加有关。利用鲁氏酵母菌发酵所生产的食物香料，在食品生产应用中具有品质优、安全性好、产品效益高等优点。很多学者对鲁氏酵母菌添加FDP产HDMF展开了研究，并发现FDP可作为HDMF的前体物质，但以FDP为前体物质，价格昂贵且不适用于工厂生产。因此，如何利用微生物合成法来使HDMF达到品质好、成本低及高产的目的，是目前生产中有待解决的关键问题。

发明内容

本发明的目的是提供QOR、FBA和TPI基因在高产HDMF中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供一种鲁氏酵母菌基因在提高微生物产HDMF的产量中的应用，所述鲁氏酵母菌基因为QOR基因，或FBA基因和TPI基因的组合；所述QOR基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述FBA基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；TPI基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供一种鲁氏酵母菌基因在制备提高微生物产HDMF的产量的产品中的应用，所述鲁氏酵母菌基因为QOR基因，或FBA基因和TPI基因的组合；所述QOR基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述FBA基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；TPI基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步的，所述微生物为鲁式酵母菌。

本发明还提供一种高产HDMF的工程菌，所述工程菌包含QOR基因或FBA基因和TPI基因的组合；其中，所述QOR基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述FBA基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；TPI基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步的，所述工程菌为酵母工程菌。

本发明还提供一种所述的高产HDMF的工程菌的制备方法，所述制备方法为：将QOR基因或FBA基因和TPI基因的组合导入鲁氏酵母菌中。

进一步的，所述QOR基因或FBA基因和TPI基因与强启动子为GAL、抗性为Amp⁺的空载体pESC-URA连接，QOR基因插入到多克隆位点5’BamHI-SalI 3’之间，FBA基因和TPI基因分别插入到多克隆位点5’BamHI-SalI 3’和5’NotI-NotI 3’之间，得到过表达重组质粒后，导入鲁氏酵母菌中。

进一步的，所述鲁氏酵母菌为鲁氏酵母感受态。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明构建的QOR基因鲁氏酵母工程菌在纯YPD培养基中HDMF产量最高可达2.75mg/L，是相同培养条件下原菌株产量的1.17倍；在添加1,4-萘醌的YPD培养基中，HDMF产量最高可达2.8mg/L，是相同培养条件下原菌株产量的1.14倍。本发明构建的FBA和TPI基因鲁氏酵母工程菌在纯YPD培养基中HDMF产量最高可达4.86mg/L，是相同培养条件下原菌株产量的2.11倍；在添加D-果糖的YPD培养基中，HDMF产量最高可达13.39mg/L，是相同培养条件下原菌株产量的1.91倍；

(2)本发明构建的QOR基因鲁氏酵母工程菌HDMF产量最高时期在发酵3d时，比相同培养条件下原菌HDMF产量最高时期提前了2d；

(3)本发明构建的FBA和TPI基因鲁氏酵母工程菌可以D-果糖为底物进行HDMF的生产，相比于使用D-果糖-1,6-二磷酸为前体物质，可有效降低生产成本；

(4)因为工程菌株发酵生产的HDMF属于天然香料，相比于化学合成法生产的HDMF，天然HDMF的香气更好、安全性更高；

(5)发酵法生产目标产物对生产环境要求更低，同时能耗低、污染小，对环境更加友好，并且合成步骤简单。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为QOR基因、FBA基因和TPI基因PCR扩增结果，其中，A为QOR基因PCR扩增结果；B为FBA基因PCR扩增结果；C为TPI基因PCR扩增结果；

图2为空载pESC-URA过表达载体图谱；

图3为QOR基因过表达载体图谱；

图4为FBA和TPI基因过表达载体图谱；

图5为基因工程菌QOR6在YPD培养中QOR基因相对表达量；

图6为基因工程菌QOR6在YPD培养中HDMF产量；

图7为基因工程菌QOR6在添加外源1,4-萘醌的YPD培养基中QOR基因相对表达量；

图8为基因工程菌QOR6在添加外源1,4-萘醌的YPD培养基HDMF产量；

图9为基因工程菌TF15-A的TPI和FBA基因相对表达量；

图10为基因工程菌TF15-A在YPD培养基和添加D-果糖的YPD培养基中HDMF产量。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

1.1QOR基因过表达重组质粒、FBA基因和TPI基因过表达重组质粒的构建

以鲁氏酵母菌基因组为模板，基因扩增引物如表1，使用KOD FX Neo高保真酶进行QOR基因(图1A)、FBA基因(图1B)和TPI基因的克隆(图1C)，将成功克隆的QOR基因、FBA基因和TPI基因目的片段送上海生工生物技术有限公司进行测序，使用DNAMAN 7.0对测序结果进行拼接。所得序列经比对与NCBI鲁氏酵母菌基因组中QOR(XM_002494472.1)、FBA(XM_002499162.1)和TPI(XM_002498482.1)序列相同。

QOR基因编码区序列如下：

ATGCTTAGATCGACAATATCCTCAGTGTTCAACAAGAGGGCAACAATGGCAACCACAACTATTCCAAAGACCCAAAAAGTTATTTTGATTAACGATACTGGTAGTTATGATGTGCTGAAATACCAGGATCATCCGGTGCCTAGTATTACTGACAATGAATTATTGGTTAAAAACAAGTACAGTGGTATTAACTTCATCGAATCTTACTTCCGGAAAGGTATTTATCCCAGTGAAAAGCCACTGATCCTAGGTCGTGAATCTAGTGGTACAGTTGTTGCTAAGGGTAATTCCGTAAAGGATTTTGATATTGGTGATAAGGTTGCTTATCTATCTGGATCTGCCTTTGCCCAATATACTAAGGTTGATGCTGCTGGTAAAGTAGTTAAATTACCAAAAGATGCCAATGATGAAACGTTAAAGTTGTATGCTGCTGGTTTGTTACAATCTTTAACAGCACTCACTTTTATTGATGAAGCTTACAATGTCAAGAAAGGTGATTTCATCTTAAACTATGCGGCTGCAGGTGGTGTTGGATTAATCTTAGACCAATTGCTAAAGGAAAGGGGTGCTCATACGATTGCAGTAGTTTCTACAGAGGAGAAATTGGAATTAGCCAAGAAGCATGGTGCTGAATACGGAATTATCTCCAGTAAAGAAGATATTGTCACTAGAGTTAAGGAAATTACAAACAATCAAGGTGTGGATGCAGCATTTGATTCTATTGGTAAGGATACTTTTGAAACTACAATTTCTGCACTCAAAAGGAAGGGTACTTTTGTATCTTACGGCAATGCTTCTGGGCCTGTTAGCCCATTCCCCTTGACTAAGCTGACCGGAAACATTAAGATTTTGAGACCGTCGCTATTCTCCTACATCGCAACAAGTGAGGAATGGAAACATTATTCTAGGGAATTTGTTTCTCTGGTCAGTTCTGGTAAATTAAAGATTAATATTGGCCATGTGTTTCCGCTAAGTGAGTATCCAAAGGCAACCCAGCTCTTGGAAGAAAGAAAGACCACTGGTAAACTAGTCTTGGAGATTCCTCAA(SEQ IDNO:1)。

FBA基因编码区序列如下：

ATGGGTGTTGAATCTATCCTAAAGAGAAAGGCCGGTGTTATCGTCGGTGATGACGTTCGTCACTTGTTTGACTACGCTAAGGAGCACAAGTTT8GCCATCCCAGCTATCAACGTGACTTCCTCTTCTACTGTCGTTTCCTCTTTGGAAGCTGCTAGAGACAACAAGTCCCCAATCATTTTGCAAACCTCCAACGGTGGTGCTGCTTACTTCGCTGGTAAGGGTGTCTCTAACGAAGGCCAAAACGCTTCCATCAAGGGTGCTGTCGCTGCTGCTCAATACATCAGATCTATCGCTCCAGCTTACGGTATCCCAGTTGTTTTGCACTCTGACCACTGTGCTAAGAAGTTGTTGCCATGGTTCGATGGTATGTTGGAAGCTGACGAAGCTTACTTCAAGGAACACGGTGAACCATTGTTCTCCTCTCACATGTTGGACTTGTCTGAAGAAACCGACAACGAAAACATTGAAACCTGTGCCAAGTACTTCAAGAGAATGGCCGCTATGGGTCAATGGTTAGAAATGGAAATCGGTATCACCGGTGGTGAAGAAGATGGTGTCAACAACGAACACGTTGACAAGGAATCTTTGTACACTCAACCACCAACTGTGTACGCCGTCCACGAAGCTCTATCCAAGATCTCTCCAAACTTCTCCATCGCTGCCGCTTTCGGTAACGTCCACGGTGTCTACAAGCCAGGTAACGTTGTGTTGTCCCCACAAATCTTGGGTGACCACCAAAAGTACGCTGCTGAAAAGGACGGTAAGGCCGCTGGCTCCAAGCCATTGTACTTGGTTTTCCACGGTGGTTCCGGTTCCTCTGACAAGGAGTTCCAAACTGGTATCGACAACGGTGTCGTCAAGGTCAACTTGGACACTGACTGTCAATACGCTTACTTGACCGGTATCAGAGACTACGTCTTGAAGAACAAGGACTACTTGATGAGCACTGTCGGTAACCCAGAAGGCCCAGACAAGCCAAACAAGAAATTCTTCGACCCAAGAGTCTGGGTTAGAGAAGGTGAAAAGACCATGTCTGCTAGAATTACCACTGCTCTAAAGGTCTTCCGTGCCGTTAACTCTGTGTAA(SEQ ID NO:2)。

TPI基因编码区序列如下：

ATGGCTAGAAACTTCTTCATTGGTGGTAACTTCAAATTGAACGGTAGCAAGGCTTCCATTAAGGAAATCGTCGACAGATTGAACGACTCCAAGTTGGACCCAAACGCTGAGGTCGTTATCTGCCCTCCAGCTCCTTACTTGGGCTACACCGTCGACCTAACCAAGTCCCCACAAGTCTCCGTCGGTGCTCAAAACGCTTACCTAAAGGCCAGCGGTGCCTTCACTGGTGAAAACTCCGTCGACCAAATCAAGGACGTCGGTGCCAAGTGGGTTATCATTGGTCACTCCGAAAGAAGACAATACTTCCACGAAGACGACAAATTGATCGCTGAAAAGACCGCTTTCGCCGTCGGCCAAGGTGTCGGTGTCATCTTGTGTATCGGTGAAACTTTGGAAGAAAAGAAGGCTGGTACCACTCTACAAGTCGTCGAAAGACAATTGCAAGCCGCTTTGGAAACCTGCAACGACTGGTCCAAGATCGTCGTTGCTTACGAACCAGTGTGGGCTATCGGTACCGGTCTAGCAGCTACCGCTGAAGACGCTCAAGACATCCACCACTCCATCAGAGAATTCTTGGCCAAGAAGTTGGGTGAAAAGGTTGCCTCTGAAATCAGAATCTTGTACGGTGGTTCCGCTAACGGTAAGAACGCTTCCTCTTTCAAGGACAAGGCTGACGTTGATGGATTCTTGGTCGGTGGTGCTTCTTTGAAGCCAGAATTCGTCGACATCATCAACTCTAGATTGTAA(SEQID NO:3)。

对QOR基因、FBA基因和TPI基因设计引物，引物如表1所示。

表1 引物序列设计

在超净台中取出鲁氏酵母菌冻干粉适量，加入到100mLYPD液体培养基中(灭菌)，于恒温振荡器中(摇床)，在28℃，180r/min条件下进行培养，培养3到4d(菌种活化大约需要4d)，测定细胞总数达到2.0-2.5×10⁸CFU/mL保存备用，发酵液中菌数测定利用血球计数法。将细胞总数达到2.0-2.5×10⁸CFU/mL的菌液以5％的比例接入到新的液体培养基中，于摇床中28℃、180r/min再培养27h，使工程菌和原菌达到相同的菌数。同时各取5mL菌种接入100mLYPD液体培养基中，相同条件下培养0、3、5和7d，转移至50mL离心管中，于4℃、8000rpm离心5min，每组做三个平行样。倒掉上清液，获得鲁氏酵母菌体样品。

鲁氏酵母菌体样品100mg或干重组织20mg，加入600μL DNA提取液，水浴60℃30min，4℃12000rpm离心5min，将上清移至新管，加等量氯仿混匀静止10min，4℃12000rpm离心5min，将上清转移至新管，加等量异丙醇，混匀静止30min，4℃12000rpm离心5min，弃上清，加1mL 70％乙醇洗涤离心，弃上清，晾干加100μL无菌水，电泳。

PCR扩增目的基因，以提取的DNA为模板，利用2x PCR MiX酶(高保真酶)进行PCR扩增，将扩增出来的目的片段进行切胶回收，将回收的基因与强启动子为GAL，抗性为Amp⁺的空载体pESC-URA进行酶切连接。空载pESC-URA过表达载体图谱如图2所示。

选用可在酵母中进行高效表达的高拷贝酵母表达载体pECS-URA进行QOR基因过表达载体QOR-PESC-URA(MCS2)的构建，插入位点为多克隆位点5’BamHI-SalI 3’之间，载体全长7651bp(图3)。选用可同时保证两个基因在酵母中进行高效表达的高拷贝酵母表达载体pECS-URA进行FBA和TPI基因过表达载体TPI-FBA-pECS-URA(MCS1)的构建，插入位点为多克隆位点5’BamHI-SalI 3’和5’NotI-NotI3’之间，载体全长8439bp(图4)。

1.2制备鲁氏酵母感受态

配制固体YPD培养基：5g YPD加入1.5g琼脂粉用蒸馏水定溶至100mL。利用高压灭菌锅，121℃，15min进行灭菌，当灭菌温度降低至55℃时取出，在超净台中加入抗生素氨苄100μL混匀后倒入一次性平皿中凝固。取出活化好的菌种1mL放入1.5mL离心管中，根据无菌操作的规则，选择一个平整，光滑的接种环，以在试管中拾取少量酵母液体，在YPD固体培养基上划板，用密封膜密封，然后放在28℃的恒温培养箱中培养约3d。在无菌操作下，在培养好的平板中挑取单菌落至40mL灭过菌的YPD液体培养基中，再利用恒温振荡器180r/min，28℃，培养36h，后按1:20比例接种至50mL灭菌的液体YPD培养基中，利用恒温振荡器180r/min，28℃，培养至OD₆₆₀值为0.6时，将菌液倒入50mL离心管中进行离心，离心机调至5000r/min，4℃，离心5min弃上清，再用25mL冰预冷无菌水重悬，同上离心处理后弃上清，重复一次。再用25mL，质量浓度为1mol的冰预冷山梨醇重悬菌体，同上离心弃上清后加入250μL质量浓度为1mol的冰预冷山梨醇重悬，分装到1.5mL离心管中，每管50μL，1:1加70％甘油，-150℃保存备用。

1.3转化

将所构建的载体TPI-FBA-pECS-URA(MCS1)通过电转化法转化至鲁氏酵母菌感受态细胞中，电击后迅速向电转杯加入YPD培养基1mL，轻柔悬浮细胞后，将其转移至1.5mL离心管，于28℃，180rpm条件下复苏2h；

将所构建的载体QOR-PESC-URA(MCS2)通过电转化法转化至鲁氏酵母菌感受态细胞中，电击后迅速向电转杯加入YPD培养基1mL，轻柔悬浮细胞后，将其转移至1.5mL离心管，于28℃，180rpm条件下复苏2h。

1.4筛选

将复苏后的培养液涂布于固体YPD培养基，28℃培养2-3d，直至长出肉眼可见的单克隆，以菌落PCR对单克隆进行阳性转化子的筛选。

将培养至2×10⁸CFU/mL的阳性转化子以5％接种量接种至新的100mL的YPD培养基中进行培养，培养条件设置为28℃、180rpm，培养周期为3d；培养基设置为YPD培养基(酵母提取物1.0g，蛋白胨2.0g，葡萄糖2.0g，去离子水100mL；121℃灭菌15min)。

1.5基因表达量及HDMF产量进行分析

转录水平上，利用实时荧光定量qRT-PCR分别对阳性转化子3d时的QOR基因表达量与FBA和TPI基因表达量进行测定。反应程序设置为95℃预变性10min，95℃变性15s，55℃退火30s，共39个循环。

以相同培养条件下提取的鲁氏酵母菌原菌株cDNA为对照组模板，GAPDH基因作为内参基因。采用相对定量法计算基因的相对表达量，每次测试设置三个生物学重复，三个技术性重复；代谢水平上，以高效液相色谱法测定HDMF产量；结合以上两个水平，筛选出HDMF高产菌株。HPLC法所用流动相流速1.0mL/min，检测波长287nm，进样量10μL，梯度洗脱条件见表2：

表2 HDMF检测梯度洗脱条件

将筛选出的HDMF高产菌株进行动态培养，培养条件设置为28℃、180rpm，培养周期为7d；培养基为YPD液体培养基。分别在第0d、3d、5d、7d时留取菌体，进行QOR基因表达量的测定(图5)；留取发酵上清液，进行HDMF含量的测定(图6)。

将筛选出的HDMF高产菌株进行动态培养，将培养至2×10⁸CFU/mL的高产鲁氏酵母工程菌以5％接种量接种至100mL培养基中，培养基设置为YPD培养基和YPD+Fru培养基(酵母提取物1.0g，蛋白胨2.0g，葡萄糖2.0g，NaCl 18g、D-果糖12g，去离子水100mL；121℃灭菌15min)，条件设置为28℃、180rpm，培养周期为7d。分别在第0d、1d、3d、5d、7d时留取菌体，进行FBA和TPI基因表达量的测定(图9)；留取发酵上清液，进行HDMF含量的测定(图10)。

对比例1

为鉴别本发明的可靠性和有效性，在相同体系和培养条件下，对鲁氏酵母和其转化菌株进行了FBA和TPI基因表达量的测定及HDMF产量的测定。

1.1实验

(1)对鲁氏酵母菌进行动态培养，将培养至2×10⁸CFU/mL的鲁氏酵母菌以5％接种至新的100mL的YPD培养基中进行培养，培养条件设置为28℃、180rpm，培养周期为7d，分别在第0d、3d、5d、7d时留取菌体，进行QOR基因表达量的测定(图5)；留取发酵上清液，进行HDMF含量的测定(图6)。

将培养至2×10⁸CFU/mL的鲁氏酵母工程菌QOR6和原菌以5％接种量分别接种至新的100mL的YPD+1,4-萘醌培养基中进行动态培养，培养条件设置为28℃、180rpm，培养周期为7d；留取第0d、3d、5d、7d时的菌体，利用qRT-PCR对鲁氏酵母菌中QOR基因表达量进行测定(图7)，以GAPDH基因为内参基因，采用相对定量法计算基因的相对表达量，每次测试设置三个生物学重复，三个技术性重复；留取第0d、3d、5d、7d时的发酵上清液，利用高效液相色谱法进行HDMF含量的测定，结果见图8，梯度洗脱条件见表2。

(2)将培养至2×10⁸CFU/mL的鲁氏酵母原菌以5％接种量分别接种至新的100mL的YPD和YPD+Fru培养基中进行动态培养，培养条件设置为28℃、180rpm，培养周期为7d；留取第0d、1d、3d、5d、7d时的菌体，利用qRT-PCR对鲁氏酵母菌中FBA和TPI基因表达量进行测定(图9)，以GAPDH基因为内参基因，采用相对定量法计算基因的相对表达量，每次测试设置三个生物学重复，三个技术性重复；留取第0d、1d、3d、5d、7d时的发酵上清液，利用高效液相色谱法进行HDMF含量的测定，结果见图10，梯度洗脱条件见表2。

1.2结果

(1)图5为基因工程菌QOR6在YPD培养中QOR基因相对表达情况。QOR6基因工程菌与原菌接种到YPD培养基中同时培养，0d、3d、5d、7d，qRT-PCR测定QOR相对表达量。QOR6基因工程菌在培养0d、3d、5d、7d时QOR基因表达量均高于原菌，发酵3d、5d、7d时表达量显著高于原菌，分别是原菌的4.8倍、3.3倍、5.6倍。

图6为基因工程菌QOR6在YPD培养中HDMF产量情况，图7为添加1,4-萘醌后QOR基因的表达情况。将工程菌QOR6与原菌接种到YPD培养基中同时培养，0d、3d、5d、7d，高效液相色谱检测HDMF产量，可以看出工程菌QOR6，在培养0d、3d、5d、7d时HDMF产量均高于原菌的HDMF产量；通过显著性分析发现，发酵3d和5d时QOR6 HDMF产量显著高于原鲁氏酵母菌，分别是原菌的1.17倍、1.10倍；QOR6发酵产HDMF趋势为先增加后降低，与原鲁氏酵母菌产呋喃酮趋势相同；原菌在发酵到第5d时HDMF产量达到最高为2.35mg/L，而QOR6号菌在发酵到第3d时HDMF产量即达到最高为2.75mg/L。可见，QOR6号菌将产HDMF高峰期提前到了发酵3d。在YPD培养基中添加外源1,4-萘醌后，鲁氏酵母工程菌QOR6的HDMF产量与鲁氏酵母原菌相比均有所提升，且在3d时显著高于原菌，是原菌的1.14倍(图8)。

可以看出QOR6工程菌不仅使HDMF产量有所提高而且将HDMF产量高峰提前到了发酵后第3d。

本发明所构建的鲁氏酵母工程菌QOR6的HDMF产量显著高于鲁氏酵母原菌，在YPD培养基中发酵3d时HDMF产量达到最高为2.75mg/L，是相同培养条件下鲁氏酵母菌原菌株的产量的1.17倍。

(2)图9为不同时期下高产HDMF鲁氏酵母工程菌TF15-A中关键酶基因的表达情况。可见菌株TF15-A的FBA和TPI基因表达量在两种培养条件下均高于原菌。同时，相比于YPD组，YPD+Fru组中TF15-A菌株的FBA在1d、3d、5d、7d均显著上调，5d表达量上调近2.5倍；TPI在3d、5d时显著上调，5d时表达量约为YPD组的2.5倍。

图10为不同时期下高产HDMF鲁氏酵母工程菌TF15-A的HDMF产量情况。YPD组中，鲁氏酵母工程菌TF15-A的HDMF含量与原菌株相比均显著提升，且在1d、3d、5d、7d时都极显著高于对照组(p<0.001)，5d时达到最高产值4.86mg/L，是相同培养条件下鲁氏酵母菌原菌株最高产量的2.11倍；YPD+Fru组中，发酵5d时，鲁氏酵母工程菌TF15-A的HDMF含量为13.39mg/L，是相同培养条件下鲁氏酵母菌原菌株产量的1.91倍；YPD+Fru组与YPD组比较，鲁氏酵母原菌与鲁氏酵母工程菌TF15-A的HDMF产量均显著提升，且两种培养条件下HDMF产量较高的均为鲁氏酵母工程菌TF15-A，鲁氏酵母工程菌TF15-A在YPD+Fru组中HDMF的最高产值是YPD组中的2.76倍。

且FBA与TPI基因的相对表达量整体趋势与HDMF产量趋势相同，呈先升后降的状态，说明FBA和TPI可能作为鲁氏酵母菌生物合成HDMF过程中的关键酶，促进HDMF的生成与积累，起正向调节作用；D-果糖可作为鲁氏酵母菌合成HDMF的有效前体物质。而0d未进行发酵时，HDMF含量的差异则是由外源添加的D-果糖经高温灭菌而产生的。

本发明所构建的鲁氏酵母工程菌TF15-A的HDMF产量显著高于鲁氏酵母原菌，在YPD+Fru培养基中发酵5d时HDMF产量达13.39mg/L，是相同培养条件下鲁氏酵母菌原菌株的产量的1.91倍。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 黑龙江八一农垦大学

<120> 鲁氏酵母菌基因在提高微生物产HDMF的产量中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1047

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcttagat cgacaatatc ctcagtgttc aacaagaggg caacaatggc aaccacaact 60

attccaaaga cccaaaaagt tattttgatt aacgatactg gtagttatga tgtgctgaaa 120

taccaggatc atccggtgcc tagtattact gacaatgaat tattggttaa aaacaagtac 180

agtggtatta acttcatcga atcttacttc cggaaaggta tttatcccag tgaaaagcca 240

ctgatcctag gtcgtgaatc tagtggtaca gttgttgcta agggtaattc cgtaaaggat 300

tttgatattg gtgataaggt tgcttatcta tctggatctg cctttgccca atatactaag 360

gttgatgctg ctggtaaagt agttaaatta ccaaaagatg ccaatgatga aacgttaaag 420

ttgtatgctg ctggtttgtt acaatcttta acagcactca cttttattga tgaagcttac 480

aatgtcaaga aaggtgattt catcttaaac tatgcggctg caggtggtgt tggattaatc 540

ttagaccaat tgctaaagga aaggggtgct catacgattg cagtagtttc tacagaggag 600

aaattggaat tagccaagaa gcatggtgct gaatacggaa ttatctccag taaagaagat 660

attgtcacta gagttaagga aattacaaac aatcaaggtg tggatgcagc atttgattct 720

attggtaagg atacttttga aactacaatt tctgcactca aaaggaaggg tacttttgta 780

tcttacggca atgcttctgg gcctgttagc ccattcccct tgactaagct gaccggaaac 840

attaagattt tgagaccgtc gctattctcc tacatcgcaa caagtgagga atggaaacat 900

tattctaggg aatttgtttc tctggtcagt tctggtaaat taaagattaa tattggccat 960

gtgtttccgc taagtgagta tccaaaggca acccagctct tggaagaaag aaagaccact 1020

ggtaaactag tcttggagat tcctcaa 1047

<210> 2

<211> 1086

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggtgttg aatctatcct aaagagaaag gccggtgtta tcgtcggtga tgacgttcgt 60

cacttgtttg actacgctaa ggagcacaag tttgccatcc cagctatcaa cgtgacttcc 120

tcttctactg tcgtttcctc tttggaagct gctagagaca acaagtcccc aatcattttg 180

caaacctcca acggtggtgc tgcttacttc gctggtaagg gtgtctctaa cgaaggccaa 240

aacgcttcca tcaagggtgc tgtcgctgct gctcaataca tcagatctat cgctccagct 300

tacggtatcc cagttgtttt gcactctgac cactgtgcta agaagttgtt gccatggttc 360

gatggtatgt tggaagctga cgaagcttac ttcaaggaac acggtgaacc attgttctcc 420

tctcacatgt tggacttgtc tgaagaaacc gacaacgaaa acattgaaac ctgtgccaag 480

tacttcaaga gaatggccgc tatgggtcaa tggttagaaa tggaaatcgg tatcaccggt 540

ggtgaagaag atggtgtcaa caacgaacac gttgacaagg aatctttgta cactcaacca 600

ccaactgtgt acgccgtcca cgaagctcta tccaagatct ctccaaactt ctccatcgct 660

gccgctttcg gtaacgtcca cggtgtctac aagccaggta acgttgtgtt gtccccacaa 720

atcttgggtg accaccaaaa gtacgctgct gaaaaggacg gtaaggccgc tggctccaag 780

ccattgtact tggttttcca cggtggttcc ggttcctctg acaaggagtt ccaaactggt 840

atcgacaacg gtgtcgtcaa ggtcaacttg gacactgact gtcaatacgc ttacttgacc 900

ggtatcagag actacgtctt gaagaacaag gactacttga tgagcactgt cggtaaccca 960

gaaggcccag acaagccaaa caagaaattc ttcgacccaa gagtctgggt tagagaaggt 1020

gaaaagacca tgtctgctag aattaccact gctctaaagg tcttccgtgc cgttaactct 1080

gtgtaa 1086

<210> 3

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggctagaa acttcttcat tggtggtaac ttcaaattga acggtagcaa ggcttccatt 60

aaggaaatcg tcgacagatt gaacgactcc aagttggacc caaacgctga ggtcgttatc 120

tgccctccag ctccttactt gggctacacc gtcgacctaa ccaagtcccc acaagtctcc 180

gtcggtgctc aaaacgctta cctaaaggcc agcggtgcct tcactggtga aaactccgtc 240

gaccaaatca aggacgtcgg tgccaagtgg gttatcattg gtcactccga aagaagacaa 300

tacttccacg aagacgacaa attgatcgct gaaaagaccg ctttcgccgt cggccaaggt 360

gtcggtgtca tcttgtgtat cggtgaaact ttggaagaaa agaaggctgg taccactcta 420

caagtcgtcg aaagacaatt gcaagccgct ttggaaacct gcaacgactg gtccaagatc 480

gtcgttgctt acgaaccagt gtgggctatc ggtaccggtc tagcagctac cgctgaagac 540

gctcaagaca tccaccactc catcagagaa ttcttggcca agaagttggg tgaaaaggtt 600

gcctctgaaa tcagaatctt gtacggtggt tccgctaacg gtaagaacgc ttcctctttc 660

aaggacaagg ctgacgttga tggattcttg gtcggtggtg cttctttgaa gccagaattc 720

gtcgacatca tcaactctag attgtaa 747

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaggaggcgg cgtcaatgtc 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cattgaaacc tggcgctgtc g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaaactcatt tgcccaccgc c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggtgaaaga tacgtgggcg t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cctgctagcc actgttcctc t 21

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acgtagtcat catcattcac acgta 25

Claims

1.一种鲁氏酵母菌（Zygosaccharomyces rouxii）基因在提高鲁式酵母菌产HDMF的产量中的应用，其特征在于，所述鲁氏酵母菌基因为QOR基因；所述QOR基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种鲁氏酵母菌（Zygosaccharomyces rouxii）基因在制备提高鲁式酵母菌产HDMF的产量的产品中的应用，其特征在于，所述鲁氏酵母菌基因为QOR基因；所述QOR基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种产HDMF的鲁式酵母工程菌，其特征在于，所述鲁式酵母工程菌包含QOR基因；其中，所述QOR基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.一种根据权利要求3所述的产HDMF的鲁式酵母工程菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：所述QOR基因与强启动子为GAL、抗性为Amp+的空载体pESC-URA连接，QOR基因插入到多克隆位点5’BamHI-SalI 3’之间，得到过表达重组质粒后，导入鲁氏酵母菌中。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述鲁氏酵母菌为鲁氏酵母感受态。