CN110438099B

CN110438099B - 糖基转移酶及其相关材料在构建产人参皂苷Rb1和Rg1的工程菌中的应用

Info

Publication number: CN110438099B
Application number: CN201810418129.2A
Authority: CN
Inventors: 张学礼; 戴住波; 王金鹤
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2018-05-04
Filing date: 2018-05-04
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2038-05-04
Also published as: CN110438099A

Abstract

本发明公开了糖基转移酶及其相关材料在构建产人参皂苷Rb1和Rg1的工程菌中的应用。本发明通过合成生物学的方法成功鉴定到催化人参皂苷Rd生成人参皂苷Rb1的糖基转移酶基因Pn3‑32，此基因同时可以催化人参皂苷F1生成人参皂苷Rg1，并构建得到产人参皂苷Rb1和Rg1的重组酵母菌。通过实验证明：本发明构建的产人参皂苷Rb1和Rg1的重组酵母菌可同时生成人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1。本发明首次利用药用植物三七中Pn1‑31、Pn3‑29、Pn3‑31和Pn3‑32四个糖基转移酶基因连续催化原人参二醇和原人参三醇合成人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1及相应中间体，为微生物菌株生产天然产物提供新案例。

Description

糖基转移酶及其相关材料在构建产人参皂苷Rb1和Rg1的工程菌中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及糖基转移酶及其相关材料在构建产人参皂苷Rb1和Rg1的工程菌中的应用。

背景技术

人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1)、人参皂苷Rd(Ginsenoside Rd)和人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1)均为达玛烷型三萜皂苷类化合物，主要分布于五加科植物人参、三七、西洋参等植物中，具有多种药理活性，是极具药用价值的化学物质。其中人参皂苷Rb1在中枢神经系统、心血管系统、免疫系统以及在抗肿瘤方面具有改善调节作用。人参皂苷Rd在心血管系统、免疫系统、肾脏功能保护及抗肿瘤作用等方面有着显著生物活性。人参皂苷Rg1具有天然抗氧化作用，对神经系统、心血管系统、免疫系统都有影响，可以抑制细胞凋亡、扩张血管、抗衰老，并对运动疲劳的恢复有一定作用。这类化合物主要是从人参属植物中分离提取得到，但这种方法有较多的缺点，包括含量低和差异大，产品纯化难，植物生长周期长，对生物资源尤其野生资源造成严重破坏等。

目前利用合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来生产天然产物已被国际认为是一种最有潜力的方法，如在大肠杆菌中生产紫杉醇的前体紫杉二烯已达到1000mg/L(Parayil Kumaran Ajikumar et al.,2010,Science,330:70-74)；银杏内酯类(Ginkgolides)前体左旋海松二烯(Levopimaradiene)，在改造后的大肠杆菌工程菌中达到700mg/L的产量(Effendi Leonard et al.,2010,PNAS,107(31):13654–13659)；在酵母工程菌中生产青蒿素(Artemisinin)的前体青蒿酸(Artemisinic acid)最高达到25g/L(Paddon CJ et al.,2013,Nature,2013,496:528-532)；目前国内在青蒿素、紫杉醇、人参皂苷和丹参酮等药物分子的生物合成方面均有相关研究。

然而，清晰的天然药物生物合成过程是应用合成生物学技术创建人工细胞工厂发酵生产目标化合物的前提。目前在人参皂苷的生物合成途径研究方面已有相关进展，包括人参皂苷合成途径中的一些关键酶，如催化类异戊二烯途径朝向固醇和三萜皂苷的角鲨烯合酶(Squalene synthase，SS)，催化2，3-氧化角鲨烯生成的角鲨烯环氧酶(Squaleneepoxidase，SE)，催化达玛烯二醇生成的达玛烯二醇合成酶(DS)，还有负责羟基化的细胞色素P450酶等，但三七中各类糖基化皂苷的生物合成比较复杂，目前尚未完全挖掘。钟建江等在钙离子对三七人参皂苷Rb1生物合成影响的研究中发现三七植物组织细胞中提取的粗酶液有催化人参皂苷Rd生成人参皂苷Rb1的活性，但并未找到相关糖基转移酶基因(Yue CJet al.,Biotechnol Bioeng,2005,89(4):444-452)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2或序列16或序列17或序列18所示的蛋白质；

b)在序列2或序列16或序列17或序列18所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2或序列16或序列17或序列18所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2或序列16或序列17或序列18所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

将氨基酸序列如序列2所示的蛋白质命名为人参皂苷Rb1-Rg1合成酶Pn3-32；将氨基酸序列如序列16所示的蛋白质命名为人参皂苷Rh2合成酶Pn1-31；将氨基酸序列如序列17所示的蛋白质命名为人参皂苷Rd-F1合成酶Pn3-29；将氨基酸序列如序列18所示的蛋白质命名为人参皂苷Rg3合成酶Pn3-31。上述蛋白质Pn3-32、Pn1-31、Pn3-29和Pn3-31均来源于三七(Panax notoginseng)，均为糖基转移酶。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2或序列16或序列17或序列18所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列2或序列16或序列17或序列18所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2或序列16或序列17或序列18所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码上述蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因细胞系。

上述生物材料中，1)其编码序列是序列1或序列3或序列4或序列5所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码上述蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2或序列16或序列17或序列18所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如酿酒酵母。

上述生物材料中，所述转基因细胞系不包括繁殖材料。

本发明还有一个目的是提供上述蛋白质或上述生物材料的新用途。

本发明提供了上述蛋白质在作为糖基转移酶中的应用。

本发明还提供了上述Pn3-32蛋白质或上述生物材料在催化人参皂苷Rd生成人参皂苷Rb1中的应用。

本发明还提供了上述Pn3-32蛋白质或上述生物材料在催化人参皂苷F1生成人参皂苷Rg1中的应用。

本发明还提供了上述蛋白质或上述生物材料在构建产人参皂苷Rb1和/或人参皂苷Rg1的重组菌中的应用。

本发明还提供了上述蛋白质或上述生物材料在生产人参皂苷Rb1和/或人参皂苷Rg1中的应用。

本发明还有一个目的是提供一种构建产人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的重组菌的方法。

本发明提供的构建产人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的重组菌的方法包括如下步骤：提高产人参皂苷Rd和人参皂苷F1的重组菌中人参皂苷Rb1-Rg1合成酶Pn3-32的表达量和/或活性，得到产人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的重组菌。

上述方法中，所述产人参皂苷Rd和人参皂苷F1的重组菌的制备方法包括如下步骤：

1)提高受体菌中达玛烯二醇合成酶SynPgDDS、原人参三醇合酶SynPgPPTS、细胞色素P450还原酶AtCPR1和原人参二醇合酶SynPPDS的表达量和/或活性，得到重组菌甲；所述受体菌为酿酒酵母BY-T3；

2)提高所述重组菌甲中磷酸葡萄糖变位酶1PGM1、α-磷酸葡萄糖变位酶PGM2、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGP1、人参皂苷Rh2合成酶Pn1-31、人参皂苷Rd-F1合成酶Pn3-29和人参皂苷Rg3合成酶Pn3-31的表达量和/或活性，得到所述产人参皂苷Rd和人参皂苷F1的重组菌。

上述方法中，所述提高产人参皂苷Rd和人参皂苷F1的重组菌中人参皂苷Rb1-Rg1合成酶Pn3-32的表达量和/或活性是通过向所述产人参皂苷Rd和人参皂苷F1的重组菌中导入人参皂苷Rb1-Rg1合成酶Pn3-32的编码基因来实现的；

所述提高受体菌中达玛烯二醇合成酶SynPgDDS、原人参三醇合酶SynPgPPTS、细胞色素P450还原酶AtCPR1和原人参二醇合酶SynPPDS的表达量和/或活性是通过向受体菌中导入达玛烯二醇合成酶SynPgDDS的编码基因、原人参三醇合酶SynPgPPTS的编码基因、细胞色素P450还原酶AtCPR1的编码基因和原人参二醇合酶SynPPDS的编码基因来实现的；

所述提高所述重组菌甲中磷酸葡萄糖变位酶1PGM1、α-磷酸葡萄糖变位酶PGM2、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGP1、人参皂苷Rh2合成酶Pn1-31、人参皂苷Rd-F1合成酶Pn3-29和人参皂苷Rg3合成酶Pn3-31的表达量和/或活性是通过向重组菌甲中导入磷酸葡萄糖变位酶1PGM1的编码基因、α-磷酸葡萄糖变位酶PGM2的编码基因、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGP1的编码基因、人参皂苷Rh2合成酶Pn1-31的编码基因、人参皂苷Rd-F1合成酶Pn3-29的编码基因和人参皂苷Rg3合成酶Pn3-31的编码基因来实现的。

本发明还提供了上述方法构建得到的产人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的重组菌或产人参皂苷Rd和人参皂苷F1的重组菌或重组菌甲。

上述产人参皂苷Rd和人参皂苷F1的重组菌或重组菌甲或产人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的重组菌在生产人参皂苷Rb1和/或人参皂苷Rg1中的应用也属于本发明的保护范围。

上述产人参皂苷Rd和人参皂苷F1的重组菌或重组菌甲在生产人参皂苷Rd和/或人参皂苷F1中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明最后提供了一种生产人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的方法。

本发明提供的生产人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的方法包括如下步骤：发酵培养上述产人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的重组菌，收集发酵产物，从所述发酵产物中获得人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1。

本发明通过合成生物学的方法成功鉴定到催化人参皂苷Rd生成人参皂苷Rb1的糖基转移酶基因Pn3-32，此基因同时可以催化人参皂苷F1生成人参皂苷Rg1，并构建得到产人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的重组酵母菌Rd-GM+Pn3-32。通过实验证明：本发明构建的产人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的重组酵母菌Rd-GM+Pn3-32可同时生成人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1。本发明首次利用药用植物三七中Pn1-31、Pn3-29、Pn3-31和Pn3-32四个糖基转移酶基因连续催化原人参二醇和原人参三醇合成人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1及相应中间体，为微生物菌株生产天然产物提供新案例。

附图说明

图1为BY-T3、Rd-GM、Rd-GM+Pn3-32溶液的LC-MS分析结果。A为待测样品和标准品的LC-MS离子图，B为对应峰的高分辨质谱分子量，C为三七来源的Pn3-32功能基因参与皂苷Rg1和Rb1的合成。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的酿酒酵母BY4742(Saccharomyces cerevisiae BY4742)，记载在文献“Carrie baker brachmann et al.,1998,YEAST,14:115–132”中，公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得。

实施例1、糖基转移酶Pn3-32、Pn1-31、Pn3-29和Pn3-31及其编码基因在制备人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1中的应用

(一)重组质粒的构建

一、基因元件的构建

1、三七cDNA的获得

1)总RNA提取：三七(Panax notoginseng)(来源于中国科学院天津工业生物技术研究所，公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得)叶片200mg，用液氮研磨后CTAB法提取总RNA：在1.5ml离心管中加入1ml 2×CTAB提取液，65℃预热之后，加入20μl 2-ME；加入少量粉末(约50mg)，混合均匀，65℃保温10min，摇匀5次；4℃，12000rpm离心10min，移出上清，用等体积的氯仿/异戊醇抽提；4℃，12000rpm离心10min，移出上清，用等体积的氯仿/异戊醇抽提；4℃，12000rpm离心10min，移出上清，用1/6体积的氯仿/异戊醇抽提；4℃，15000rpm离心30min，移出上清，加入1/4体积的10mol/L LiCl，4℃放置过夜；4℃，15000rpm离心30min，弃去上清，用75％乙醇洗涤沉淀2次，无水乙醇洗涤沉淀1次，超净台放置15min(室温)；用20μl milliQ DEPC处理水溶解，加入1/10体积的2mol/l NaAC(pH4.0)，加入2体积的无水乙醇，-20℃放置2h；4℃，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用75％乙醇洗涤两次，无水乙醇洗涤沉淀1次；超净台放置15min(室温)，加15μl milliQ DEPC处理水使沉淀充分溶解，-80℃保存。

2)第一链反转录-PCR：取无RNA酶PCR管，按第一链反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)配备体系(总体积10μl)：Radom 6Mers 2μl、dNTP 1μl、total RNA 1μl(200ng)、H₂O 6μl，瞬间离心，65℃反应5min，冰上急冷；再加入以下体系中反应液：5×primer Buffer 4μl、RNAs Inhibiter 0.5μl、R-Transcription 1μl、H₂O 4.5μl，瞬间离心，PCR仪进行反应：30℃10min、42℃60min、70℃15min、4℃保温，得到三七cDNA。

2、酵母基因组DNA提取

挑取酿酒酵母BY4742菌斑于YPD液体培养基(配方：1％Yeast Extract(酵母膏)，2％Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose(葡萄糖))中，30℃，200rpm培养24h，得到酵母菌液。将酵母菌液12000rpm离心2分钟，弃尽上清，收集菌体于1.5ml离心管中，水清洗两次，菌体重悬于酵母破壁液(5μl酵母破壁酶，600μl山梨醇缓冲液，5μlβ-ME)中，30℃孵育1h后4000rpm离心10min，弃尽上清；加入200μl缓冲液GA重悬菌体，再加入10μl Proteinase K溶液和220μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃水浴10min；加入220μl无水乙醇，充分颠倒混匀后加入到吸附柱CB3中，12000rpm离心弃上清；加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心弃上清；加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心弃上清，两次；12000rpm空离2min，弃废液；将吸附柱CB3放入新离心管中，烘箱放置5min；向吸附膜中央悬滴50μl 60℃预热dd H₂O，室温静置2min；12000rpm离心2min，得到酵母基因组DNA。

3、PCR扩增

以三七cDNA为模板，分别采用表1中引物，分别扩增得到人参皂苷Rh2合成酶基因Pn1-31(序列3)、人参皂苷Rd-F1合成酶基因Pn3-29(序列4)、人参皂苷Rg3合成酶基因Pn3-31(序列5)、人参皂苷Rb1-Rg1合成酶基因Pn3-32(序列1)。以酵母基因组DNA为模板，分别采用表1中引物，分别扩增得到磷酸葡萄糖变位酶1基因PGM1(序列6)、α-磷酸葡萄糖变位酶基因PGM2(序列7)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGP1(序列8)，启动子pTEF1(序列9)、pPDC1(序列10)、pENO2(序列11)和终止子tCYC1(序列12)、tADH2(序列13)、tPDC1(序列14)。人参皂苷Rb1-Rg1合成酶基因Pn3-32编码的蛋白的氨基酸序列如序列2所示，人参皂苷Rh2合成酶基因Pn1-31编码的蛋白的氨基酸序列如序列16，人参皂苷Rd-F1合成酶基因Pn3-29编码的蛋白的氨基酸序列如序列17，人参皂苷Rg3合成酶基因Pn3-31编码的蛋白的氨基酸序列如序列18。

扩增体系如下：TAKARA

HS DNA聚合酶5×PS Buffer 10μl，dNTPMix 4μl，引物各1.5μl，RNA模板0.5μl，

HS聚合酶(2.5U/μl)0.5μl，补加ddH₂O至总体积50μl。

扩增条件如下：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火15秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。产物经割胶回收保存。

表1引物序列

4、SynPgDDS的全合成

委托金斯瑞生物科技有限公司对SynPgDDS基因(序列15)进行全合成，并将其插入pUC57载体(金斯瑞生物科技有限公司提供)的克隆位点间，得到含SynPgDDS基因的克隆型质粒pUC57-SynPgDDS。

二、重组质粒的构建

1、pM2-PGM1

用限制性内切酶SexAⅠ和AscⅠ分别双酶切质粒pM2-tHMG1(记载在中国专利ZL201310399947.X中)和基因PGM1，割胶回收目的片段：pEASY-Blunt-PGK1-//-ADH1(100ng)和PGM1(1713bp，30ng)，将目的片段进行连接，连接体系如下：5μl 2×QuickLigation Buffer(NEB公司)、0.5μl Quick T4 DNA Ligase(NEB公司，400,000cohesiveend units/ml)，补充ddH₂O至10μl，25℃反应10min，得到连接产物，转入Trans1 T1感受态细胞并进行测序验证，得到重组载体。经过测序，该重组载体为将PGM1基因的表达盒P_PGK1-PGM1-T_ADH1插入pEASY-Blunt Simple克隆载体(pEASY克隆载体，北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司)的克隆位点间得到的载体，并将其命名为pM2-PGM1。

2、pM8-PGM2

用限制性内切酶SexAⅠ和AscⅠ分别双酶切质粒pM8-SynPgPPTS(记载在中国专利ZL201310399947.X)和基因PGM2，割胶回收目的片段：pEASY-Blunt-FBA1-//-ADH2(100ng)和PGM2(1710bp，30ng)，按照步骤(1)中的方法进行连接并进行测序验证，得到重组载体。经过测序，该重组载体为将PGM2基因的表达盒P_FBA1-PGM2-T_TDH2插入pEASY-Blunt Simple克隆载体的克隆位点间得到的载体，并将其命名为pM8-PGM2。

3、pM11-UGP1

用限制性内切酶PacⅠ和AscⅠ分别双酶切质粒pM11-AtCPR1(记载在中国专利ZL201310399947.X中)和基因UGP1，割胶回收目的片段：pEASY-Blunt-TDH3-//-TPI1(100ng)和Pn1-31(1500bp，30ng)，按照步骤(1)中的方法进行连接并进行测序验证，得到重组载体。经过测序，该重组载体为将UGP1基因的表达盒P_TDH3-UGP1-T_TPI1插入pEASY-BluntSimple克隆载体的克隆位点间得到的载体，并将其命名为pM11-UGP1。

4、pM13-Pn3-29

用限制性内切酶PacⅠ和AscⅠ分别双酶切pM13-pgPPDS(记载于文献：Dai ZB etal.,2013，Metabolic Engineering 20：145-156中，公众可从天津工业生物技术研究所所获得)和基因Pn3-29，割胶回收目的片段：pEASY-Blunt-TEF1-//-CYC1t(100ng)和Pn3-29(1428bp，30ng)，按照步骤(1)中的方法进行连接并进行测序验证，得到重组载体。经过测序，该重组载体为将Pn3-29基因的表达盒P_TEF1-Pn3-29-T_CYC1t插入pEASY-Blunt Simple克隆载体的克隆位点间得到的载体，命名为pM13-Pn3-29。

5、pM2-SynPgDDS

用限制性内切酶SexAⅠ和AscⅠ分别双酶切质粒pM2-tHMG1(记载在中国专利ZL201310399947.X中)和步骤4制备的质粒pUC57-SynPgDDS，割胶回收目的片段pEASY-Blunt-PGK1-//-ADH1和SpgDDS(2310bp，30ng)，按照步骤(1)中的方法进行连接并进行测序验证，得到重组载体。经过测序，该重组载体为将SynPgDDS基因的表达盒P_PGK1-SynPgDDS-T_ADH1插入pEASY-Blunt Simple克隆载体的克隆位点间得到的载体，并将其命名为pM2-SynPgDDS。

6、pRS425-LEU2-P_TEF1-Pn3-32-T_CYC1

用限制性内切酶SexAⅠ和AscⅠ分别双酶切质粒pRS425-LEU2-P_TEF1-STpGMAS-T_CYC1(记载在中国专利201711064197.5)和基因Pn3-32，割胶回收目的片段：pEASY-Blunt-TEF1-//-CYC1(100ng)和Pn1-31(1368bp，30ng)，按照步骤(1)中的方法进行连接并进行测序验证，得到重组载体。经过测序，该重组载体为将Pn3-32基因的表达盒P_TEF1-Pn3-32-T_CYC1插入pEASY-Blunt Simple克隆载体的克隆位点间得到的载体，并将其命名为pRS425-LEU2-P_TEF1-Pn3-32-T_CYC1。

7、pM9-Pn1-31

用限制性内切酶SexAⅠ酶切上述步骤一的3中扩增得到pPDC1，得到800bp的pPDC1酶切产物；

用限制性内切酶Asc1酶切上述步骤一的3中扩增得到的tADH2，得到200bp的tADH2酶切产物；

用限制性内切酶SexAⅠ和Asc1酶切Pn1-31，回收1368bp的Pn1-31酶切产物；

将pPDC1酶切产物、tADH2酶切产物和Pn1-31酶切产物各50ng加入连接体系：2μL10×T4 DNA Ligase Reaction Buffer(NEB公司)、1μL T4 DNA Ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20μL，室温反应2小时得到连接产物；以连接产物为模板进行PCR扩增，得到扩增产物pPDC1-Pn1-31-tADH2。PCR扩增具体步骤如下：将1μL连接产物加入PCR体系(Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer试剂盒，NEB公司)：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM each dNTP)1μL、DNA模板20ng、加入表1引物Pac-pPDC1和tADH2-Pme1(10μM)各1.5μL、Phusion High-Fidelity DNAPolymerase(2.5U/μL)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL；扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸1.5分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。纯化PCR扩增产物。

将扩增产物pPDC1-Pn1-31-tADH2克隆到pEASY-Blunt Simple克隆载体，再转化Trans1 T1感受态细胞中，提取质粒测序验证，得到质粒pM9-Pn1-31。

8、pM16-Pn3-31

用限制性内切酶SexAⅠ酶切上述步骤一的3扩增得到的pENO2，得到800bp的pENO2酶切产物；

用限制性内切酶Asc1酶切上述步骤一的3扩增得到的tPDC1，得到400bp的tPDC1酶切产物；

用限制性内切酶SexAⅠ和Asc1酶切Pn3-31，回收1329bp的Pn3-31酶切产物；

将pENO2酶切产物、tPDC1酶切产物和Pn3-31酶切产物各50ng加入连接体系：2μL10×T4 DNA Ligase Reaction Buffer(NEB公司)、1μL T4 DNA Ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20μL，室温反应2小时得到连接产物；以连接产物为模板进行PCR扩增，得到扩增产物pPDC1-Pn3-31-tADH2。PCR扩增具体步骤如下：取1μL连接产物加入PCR体系(Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer试剂盒，NEB公司)：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM each dNTP)1μL、DNA模板20ng、加入表1引物Pac-pENO2和tPDC1-Sacll(10μM)各1.5μL、Phusion High-Fidelity DNAPolymerase(2.5U/μL)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸1.5分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。纯化PCR扩增产物。

将扩增产物pPDC1-Pn3-31-tADH2克隆到pEASY-Blunt Simple克隆载体，再转化Trans1T1感受态细胞中，提取质粒测序验证，得到质粒pM16-Pn3-31。

上述质粒构建中所用到的质粒信息如表2所示。

表2、所用质粒信息

质粒名称	基本信息
		pM2-SynPgDDS	Containing P<sub>PGK1</sub>-SynPgDDS-T<sub>ADH1</sub> cassette
pM8-SynPgPPTS	Containing P<sub>FBA1</sub>-SynPgPPTS-T<sub>TDH2</sub> cassette
		pM11-AtCPR1	Containing P<sub>TDH3</sub>-AtCPR1-T<sub>TPI1</sub> cassette
pM3-SynPPDS	Containing P<sub>TEF1</sub>-SynPPDS-T<sub>CYC1</sub> cassette
		pM2-PGM1	Containing P<sub>PGK1</sub>-PGM1-T<sub>ADH1</sub> cassette
pM8-PGM2	Containing P<sub>FBA1</sub>-PGM2-T<sub>TDH2</sub> cassette
		pM11-UGP1	Containing P<sub>TDH3</sub>-UGP1-T<sub>TPI1</sub> cassette
pM9-Pn1-31	Containing P<sub>PDC1</sub>-Pn1-31-T<sub>ADH2</sub> cassette
		pM13-Pn3-29	Containing P<sub>TEF1</sub>-Pn3-29-T<sub>CYC1</sub> cassette
pM16-Pn3-31	Containing P<sub>ENO2</sub>-Pn3-31-T<sub>PDC1</sub> cassette
		pRS425-LEU2-P<sub>TEF1</sub>-Pn3-32-T<sub>CYC1</sub>	Containing P<sub>TEF1</sub>-Pn3-32-T<sub>CYC1</sub> cassette,LEU2,high-copy plasmid

(二)重组菌的构建

一、BY-PPD-PPT的构建

1、基因模块的构建

分别用表3描述的PCR模板(GAL7-URA3记载在中国专利申请201210453416.X中，pM8-SynPgPPTS和pM11-AtCPR1均记载在中国专利ZL201310399947.X中，pM3-SynPPDS记载于文献：Dai ZB et al.,2013，Metabolic Engineering 20：145-156中，公众可从天津工业生物技术研究所获得)和相应引物进行PCR扩增，分别获得功能模块：M1(GAL7-URA3-up)、M2(P_PGK1-SynPgDDS-T_ADH1)、M3(P_FBA1-SynPgPPTS-T_TDH2)、M4(P_TDH3-AtCPR1-T_TPI1)、M5(P_TEF1-SynPPDS-T_CYC1)和M6(GAL7-URA3-down)。

扩增体系如下：TAKARA

HS聚合酶(2.5U/μl)0.5μl，补加ddH₂O至总体积50μl。

扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火15秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。产物经割胶回收保存。

表3、引物序列

2、重组菌BY-PPD-PPT的构建

按照中国专利申请201210453416.X中实施例2中感受态细胞的制备方法，制备得到BY-T3感受态细胞(BY-T3记载于中国专利申请201610236283.9中)，然后向BY-T3感受态细胞中加入转化用片段：M1、M2、M3、M4、M5和M6基因模块共6μg(摩尔比＝1:1:1:1:1:1)。筛选培养的培养基为：0.8％(质量百分比浓度)酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％(质量百分比浓度)葡萄糖，0.01％(质量百分比浓度)Trp，0.01％(质量百分比浓度)Leu；筛选培养的条件为：30度，培养36h以上。PCR鉴定出序列正确的阳性克隆，并将其命名为重组菌BY-PPD-PPT。

二、Rd-GM的构建

1、基因模块的构建

用表4描述的PCR模板和相应引物进行PCR，分别获得功能模块：M1′(EGH1-up)、M2′(P_PGK1-PGM1-T_ADH1)、M3′(P_PDC1-Pn1-31-T_ADH2)、M4′(P_ENO2-Pn3-31-T_PDC1)、M5′(P_FBA1-PGM2-T_TDH2)、M6′(P_TDH3-UGP1-T_TPI1)、M7′(P_TEF1-Pn3-29-T_CYC1)、M8′(EGH1-down)和M9′(TRP1-PGK)(TRP1-PGK记载在中国专利申请201210453416.X中)。

扩增体系为：TAKARA

HS聚合酶(2.5U/μl)0.5μl，补加ddH₂O至总体积50μl。

表4、引物序列

2、重组菌Rd-GM的构建

按照中国专利申请201210453416.X中实施例2中感受态细胞的制备方法，制备得到BY-PPD-PPT感受态细胞，然后向BY-PPD-PPT感受态细胞中加入转化用片段：M1′、M2′、M3′、M4′、M5′、M6′、M7′、M8′和M9′基因模块共9μg(摩尔比＝1:1:1:1:1:1:1:1:1)。筛选培养的培养基为：0.8％(质量百分比浓度)酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％(质量百分比浓度)葡萄糖，0.01％(质量百分比浓度)Leu；筛选培养的条件为：30度培养36h以上。PCR鉴定出序列正确的阳性克隆，并将其命名为Rd-GM。

三、Rd-GM+Pn3-32的构建

按照中国专利申请201210453416.X中实施例2中感受态细胞的制备方法，制备得到Rd-GM感受态细胞，然后向Rd-GM感受态细胞中加入转化用质粒1μg：pRS425-LEU2-P_TEF1-Pn3-32-T_CYC1质粒。筛选培养的培养基为：0.8％(质量百分比浓度)酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％(质量百分比浓度)葡萄糖；筛选培养的条件为：30度培养36h以上。PCR鉴定出序列正确的阳性克隆，命名为Rd-GM+Pn3-32。

上述重组菌构建所用菌株信息如表5所示。

表5、本发明所用菌株信息

(三)摇瓶发酵和LC-MS检测

1、摇瓶发酵

在固体选择培养基1(固体选择培养基1由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄糖，0.01％Ura，0.01％Trp，0.01％Leu和琼脂粉)中活化BY-T3，然后接种于液体选择培养基1(液体选择培养基1由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄糖，0.01％Ura，0.01％Trp，0.01％Leu)中于30℃，250rpm培养16h制备种子液，将种子液以OD_260nm＝0.1接种于含15ml液体选择培养基1的100ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养6天，得到BY-T3发酵液。

在固体选择培养基2(固体选择培养基2由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄糖，0.01％Trp，0.01％Leu和琼脂粉)中活化BY-PPD-PPT，然后接种于液体选择培养基2(液体选择培养基2由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄糖，0.01％Trp，0.01％Leu)中于30℃，250rpm培养16h制备种子液，将种子液以OD_260nm＝0.1接种于含15ml液体选择培养基2的100ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养6天，得到BY-PPD-PPT发酵液。

在固体选择培养基3(固体选择培养基3由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄糖，0.01％Leu和琼脂粉)中活化Rd-GM，然后接种于液体选择培养基3(液体选择培养基3由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，0.01％Leu，2％葡萄糖)中于30℃，250rpm培养16h制备种子液，将种子液以OD_260nm＝0.1接种于含15ml液体选择培养基3的100ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养6天，得到Rd-GM发酵液。

在固体选择培养基4(固体选择培养基4由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄和琼脂粉)中活化Rd-GM+Pn3-32，然后接种于液体选择培养基4(液体选择培养基4由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄糖)中于30℃，250rpm培养16h制备种子液，将种子液以OD_260nm＝0.1接种于含15ml液体选择培养基4的100ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养6天，得到Rd-GM+Pn3-32发酵液。

2、化合物提取

按照如下方法分别提取步骤1中4种发酵液中的化合物：用50ml离心管收集全部发酵液，5000rpm离心5min，弃上清液；沉淀用ddH₂O清洗后转移至破碎管中，12000rpm离心2min，弃上清液；向沉淀中加入玻璃珠(直径0.5mm)和1ml萃取液(萃取液由甲醇和丙酮组成，甲醇与丙酮的体积比为1:1)，震荡破碎5min，2次，超声破碎30min；13000rpm离心2min，弃沉淀，将上清液过0.22μm有机滤膜至液相瓶中得到溶液，分别命名为BY-T3溶液、BY-PPD-PPT溶液、Rd-GM溶液和Rd-GM+Pn3-32溶液。

3、LC-MS定性分析

标准品为人参皂苷Rd、人参皂苷F1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1，均购买于上海源叶生物科技有限公司。

仪器：液相色谱-串联质谱(LC-MS)仪，由安捷伦1200高效液相色谱仪和Bruker-micrOTOF-II质谱仪组成；MicroOTOF control version 3.0/Data Anaysis Version 4.0数据采集和处理系统。

质谱条件：电喷雾电离源正离子模式(ESI⁺)，喷雾电压(4.5kV)，雾化气流量(6L/h)，雾化器温度(180℃)，碰撞气为氮气，压力为1.0Bar，数据采集频率1.0HZ：碰撞能量为8.0eV。

LC条件：DAD检测器，检测波长203nm，Waters

C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相A(甲醇：水＝1：9，含0.1％甲酸)；流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)；梯度洗脱，流速0.8mL/min；柱温30℃；进样体积(20μl)。洗脱方式如下：

0～27min(包括27min)流动相A的体积百分比浓度为80％～49％，流动相B的体积百分比浓度为20％～51％；

27～29min(包括29min)流动相A的体积百分比浓度为49％～0％，流动相B的体积百分比浓度为51％～100％；

29～34min(包括34min)流动相A的体积百分比浓度保持0％，流动相B的体积百分比浓度为保持100％；

34～36min(包括36min)流动相A的体积百分比浓度为0％～80％，流动相B的体积百分比浓度为100％～20％；

36～41min(包括41min)流动相A的体积百分比浓度为保持80％，流动相B的体积百分比浓度保持20％。

4、结果分析

结果如图1所示。从图中可以看出：Rd-GM溶液中含有和标准品同时出现相同的高分辨率人参皂苷Rd和F1质谱离子峰图。Rd-GM+Pn3-32溶液中含有和标准品同时出现相同的高分辨率人参皂苷Rd、人参皂苷F1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1质谱离子峰图。

上述结果表明，酿酒酵母菌株BY-T3本身不具备生产人参皂苷类物质的能力。将达玛烯二醇合成酶基因SynPgDDS、原人参三醇合酶基因SynPgPPTS、细胞色素P450还原酶基因AtCPR1和原人参二醇合酶基因SynPPDS导入酿酒酵母菌株BY-T3，得到重组酵母菌BY-PPD-PPT；在BY-PPD-PPT的基础上，再将磷酸葡萄糖变位酶1基因PGM1、α-磷酸葡萄糖变位酶基因PGM2、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGP1、人参皂苷Rh2合成酶基因Pn1-31、人参皂苷Rg3合成酶基因Pn3-31和人参皂苷Rd-F1合成酶基因Pn3-29导入重组酵母菌BY-PPD-PPT后，得到重组酵母菌Rd-GM，重组酵母菌Rd-GM可以生产人参皂苷Rd和人参皂苷F1；将人参皂苷Rb1-Rg1合成酶基因Pn3-32导入重组酵母菌Rd-GM后，得到重组酵母菌Rd-GM+Pn3-32，重组酵母菌Rd-GM+Pn3-32可以同时生产人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1。

序列表

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120>糖基转移酶及其相关材料在构建产人参皂苷Rb1和Rg1的工程菌中的应用

<160>18

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1344

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atggatatcg agaaaggtag aatcagtata gttatgctac catttttagc ccatggtcac 60

atatctccat tctttgagct agccaagcat ctctcaaaaa gaaattgcaa tatattcctc 120

tgttctaccc caatcaatct tagctccatc aagaacagag tatctgataa ggattcctct 180

gcttcaataa aactagtaga gcttcatctt ccatcttccc ctgatcctcc tcctcagtac 240

cacaccacaa atggcctccc ttcccatctc atggtcccac tcaaaaacgc ctttgaaaca 300

gtaggcccca ccttctctga aatccttaaa accttagacc ctgatttgct tatttatgat 360

ttcaatccct catgggcacc ggagatcgct ttgtctcaca atattccggc agtttatttc 420

ctaacctcgg cagcagccac ctcttccgtg gccctacgtg ctttgaaaaa cccaggtgaa 480

aaatacccat ttccagattt ttatgataac agtaatatta cccctgaacc accttctgca 540

gataaaatga agctatttca tgattttgtt gcttgtttca aacgatcttg cgacattatt 600

ttgattaaga gttttagaga actagaaggg aaatatattg atttgctttc cactttatct 660

aagaaaactt tggttcctgt tggtccactc gttcaagatc ctttgggaca tgatgaagat 720

ccaaaaacag ggcatcttat aaactggctt gacaaaaggg ctgaatctac agtggtgttt 780

gtctgctttg gaagtgagta ttttccctcc aatgaggaat tggaagaagt agcaattggg 840

ctagagatta gcatggttaa tttcatattg gctgtgagat ttcttgaagg agagaaaaaa 900

ggggttttac cagaggggtt tgttcaaagg gtaggagaca gaggattggt tgtggagggg 960

tgggctccac aggcaagaat tttaggacat tcaagcaccg gtgggtttgt gagccattgt 1020

gggtggagtt ctattatgga gagtgtgaag tttggggttc cagtaattgc catggccagg 1080

catcttgatc agcctttgaa tgctaagctg gcggcggagg tcggtgtggg catggaggtt 1140

gtgagagatg aaaatgggaa gtataagaga gaagcgattg cagaggtaat aagaaaagtc 1200

gtgatggaga aaaatgggga ggttatcagg aggaaagcaa gggaattgag tgagaaaatg 1260

aaagagacag gagagcaaga gattggtagg gcagtggagg agctagtaca aatttgtaag 1320

atgaagaaag acgcacaata ttaa 1344

<210>2

<211>447

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Asp Ile Glu Lys Gly Arg Ile Ser Ile Val Met Leu Pro Phe Leu

1 5 10 15

Ala His Gly His Ile Ser Pro Phe Phe Glu Leu Ala Lys His Leu Ser

20 25 30

Lys Arg Asn Cys Asn Ile Phe Leu Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Ser

35 40 45

Ser Ile Lys Asn Arg Val Ser Asp Lys Asp Ser Ser Ala Ser Ile Lys

50 55 60

Leu Val Glu Leu His Leu Pro Ser Ser Pro Asp Pro Pro Pro Gln Tyr

65 70 75 80

His Thr Thr Asn Gly Leu Pro Ser His Leu Met Val Pro Leu Lys Asn

85 90 95

Ala Phe Glu Thr Val Gly Pro Thr Phe Ser Glu Ile Leu Lys Thr Leu

100 105 110

Asp Pro Asp Leu Leu Ile Tyr Asp Phe Asn Pro Ser Trp Ala Pro Glu

115 120 125

Ile Ala Leu Ser His Asn Ile Pro Ala Val Tyr Phe Leu Thr Ser Ala

130 135 140

Ala Ala Thr Ser Ser Val Ala Leu Arg Ala Leu Lys Asn Pro Gly Glu

145 150 155 160

Lys Tyr Pro Phe Pro Asp Phe Tyr Asp Asn Ser Asn Ile Thr Pro Glu

165 170 175

Pro Pro Ser Ala Asp Lys Met Lys Leu Phe His Asp Phe Val Ala Cys

180 185 190

Phe Lys Arg Ser Cys Asp Ile Ile Leu Ile Lys Ser Phe Arg Glu Leu

195 200 205

Glu Gly Lys Tyr Ile Asp Leu Leu Ser Thr Leu Ser Lys Lys Thr Leu

210 215 220

Val Pro Val Gly Pro Leu Val Gln Asp Pro Leu Gly His Asp Glu Asp

225 230 235 240

Pro Lys Thr Gly His Leu Ile Asn Trp Leu Asp Lys Arg Ala Glu Ser

245 250 255

Thr Val Val Phe Val Cys Phe Gly Ser Glu Tyr Phe Pro Ser Asn Glu

260 265 270

Glu Leu Glu Glu Val Ala Ile Gly Leu Glu Ile Ser Met Val Asn Phe

275 280 285

Ile Leu Ala Val Arg Phe Leu Glu Gly Glu Lys Lys Gly Val Leu Pro

290 295 300

Glu Gly Phe Val Gln Arg Val Gly Asp Arg Gly Leu Val Val Glu Gly

305 310 315 320

Trp Ala Pro Gln Ala Arg Ile Leu Gly His Ser Ser Thr Gly Gly Phe

325 330 335

Val Ser His Cys Gly Trp Ser Ser Ile Met Glu Ser Val Lys Phe Gly

340 345 350

Val Pro Val Ile Ala Met Ala Arg His Leu Asp Gln Pro Leu Asn Ala

355 360 365

Lys Leu Ala Ala Glu Val Gly Val Gly Met Glu Val Val Arg Asp Glu

370 375 380

Asn Gly Lys Tyr Lys Arg Glu Ala Ile Ala Glu Val Ile Arg Lys Val

385 390 395 400

Val Met Glu Lys Asn Gly Glu Val Ile Arg Arg Lys Ala Arg Glu Leu

405 410 415

Ser Glu Lys Met Lys Glu Thr Gly Glu Gln Glu Ile Gly Arg Ala Val

420 425 430

Glu Glu Leu Val Gln Ile Cys Lys Met Lys Lys Asp Ala Gln Tyr

435 440 445

<210>3

<211>1368

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

atggacagag aaatgttgag caaaactcac attatgttca tcccattccc agctcaaggc 60

cacatgagcc caatgatgca attcgtcaag cgtttagcct ggaaaggcgt gcgaatcacg 120

atagttcttc cggctgagat tcgagattct atgcaaataa acaactcatt gatcaacact 180

gagtgcatct cctttgattt tgataaagat gatgagatgc catacagcat gcgggcttat 240

atgggagttg taaagctcaa ggtcacaaat aaactgagtg acctactcga gaagcaaaaa 300

acaaatggct accctgttaa tttgctagtg gtcgattcat tatatccatc tcgggtagaa 360

atgtgccacc aacttggggt aaaaggagct ccatttttca ctcactcttg tgctgttggt 420

gccatttatt ataatgctcg cttagggaaa ttgaagatac ctcctgagga agggttgact 480

tctgtttcat tgccttcaat tccattgttg gggagaaatg atttgccaat tattcggact 540

ggcacctttc ctgatctctt tgagcatttg gggaatcagt tttcagatct tgataaagcg 600

gattggatct ttttcaatac ttttgataag cttgaaaatg aggaagcaaa atggctatct 660

agccaatggc caattacatc catcggacca ttaatccctt caatgtactt agacaaacaa 720

ttaccaaatg acaaagacaa tgacattaat ttctacaagg cagacgtcgg atcgtgcatc 780

aagtggctag acgccaaaga ccctggctcg gtagtctacg cctcattcgg gagcgtgaag 840

cacaacctcg gcgatgacta catggacgaa gtagcatggg gcttgttaca cagcaaatat 900

cacttcatat gggttgttat agaatccgaa cgtacaaagc tctctagcga tttcttggca 960

gaggcagagg aaaaaggcct aatagtgagt tggtgccctc aactcgaagt tttgtcacat 1020

aaatctatag gtagttttat gactcattgt ggttggaact cgacggttga ggcattgagt 1080

ttgggcgtgc caatggtggc agtgccacaa cagtttgatc agcctgttaa tgccaagtat 1140

atcgtggatg tatggcgaat tggggttcag gttccgattg gtgaaaatgg ggttcttttg 1200

aggggagaag ttgctaactg tataaaggat gttatggagg gggaaatagg ggatgagctt 1260

agagggaatg ctttgaaatg gaaggggttg gctgtggagg caatggagaa agggggtagc 1320

tctgataaga atattgatga gttcatttca aagcttgtgt cctcctga 1368

<210>4

<211>1428

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

atgaagtcag aattgatatt cttgcccgcc ccggccatcg gacacctcgt gggaatggtg 60

gagatggcta aactcttcat cagtcgacat gaaaacctct cggtcaccgt cctcatcgcg 120

aaattctaca tggatacggg ggtagacaac tacaataaat cactcttaac aaagcctacc 180

ccgcgtctca caattgtaaa tctcccggaa agcgaccccc aaaactatat gctcaaacca 240

cgccacgcca tctttcctag cgtcatcgag actcagaaga cacacgtgcg agacataata 300

ttaggcatga ctcagtccga gtcgactcgg gtcgttggtt tgctggctga ccttttgttc 360

atcaacatta tggacattgc caatgagttc aatgttccaa cttatgtata ctcccctgcc 420

ggagcaggtc atcttggcct cgcgttccat ctccagacac tcaacgacaa aaagcaagat 480

gtgaccgagt tcaggcactc ggacactgag ttattggtac cgagttttgc aaacccggtt 540

cccgccgagg tcttgccgtc gatgtatgtg gataaagaag gtgggtatga ttatttgttt 600

tcattgttcc ggaggtgcag agagtcaaag gcaattatta ttaacacgtt tgaggagctg 660

gaaccctatg cgatcaattc cctccggatg gatagtatga tccctccgat ctacccggtg 720

ggacccatac taaatctcaa cggtgatggc caaaactccg atgaggctgc tgtgatcctt 780

ggttggttag acgatcaacc accttcatct gtggtgtttt tgtgctttgg tagctatgga 840

acctttcaag aaaaccaggt gaaggagatt gcaatgggtc tagagcgcag tgggcatcgc 900

ttcttgtggt ccttgcgtcc gtctatccct aaaggcgaga caaagcttca gcttaaatac 960

tcaaatttgg aagaaattct cccagtcgga ttcttggaca ggacatcatg cgtcggaaaa 1020

gttattggat gggccccgca agtggcggtg ctcggacacg aggcagtcgg agggttcctg 1080

tctcattgtg gttggaattc gacattagag agtgtgtggt gtggcgtgcc cgtcgcaaca 1140

tggccaatgt acggcgagca acaactcaat gcttttgaga tggttaagga gttgggtatt 1200

gcggtggaaa ttgaggtgga ctataagaat gaatatttta acatgacgaa tgattttatt 1260

gttagggcag aagaaattga gacgaaaata aagaagttga tgatggatga aaagaatagt 1320

gaaataagga agaaggtaaa ggaaatgaaa gaaaagagta ggcttgcaat gtctgagaat 1380

ggatcatctt ataattcctt ggcgaagcta tttgaggaaa ttatgtaa 1428

<210>5

<211>1329

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>5

atggataacc aaaaaggtag aatcagtata gcgttgctac catttttagc ccatggtcac 60

atatctccct tctttgagct agccaaacaa ctagcaaaaa gaaattgcaa tgttttcctc 120

tgttctaccc caatcaatct tagctccatc aagaataagg attcctctgc ttctgtaaaa 180

ctagttgagc ttcatcttcc atcttcccct gatcttcctc ctcactatca caccacaaat 240

ggcctccctt cccatctcat ggtcccactc agaaacgcct ttgaaacagt aggccccacc 300

ttctctgaaa tccttaaaac cttaaaccct gatttgctta tttatgattt caatccctca 360

tgggcaccgg agatcgcttc gtctcacaat attccggcag tttatttcct aaccacggca 420

gcagccagct cttccattgg cctacatgct ttcaaaaacc caggtgaaaa atacccattt 480

ccagattttt atgataacag taatattacc cctgaaccac cttctgcaga taacatgaag 540

ctacttcatg attttatcgc ttgtttcgaa cgatcttgcg atattatttt gattaagagt 600

tttagagaac tagaagggaa atatattgat ttgctttcca ctttatctga taaaactttg 660

gttcctgttg gtccactcgt tcaagatcct atgggccata atgaagatcc aaaaacagag 720

cagattataa actggcttga caaaagggct gaatctacag tggtgtttgt ctgctttgga 780

agtgagtatt ttctctccaa tgaggaattg gaagaagtag caattgggct agagattagc 840

atggttaatt tcatatgggc tgtgagatta attgaaggag agaaaaaagg ggttttacca 900

gaggggtttg ttcaaagggt aggagacaga ggattggttg tggaggggtg ggctccacag 960

gcaagaattt taggacattc aagcaccggt gggtttgtga gccattgtgg gtggagttct 1020

attgcggaga gtatgaagtt tggggttcca gtaattgcca tggctaggca tcttgatcag 1080

cctttgaatg ctaagctggc ggcggaggtt ggtgtgggca tggaggttgt gagagatgat 1140

aatgggaaat ataagaggga agggattgca gaggtaataa gaaaagtcgt tgtggagaaa 1200

agtggggagg ttatcaggag gaaagcaagg gagttgagtg agaaaatgaa agagaaagga 1260

gagcaagaga ttgatagggc agtggaggag ctagtacaaa tttgtaagaa gaagaaagat 1320

gcacaatag 1329

<210>6

<211>1713

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>6

atgtcacttc taatagattc tgtaccaaca gttgcttata aggaccaaaa accgggtact 60

tcaggtttac gtaagaagac caaggttttc atggatgagc ctcattatac tgagaacttc 120

attcaagcaa caatgcaatc tatccctaat ggctcagagg gaaccacttt agttgttgga 180

ggagatggtc gtttctacaa cgatgttatc atgaacaaga ttgccgcagt aggtgctgca 240

aacggtgtca gaaagttagt cattggtcaa ggcggtttac tttcaacacc agctgcttct 300

catataatta gaacatacga ggaaaagtgt accggtggtg gtatcatatt aactgcctca 360

cacaacccag gcggtccaga gaatgattta ggtatcaagt ataatttacc taatggtggg 420

ccagctccag agagtgtcac taacgctatc tgggaagcgt ctaaaaaatt aactcactat 480

aaaattataa agaacttccc caagttgaat ttgaacaagc ttggtaaaaa ccaaaaatat 540

ggcccattgt tagtggacat aattgatcct gccaaagcat acgttcaatt tctgaaggaa 600

atttttgatt ttgacttaat taaaagcttc ttagcgaaac agcgcaaaga caaagggtgg 660

aagttgttgt ttgactcctt aaatggtatt acaggaccat atggtaaggc tatatttgtt 720

gatgaatttg gtttaccggc agaggaagtt cttcaaaatt ggcacccttt acctgatttc 780

ggcggtttac atcccgatcc gaatctaacc tatgcacgaa ctcttgttga cagggttgac 840

cgcgaaaaaa ttgcctttgg agcagcctcc gatggtgatg gtgataggaa tatgatttac 900

ggttatggcc ctgctttcgt ttcgccaggt gattctgttg ccattattgc cgaatatgca 960

cccgaaattc catacttcgc caaacaaggt atttatggct tggcacgttc atttcctaca 1020

tcctcagcca ttgatcgtgt tgcagcaaaa aagggattaa gatgttacga agttccaacc 1080

ggctggaaat tcttctgtgc cttatttgat gctaaaaagc tatcaatctg tggtgaagaa 1140

tccttcggta caggttccaa tcatatcaga gaaaaggacg gtctatgggc cattattgct 1200

tggttaaata tcttggctat ctaccatagg cgtaaccctg aaaaggaagc ttcgatcaaa 1260

actattcagg acgaattttg gaacgagtat ggccgtactt tcttcacaag atacgattac 1320

gaacatatcg aatgcgagca ggccgaaaaa gttgtagctc ttttgagtga atttgtatca 1380

aggccaaacg tttgtggctc ccacttccca gctgatgagt ctttaaccgt tatcgattgt 1440

ggtgattttt cgtatagaga tctagatggc tccatctctg aaaatcaagg ccttttcgta 1500

aagttttcga atgggactaa atttgttttg aggttatccg gcacaggcag ttctggtgca 1560

acaataagat tatacgtaga aaagtatact gataaaaagg agaactatgg ccaaacagct 1620

gacgtcttct tgaaacccgt catcaactcc attgtaaaat tcttaagatt taaagaaatt 1680

ttaggaacag acgaaccaac agtccgcaca tag 1713

<210>7

<211>1710

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>7

atgtcatttc aaattgaaac ggttcccacc aaaccatatg aagaccaaaa gcctggtacc 60

tctggtttgc gtaagaagac aaaggtgttt aaagacgaac ctaactacac agaaaatttc 120

attcaatcga tcatggaagc tattccagag ggttctaaag gtgccactct tgttgtcggt 180

ggtgatgggc gttactacaa tgatgtcatt cttcataaga ttgccgctat cggtgctgcc 240

aacggtatta aaaagttagt tattggccag catggtcttc tgtctacgcc agccgcttct 300

cacatcatga gaacctacga ggaaaaatgt actggtggta ttatcttaac cgcctcacat 360

aatccaggtg gtccagaaaa tgacatgggt attaagtata acttatccaa tgggggtcct 420

gctcctgaat ccgtcacaaa tgctatttgg gagatttcca aaaagcttac cagctataag 480

attatcaaag acttcccaga actagacttg ggtacgatag gcaagaacaa gaaatacggt 540

ccattactcg ttgacattat cgatattaca aaagattatg tcaacttctt gaaggaaatc 600

ttcgatttcg acttaatcaa gaaattcatc gataatcaac gttctactaa gaattggaag 660

ttactgtttg acagtatgaa cggtgtaact ggaccatacg gtaaggctat tttcgttgat 720

gaatttggtt taccggcgga tgaggtttta caaaactggc atccttctcc ggattttggt 780

ggtatgcatc cagatccaaa cttaacttat gccagttcgt tagtgaaaag agtagatcgt 840

gaaaagattg agtttggtgc tgcatccgat ggtgatggtg atagaaatat gatttacggt 900

tacggcccat ctttcgtttc tccaggtgac tccgtcgcaa ttattgccga atatgcagct 960

gaaatcccat atttcgccaa gcaaggtata tatggtctgg cccgttcatt ccctacctca 1020

ggagccatag accgtgttgc caaggcccat ggtctaaact gttatgaggt cccaactggc 1080

tggaaatttt tctgtgcttt gttcgacgct aaaaaattat ctatttgtgg tgaagaatcg 1140

tttggtactg gttccaacca cgtaagggaa aaggacggtg tttgggccat tatggcgtgg 1200

ttgaacatct tggccattta caacaagcat catccggaga acgaagcttc tattaagacg 1260

atacagaatg aattctgggc aaagtacggc cgtactttct tcactcgtta tgattttgaa 1320

aaagttgaaa cagaaaaagc taacaagatt gtcgatcaat tgagagcata tgttaccaaa 1380

tcgggtgttg ttaattccgc cttcccagcc gatgagtctc ttaaggtcac cgattgtggt 1440

gatttttcat acacagattt ggacggttct gtttctgacc atcaaggttt atatgtcaag 1500

ctttccaatg gtgcaagatt cgttctaaga ttgtcaggta caggttcttc aggtgctacc 1560

attagattgt acattgaaaa atactgcgat gataaatcac aataccaaaa gacagctgaa 1620

gaatacttga agccaattat taactcggtc atcaagttct tgaactttaa acaagtttta 1680

ggaactgaag aaccaacggt tcgtacttaa 1710

<210>8

<211>1500

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>8

atgtccacta agaagcacac caaaacacat tccacttatg cattcgagag caacacaaac 60

agcgttgctg cctcacaaat gagaaacgcc ttaaacaagt tggcggactc tagtaaactt 120

gacgatgctg ctcgcgctaa gtttgagaac gaactggatt cgtttttcac gcttttcagg 180

agatatttgg tagagaagtc ttctagaacc accttggaat gggacaagat caagtctccc 240

aacccggatg aagtggttaa gtatgaaatt atttctcagc agcccgagaa tgtctcaaac 300

ctttccaaat tggctgtttt gaagttgaac ggtgggctgg gtacctccat gggctgcgtt 360

ggccctaaat ctgttattga agtgagagag ggaaacacct ttttggattt gtctgttcgt 420

caaattgaat acttgaacag acagtacgat agcgacgtgc cattgttatt gatgaattct 480

ttcaacactg acaaggatac ggaacacttg attaagaagt attccgctaa cagaatcaga 540

atcagatctt tcaatcaatc caggttccca agagtctaca aggattcttt attgcctgtc 600

cccaccgaat acgattctcc actggatgct tggtatccac caggtcacgg tgatttgttt 660

gaatctttac acgtatctgg tgaactggat gccttaattg cccaaggaag agaaatatta 720

tttgtttcta acggtgacaa cttgggtgct accgtcgact taaaaatttt aaaccacatg 780

atcgagactg gtgccgaata tataatggaa ttgactgata agaccagagc cgatgttaaa 840

ggtggtactt tgatttctta cgatggtcaa gtccgtttat tggaagtcgc ccaagttcca 900

aaagaacaca ttgacgaatt caaaaatatc agaaagttta ccaacttcaa cacgaataac 960

ttatggatca atctgaaagc agtaaagagg ttgatcgaat cgagcaattt ggagatggaa 1020

atcattccaa accaaaaaac tataacaaga gacggtcatg aaattaatgt cttacaatta 1080

gaaaccgctt gtggtgctgc tatcaggcat tttgatggtg ctcacggtgt tgtcgttcca 1140

agatcaagat tcttgcctgt caagacctgt tccgatttgt tgctggttaa atcagatcta 1200

ttccgtctgg aacacggttc tttgaagtta gacccatccc gttttggtcc aaacccatta 1260

atcaagttgg gctcgcattt caaaaaggtt tctggtttta acgcaagaat ccctcacatc 1320

ccaaaaatcg tcgagctaga tcatttgacc atcactggta acgtcttttt aggtaaagat 1380

gtcactttga ggggtactgt catcatcgtt tgctccgacg gtcataaaat cgatattcca 1440

aacggctcca tattggaaaa tgttgtcgtt actggtaatt tgcaaatctt ggaacattga 1500

<210>9

<211>430

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>9

agtgatcccc cacacaccat agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac tcttccagat 60

tttctcggac tccgcgcatc gccgtaccac ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat 120

ttcccctctt tcttcctcta gggtgtcgtt aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa 180

aaaagagacc gcctcgtttc tttttcttcg tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg 240

tttctttttc ttgaaaattt ttttttttga tttttttctc tttcgatgac ctcccattga 300

tatttaagtt aataaacggt cttcaatttc tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta 360

ttacaacttt ttttacttct tgctcattag aaagaaagca tagcaatcta atctaagttt 420

taattacaaa 430

<210>10

<211>800

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>10

catgcgactg ggtgagcata tgttccgctg atgtgatgtg caagataaac aagcaaggca 60

gaaactaact tcttcttcat gtaataaaca caccccgcgt ttatttacct atctctaaac 120

ttcaacacct tatatcataa ctaatatttc ttgagataag cacactgcac ccataccttc 180

cttaaaaacg tagcttccag tttttggtgg ttccggcttc cttcccgatt ccgcccgcta 240

aacgcatatt tttgttgcct ggtggcattt gcaaaatgca taacctatgc atttaaaaga 300

ttatgtatgc tcttctgact tttcgtgtga tgaggctcgt ggaaaaaatg aataatttat 360

gaatttgaga acaattttgt gttgttacgg tattttacta tggaataatc aatcaattga 420

ggattttatg caaatatcgt ttgaatattt ttccgaccct ttgagtactt ttcttcataa 480

ttgcataata ttgtccgctg cccctttttc tgttagacgg tgtcttgatc tacttgctat 540

cgttcaacac caccttattt tctaactatt ttttttttag ctcatttgaa tcagcttatg 600

gtgatggcac atttttgcat aaacctagct gtcctcgttg aacataggaa aaaaaaatat 660

ataaacaagg ctctttcact ctccttgcaa tcagatttgg gtttgttccc tttattttca 720

tatttcttgt catattcctt tctcaattat tattttctac tcataacctc acgcaaaata 780

acacagtcaa atcaatcaaa 800

<210>11

<211>1000

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>11

aatcctactc ttgccgttgc catccaaaat gagctagaag gtggattaac aaatataatg 60

acaaatcgtt gcttgtctga cttgattcca ctacagttac aaatatttga cattgtatat 120

aagttttgca agttcatcaa atctatgaga gcaaaattat gtcaactgga ccccgtacta 180

tatgagaaac acaaaagcgg gatgatgaaa acactaaacg aaggctatcg tacaaacaat 240

ggcggtcagg aagatgttgg ttaccaagaa gatgccgccc tggaattaat tcagaagctg 300

attgaataca ttagcaacgc gtccagcatt tttcggaagt gtctcataaa ctttactcaa 360

gagttaagta ctgaaaaatt cgacttttat gatagttcaa gtgtcgacgc tgcgggtata 420

gaaagggttc tttactctat agtacctcct cgctcagcat ctgcttcttc ccaaagatga 480

acgcggcgtt atgtcactaa cgacgtgcac caacttgcgg aaagtggaat cccgttccaa 540

aactggcatc cactaattga tacatctaca caccgcacgc cttttttctg aagcccactt 600

tcgtggactt tgccatatgc aaaattcatg aagtgtgata ccaagtcagc atacacctca 660

ctagggtagt ttctttggtt gtattgatca tttggttcat cgtggttcat taattttttt 720

tctccattgc tttctggctt tgatcttact atcatttgga tttttgtcga aggttgtaga 780

attgtatgtg acaagtggca ccaagcatat ataaaaaaaa aaagcattat cttcctacca 840

gagttgattg ttaaaaacgt atttatagca aacgcaattg taattaattc ttattttgta 900

tcttttcttc ccttgtctca atcttttatt tttattttat ttttcttttc ttagtttctt 960

tcataacacc aagcaactaa tactataaca tacaataata 1000

<210>12

<211>307

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>12

ccgctgatcc tagagggccg catcatgtaa ttagttatgt cacgcttaca ttcacgccct 60

ccccccacat ccgctctaac cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt ctaggtccct 120

atttattttt ttatagttat gttagtatta agaacgttat ttatatttca aatttttctt 180

ttttttctgt acagacgcgt gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt gcttgagaag 240

gttttgggac gctcgaaggc tttaatttgc aagctgcggc cctgcattaa tgaatcggcc 300

aacgcgc 307

<210>13

<211>400

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>13

gcggatctct tatgtcttta cgatttatag ttttcattat caagtatgcc tatattagta 60

tatagcatct ttagatgaca gtgttcgaag tttcacgaat aaaagataat attctacttt 120

ttgctcccac cgcgtttgct agcacgagtg aacaccatcc ctcgcctgtg agttgtaccc 180

attcctctaa actgtagaca tggtagcttc agcagtgttc gttatgtacg gcatcctcca 240

acaaacagtc ggttatagtt tgtcctgctc ctctgaatcg tctccctcga tatttctcat 300

tttccttcgc atgccagcat tgaaatgatc gaagttcaat gatgaaacgg taattcttct 360

gtcatttact catctcatct catcaagtta tataattcta 400

<210>14

<211>400

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>14

gcgatttaat ctctaattat tagttaaagt tttataagca tttttatgta acgaaaaata 60

aattggttca tattattact gcactgtcac ttaccatgga aagaccagac aagaagttgc 120

cgacagtctg ttgaattggc ctggttaggc ttaagtctgg gtccgcttct ttacaaattt 180

ggagaatttc tcttaaacga tatgtatatt cttttcgttg gaaaagatgt cttccaaaaa 240

aaaaaccgat gaattagtgg aaccaaggaa aaaaaaagag gtatccttga ttaaggaaca 300

ctgtttaaac agtgtggttt ccaaaaccct gaaactgcat tagtgtaata gaagactaga 360

cacctcgata caaataatgg ttactcaatt caaaactgcc 400

<210>15

<211>2325

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>15

acctggtatg tggaagttaa aggtagctca aggtaatgac ccttacttat actcaaccaa 60

caatttcgtc ggtagacaat actgggaatt tcaaccagat gctggtacac ctgaagaaag 120

agaagaagtc gaaaaggcaa gaaaggacta cgtaaacaac aaaaagttac atggtattca 180

cccatgttca gatatgttga tgagaagaca attgataaaa gaatcaggta tcgacttgtt 240

atccattcca cctttgagat tggatgaaaa cgaacaagtt aactacgacg ccgtcactac 300

agctgttaaa aaggctttga gattaaatag agcaattcaa gcccatgatg gtcactggcc 360

agctgaaaac gcaggtagtt tgttgtacac cccacctttg ataatagctt tgtacatctc 420

tggtactata gatacaatct taaccaagca acataaaaag gaattgatca gattcgtcta 480

caaccaccaa aacgaagatg gtggttgggg tagttacatc gaaggtcatt ctactatgat 540

tggttccgtt ttgagttacg tcatgttgag attgttgggt gaaggtttag ccgaatcaga 600

tgacggtaat ggtgctgttg aaagaggtag aaaatggatc ttggatcatg gtggtgctgc 660

aggtattcca tcttggggta aaacatattt ggctgtattg ggtgtttacg aatgggaagg 720

ttgtaatcca ttaccacctg aattttggtt gttcccttct tcatttccat tccatcctgc 780

aaaaatgtgg atctattgta gatgcaccta catgccaatg tcatatttgt acggtaaaag 840

ataccacggt cctataactg atttggtttt atccttgaga caagaaatct ataacatccc 900

atacgaacaa attaaatgga accaacaaag acacaactgt tgcaaggaag atttgtatta 960

ccctcacact ttagtacaag atttggtttg ggacggtttg cattacttct ctgaaccatt 1020

cttgaagaga tggcctttta ataagttgag aaagagaggt ttgaagagag ttgtcgaatt 1080

aatgagatac ggtgctacag aaactagatt cattaccact ggtaatggtg aaaaagcatt 1140

gcaaatcatg tcatggtggg ccgaagatcc aaacggtgac gaattcaagc atcacttagc 1200

cagaattcct gatttcttgt ggatagctga agacggtatg acagttcaat cttttggttc 1260

acaattgtgg gattgtatat tggccactca agctatcatt gcaacaaata tggtcgaaga 1320

atatggtgac agtttgaaga aagctcattt ctttatcaag gaatctcaaa tcaaggaaaa 1380

cccacgtggt gactttttga aaatgtgtag acaattcacc aagggtgcat ggactttttc 1440

agatcaagac cacggttgtg tagtttccga ttgcaccgca gaagccttga agtgcttgtt 1500

gttgttgtct caaatgccac aagacattgt aggtgaaaag cctgaagttg aaagattgta 1560

cgaagccgtt aacgtcttgt tgtacttgca atccagagtt agtggtggtt tcgctgtttg 1620

ggaaccacct gtcccaaaac cttatttgga aatgttgaac ccatcagaaa tctttgctga 1680

tatagtcgta gaaagagaac atatcgaatg tacagcttcc gtaatcaaag gtttgatggc 1740

ttttaaatgc ttgcatccag gtcacagaca aaaggaaata gaagatagtg ttgctaaggc 1800

aatcagatat ttggaaagaa accaaatgcc tgacggttct tggtatggtt tttggggtat 1860

atgtttctta tacggtactt tctttacatt gagtggtttt gcctctgctg gtagaacata 1920

cgataattca gaagcagtca gaaaaggtgt aaagtttttc ttatccaccc aaaacgaaga 1980

aggtggttgg ggtgaatctt tggaatcatg cccatccgaa aaattcactc ctttgaaggg 2040

taacagaaca aacttggttc aaacctcttg ggcaatgtta ggtttgatgt ttggtggtca 2100

agccgaaaga gatccaactc ctttgcatag agccgctaaa ttgttgatta atgcacaaat 2160

ggataacggt gacttcccac aacaagaaat cacaggtgtt tactgtaaga actctatgtt 2220

gcactacgcc gaatacagaa acatttttcc tttgtgggcc ttgggtgaat acagaaaaag 2280

agtttggtta cctaagcatc aacaattaaa gatatgaggc gcgcc 2325

<210>16

<211>455

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>16

Met Asp Arg Glu Met Leu Ser Lys Thr His Ile Met Phe Ile Pro Phe

1 5 10 15

Pro Ala Gln Gly His Met Ser Pro Met Met Gln Phe Val Lys Arg Leu

20 25 30

Ala Trp Lys Gly Val Arg Ile Thr Ile Val Leu Pro Ala Glu Ile Arg

35 40 45

Asp Ser Met Gln Ile Asn Asn Ser Leu Ile Asn Thr Glu Cys Ile Ser

50 55 60

Phe Asp Phe Asp Lys Asp Asp Glu Met Pro Tyr Ser Met Arg Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gly Val Val Lys Leu Lys Val Thr Asn Lys Leu Ser Asp Leu Leu

85 90 95

Glu Lys Gln Lys Thr Asn Gly Tyr Pro Val Asn Leu Leu Val Val Asp

100 105 110

Ser Leu Tyr Pro Ser Arg Val Glu Met Cys His Gln Leu Gly Val Lys

115 120 125

Gly Ala Pro Phe Phe Thr His Ser Cys Ala Val Gly Ala Ile Tyr Tyr

130 135 140

Asn Ala Arg Leu Gly Lys Leu Lys Ile Pro Pro Glu Glu Gly Leu Thr

145 150 155 160

Ser Val Ser Leu Pro Ser Ile Pro Leu Leu Gly Arg Asn Asp Leu Pro

165 170 175

Ile Ile Arg Thr Gly Thr Phe Pro Asp Leu Phe Glu His Leu Gly Asn

180 185 190

Gln Phe Ser Asp Leu Asp Lys Ala Asp Trp Ile Phe Phe Asn Thr Phe

195 200 205

Asp Lys Leu Glu Asn Glu Glu Ala Lys Trp Leu Ser Ser Gln Trp Pro

210 215 220

Ile Thr Ser Ile Gly Pro Leu Ile Pro Ser Met Tyr Leu Asp Lys Gln

225 230 235 240

Leu Pro Asn Asp Lys Asp Asn Asp Ile Asn Phe Tyr Lys Ala Asp Val

245 250 255

Gly Ser Cys Ile Lys Trp Leu Asp Ala Lys Asp Pro Gly Ser Val Val

260 265 270

Tyr Ala Ser Phe Gly Ser Val Lys His Asn Leu Gly Asp Asp Tyr Met

275 280 285

Asp Glu Val Ala Trp Gly Leu Leu His Ser Lys Tyr His Phe Ile Trp

290 295 300

Val Val Ile Glu Ser Glu Arg Thr Lys Leu Ser Ser Asp Phe Leu Ala

305 310 315 320

Glu Ala Glu Glu Lys Gly Leu Ile Val Ser Trp Cys Pro Gln Leu Glu

325 330 335

Val Leu Ser His Lys Ser Ile Gly Ser Phe Met Thr His Cys Gly Trp

340 345 350

Asn Ser Thr Val Glu Ala Leu Ser Leu Gly Val Pro Met Val Ala Val

355 360 365

Pro Gln Gln Phe Asp Gln Pro Val Asn Ala Lys Tyr Ile Val Asp Val

370 375 380

Trp Arg Ile Gly Val Gln Val Pro Ile Gly Glu Asn Gly Val Leu Leu

385 390 395 400

Arg Gly Glu Val Ala Asn Cys Ile Lys Asp Val Met Glu Gly Glu Ile

405 410 415

Gly Asp Glu Leu Arg Gly Asn Ala Leu Lys Trp Lys Gly Leu Ala Val

420 425 430

Glu Ala Met Glu Lys Gly Gly Ser Ser Asp Lys Asn Ile Asp Glu Phe

435 440 445

Ile Ser Lys Leu Val Ser Ser

450 455

<210>17

<211>475

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>17

Met Lys Ser Glu Leu Ile Phe Leu Pro Ala Pro Ala Ile Gly His Leu

1 5 10 15

Val Gly Met Val Glu Met Ala Lys Leu Phe Ile Ser Arg His Glu Asn

20 25 30

Leu Ser Val Thr Val Leu Ile Ala Lys Phe Tyr Met Asp Thr Gly Val

35 40 45

Asp Asn Tyr Asn Lys Ser Leu Leu Thr Lys Pro Thr Pro Arg Leu Thr

50 55 60

Ile Val Asn Leu Pro Glu Ser Asp Pro Gln Asn Tyr Met Leu Lys Pro

65 70 75 80

Arg His Ala Ile Phe Pro Ser Val Ile Glu Thr Gln Lys Thr His Val

85 90 95

Arg Asp Ile Ile Leu Gly Met Thr Gln Ser Glu Ser Thr Arg Val Val

100 105 110

Gly Leu Leu Ala Asp Leu Leu Phe Ile Asn Ile Met Asp Ile Ala Asn

115 120 125

Glu Phe Asn Val Pro Thr Tyr Val Tyr Ser Pro Ala Gly Ala Gly His

130 135 140

Leu Gly Leu Ala Phe His Leu Gln Thr Leu Asn Asp Lys Lys Gln Asp

145 150 155 160

Val Thr Glu Phe Arg His Ser Asp Thr Glu Leu Leu Val Pro Ser Phe

165 170 175

Ala Asn Pro Val Pro Ala Glu Val Leu Pro Ser Met Tyr Val Asp Lys

180 185 190

Glu Gly Gly Tyr Asp Tyr Leu Phe Ser Leu Phe Arg Arg Cys Arg Glu

195 200 205

Ser Lys Ala Ile Ile Ile Asn Thr Phe Glu Glu Leu Glu Pro Tyr Ala

210 215 220

Ile Asn Ser Leu Arg Met Asp Ser Met Ile Pro Pro Ile Tyr Pro Val

225 230 235 240

Gly Pro Ile Leu Asn Leu Asn Gly Asp Gly Gln Asn Ser Asp Glu Ala

245 250 255

Ala Val Ile Leu Gly Trp Leu Asp Asp Gln Pro Pro Ser Ser Val Val

260 265 270

Phe Leu Cys Phe Gly Ser Tyr Gly Thr Phe Gln Glu Asn Gln Val Lys

275 280 285

Glu Ile Ala Met Gly Leu Glu Arg Ser Gly His Arg Phe Leu Trp Ser

290 295 300

Leu Arg Pro Ser Ile Pro Lys Gly Glu Thr Lys Leu Gln Leu Lys Tyr

305 310 315 320

Ser Asn Leu Glu Glu Ile Leu Pro Val Gly Phe Leu Asp Arg Thr Ser

325 330 335

Cys Val Gly Lys Val Ile Gly Trp Ala Pro Gln Val Ala Val Leu Gly

340 345 350

His Glu Ala Val Gly Gly Phe Leu Ser His Cys Gly Trp Asn Ser Thr

355 360 365

Leu Glu Ser Val Trp Cys Gly Val Pro Val Ala Thr Trp Pro Met Tyr

370 375 380

Gly Glu Gln Gln Leu Asn Ala Phe Glu Met Val Lys Glu Leu Gly Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Ile Glu Val Asp Tyr Lys Asn Glu Tyr Phe Asn Met Thr

405 410 415

Asn Asp Phe Ile Val Arg Ala Glu Glu Ile Glu Thr Lys Ile Lys Lys

420 425 430

Leu Met Met Asp Glu Lys Asn Ser Glu Ile Arg Lys Lys Val Lys Glu

435 440 445

Met Lys Glu Lys Ser Arg Leu Ala Met Ser Glu Asn Gly Ser Ser Tyr

450 455 460

Asn Ser Leu Ala Lys Leu Phe Glu Glu Ile Met

465 470 475

<210>18

<211>442

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>18

Met Asp Asn Gln Lys Gly Arg Ile Ser Ile Ala Leu Leu Pro Phe Leu

1 5 10 15

Ala His Gly His Ile Ser Pro Phe Phe Glu Leu Ala Lys Gln Leu Ala

20 25 30

Lys Arg Asn Cys Asn Val Phe Leu Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Ser

35 40 45

Ser Ile Lys Asn Lys Asp Ser Ser Ala Ser Val Lys Leu Val Glu Leu

50 55 60

His Leu Pro Ser Ser Pro Asp Leu Pro Pro His Tyr His Thr Thr Asn

65 70 75 80

Gly Leu Pro Ser His Leu Met Val Pro Leu Arg Asn Ala Phe Glu Thr

85 90 95

Val Gly Pro Thr Phe Ser Glu Ile Leu Lys Thr Leu Asn Pro Asp Leu

100 105 110

Leu Ile Tyr Asp Phe Asn Pro Ser Trp Ala Pro Glu Ile Ala Ser Ser

115 120 125

His Asn Ile Pro Ala Val Tyr Phe Leu Thr Thr Ala Ala Ala Ser Ser

130 135 140

Ser Ile Gly Leu His Ala Phe Lys Asn Pro Gly Glu Lys Tyr Pro Phe

145 150 155 160

Pro Asp Phe Tyr Asp Asn Ser Asn Ile Thr Pro Glu Pro Pro Ser Ala

165 170 175

Asp Asn Met Lys Leu Leu His Asp Phe Ile Ala Cys Phe Glu Arg Ser

180 185 190

Cys Asp Ile Ile Leu Ile Lys Ser Phe Arg Glu Leu Glu Gly Lys Tyr

195 200 205

Ile Asp Leu Leu Ser Thr Leu Ser Asp Lys Thr Leu Val Pro Val Gly

210 215 220

Pro Leu Val Gln Asp Pro Met Gly His Asn Glu Asp Pro Lys Thr Glu

225 230 235 240

Gln Ile Ile Asn Trp Leu Asp Lys Arg Ala Glu Ser Thr Val Val Phe

245 250 255

Val Cys Phe Gly Ser Glu Tyr Phe Leu Ser Asn Glu Glu Leu Glu Glu

260 265 270

Val Ala Ile Gly Leu Glu Ile Ser Met Val Asn Phe Ile Trp Ala Val

275 280 285

Arg Leu Ile Glu Gly Glu Lys Lys Gly Val Leu Pro Glu Gly Phe Val

290 295 300

Gln Arg Val Gly Asp Arg Gly Leu Val Val Glu Gly Trp Ala Pro Gln

305 310 315 320

Ala Arg Ile Leu Gly His Ser Ser Thr Gly Gly Phe Val Ser His Cys

325 330 335

Gly Trp Ser Ser Ile Ala Glu Ser Met Lys Phe Gly Val Pro Val Ile

340 345 350

Ala Met Ala Arg His Leu Asp Gln Pro Leu Asn Ala Lys Leu Ala Ala

355 360 365

Glu Val Gly Val Gly Met Glu Val Val Arg Asp Asp Asn Gly Lys Tyr

370 375 380

Lys Arg Glu Gly Ile Ala Glu Val Ile Arg Lys Val Val Val Glu Lys

385 390 395 400

Ser Gly Glu Val Ile Arg Arg Lys Ala Arg Glu Leu Ser Glu Lys Met

405 410 415

Lys Glu Lys Gly Glu Gln Glu Ile Asp Arg Ala Val Glu Glu Leu Val

420 425 430

Gln Ile Cys Lys Lys Lys Lys Asp Ala Gln

435 440

Claims

1.蛋白质，是如下a)或b)所示的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因细胞系；

所述转基因细胞系不包括繁殖材料。

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.权利要求1所述的蛋白质在作为糖基转移酶中的应用；

或，权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在催化人参皂苷Rd生成人参皂苷Rb1中的应用；

或，权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在催化人参皂苷F1生成人参皂苷Rg1中的应用；

或，权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在构建产人参皂苷Rb1和/或人参皂苷Rg1的重组菌中的应用；

或，权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在生产人参皂苷Rb1和/或人参皂苷Rg1中的应用。

5.一种构建产人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的重组菌的方法，包括如下步骤：提高产人参皂苷Rd和人参皂苷F1的重组菌中人参皂苷Rb1-Rg1合成酶的表达量和/或活性，得到产人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的重组菌；

所述产人参皂苷Rd和人参皂苷F1的重组菌的制备方法包括如下步骤：

2)提高所述重组菌甲中磷酸葡萄糖变位酶1PGM1、α-磷酸葡萄糖变位酶PGM2、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGP1、人参皂苷Rh2合成酶Pn1-31、人参皂苷Rd-F1合成酶Pn3-29和人参皂苷Rg3合成酶Pn3-31的表达量和/或活性，得到所述产人参皂苷Rd和人参皂苷F1的重组菌；

所述人参皂苷Rb1-Rg1合成酶为氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

所述人参皂苷Rh2合成酶Pn1-31为氨基酸序列是序列16所示的蛋白质；

所述人参皂苷Rd-F1合成酶Pn3-29为氨基酸序列是序列17所示的蛋白质；

所述人参皂苷Rg3合成酶Pn3-31为氨基酸序列是序列18所示的蛋白质。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述提高产人参皂苷Rd和人参皂苷F1的重组菌中人参皂苷Rb1-Rg1合成酶的表达量和/或活性是通过向所述产人参皂苷Rd和人参皂苷F1的重组菌中导入人参皂苷Rb1-Rg1合成酶的编码基因来实现的；

7.按照权利要求5或6所述方法构建得到的产人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的重组菌；

或，权利要求5或6中所述的产人参皂苷Rd和人参皂苷F1的重组菌；

或，权利要求5或6中所述的重组菌甲。

8.权利要求7中所述的重组菌甲或权利要求7中所述的产人参皂苷Rd和人参皂苷F1的重组菌或权利要求7中所述的产人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的重组菌在生产人参皂苷Rb1和/或人参皂苷Rg1中的应用。

9.权利要求7中所述的产人参皂苷Rd和人参皂苷F1的重组菌或权利要求7中所述的重组菌甲在生产人参皂苷Rd和/或人参皂苷F1中的应用。

10.一种生产人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的方法，包括如下步骤：发酵培养权利要求8所述的产人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的重组菌，收集发酵产物，从所述发酵产物中获得人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1。