CN110511879A

CN110511879A - 酿酒酵母工程菌的构建及桦木酸的制备方法

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Publication number: CN110511879A
Application number: CN201810495048.2A
Authority: CN
Inventors: 訾佳辰; 黄嘉键; 朱建勋; 安天悦
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University; University of Jinan
Priority date: 2018-05-22
Filing date: 2018-05-22
Publication date: 2019-11-29

Abstract

本发明提供了一种酿酒酵母工程菌的构建方法及利用该酿酒酵母工程菌制备桦木酸的方法，所述酿酒酵母工程菌为，在酿酒酵母中导入了羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs和细胞色素P450酶编码基因RoCYP‑34445、细胞色素P450还原酶编码基因RoCPR，该基因能够编码桦木酸生物合成途径中的关键酶，构建得到的工程菌采用生物合成的方法制备桦木酸，该方法羽扇豆醇转化为桦木酸的转化率高，产量大，且环境友好。

Description

酿酒酵母工程菌的构建及桦木酸的制备方法

技术领域

本发明涉及合成生物学领域，特别涉及一种酿酒酵母工程菌的构建及桦木酸的制备方法。

背景技术

桦木酸(betulinic acid)和以其为起始物的衍生物在抗肿瘤和抗HIV新药创制方面表现出光明的应用前景。早在1995年，桦木酸具有很好的抗黑色素瘤的作用。之后，以桦木酸为起始物，许多强抗肿瘤活性衍生物被合成。

此外，许多桦木酸衍生物具有很好的抗HIV的作用。例如3-O-(3,3-dimethylsuccinyl)betulinic acid(bevirimat)对野生型和耐药型HIV-1都有强抑制其复制的作用，并且该化合物已经在I和II期临床取得成功。近期，通过以桦木酸为起始物，许多新的抗HIV衍生物被合成出来，其中一些化合物可抑制耐bevirimat HIV-1的变种病毒。

以上桦木酸衍生物均是已桦木酸为起始化合物，通过半合成的方法获得的。因此，对这些分子进行新药开发，首先解决的关键问题是药源问题，即如何获得工业化规模的桦木酸。桦木酸在白桦树皮中的含量最高，但是也只有0.025％。由于桦木醇在白桦树皮中含量高(25％)，因此目前主要以桦木醇为起始物，半合成桦木酸。半合成的方法制备桦木酸，同样需要大量提取植物材料，并且在化学合成中使用大量化学试剂，环境不友好。近期，有研究报道了一个能够分别氧化齐墩果烷和熊果烷为齐墩果酸和熊果酸的酶CYP716AL1。由于该酶具有一定底物选择的泛宽性，也可氧化羽扇豆醇得少量桦木酸。以CYP716AL1催化最后一步氧化反应，在酿酒酵母中重建桦木酸的生物合成途径，但其产量仅为0.01mg/L，产量很低。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于提供一种产量高、环境友好的桦木酸生物合成方法。

具体技术方案如下：

一种用于制备桦木酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括：向酿酒酵母中转化含有细胞色素还原酶基因RoCPR和细胞色素P450基因RoCYP-34445的重组质粒。

所述细胞色素还原酶基因RoCPR，以迷迭香cDNA为模板，以核苷酸序列如SEQ.IDNO.8所示的RoCPR-F和核苷酸序列如SEQ.ID NO.9所示的RoCPR-R为引物，经PCR扩增得到；所述迷迭香cDNA由提取迷迭香的总RNA后进行反转录得到。

所述细胞色素P450基因RoCYP-34445为，以迷迭香cDNA为模板，以核苷酸序列如SEQ.ID NO.18所示的RoCYP-34445-F、和核苷酸序列如SEQ.ID NO.19所示的RoCYP-34445-R为引物，经PCR扩增得到；所述迷迭香cDNA由提取迷迭香的总RNA后进行反转录得到。

优选地，上述酿酒酵母工程菌的构建方法还包括：向酿酒酵母中转化入含有羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs的重组质粒。

所述羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs为，以拟南芥cDNA为模板，以核苷酸序列如SEQ.ID NO.1所示的LUP-F、和核苷酸序列如SEQ.ID NO.2所示的LUP-R为引物，PCR扩增得到；所述拟南芥cDNA由提取拟南芥的总RNA后进行反转录得到。

优选地，所述细胞色素还原酶基因RoCPR的核苷酸序列如SEQ.ID NO.7所示。

优选地，所述细胞色素P450基因RoCYP-34445的核苷酸序列如SEQ.ID NO.17所示。

优选地，所述羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs的核苷酸序列如SEQ.ID NO.3所示。

优选地，所述酿酒酵母为S.cerevisiae BY4741。

本发明的目的还在于提供一种用于制备桦木酸的酿酒酵母工程菌，具体技术方案如下：

一种用于制备桦木酸的酿酒酵母工程菌，由上述的酿酒酵母工程菌的构建方法构建得到。

本发明的目的还在于提供一种桦木酸的制备方法，具体技术方案如下：

将上述构建方法构建得到的酿酒酵母工程菌，接种于培养基中培养，萃取旋干复溶，即得。本发明具有以下有益效果：

本发明所述用于制备桦木酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，发现、研究并构建得到了含有细胞色素还原酶基因RoCPR和细胞色素P450基因RoCYP-34445的重组质粒，该基因能够编码桦木酸生物合成途径中的关键酶，构建得到的工程菌采用生物合成的方法制备桦木酸，该方法羽扇豆醇转化为桦木酸的转化率高，产量大，且环境友好。

而且，本发明所述的制备桦木酸的酿酒酵母工程菌，同时包含了桦木酸生物合成通路中相关酶对应的三个基因：羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs、细胞色素P450基因RoCYP-34445和细胞色素还原酶基因RoCPR；三个基因在该酿酒酵母工程菌中构建形成了桦木酸的生物合成通路，通过羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs实现桦木酸上游底物羽扇豆醇的合成，并结合细胞色素还原酶基因RoCPR和细胞色素P450基因RoCYP-34445，直接将羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs产生的羽扇豆醇氧化，即可制备得到桦木酸，所得工程菌桦木酸的产量高。

本发明所述的桦木酸的制备方法，利用了代谢工程的方法，在酿酒酵母中构建得到桦木酸的生物合成途径，通过发酵方法，可制备得到高产量的桦木酸，有利于桦木酸的工业化、规模化生产。同时，避免了桦木酸半合成的制备方法中大量消耗植物材料和化学试剂，该方法具有环境友好的特点。

附图说明

图1为分别含有不同表达载体的酿酒酵母以羽扇豆醇为底物的发酵产物的色谱检测实验结果；

图2A为pESC-URA质粒图谱，图2B为pESC-LEU质粒图谱；

图3A为同时导入了RoCYP-34445、RoCPR和AtLUPs基因的酿酒酵母培养物提取得到的产物的色谱检测图谱；图3B为同时导入了RoCPR和AtLUPs基因的酿酒酵母培养物提取得到的产物的色谱检测图谱；图3C为导入了空载体的酿酒酵母培养物提取得到的产物的色谱检测图谱；

图4为同时导入了RoCYP-34445、RoCPR和AtLUPs基因的酿酒酵母培养物提取得到的产物进行GC-MS检测的质谱检测图谱。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1表达载体构建

1.材料与方法

用于构建桦木酸合成途径的宿主菌株为酿酒酵母S.cerevisiae BY4741，表达载体为拷贝的质粒pESC-URA与pESC-LEU。

表1

高保真Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶购买于南京诺唯赞生物科技有限公司；5’/3’-SMARTerTM RACE试剂盒购自于宝生物工程(大连)有限公司；限制性内切酶EcoRI、Not I、Cla I、BamH I、Kpn I与Xho I和Trizol试剂购买于美国Thermo公司；酵母氮源、蛋白胨和酵母提取物购买于美国BD Difco公司；氨基酸购买于美国Sigma公司。胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购买于天根生化科技(北京)有限公司。

NZY培养基：用于大肠杆菌的培养，培养基中包括酪蛋白Casein 10g/L,氯化钠10g/L,酵母提取物5g/L，无水硫酸镁1g/L,加去离子水定容至1L，pH值调至7.0，在121℃条件下灭菌20分钟。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉。

YPD培养基用于酵母的活化与发酵，其中含有1％的酵母浸出粉，2％的蛋白胨和2％的葡萄糖。溶解后，搅匀，分装，121℃高压灭菌20min，其中的葡萄糖单独灭菌后在使用前加入。若用于配制YPD固体培养基，则加入2％的琼脂粉。

SD培养基用于培养和筛选含有相关营养缺陷型质粒的重组菌株，主要含有6.7g/LYNB培养基、20g/L葡萄糖和一种或者多种相关的氨基酸(20mg/L尿嘧啶，20mg/L组氨酸，20mg/L甲硫氨酸或者100mg/L亮氨酸)

2.候选基因

以长春花中细胞色素P450基因CYP716AL1(cytochrome P450，CYP716AL1)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中细胞色素P450还原酶(cytochrome P450reductase,AtCPR)为参考序列，在产生桦木酸的植物迷迭香的转录组数据库中进行序列比对，得到3个与CYP716AL1的序列相似度超过50％的细胞色素P450酶编码基因，分别将其命名为RoCYP-34445、RoCYP-9438、RoCYP-4809，以及一个细胞色素P450还原酶基因RoCPR的编码基因，其中RoCYP-34445、RoCYP-9438和RoCPR为不完整基因，RoCYP-4809为全长序列。

3.基因克隆

3.1羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs片段

(1)对拟南芥进行总RNA的提取，反转录合成拟南芥cDNA；

(2)以上述拟南芥cDNA为模板，以LUP-F(SEQ.ID NO.1)、LUP-R(SEQ.ID NO.2)为引物，进行PCR扩增，扩增体系如表2-3所示，克隆得到羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs扩增片段，序列如SEQ.ID NO.3所示。

(4)将得到含羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs的扩增片段经过胶回收试剂盒纯化回收，与pEASY-Blunt平末端载体进行连接，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆子进行测序。

(5)测序并与羽扇豆醇合成酶基因(GenBank ID为NM_106546)比对正确后，提取质粒。得含有AtLUPs基因的质粒。

3.2迷迭香cDNA

(1)将总RNA提取所需要的实验器具进行灭菌和去RNA酶处理。

(2)取迷迭香叶片，用锡箔纸包住，浸泡在液氮中速冻，取出后放入研钵中，加入液氮，用研棒快速研成细粉，在研磨过程中始终补充液氮以保持低温。

(3)待其全部研磨成粉末后，按照Trizol法步骤进行总RNA的提取。

(4)用5’/3’-SMARTerTM RACE试剂盒反转录得到迷迭香5'/3'-RACE-ready cDNA。

3.3细胞色素P450还原酶RoCPR片段

RoaCPR为非全长序列，采用3’-cDNA末端快速扩增技术(3’-RACE)的方法来获得全长序列，步骤如下：

(1)以迷迭香3'-RACE-ready cDNA为模板，设计3’端引物RoCPR-3’-GSP-1(SEQ.IDNO.4)、RoCPR-3’-GSP-2(SEQ.ID NO.5)，通过巢式PCR方法扩增得到RoCPR目的条带。

(2)将RoCPR目的条带与经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物，然后与pEASY-Blunt平末端载体连接。

(3)大肠杆菌转化、阳性克隆子筛选后，测序，获得RoCPR的3’端未知序列(SEQ.IDNO.6)，并与迷迭香的转录组数据库中得到的原RoCPR序列(来自ID为roa_locus_7104_iso_7_len_2267_ver_2)拼接，得到全长RoCPR，序列如SEQ.ID NO.7所示；其中，上述ID出自数据库Medicinal Plant Genomics Resource(http://medicinalplantgenomics.msu.edu/)。

(4)根据全长RoCPR(SEQ.ID NO.7)，设计得到RoCPR-F(SEQ.ID NO.8)、RoCPR-R(SEQ.ID NO.9)引物，以上述迷迭香cDNA为模板进行PCR扩增，扩增体系如表2-3所示，克隆得到含细胞色素P450还原酶基因RoCPR的扩增片段，序列如SEQ.ID NO.10所示。

(5)将得到含细胞色素P450还原酶基因RoCPR的扩增片段经过胶回收试剂盒纯化回收，与pEASY-Blunt平末端载体进行连接，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆子进行测序。

(6)测序正确后，提取质粒。得含有RoCPR基因的质粒。

3.4细胞色素P450酶编码基因RoCYP-34445片段

(1)以迷迭香5'/3'-RACE-ready cDNA为模板，设计5’端引物RoCYP-34445-5’-GSP-1(SEQ.ID NO.11)、RoCYP-34445-5’-GSP-2(SEQ.ID NO.12)和3’端引物RoCYP-34445-3’-GSP-1(SEQ.ID NO.13)、RoCYP-34445-3’-GSP-2(SEQ.ID NO.14)，通过巢式PCR方法扩增得到RoCYP-34445目的条带。

(2)将RoCYP-34445目的条带与经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物，然后与pEASY-Blunt平末端载体连接。

(3)大肠杆菌转化、阳性克隆子筛选后，测序，获得RoCYP-34445的5’端未知序列(SEQ.ID NO.15)和3’端未知序列(SEQ.ID NO.16)，并与迷迭香的转录组数据库中得到的原RoCYP-34445序列(ID为roa_locus_34445_iso_10_len_1528_ver_2)拼接，得到全长RoCYP-34445，序列如SEQ.ID NO.17所示；其中，上述ID出自数据库Medicinal Plant GenomicsResource(http://medicinalplantgenomics.msu.edu/)。

(4)根据全长RoCYP-34445(SEQ.ID NO.17)，设计得到RoCYP-34445-F(SEQ.IDNO.18)、RoCYP-34445-R(SEQ.ID NO.19)引物，以上述迷迭香cDNA为模板进行PCR扩增，扩增体系如表2-3所示，克隆得到含细胞色素P450还原酶基因RoCYP-34445的扩增片段，序列如SEQ.ID NO.20所示。

(5)将得到含细胞色素P450还原酶基因RoCYP-34445的扩增片段经过胶回收试剂盒纯化回收，与pEASY-Blunt平末端载体进行连接，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆子进行测序。

(6)测序正确后，提取质粒。得含有RoCYP-34445基因的质粒。

3.5细胞色素P450酶编码基因RoaCYP-9438片段

(1)以迷迭香5'-RACE-ready cDNA为模板，设计5’端引物RoCYP-9438-5’-GSP-1(SEQ.ID NO.21)和RoCYP-9438-5’-GSP-2(SEQ.ID NO.22)，通过巢式PCR方法扩增得到RoCYP-9438目的条带，扩增体系如表2所示，反应条件如表3所示。

(2)将RoCYP-9438目的条带与经过DNA纯化试剂盒回收，得到胶回收产物，然后与pEASY-Blunt平末端载体连接。

(3)大肠杆菌转化、阳性克隆子筛选后，测序，得RoCYP-9438的5’未知序列(SEQ.IDNO.23)，并与迷迭香的转录组数据库中得到的原RoCYP-9438(ID为roa_locus_9438_iso_5_len_3078_ver_2)拼接，得到全长RoCYP-9438，序列如SEQ.ID NO.24所示；其中，上述ID出自数据库Medicinal Plant Genomics Resource(http://medicinalplantgenomics.msu.edu/)。

(4)根据全长RoaYP-9438(SEQ.ID NO.24)，设计得到RoCYP-9438-F(SEQ.IDNO.25)、RoCYP-9438-R(SEQ.ID NO.26)引物，以上述迷迭香cDNA为模板进行PCR扩增，扩增体系如表2-3所示，克隆得到含细胞色素P450还原酶基因RoCYP-9438的扩增片段，序列如SEQ.ID NO.27所示。

(5)将得到含细胞色素P450还原酶基因RoaCYP-34445的扩增片段经过胶回收试剂盒纯化回收，与pEASY-Blunt平末端载体进行连接，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆子进行测序。

(6)测序正确后，提取质粒。得含有RoaCYP-34445基因的质粒。

3.6细胞色素P450酶编码基因RoCYP-4809片段

(1)设计得到RoCYP-4809-F(SEQ.ID NO.28)、RoCYP-4809-R(SEQ.ID NO.29)引物，以上述迷迭香cDNA为模板进行PCR扩增，扩增体系如表2-3所示，克隆得到含细胞色素P450还原酶基因RoCYP-4809的扩增片段，序列如SEQ.ID NO.30所示。

(2)将得到含细胞色素P450还原酶基因RoCYP-4809的扩增片段经过胶回收试剂盒纯化回收，与pEASY-Blunt平末端载体进行连接，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆子进行测序。

(3测序与数据库中P450还原酶基因RoCYP-4809(ID为roa_locus_4809_iso_6_len_1715_ver_2)比对正确后，提取质粒。得含有RoCYP-4809基因的质粒；其中，上述ID出自数据库Medicinal Plant Genomics Resource(http://medicinalplantgenomics.msu.edu/)。

对于上述非全长序列基因的cDNA片段的获取和巢式PCR扩增，详细步骤如下：

合成5’/3’-RACE-Ready cDNA

(1)按照下列体积配制Buffer Mix用于cDNA合成反应。

(2)在单独的微量离心管中加入下列试剂，最好使用无酶枪头添加，用移液枪吹打混匀。

(3)混合组分，在微型离心机上短暂离心，将溶液收集到底部。

(4)将步骤(2)中的溶液在72℃条件下孵育3分钟，然后在42℃下冷却2分钟。待冷却后，在14000Xg条件下短暂离心10秒，把试剂收集到管底。该步骤可以在PCR仪或者水浴锅中进行，在孵育PCR管的同时，可以准备步骤(6)中的混合液。

(5)为了补齐步骤(2)中的5’-RACE-Ready cDNA合成反应液，在每个反应液中添加1μl的SMARTer II A Oligonucleotide，吹打混匀。

(6)按照下列体积配制5’-RACE和3’-RACE合成反应液，在室温下按照下列反应体系添加试剂：

(7)将步骤(6)中的Master Mix加到步骤(4)中的变性RNA(3’-RACE-cDNA)或步骤(5)中的变性RNA(5’-RACE-cDNA)中。每个cDNA合成反应的总体积变为20μl。

(8)用移液枪轻轻吹打混匀并短暂离心，收集反应液到PCR管底部。

(9)将步骤(7)中的反应液放入PCR仪或者水浴锅中，在42℃条件下恒温孵育90分钟，然后在70℃下加热10分钟。

(10)反应完毕后，使用Tricine-EDTA Buffer稀释第一链cDNA合成反应产物：

如果起始total RNA<200ng，须添加10μl；

如果起始total RNA>200ng，须添加90μl；

如果起始使用的是poly A+RNA，则添加240μl。

(12)稀释完毕后，则得到了可用的3’-RACE-ready cDNA和5’-RACE-ready cDNA。该cDNA样品在-20℃条件下最多保存3个月。

5’/3’-RACE-cDNA扩增

下面是5’-RACE PCR和3’-RACE PCR反应，产物为5’cDNA和3’cDNA片段。本实验采用巢式PCR反应，使用两对PCR引物来扩增未知的cDNA片段。其中的高保真酶采用南京诺唯赞生物科技有限公司的Phanta Max高保真DNA聚合酶。

第一轮反应：

(1)按照以下体积配制PCR Master Mix，为了保证足够的反应体积，请额外多配制一个反应的量。5’-RACE PCR和3’-RACE PCR可以使用相同的Master Mix。每50μl的PCR反应体系，按照下列体积混合试剂：

(2)按照下表配制PCR反应液。按下面顺序把各组分加入到PCR管中，用枪头轻轻吹打混匀。5’/3’-基因特异性引物(GSP)使用外向引物(outer primer)。

(3)采用下列PCR程序进行第一轮PCR扩增：

(4)第一轮PCR反应扩增完毕后，从PCR管中取1μl的反应液，用ddH2O稀释50倍，用作于第二轮PCR反应的模板。

(5)按照下表配制PCR反应液。在第二轮PCR反应中，将10X通用引物(UPM)换成短通用引物(Universal Primer Short)，5’/3’-基因特异性引物(GSP)换成内向引物(innerprimer),而模板则为稀释后的第一轮PCR反应液。

(6)采用下列PCR程序进行第二轮PCR扩增(x为第二条基因特异性引物的退火温度)

(7)第二轮PCR反应结束后，得目的条带。

其中上述退火温度X℃，与使用的引物有关，引物与退火温度X℃的关系如表2所示。

表2

采用PCR扩增全长序列，均采用高保真Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶来进行扩增，PCR反应体系如表3所示、反应条件如表4所示。其中，表4中的退火温度x(T_M值)与使用的引物有关，引物与退火温度x的关系如表5所示：

表5

4.表达载体构建

4.1pESC-LEU-AtLUPs载体的构建

用BamH I和Xho I两种内切酶分别处理含有AtLUPs的质粒和pESC-LEU表达载体，酶切体系如表6：

表6

双酶切后，进行凝胶电泳，切胶回收目的条带，根据DNA纯化回收试剂盒进行操作，回收后，将目的基因与表达载体进行连接，根据T4-DNA连接酶(来自于美国Thermo公司)要求进行操作，一般在10μl体系下进行，反应条件：室温下，反应40min。连接体系与条件如表6所示。

表6

转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆子，摇菌，提取质粒，获得构建好的pESC-LEU-AtLUPs载体。

4.2pESC-URA-RoCPR-RoCYP-34445载体构建

由于酶切位点的原因，首先用BamH I和Kpn I两个内切酶处理pESC-URA和RoCRP质粒，酶切体系如表7：

表7

双酶切后，进行凝胶电泳，切胶回收目的条带，根据DNA纯化回收试剂盒进行操作，回收后，将目的基因与表达载体进行连接，根据T4-DNA连接酶(来自于美国Thermo公司)要求进行操作，一般在10μl体系下进行，反应条件：室温下，反应40min，连接体系如表8所示：

试剂	体积(μl)
		回收片段RoCPR	根据浓度加入
回收载体pESC-URA	根据浓度加入
		T4-DNA ligase	0.5
10×buffer	1
		ddH<sub>2</sub>O	加至10

表8

转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆子，摇菌，提取质粒，获得构建好的pESC-URA-RoCPR载体，由于RoCPR基因位于GAL1启动子下，因此用EcoR I和Not I内切酶对pESC-URA-RoCPR载体和RoCYP-34445质粒进行酶切，对RoCYP-34445基因和pESC-URA-RoCPR载体进行回收，然后进行连接转化，挑选阳性克隆子，提取质粒得到pESC-URA-RoCPR-RoCYP-34445载体。酶切体系如表9所示，转化体系如表10所示：

表9

试剂	体积(μl)
		回收片段RoCYP-34445	根据浓度加入
回收载体pESC-URA-RoCPR	根据浓度加入
		T4-DNA ligase	0.5
10×buffer	1
		ddH<sub>2</sub>O	加至10

表10

另外，构建pESC-URA-RoCPR-RoCYP-9438和pESC-URA-RoCPR-RoCYP-4809载体，其构建方法同pESC-URA-RoCPR-RoCYP-34445。

实施例2酿酒酵母工程菌的构建及细胞色素P450基因功能验证

1.酿酒酵母感受态的制备

(1)活化冻存的甘油菌，在无抗性YPD平板上划线，30℃过夜培养。

(2)挑取单菌落接种于5ml的YPD培养基的试管中过夜培养。

(3)吸取过夜培养的菌液，接种于50ml的YPD培养基中，在30℃，220rpm条件下摇菌，培养至OD₆₀₀为1.3-1.5。

(4)将培养基转移至无菌的50ml离心管中，在冰上静置15min，停止酵母菌生长。

(5)静置完毕后，在3000g，4℃条件下，离心5min，弃去上清。

(6)用10ml无菌水对菌体进行洗涤，然后在在3000g，4℃条件下，离心5min，弃去上清。

(7)重复步骤(6)。

(8)用10ml的1mol山梨醇对沉淀菌体进行洗涤，然后在在3000g，4℃条件下，离心5min，弃去上清。

(9)最后加入500μl山梨醇重悬酵母细胞，并转移到预冷的无菌的1.5ml EP管中，即做成酵母感受态细胞。

2.酿酒酵母电击转化方法

(1)分别取2-5μl(50-100ng)pESC-URA-RoCPR-RoCYP-34445、pESC-URA-RoCPR-RoCYP-9438、pESC-URA-RoCPR-RoCYP-4809质粒与pESC-URA空白质粒，加入到预冷的1.5ml的EP管中，与酵母感受态细胞轻轻混匀，在冰上静置5min。

(2)将混合物加入到2mm的预冷的电击杯中，于750V/mm的电击强度下，电击4-6ms。

(3)加入1ml的1mol山梨醇，轻轻悬浮细胞，转移到1.5ml EP管中，涂布到相应营养缺陷的SD平板上。

(4)在30℃培养箱中培养48-72h，得到。

3.基因的功能验证

(1)从平板上挑取单菌落，接种于5ml的SD-URA培养基中，在30℃220rpm条件下振摇24h。

(2)从5ml的SD-URA培养基中取1ml菌液接种于50ml的SD-URA中进行培养24h。

(5)在50ml培养基中培养24h后，向培养基中加入50ul 0.3mg/ml的羽扇豆醇，继续培养72h。

(6)加入乙酸乙酯提取产物，进行检测。

其中，产物(桦木酸)的提取具体步骤如下：

在培养基中加入100ml乙酸乙酯，超声30min，静置过夜。

萃取，将上层乙酸乙酯层转移至圆底烧瓶中，旋干。

再加入100ml乙酸乙酯，用旋转蒸发仪旋干，用甲醇：氯仿(1:1)溶解。

产物中桦木酸的检测具体步骤如下：

检测前，需要对样品进行衍生化：取100μl样品于液相小瓶中，用氮吹仪吹干，加入100μl硅烷化试剂MSTFA进行衍生化，在80℃条件下，反应30min，冷却后加入400μl色谱级正己烷，进行GC-MS检测。

本实验采用安捷伦7890B和5977B质谱检测器，以及毛细管色谱柱HP-5MS。载气为氦气，流速为1.0ml/min，在不分流模式下进样量为1ul，温度为250℃，具体升温程序为以80℃为起始温度，以20℃/min升温至300℃，保持15min。质谱条件为电离源为EI，电子能量为70eV，离子源温度为230℃，采用全扫描模式，扫描范围m/z为50～1000。

4.结果

由GC-MS检测结果可知：

含有pESC-URA-RoCPR-RoCYP-34445表达载体的酿酒酵母，可将投喂的底物——羽扇豆醇氧化为桦木酸，与标准品色谱峰的保留时间一致，而含有pESC-URA-RoCPR-RoCYP-9438、pESC-URA-RoCPR-RoCYP-4809、pESC-URA-RoCPR表达载体的酿酒酵母，无法将羽扇豆醇氧化为桦木酸，其GC-MS检测结果如图1所示，图中可见，含有pESC-URA-RoCPR-RoCYP-34445表达载体的酿酒酵母可以将羽扇豆醇氧化为桦木酸，并含有少量的羽扇豆醇。

实施例3在酿酒酵母中构建桦木酸生物合成通路

(1)酿酒酵母感受态的制备及酿酒酵母电击转化步骤同实施例2。其中，向酵母感受态细胞分别加入下面四种组合的质粒：

①pESC-LEU-AtLUPs和pESC-URA-RoCPR-RoCYP-34445；

②pESC-LEU-AtLUPs和pESC-URA-RoCPR；

③pESC-LEU和pESC-URA-RoCPR；

④pESC-LEU和pESC-URA-RoCPR-RoCYP-34445。

(2)培养48-72h后，从平板上挑取单菌落接种于5ml的SD-URA-LEU培养基中，在30℃220rpm条件下振摇24h。

(4)从5ml的SD-URA-LEU培养基中取1ml菌液接种于50ml的SD-URA中进行培养96h。

(5)加入乙酸乙酯提取产物，进行检测。提取与检测方法同实施例2。

如图3所示，从气相色谱结果显示，同时导入AtLUPs、RoCYP-34445基因和RoCPR基因的菌株(含有pESC-LEU-AtLUPs+pESC-URA-RoCPR-RoCYP-3444表达载体)可以将羽扇豆醇氧化为桦木酸，经计算，其产量达到6.3mg/L。

含pESC-LEU-AtLUPs和pESC-URA-RoCPR-RoCYP-34445两个表达载体的酿酒酵母工程菌，合成桦木酸的上游的羽扇豆醇合成酶AtLUPs基因与细胞色素氧化酶RoCYP-34445基因和细胞色素还原酶RoCPR基因一起在酿酒酵母中构建形成桦木酸的生物合成通路，通过代谢工程的方法制备得到桦木酸，通过该方法得到的桦木酸的产量为6.3mg/L，其气相色谱检测结果如图3A所示；而含pESC-LEU-AtLUPs和pESC-URA-RoCPR表达载体的酿酒酵母菌，含有合成桦木酸的上游的羽扇豆醇合成酶AtLUPs基因，和细胞色素还原酶RoCPR基因，但不含RoCYP-34445基因，该菌无法得到桦木酸，其色谱检测结果如图3B所示；含pESC-LEU和pESC-URA-RoCPR的酿酒酵母，作为阴性对照，不产生桦木酸，其色谱检测结果如图3C所示；含有pESC-LEU和pESC-URA-RoCPR-RoCYP-34445表达载体的酿酒酵母菌，因其中缺少了2,3-氧化鲨烯下游的萜类合成酶基因，仅直接导入RoCYP-34445基因和RoCPR基因，而不导入AtLUPs，在培养基中未投喂有底物的情况下，无法表达制备得到桦木酸。

对表达产物进行质谱检测，得到图谱如图4所示，其中图4A为羽扇豆醇的质谱结果图，图4B为桦木酸的质谱检测结果图。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 酿酒酵母工程菌的构建及桦木酸的制备方法

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggatccatgt ggaagttgaa gataggaaag g 31

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtaccttaa ttaacgataa acacaacttt tcg 33

<210> 3

<211> 2286

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatccatgt ggaagttgaa gataggaaag ggaaatggag aagatccgca tttattcagc 60

agcaataact tcgtcggacg tcaaacatgg aagtttgatc acaaagccgg ctcaccggag 120

gaacgagctg ccgtcgaaga agctcgccgg ggtttcttgg ataaccgttt tcgtgttaaa 180

ggttgcagtg atctattgtg gcgaatgcaa tttttaagag agaagaaatt cgaacaaggc 240

ataccacaac taaaagctac taacatagaa gaaataacgt atgaaacaac gacaaatgca 300

ttacgaagag gcgttcgtta cttcacggct ttgcaagcct ctgacggcca ttggccggga 360

gaaatcaccg gtccgctttt cttccttcct cctctcatat tttgtttgta cattaccgga 420

catctggagg aagtattcga tgctgaacat cgcaaagaga tgctaagaca tatctattgt 480

caccagaacg aagatggtgg atggggatta cacatcgaaa gcaagagtgt tatgttctgc 540

accgtgttga attacatatg tttacgtatg cttggagaaa atcctgaaca agacgcatgc 600

aaacgagcta gacaatggat tcttgaccgt ggtggagtga tctttattcc ttcttggggg 660

aaattttggc tctcgatact tggagtctat gattggtctg gaactaatcc gacgccacca 720

gaactcttga tgctgccttc ttttcttcca atacatccag ggaaaatttt gtgttatagc 780

cggatggtta gtatacctat gtcgtatcta tatgggaaga ggtttgttgg tccaattaca 840

cctcttattt tactcttgcg cgaagaactt tacttggaac cttatgaaga aatcaattgg 900

aaaaaaagtc gacgtctata tgcaaaagaa gacatgtatt atgctcatcc tttggttcaa 960

gatttgttat ctgacactct tcaaaacttt gtggagcctt tacttacacg ttggccattg 1020

aacaagcttg tgagggaaaa agctcttcag cttactatga aacacataca ctatgaagac 1080

gaaaatagcc attacataac cattggatgt gttgaaaagg tactgtgcat gctagcttgt 1140

tgggttgaaa atccgaatgg agattatttc aagaagcatc tggctagaat tccagattat 1200

atgtgggtcg ctgaagatgg aatgaaaatg cagagctttg gatgtcaact gtgggatacc 1260

ggatttgcta ttcaagcttt gcttgcaagt aatctccctg atgaaactga tgatgcacta 1320

aagagaggac ataattacat aaaggcatct caggttagag aaaacccttc aggtgatttt 1380

aggagcatgt accgccacat ttcgaaagga gcatggacat tttctgatcg agatcatgga 1440

tggcaagttt cagattgtac agctgaagct ttaaagtgtt gcctgctgct ttccatgatg 1500

tcagctgata tcggcggcca gaaaatagat gatgaacaat tatatgactc tgttaacctc 1560

ttgctgtctt tacagagcgg aaatggaggt gtcaatgcgt gggagccatc ccgtgcatat 1620

aaatggttgg aactgctcaa tcctacagaa ttcatggcta ataccatggt cgagcgggag 1680

tttgtggaat gcacctcatc tgttatacaa gcacttgatc tatttagaaa attgtatcca 1740

gatcacagga agaaagagat caacaggtcc atcgaaaaag ctgtgcaatt tatacaagac 1800

aatcaaacac cagacggttc atggtacgga aattggggtg tttgcttcat ttacgctact 1860

tggtttgctc ttggaggcct agcagcagct ggtgaaactt acaacgattg tttagctatg 1920

cgcaatggtg tccacttttt gctcacgaca caaagagatg atggaggttg gggtgaaagc 1980

tatttatcat gctccgaaca gagatatata ccatcagaag gagaaagatc aaaccttgtg 2040

caaacatcat gggctatgat ggctctaatt catacgggac aggctgagag agatttgact 2100

cctcttcatc gtgctgccaa acttatcatc aattcacaac ttgaaaacgg cgattttcct 2160

caacaggaaa tagtaggagc gttcatgaat acatgcatgc tacactatgc tacatacaga 2220

aacaccttcc cattatgggc actcgcagaa taccgaaaag ttgtgtttat cgttaattaa 2280

ctcgag 2286

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccacctcca ttcccccctt gcactttg 28

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gttcccgtcc gccaagcctt ctctagg 27

<210> 7

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgtgatgtac accgaactct ccacacaatc gcacaaaaac agggttgtct gagcagctcc 60

gaagccgaag gcatggtcaa gaatctgcaa acgacaggaa gatatttgcg cgatgtatgg 120

tga 123

<210> 9

<211> 2118

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggaaccct cgtcgccgaa gctctcgccg ctcgatttca tagcggcgat cttaaagggc 60

gatattgagg gggcggcgcc gcggggtgtg gcggcgatgt tgatggagaa cagagacctc 120

gcgatggtgc tcactacatc cgtcgcgttg ctcataggct gcgtcgttgt gctagcgtgg 180

cggcgcaccg ccggatcggc ggggaagaag cagctacagc cgcccaagct ggtggtgccg 240

aaggcggcgg tggagccgga ggaggcggag gatgacaaca ccaaggtttc cgtcttcttc 300

ggcacacaga ctggtacagc tgaaggtttc gcaaaggcat ttgctgagga agctaaagct 360

agatatccac aggccaagtt taaagtaatt gacttagatg attatgctgc cgatgatgat 420

gagtacgagg ataagttgaa gaaggagagt ttagcattct tcttcctggc ctcatatgga 480

gatggtgagc ctacagacaa tgctgcaagg ttctacaaat ggtttactga gggaaaagat 540

agggaggaat ggcttaagaa tcttcagtac gctatattcg gtcttgggaa cagacaatac 600

gagcatttca acaagattgc gatagtggta gatgacctta tcaccgagca aggaggaaag 660

aagcttgttc cagtaggctt gggagatgat gaccaatgca ttgaagatga ctttactgca 720

tggcgtgaat tattgtggcc tgagttggat aaattgctcc gcaacgagga cgatgcaacg 780

gttgctactc catacactgc tgcggtgttg cagtatcgtg ttgtgctcca tgaccaaaca 840

gatggattga ttacagagaa tggttcacca aatggtcgtg ccaatggtaa cactgtatat 900

gatgctcaac atccctgcag ggcaaatgtt tctgtaaaga gagagctgca cactcctgaa 960

tcagatcgtt cttgcactca tttggaattt gacatagctg gcacaggact tgtgtatgaa 1020

acgggggacc atgttggtgt ctattgtgag aatttgctca agaatgtgga ggaagcggaa 1080

aagttactaa atctgtcccc gcaaacatac ttttcagttc atactgataa cgaggatggc 1140

actccactca gtggaagctc tttgccacct ccattccccc cttgcacttt gcggacagca 1200

ctaactaaat acgcagatct tatgagtatg cccaaaaagt ctgtgctagt tgcattagcg 1260

gaatatgctt ctgaccaaag tgaagctgat cgactcagat atcttgcatc ccccgatgga 1320

aaggaggaat atgcacagta tgtagttgca agtcagagaa gcctactgga gatcatggcc 1380

gagttcccgt ccgccaagcc ttctctaggt gttttctttg cagctgttgc tcctcggctc 1440

cagcccagat tttattctat ctcatcctcc ccgaaaatcg caccaaccag agttcatgtg 1500

acttgtgctc tggtttatga caaaacacca acaggacgaa tccacaaggg tatatgctct 1560

acatggataa agaatgctgt gcctttggag gaaagtagcg attgcagttg ggcatcaatt 1620

tttattagaa gctctaactt caaactccct actgatccta aagtaccggt aataatggtc 1680

ggccctggta ctggcttggc tccatttagg ggtttccttc aggaaaggtt agctctaaag 1740

gaatctggag ctgaacttgg tcctgccatt ttattttttg gttgtaggaa ccgtaaaatg 1800

gattttattt atgaagatga gttgaatggc tttgtcaaag ctggagcaat ttccgagctc 1860

atagttgcat tctcacgtga gggacctgcg aaggaatacg tgcaacacaa gatgtctcaa 1920

agggcttcgg acgtctggaa aatgatctct gatggaggtt atgtctacgt ctgtggtgat 1980

gccaagggaa tggcgcgtga tgtacaccga actctccaca caatcgcaca aaaacagggt 2040

tgtctgagca gctccgaagc cgaaggcatg gtcaagaatc tgcaaacgac aggaagatat 2100

ttgcgcgatg tatggtga 2118

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggatccatgg aaccctcgtc gccgaagctc 30

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtacctcac catacatcgc gcaaatatct tcctg 35

<210> 12

<211> 2130

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggatccatgg aaccctcgtc gccgaagctc tcgccgctcg atttcatagc ggcgatctta 60

aagggcgata ttgagggggc ggcgccgcgg ggtgtggcgg cgatgttgat ggagaacaga 120

gacctcgcga tggtgctcac tacatccgtc gcgttgctca taggctgcgt cgttgtgcta 180

gcgtggcggc gcaccgccgg atcggcgggg aagaagcagc tacagccgcc caagctggtg 240

gtgccgaagg cggcggtgga gccggaggag gcggaggatg acaacaccaa ggtttccgtc 300

ttcttcggca cacagactgg tacagctgaa ggtttcgcaa aggcatttgc tgaggaagct 360

aaagctagat atccacaggc caagtttaaa gtaattgact tagatgatta tgctgccgat 420

gatgatgagt acgaggataa gttgaagaag gagagtttag cattcttctt cctggcctca 480

tatggagatg gtgagcctac agacaatgct gcaaggttct acaaatggtt tactgaggga 540

aaagataggg aggaatggct taagaatctt cagtacgcta tattcggtct tgggaacaga 600

caatacgagc atttcaacaa gattgcgata gtggtagatg accttatcac cgagcaagga 660

ggaaagaagc ttgttccagt aggcttggga gatgatgacc aatgcattga agatgacttt 720

actgcatggc gtgaattatt gtggcctgag ttggataaat tgctccgcaa cgaggacgat 780

gcaacggttg ctactccata cactgctgcg gtgttgcagt atcgtgttgt gctccatgac 840

caaacagatg gattgattac agagaatggt tcaccaaatg gtcgtgccaa tggtaacact 900

gtatatgatg ctcaacatcc ctgcagggca aatgtttctg taaagagaga gctgcacact 960

cctgaatcag atcgttcttg cactcatttg gaatttgaca tagctggcac aggacttgtg 1020

tatgaaacgg gggaccatgt tggtgtctat tgtgagaatt tgctcaagaa tgtggaggaa 1080

gcggaaaagt tactaaatct gtccccgcaa acatactttt cagttcatac tgataacgag 1140

gatggcactc cactcagtgg aagctctttg ccacctccat tccccccttg cactttgcgg 1200

acagcactaa ctaaatacgc agatcttatg agtatgccca aaaagtctgt gctagttgca 1260

ttagcggaat atgcttctga ccaaagtgaa gctgatcgac tcagatatct tgcatccccc 1320

gatggaaagg aggaatatgc acagtatgta gttgcaagtc agagaagcct actggagatc 1380

atggccgagt tcccgtccgc caagccttct ctaggtgttt tctttgcagc tgttgctcct 1440

cggctccagc ccagatttta ttctatctca tcctccccga aaatcgcacc aaccagagtt 1500

catgtgactt gtgctctggt ttatgacaaa acaccaacag gacgaatcca caagggtata 1560

tgctctacat ggataaagaa tgctgtgcct ttggaggaaa gtagcgattg cagttgggca 1620

ccaattttta ttagaagctc taacttcaaa ctccctactg atcctaaagt accggtaata 1680

atggtcggcc ctggtactgg cttggctcca tttaggggtt tccttcagga aaggttagct 1740

ctaaaggaat ctggagctga acttggtcct gccattttat tttttggttg taggaaccgt 1800

aaaatggatt ttatttatga agatgagttg aatggctttg tcaaagctgg agcaatttcc 1860

gagctcatag ttgctttctc acgtgaggga cctgcgaagg aatacgtgca acacaagatg 1920

tctcaaaggg cttcggacgt ctggaaaatg atctccgatg gaggttatgt ctacgtctgt 1980

ggtgatgcca agggaatggc gcgtgatgta caccgaactc tccacacaat cgcacaaaaa 2040

cagggttgtc tgagcagctc cgaagccgaa ggcatggtca agaatctgca aacgacagga 2100

agatatttgc gcgatgtatg gtgaggtacc 2130

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggccaggtcg gccttccgct gcttgatg 28

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggtccatgat gccaacgtag cggtggag 28

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggacgccgtt ccacaagggg atcaaggc 28

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gctcgtcgcc atcatcaagc agcggaag 28

<210> 17

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atggagttct tctatgcttc cctcctctgc ctcttcgtct ccctggtctt cctctccctc 60

cacctcctct tttataagac gaagaccggc tccctccccc cgggcaagac cgggtggccg 120

gtgatcgggg agagcctcga gttcctctcc accggctgga agggccaccc agagaagttc 180

atcttcgacc gg 192

<210> 18

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgagaaaatt gtggttgatc caatgcccat tccggctaat ggtctcccag ttcgactcta 60

cccccacact tcttaa 76

<210> 20

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atggagttct tctatgcttc cctcctctgc ctcttcgtct ccctggtctt cctctccctc 60

cacctcctct tttataagac gaagaccggc tccctccccc cgggcaagac cgggtggccg 120

gtgatcgggg agagcctcga gttcctctcc accggctgga agggccaccc agagaagttc 180

atcttcgacc ggatggcccg ctactcctcc cacgtcttcc gcacccacct cctcggcgag 240

ccggccgctg tcctctgcgg ctccgccggc aacaagttcc tcttctccaa cgagaacaag 300

ctcgtccaag cgtggtggcc gagctccgtc gagaagatct tccccaacga caacgccgag 360

acatcctcga aggaagagtc catcaagatg cgccgcatgc tccccacctt cttcaagccg 420

gaggccctcc accgctacgt tggcatcatg gaccacattg cccgccgcca cttcgccgac 480

ggctgggacg gcaaacggga ggtcgtcgtc ttccccttgg ccaagaacta caccttctgg 540

ctcgcctgcc gcctctttct cagcgtcgag gatccctcgc aggtcgaaaa attcgcggcc 600

ccgttcaatc ttttagcatc ggggctgatc tcgatcccga tcgatctgcc cgggacgccg 660

ttccacaagg ggatcaaggc ctccgcctac atcaggaagg agctcgtcgc catcatcaag 720

cagcggaagg ccgacctggc cgacggcacg gcgtcaccga cgcaggacat cctgtcgcac 780

atgctgctca ccagcaacga agatgggaaa ttcatgcagg agtcggacat cgcgaacaag 840

attctgggtt tgctcattgg cggccatgac actgctagct ctgcttgtac cttcgtcgtc 900

aagtacctcg ccgagttgcc ccaggtctac gagggcgtct acaaagagca aatggagatc 960

gcgaaatcaa aggcggccgg agagttgctg aactgggagg acttgcagaa gatgaagtac 1020

tcatggaacg ttgcatgcga agtgctgaga ctcgcaccgc cccttcaggg tgcattcaga 1080

gaagcccttg ccgatttctc attcaatggc ttctccatcc caaagggctg gaagttatat 1140

tggagtgcaa attcgacgca caagaactcg gagttcttcc cggagccgga gaagttcgat 1200

ccgtcgaggt tcgaggggtc gggacccgcc ccgtacacgt tcgtgccgtt cggcggcggg 1260

ccgaggatgt gccccggcaa ggaatatgcc cgtttggaaa tcctagtgtt catgcaccac 1320

cttgtgaaga ggttcaagtg ggagaagatg attcctgatg agaaaattgt ggttgatcca 1380

atgcccattc cggctaatgg tctcccagtt cgactctacc cccacacttc ttaa 1434

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcggccgctt aagaagtgtg ggggtagagt cg 32

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gaattcatgg agttcttcta tgcttccctc 30

<210> 23

<211> 1448

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gaattcatgg agttcttcta tgcttccctc ctctgcctct tcgtctccct ggtcttcctc 60

tccctccacc tcctctttta taagacgaag accggctccc tccccccggg caagaccggg 120

tggccggtga tcggggagag cctcgagttc ctctccaccg gctggaaggg ccacccagag 180

aagttcatct tcgaccggat ggcccgctac tcctcccacg tcttccgcac ccacctcctc 240

ggcgagccgg ccgctgtcct ctgcggctcc gccggcaaca agttcctctt ctccaacgag 300

aacaagctcg tccaagcgtg gtggccgagc tccgtcgaga agatcttccc caacgacaac 360

gccgagacat cctcgaagga agagtccatc aagatgcgcc gcatgctccc caccttcttc 420

aagccggagg ccctccaccg ctacgttggc atcatggacc acattgcccg ccgccacttc 480

gccgacggct gggacggcaa acgggaggtc gtcgtcttcc ccttggccaa gaactacacc 540

ttctggctcg cctgccgcct ctttctcagc gtcgaggatc cctcgcaggt cgaaaaattc 600

gcggccccgt tcaatctttt agcatcgggg ctgatctcga tcccgatcga tctgcccggg 660

acgccgttcc acaaggggat caaggcctcc gcctacatca ggaaggagct cgtcgccatc 720

atcaagcagc ggaaggccga cctggccgac ggcacggcgt caccgacgca ggacatcctg 780

tcgcacatgc tgctcaccag caacgaagat gggaaattca tgcaggagtc ggacatcgcg 840

aacaagattc tgggtttgct cattggcggc catgacactg ctagctctgc ttgtaccttc 900

gtcgtcaagt acctcgccga gttgccccag gtctacgagg gcgtctacaa agagcaaatg 960

gagatcgcga aatcaaaggc ggccggagag ttgctgaact gggaggactt gcagaagatg 1020

aagtactcat ggaacgttgc atgcgaagtg ctgagactcg caccgcccct tcagggtgca 1080

ttcagagaag cccttgccga tttctcattc aatggcttct ccatcccaaa gggctggaag 1140

ttatattgga gtgcaaattc gacgcacaag aactcggagt tcttcccgga gccggagaag 1200

ttcgatccgt cgaggttcga ggggtcggga cccgccccgt acacgttcgt gccgttcggc 1260

ggcgggccga ggatgtgccc cggcaaggaa tatgcccgtt tggaaatcct agtgttcatg 1320

caccaccttg tgaagaggtt caagtgggag aagatgattc ctgatgagaa aattgtggtt 1380

gatccaatgc ccattccggc taatggtctc ccagttcgac tctaccccca cacttcttaa 1440

gcggccgc 1448

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cgttctccaa ggctcttcag cagcatcg 28

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gcaacgctgg acgtgtcgtg gcctgc 26

<210> 26

<211> 198

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

atggctgaaa tacttttgat gcttgcagca tttttgataa tcttggtcat aataattttc 60

tcaaatagga cgaggtgttc aagaaacggg gccttgaatc tgcctccggg cagctatggg 120

tggccggttc ttggggaaac ggttgagttc ctccgtgctg gattggatgg gacgccggag 180

aaatttgtta gagagaga 198

<210> 28

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

atggctgaaa tacttttgat gcttgcagca tttttgataa tcttggtcat aataattttc 60

tcaaatagga cgaggtgttc aagaaacggg gccttgaatc tgcctccggg cagctatggg 120

tggccggttc ttggggaaac ggttgagttc ctccgtgctg gattggatgg gacgccggag 180

aaatttgtta gagagagaat ggagaaatac aagtcgcaag ttttcaagac atggatcatg 240

ggggagccca tggccgtttt gtgtggagct gcaggtaaca aattcttgtt cagcaatgaa 300

aagaagctgg tgacagtgtg gtggccgagc tccgtgagga atctgctggg gccgtgcttg 360

gccacaagcg gcggcgatga aggccgccag atgaggagga tggtgtcgta tttcgtgagc 420

cctgatgctt tcacgaggct ttatatcaag acaatggata tggtctccca gcagcatatc 480

aagattaact ggcaaggtaa agaagaggtc aaagtgtttc cgacgatcaa gttgtacacg 540

tttgaacttg catgtagact gtttatgagc cttgaagatg gcgagcagat tgggaagctt 600

gctactttgt ttaatatttt cttgaaaggg ataatctcaa tccctatcaa tttgcctgga 660

gcaagattct acagagcaaa gaaagctaca tctgctatca agaatgaact gcacaagtta 720

gtgagagata gacgaggtgc tttggagcag aaaacagctc tgccctccca agatcttctc 780

tctcatctgc tagtaacccc tgatgagaat ggcaagttca tgactgaatc ggtaatcgtg 840

aacaacatac tgatgctgct ctttgcaggc cacgacacgt ccagcgttgc aataacgatg 900

ctgctgaaga gccttggaga acgtcctgat gtttatgaga aggtgttgag agagcagaag 960

gagatagcat catcggaagg ggagtttctg cagtgggagg acatacagaa gatgaagtac 1020

tcgtggagcg tggtatgtga agtgacgagg ctgtcaccgc cagtcattgg tgctttcaga 1080

gaagcgttaa cggacataag ctacgcgggc taccatatcc ccaaggggtg gaagttgtat 1140

tggagctcgt ccaacacaca tagggaccca agcttgttca cgagctacac caggtttgat 1200

ccatcgagat ttgaagagtc accggggcca gccccatttt cgtatgtgcc gtttggtggg 1260

gggcctagga tgtgcctggg gaaagagttt gcaaggctgg agatactcat atttttacac 1320

aacgtgatta aaagatatag gtggaagttg gtgaatcctg atgagaaaat tgcatatgat 1380

ccaatgccca cacctgtgga aggacttccc attcttatcc aaccacagac atag 1434

<210> 29

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gcggccgcct atgtctgtgg ttggataaga atg 33

<210> 30

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gaattcatgg ctgaaatact tttgatgc 28

<210> 31

<211> 1448

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gaattcatgg ctgaaatact tttgatgctt gcagcatttt tgataatctt ggtcataata 60

attttctcaa ataggacgag gtgttcaaga aacggggcct tgaatctgcc tccgggcagc 120

tatgggtggc cggttcttgg ggaaacggtt gagttcctcc gtgctggatt ggatgggacg 180

ccggagaaat ttgttagaga gagaatggag aaatacaagt cgcaagtttt caagacatgg 240

atcatggggg agcccatggc cgttttgtgt ggagctgcag gtaacaaatt cttgttcagc 300

aatgaaaaga agctggtgac agtgtggtgg ccgagctccg tgaggaatct gctggggccg 360

tgcttggcca caagcggcgg cgatgaaggc cgccagatga ggaggatggt gtcgtatttc 420

gtgagccctg atgctttcac gaggctttat atcaagacaa tggatatggt ctcccagcag 480

catatcaaga ttaactggca aggtaaagaa gaggtcaaag tgtttccgac gatcaagttg 540

tacacgtttg aacttgcatg tagactgttt atgagccttg aagatggcga gcagattggg 600

aagcttgcta ctttgtttaa tattttcttg aaagggataa tctcaatccc tatcaatttg 660

cctggagcaa gattctacag agcaaagaaa gctacatctg ctatcaagaa tgaactgcac 720

aagttagtga gagatagacg aggtgctttg gagcagaaaa cagctctgcc ctcccaagat 780

cttctctctc atctgctagt aacccctgat gagaatggca agttcatgac tgaatcggta 840

atcgtgaaca acatactgat gctgctcttt gcaggccacg acacgtccag cgttgcaata 900

acgatgctgc tgaagagcct tggagaacgt cctgatgttt atgagaaggt gttgagagag 960

cagaaggaga tagcatcatc ggaaggggag tttctgcagt gggaggacat acagaagatg 1020

aagtactcgt ggagcgtggt atgtgaagtg acgaggctgt caccgccagt cattggtgct 1080

ttcagagaag cgttaacgga cataagctac gcgggctacc atatccccaa ggggtggaag 1140

ttgtattgga gctcgtccaa cacacatagg gacccaagct tgttcacgag ctacaccagg 1200

tttgatccat cgagatttga agagtcaccg gggccagccc cattttcgta tgtgccgttt 1260

ggtggggggc ctaggatgtg cctggggaaa gagtttgcaa ggctggagat actcatattt 1320

ttacacaacg tgattaaaag atataggtgg aagttggtga atcctgatga gaaaattgca 1380

tatgatccaa tgcccacacc tgtggaagga cttcccattc ttatccaacc acagacatag 1440

gcggccgc 1448

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gaattcatgg agctcctaac gttagctg 28

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

atcgattcac tgtttgtaaa ggcggac 27

<210> 34

<211> 1461

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gaattcatgg agctcctaac gttagctgtt tccttactcc tcatcgccct cacattcttc 60

ctcctccgcc gtagctccgg cggcgtcgat gccctccccc cgggcagctt cgggtggccg 120

ttgctgggag agagcgtcga gttcctgttc ggcaagccgg agaaattcgt cggcgaccgg 180

atgaagaaat actcgctgga catcttcaaa actaaaatcc tcggtgagaa aaccgccgtg 240

atctgcggcc ccgccggcca caaattcctc ttctccaacg agcagaagta cttcaccgca 300

ttccgccccc accccatgca gcacctcttc cgctcctaca aacctaaatc cgcctccgcc 360

gccgagaagc cggctgaagc cgccgctccg ccgacgacca aagccaccga cgagaccaag 420

gccatacgcc agcccggatt cctcaagccc gaagccctaa tgcgattttt ggcggggatg 480

gatttaatca ctcaaaagca gctgcaaatt cactgtgcag gtaaaaacgt ggtccagttt 540

tacccgctgt cgaaaacaat taccctaacc atcgcgtgcc agttttttat gggtattaat 600

aacccggagc gcatcgcgcg cttggtgaaa aacttcgacg atgttaccgt ggggatgcac 660

tgcatcatgt taaacttacc gggcacgatt ttttaccgcg gtaacaaagc tgcggcggcg 720

ctcaggaagg aactgatcgc tgtcatcaag gagaagaagc aatctatcgc cggcggggcg 780

ccgctgcacg acatcttgtc gcacatgatc gtcgcctctg acccggcagg gagatccatg 840

cccgaacctg agatcgcaga taagattatg gggattttga ccgccgggta tagtacggtg 900

gcgaccacga tgaccttctt gatgaagtat ctagggttga atcccgatat ctacgaacga 960

gttcgtgcag agcaattgga gattgcggct gtgaagaaag aaggggaacc attgaattgg 1020

gaagatatgg ggaaaatgaa gtattcatgg aatgtgatat gcgagacaat gagaatggtt 1080

cctccattgc aagggacatt tagggaagtg ctcgaggaat ttacatatgc cggctacaat 1140

attcccaagg gctggaaggt atattggacg gtgagcacaa ccaacatgaa cccacagtat 1200

ttcaagaatc cagagagatt caatccatcg agatatgagg agggagaagc gcctccgccg 1260

tacacctacg ttccattcgg gggagggccg agaatgtgcc ccggaaaaga gtacgctaga 1320

atatcaatat tggctttcgt tcacaatgtt gtgaagaatt accggtggga agttgtcgat 1380

ccaaatgaga aggtggaagg agatatgatg ccggagccgc agaaaggtct gccggtccgc 1440

ctttacaaac agtgaatcga t 1461

Claims

1.一种用于制备桦木酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括：向酿酒酵母中转化含有细胞色素还原酶基因RoCPR和细胞色素P450基因RoCYP-34445的重组质粒。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述细胞色素还原酶基因RoCPR，以迷迭香cDNA为模板，以核苷酸序列如SEQ.ID NO.8所示的RoCPR-F和核苷酸序列如SEQ.ID NO.9所示的RoCPR-R为引物，经PCR扩增得到；所述迷迭香cDNA由提取迷迭香的总RNA后进行反转录得到。

3.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述细胞色素P450基因RoCYP-34445为：以迷迭香cDNA为模板，以核苷酸序列如SEQ.ID NO.18所示的RoCYP-34445-F、和核苷酸序列如SEQ.ID NO.19所示的RoCYP-34445-R为引物，经PCR扩增得到；所述迷迭香cDNA由提取迷迭香的总RNA后进行反转录得到。

4.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，还包括：向酿酒酵母中转化含有羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs的重组质粒。

5.根据权利要求4所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs为：以拟南芥cDNA为模板，以核苷酸序列如SEQ.ID NO.1所示的LUP-F、和核苷酸序列如SEQ.ID NO.2所示的LUP-R为引物，PCR扩增得到；所述拟南芥cDNA由提取拟南芥的总RNA后进行反转录得到。

6.根据权利要求1-5任一项所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述细胞色素还原酶基因RoCPR的核苷酸序列如SEQ.ID NO.7所示；及/或

所述细胞色素P450基因RoCYP-34445的核苷酸序列如SEQ.ID NO.17所示。

7.根据权利要求4或5所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs的核苷酸序列如SEQ.ID NO.3所示。

8.根据权利要求1-7任一项所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述酿酒酵母为S.cerevisiae BY4741。

9.一种用于制备桦木酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于，由如权利要求1-8任一项所述的酿酒酵母工程菌的构建方法构建得到。

10.一种桦木酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求1-8任一项所述的构建方法构建得到的酿酒酵母工程菌，接种于培养基中培养，即得。