CN113817778B - 一种利用核仁素增强mRNA稳定表达的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用核仁素增强mRNA稳定表达的方法，属于生物技术领域。本发明设计DNA序列，通过体外转录出带有核仁素和功能蛋白的mRNA，使用脂质体包裹后制得脂质纳米粒，导入细胞表达核仁素和功能蛋白，核仁素作为一种反式作用因子结合RNA的3’UTR，从而提高功能蛋白mRNA的稳定性，达到增强功能蛋白的表达量的效果。

Description

一种利用核仁素增强mRNA稳定表达的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用核仁素增强mRNA稳定表达的方法。

背景技术

核仁素是一种RNA结合蛋白，包含四个RNA结合区域，该区域提供特定的RNA结合位点,它们通过识别特殊的RNA结合域与核酸相互作用，广泛参与到RNA剪切、转运、序列编辑、胞内定位及翻译控制等多个过程。由于新冠疫情爆发，极大推动了mRNA技术在生物制药领域的应用，也让mRNA一跃成为研究的热点。mRNA疫苗比传统疫苗具有许多优势：与某些病毒疫苗不同，mRNA不会整合到基因组中，从而避免了插入突变的风险，mRNA疫苗可以以无细胞的方式制造，从而实现快速、经济、高效的生产。此外，单个mRNA疫苗可以编码多种抗原，增强针对适应性病原体的免疫反应，并能够以单一配方针对多种微生物或病毒变体。截止目前，全球累计mRNA药物及疫苗研发管线超过150种，主要针对传染病、肿瘤疾病、蛋白质替代与基因治疗。除mRNA新冠疫苗紧急上市外，其他大多处于早期阶段。研究表明，mRNA稳定性的调节在调节基因表达中起着重要作用，调节mRNA稳定性的许多元素位于mRNA的3’端非翻译区域即3’UTR，3'UTR位mRNA的C末端，UTR茎环结构中存在与mRNA结合蛋白的结合位点，调控mRNA稳定性、亚细胞定位并能与调节蛋白质相互作用，更好地发挥其调控功能。而如何获得在体内保持稳定的mRNA成为当前亟待研究的重要课题。

发明内容

本发明旨在着力解决现有mRNA在转录后易降解无法稳定表达蛋白的技术问题，本发明的目的是提供了一种利用核仁素增强mRNA稳定性表达的方法。

本发明目的是通过以下方式实现：

本方法通过DNA序列的设计，通过体外转录出带有核仁素和功能蛋白的mRNA，使用脂质体包裹后制得脂质纳米粒，导入细胞表达核仁素和功能蛋白，核仁素作为一种反式作用因子结合RNA的3’UTR，从而提高功能蛋白mRNA的稳定性，达到增强荧功能蛋白的表达量的效果。

一种利用核仁素增强mRNA稳定表达的方法，主要包括如下步骤：

(1)合成依次为T7启动子序列、5’UTR序列、优化后的核仁素序列、连接元件P2A序列、功能蛋白序列和3’UTR序列的目的基因序列，连接到质粒载体中，构建含有目的基因的质粒；

(2)设计引物，将步骤(1)得到的质粒通过PCR反应获得目的基因尾部添加了polyT序列的线性目的基因片段；

(3)以步骤(2)得到的线性目的基因片段为模板，转录获得mRNA；

(4)通过加帽酶系统对步骤(3)得到的mRNA进行加帽反应，获得5’端携带cap1帽子结构的mRNA；

(5)将步骤(4)得到的携带cap1帽子结构的mRNA和脂质体以特定比例混合，获得脂质纳米粒；

(6)将步骤(5)得到的脂质纳米粒转染细胞中，增强细胞中mRNA的稳定表达。

进一步地，步骤(1)中的所述质粒载体为PUC57-Kan。

进一步地，步骤(1)中T7启动子序列如SEQ ID NO：1所示，5’UTR序列如SEQ ID NO：2所示，优化后的核仁素序列如SEQ ID NO：3所示，连接元件P2A序列如SEQ ID NO：4所示，功能蛋白序列如SEQ ID NO：5所示，3’UTR序列如SEQ ID NO：6所示。

进一步地，步骤(2)中正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，PCR反应试剂包括BeyoFusion^TMPCR Master Mix预混液。

进一步地，步骤(2)中PCR反应体系中质粒浓度为0.1-10ng/μL。

进一步地，步骤(2)中所述线性目的基因片段通过磁珠纯化法获得。

进一步地，步骤(3)中所述转录的具体过程为：将线性目的基因片段、RNA转录酶、缓冲液、核苷三磷酸在室温下混合，于37℃条件下孵育3h。

进一步地，步骤(3)中转录完成后，加入DnaseⅠ，37℃孵育15min，以去除DNA模板。

进一步地，步骤(4)中所述的加帽酶系统为牛痘病毒加帽酶系统。

进一步地，步骤(5)中mRNA和脂质体的体积比为(1:1)～(1:5)，脂质体中阳离子脂质体、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇的摩尔比为50：10：37.5：2.5，所述阳离子脂质体为4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯，辅助脂质为二硬脂酰基磷脂酰胆碱。

进一步地，步骤(6)中所述细胞为人宫颈癌细胞。

本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：

1.本发明所合成的mRNA均由体外进行转录进行加帽反应获得，细胞内存在许多RNA酶，它们可从5’端攻击游离的RNA，使mRNA极易降解，当mRNA的5’端加上m7GpppG帽子后，可阻止RNA酶的切割，延长mRNA的半衰期，提高翻译效率，同时真核生物mRNA必需通过5’帽结合蛋白才能接触核糖体从而正确起始翻译。

2.本方法在mRNA翻译过程中设计添加了核仁素，核仁素是一种RNA结合蛋白，在mRNA翻译的过程中作为反式作用因子，核仁素由四个结构域组成，其中核仁素的前两个RNA结合域顺式排列结合特定的核仁素识别原件，从而提高mRNA的稳定性，实现更加有效的翻译过程。

3.本实验编码区所采用的蛋白质序列均进行了优化，由于密码子使用偏好在不同物种甚至某一物种内的不同基因都具有特异性，同样的蛋白质可以从不同的基因序列中产生，有些组合会导致更高的蛋白质产量；对蛋白质的密码子进行优化，最佳密码子组合可以降低mRNA的降解，从而拥有高表达量的蛋白。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。

图1为实施例1设计的DNA序列的结构图。

图2为实施例1中磁珠法纯化得到的高纯DNA的电泳图谱，第一孔道为marker，高亮条带为1k和3k，其余孔道均为PCR纯化后的上样条带。

图3为表达核仁素的mRNA和未表达核仁素的mRNA表达的荧光素酶量的对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。

实施例1

本发明以易检测蛋白表达量的荧光素酶为例，在荧光素酶前表达核仁素，与未在荧光素酶前表达核仁素的序列作对比，说明核仁素结合荧光素酶的3’UTR从而增强蛋白的表达量，具体步骤如下：

1.设计DNA序列：以PUC57-Kan为质粒载体，选择BamHI和EcoRI为目的基因两侧的酶切位点，目的基因序列依次为T7启动子序列、5’UTR序列、优化后的核仁素序列、连接元件P2A序列、优化后的荧光素酶序列、3’UTR序列，DNA模板序列不同元件的信息如表1所示，序列的结构图如图1所示，具体的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

表1.DNA模板序列不同元件的信息

2.进行质粒PCR反应加尾：按照试剂盒说明书冰上配置PCR反应体系。将质粒冻干粉溶解于400ul的ddH₂O中，配制成0.01ug/ul(10ng/ul)浓度的质粒溶液，取10uM的引物溶液于冰上融化。其中所述正向引物：CTATGCGGCATCAGAGCAGA，反向引物序列为TTTT…(120)AGGAGAAGTCTGCCGTTACTG。

表2.PCR反应体系

加入组分后，用手指轻弹PCR管数次，使反应体系混合均匀，室温下低速离心数秒，使液体体积积聚于管底。

表3.PCR反应参数

3.核酸纯化：采用磁珠法纯化PCR产物，得到高质量的纯化DNA片段。利用超微量紫外分光光度计对DNA进行定性和定量分析，进行琼脂糖凝胶电泳验证DNA模板的完整性及纯度。电泳图谱如图2所示。

4.体外转录：根据体外转录试剂盒，在含有RNA转录酶、缓冲液、核苷三磷酸等条件的体外无细胞系统中，以DNA为模板转录得mRNA。操作如下：冰上融化表4中的各组分，室温下混合，反应体系置于37℃金属浴中孵育3h。转录完成后每0.5ug模板DNA加入1μL DnaseⅠ，37℃孵育15min，以去除DNA模板。

表4.体外转录体系(20μL)

/>

注：先混匀其他组分，最后加入T7 RNA Polymerase Mix，轻轻混匀。

5.磁珠法纯化体外转录产物：以mRNA转录产物与磁珠质量比为1:1，将转录产物和磁珠充分混匀后，弃去缓冲液，加入相应体积的RNA结合缓冲液，终体积缓冲液稀释为1×，使磁珠充分吸附于磁力架上，置于磁力架上干燥，尽量弃去上清，减少残留溶液，得到目的基因转录相应的mRNA。

6.5’端标记反应：采用牛痘病毒加帽酶系统对转录的RNA进行加帽反应，使相应的RNA在5’端携带cap1帽子结构，具体过程如下：

(1)用RNase-free water将50μg RNA稀释至67ul。

(2)将所得的RNA溶液置于65℃加热10min，结束后冰上放置5min。

(3)依次加入表5中的各组分。

(4)37℃反应30min。

表5.加帽反应系统中的组分

7.脂质体的配制：按照以下配比配制脂质体，其中阳离子脂质体：辅助脂质：胆固醇：聚乙二醇的摩尔比为50：10：37.5：2.5，所述阳离子脂质体为4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯，缩写为DLin-MC3-DMA，辅助脂质为二硬脂酰基磷脂酰胆碱，缩写为DSPC。

8.制备脂质纳米粒：根据脂质体和mRNA的体积比为3：1，配置所需体积的纳米粒，轻微震荡混匀，制得转染细胞所需的脂质纳米粒。

9.转染前一天将人宫颈癌细胞铺板，观察细胞状态，使细胞密度生长铺板大约为70％-90％后，方可转染脂质纳米粒到人宫颈癌细胞，加入脂质纳米粒后轻微震荡混匀，于37℃、5％CO₂的饱和湿度培养箱中，培养24～48小时。

10.将培养板平衡至室温后，加入荧光素底物，使细胞充分裂解3分钟后，在酶标仪检测发光信号。其结果图为图3所示。

由图3对比可知，在用酶标仪检测发光值的过程中，表达核仁素的mRNA比未表达核仁素的mRNA产生更高的信号值，信号值的高低即代表mRNA翻译的蛋白质的量，间接说明表达核仁素的mRNA具有更高的稳定性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连理工大学

<120> 一种利用核仁素增强mRNA稳定表达的方法

<130> 20210908

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

taatacgact cactataagg 20

<210> 2

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agaataaact agtattcttc tggtccccac agactcagag agaacccgcc acc 53

<210> 3

<211> 2139

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgcatcatc atcatcatca tgtcaagctg gccaaggccg gaaagaacca gggcgaccct 60

aagaagatgg cccctccacc taaagaggtg gaagaggaca gcgaggacga ggaaatgtcc 120

gaggacgaag aggacgacag cagcggcgag gaagtggtca tccctcagaa gaagggcaag 180

aaggccgctg ccaccagcgc caagaaagtg gtggtgtccc ctaccaaaaa ggtggccgtg 240

gccacaccag ccaaaaaggc tgctgtgacc cctggaaaga aagccgccgc tactcccgcc 300

aaaaagaccg tgacaccagc taaggccgtg acaacccctg gcaaaaaggg cgccacacct 360

ggaaaagccc tggtggctac accgggaaag aagggcgcag ccattcctgc caagggcgct 420

aagaacggga agaacgctaa gaaagaggac tccgacgaag aggaagatga cgacagcgag 480

gaagatgaag aggacgacga ggatgaggac gaggacgaag atgagattga gcctgccgcc 540

atgaaggccg cagctgctgc tcctgctagc gaagatgagg atgatgaaga tgatgaggat 600

gacgaggacg atgatgacga cgaagaagat gacagcgaag aggaagccat ggaaacaacc 660

ccagccaaag gcaagaaagc tgccaaggtg gtgcccgtga aggccaagaa tgtggccgag 720

gatgaagatg aagaagagga cgacgaggac gaagatgatg atgacgatga ggacgacgaa 780

gatgacgatg acgaggatga tgaagaagag gaggaagaag aggaagagga acccgtcaaa 840

gaggccccag gcaagcggaa gaaagagatg gccaagcaga aggctgcccc tgaggccaaa 900

aagcagaaag tggaaggcac cgagcctacc accgccttca atctgttcgt gggcaacctg 960

aacttcaaca agagcgcccc tgagctgaaa accggcatct ccgatgtgtt cgccaagaac 1020

gatctggccg tggtggatgt gcggatcggc atgaccagaa agttcggcta cgtggacttc 1080

gagagcgccg aggatctgga aaaggctctg gaactgaccg gcctgaaggt gttcggcaac 1140

gagatcaagc tggaaaaacc caagggcaaa gacagcaaga aagagcggga cgccagaaca 1200

ctgctggcca aaaacctgcc ttacaaagtg acccaggacg agctgaaaga ggtgttcgag 1260

gacgccgccg agatcagact ggtgtccaag gatggcaaga gcaagggaat cgcctacatc 1320

gagttcaaga ccgaggccga cgccgagaaa accttcgagg aaaagcaggg caccgagatc 1380

gacggcagat ccatcagcct gtactacacc ggcgagaagg gccagaacca ggattacaga 1440

ggcggcaaga acagcacttg gagcggcgag tctaagaccc tggtgctgag caacctgagc 1500

tacagcgcca ccgaagagac actgcaagaa gtgtttgaga aggccacctt catcaaggtg 1560

ccccagaatc agaacggcaa gtccaagggc tacgccttta tcgagttcgc cagcttcgag 1620

gatgccaaag aagccctgaa cagctgcaac aagagagaga ttgagggcag agccatccgg 1680

ctggaactgc agggacctag aggcagccct aacgccagaa gccagcctag caagaccctg 1740

ttcgtgaagg gcctgagcga ggataccacc gaggaaaccc tgaaagagtc cttcgacggc 1800

tctgtgcggg ccagaatcgt gaccgataga gagacaggca gcagcaaagg cttcggcttt 1860

gtggatttca actccgaaga ggacgctaaa gaagccatgg aggacggcga gatcgatggc 1920

aacaaagtga cactggactg ggccaagcct aaaggcgaag gcggctttgg cggaagaggc 1980

ggaggtagag gcggattcgg tggccgcgga ggtggccgag gtggcagagg cggttttgga 2040

ggtagaggac gcggaggctt tggaggccga ggcggcttta gaggcggccg tggcggaggc 2100

ggagatcaca aacctcaggg caaaaagaca aagttcgag 2139

<210> 4

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 5

<211> 1653

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaagatgcca agaacatcaa gaagggccct gctccattct accctctgga agatggaaca 60

gccggcgagc agctgcacaa ggccatgaag agatatgccc tggtgcctgg cacaatcgcc 120

ttcacagatg cccacatcga ggtggacatc acctacgccg agtacttcga gatgtctgtg 180

cggctggccg aagctatgaa gcgctacggc ctgaacacca accaccggat cgtcgtgtgc 240

agcgagaaca gcctgcagtt cttcatgcct gtgctgggcg ccctgttcat cggagttgct 300

gtggcccctg ccaacgacat ctacaacgag cgcgagctgc tgaacagcat gggcatctct 360

cagcccaccg tggtgttcgt gtccaagaag ggactgcaga aaatcctgaa cgtgcagaag 420

aagctgccca tcatccagaa aatcatcatc atggacagca agaccgacta ccagggcttc 480

cagagcatgt acaccttcgt gaccagccat ctgccacctg gcttcaacga gtacgacttc 540

gtgcccgaga gcttcgaccg ggacaagaca atcgccctga tcatgaacag cagcggctct 600

accggactgc ccaaaggtgt tgccctgcct catagaactg cctgcgtgcg gtttagccac 660

gccagagatc ccatcttcgg caaccagatc atccccgaca cagccatcct gagcgtggtg 720

ccttttcacc acggcttcgg catgttcacc acactgggct acctgatctg cggcttcaga 780

gtggtgctga tgtaccgctt cgaggaagaa ctgttcctgc ggagcctgca ggactacaag 840

atccagtctg ctctgctggt gcctactctg ttcagcttct ttgccaagag caccctgatc 900

gataagtacg acctgagcaa cctgcacgag atcgcctctg gcggagcccc tctgtctaaa 960

gaagtgggag aagccgtcgc caagcggttc catctgcctg gcatcagaca aggctatggc 1020

ctgaccgaga caaccagcgc cattctgatt acccctgagg gcgacgataa gcctggcgct 1080

gtgggaaaag tggtgccatt cttcgaggcc aaggtggtgg atctggacac cggcaaaaca 1140

ctgggcgtta accagagggg cgagctgtgt gttagaggcc ctatgatcat gagcggctac 1200

gtgaacaacc ccgaggccac aaacgctctg atcgacaagg atggatggct gcacagcggc 1260

gacattgcct actgggacga agatgagcac ttcttcatcg tggaccggct gaagtccctg 1320

atcaagtaca agggctacca ggtggcccca gccgagctgg aatctattct gctgcaacac 1380

cccaacatct tcgatgccgg cgttgcagga ctgcccgatg atgatgctgg cgaactgcca 1440

gctgctgtgg tggtgctgga acacggcaag accatgaccg agaaagaaat cgtggactac 1500

gtggccagcc aagtgaccac cgccaagaaa ctgagaggcg gcgtggtgtt tgtggacgag 1560

gtgccaaaag gcctgacagg caagctggac gcccggaaga tcagagagat cctgattaag 1620

gccaagaaag gcggcaagat cgccgtgtga tga 1653

<210> 6

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60

taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120

tattttcatt gcgctcgctt tcttgctgtc caatttctat taaaggttcc tttgttccct 180

aagtccaact actaaactgg gggatattat gaagggcctt gagcatctgg attctgccta 240

ataaaaaaca tttattttca ttgcgctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt 300

cctttgttcc ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct 360

ggattctgcc taataaaaaa catttatttt cattgc 396

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctatgcggca tcagagcaga 20

<210> 8

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120

aggagaagtc tgccgttact g 141

<210> 9

<211> 4348

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

taatacgact cactataagg agaataaact agtattcttc tggtccccac agactcagag 60

agaacccgcc accatgcatc atcatcatca tcatgtcaag ctggccaagg ccggaaagaa 120

ccagggcgac cctaagaaga tggcccctcc acctaaagag gtggaagagg acagcgagga 180

cgaggaaatg tccgaggacg aagaggacga cagcagcggc gaggaagtgg tcatccctca 240

gaagaagggc aagaaggccg ctgccaccag cgccaagaaa gtggtggtgt cccctaccaa 300

aaaggtggcc gtggccacac cagccaaaaa ggctgctgtg acccctggaa agaaagccgc 360

cgctactccc gccaaaaaga ccgtgacacc agctaaggcc gtgacaaccc ctggcaaaaa 420

gggcgccaca cctggaaaag ccctggtggc tacaccggga aagaagggcg cagccattcc 480

tgccaagggc gctaagaacg ggaagaacgc taagaaagag gactccgacg aagaggaaga 540

tgacgacagc gaggaagatg aagaggacga cgaggatgag gacgaggacg aagatgagat 600

tgagcctgcc gccatgaagg ccgcagctgc tgctcctgct agcgaagatg aggatgatga 660

agatgatgag gatgacgagg acgatgatga cgacgaagaa gatgacagcg aagaggaagc 720

catggaaaca accccagcca aaggcaagaa agctgccaag gtggtgcccg tgaaggccaa 780

gaatgtggcc gaggatgaag atgaagaaga ggacgacgag gacgaagatg atgatgacga 840

tgaggacgac gaagatgacg atgacgagga tgatgaagaa gaggaggaag aagaggaaga 900

ggaacccgtc aaagaggccc caggcaagcg gaagaaagag atggccaagc agaaggctgc 960

ccctgaggcc aaaaagcaga aagtggaagg caccgagcct accaccgcct tcaatctgtt 1020

cgtgggcaac ctgaacttca acaagagcgc ccctgagctg aaaaccggca tctccgatgt 1080

gttcgccaag aacgatctgg ccgtggtgga tgtgcggatc ggcatgacca gaaagttcgg 1140

ctacgtggac ttcgagagcg ccgaggatct ggaaaaggct ctggaactga ccggcctgaa 1200

ggtgttcggc aacgagatca agctggaaaa acccaagggc aaagacagca agaaagagcg 1260

ggacgccaga acactgctgg ccaaaaacct gccttacaaa gtgacccagg acgagctgaa 1320

agaggtgttc gaggacgccg ccgagatcag actggtgtcc aaggatggca agagcaaggg 1380

aatcgcctac atcgagttca agaccgaggc cgacgccgag aaaaccttcg aggaaaagca 1440

gggcaccgag atcgacggca gatccatcag cctgtactac accggcgaga agggccagaa 1500

ccaggattac agaggcggca agaacagcac ttggagcggc gagtctaaga ccctggtgct 1560

gagcaacctg agctacagcg ccaccgaaga gacactgcaa gaagtgtttg agaaggccac 1620

cttcatcaag gtgccccaga atcagaacgg caagtccaag ggctacgcct ttatcgagtt 1680

cgccagcttc gaggatgcca aagaagccct gaacagctgc aacaagagag agattgaggg 1740

cagagccatc cggctggaac tgcagggacc tagaggcagc cctaacgcca gaagccagcc 1800

tagcaagacc ctgttcgtga agggcctgag cgaggatacc accgaggaaa ccctgaaaga 1860

gtccttcgac ggctctgtgc gggccagaat cgtgaccgat agagagacag gcagcagcaa 1920

aggcttcggc tttgtggatt tcaactccga agaggacgct aaagaagcca tggaggacgg 1980

cgagatcgat ggcaacaaag tgacactgga ctgggccaag cctaaaggcg aaggcggctt 2040

tggcggaaga ggcggaggta gaggcggatt cggtggccgc ggaggtggcc gaggtggcag 2100

aggcggtttt ggaggtagag gacgcggagg ctttggaggc cgaggcggct ttagaggcgg 2160

ccgtggcgga ggcggagatc acaaacctca gggcaaaaag acaaagttcg agggaagcgg 2220

agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg gaggagaacc ctggacctga 2280

agatgccaag aacatcaaga agggccctgc tccattctac cctctggaag atggaacagc 2340

cggcgagcag ctgcacaagg ccatgaagag atatgccctg gtgcctggca caatcgcctt 2400

cacagatgcc cacatcgagg tggacatcac ctacgccgag tacttcgaga tgtctgtgcg 2460

gctggccgaa gctatgaagc gctacggcct gaacaccaac caccggatcg tcgtgtgcag 2520

cgagaacagc ctgcagttct tcatgcctgt gctgggcgcc ctgttcatcg gagttgctgt 2580

ggcccctgcc aacgacatct acaacgagcg cgagctgctg aacagcatgg gcatctctca 2640

gcccaccgtg gtgttcgtgt ccaagaaggg actgcagaaa atcctgaacg tgcagaagaa 2700

gctgcccatc atccagaaaa tcatcatcat ggacagcaag accgactacc agggcttcca 2760

gagcatgtac accttcgtga ccagccatct gccacctggc ttcaacgagt acgacttcgt 2820

gcccgagagc ttcgaccggg acaagacaat cgccctgatc atgaacagca gcggctctac 2880

cggactgccc aaaggtgttg ccctgcctca tagaactgcc tgcgtgcggt ttagccacgc 2940

cagagatccc atcttcggca accagatcat ccccgacaca gccatcctga gcgtggtgcc 3000

ttttcaccac ggcttcggca tgttcaccac actgggctac ctgatctgcg gcttcagagt 3060

ggtgctgatg taccgcttcg aggaagaact gttcctgcgg agcctgcagg actacaagat 3120

ccagtctgct ctgctggtgc ctactctgtt cagcttcttt gccaagagca ccctgatcga 3180

taagtacgac ctgagcaacc tgcacgagat cgcctctggc ggagcccctc tgtctaaaga 3240

agtgggagaa gccgtcgcca agcggttcca tctgcctggc atcagacaag gctatggcct 3300

gaccgagaca accagcgcca ttctgattac ccctgagggc gacgataagc ctggcgctgt 3360

gggaaaagtg gtgccattct tcgaggccaa ggtggtggat ctggacaccg gcaaaacact 3420

gggcgttaac cagaggggcg agctgtgtgt tagaggccct atgatcatga gcggctacgt 3480

gaacaacccc gaggccacaa acgctctgat cgacaaggat ggatggctgc acagcggcga 3540

cattgcctac tgggacgaag atgagcactt cttcatcgtg gaccggctga agtccctgat 3600

caagtacaag ggctaccagg tggccccagc cgagctggaa tctattctgc tgcaacaccc 3660

caacatcttc gatgccggcg ttgcaggact gcccgatgat gatgctggcg aactgccagc 3720

tgctgtggtg gtgctggaac acggcaagac catgaccgag aaagaaatcg tggactacgt 3780

ggccagccaa gtgaccaccg ccaagaaact gagaggcggc gtggtgtttg tggacgaggt 3840

gccaaaaggc ctgacaggca agctggacgc ccggaagatc agagagatcc tgattaaggc 3900

caagaaaggc ggcaagatcg ccgtgtgatg agctcgcttt cttgctgtcc aatttctatt 3960

aaaggttcct ttgttcccta agtccaacta ctaaactggg ggatattatg aagggccttg 4020

agcatctgga ttctgcctaa taaaaaacat ttattttcat tgcgctcgct ttcttgctgt 4080

ccaatttcta ttaaaggttc ctttgttccc taagtccaac tactaaactg ggggatatta 4140

tgaagggcct tgagcatctg gattctgcct aataaaaaac atttattttc attgcgctcg 4200

ctttcttgct gtccaatttc tattaaaggt tcctttgttc cctaagtcca actactaaac 4260

tgggggatat tatgaagggc cttgagcatc tggattctgc ctaataaaaa acatttattt 4320

tcattgcagg agaagtctgc cgttactg 4348

<210> 10

<211> 4468

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

uaauacgacu cacuauaagg agaauaaacu aguauucuuc ugguccccac agacucagag 60

agaacccgcc accaugcauc aucaucauca ucaugucaag cuggccaagg ccggaaagaa 120

ccagggcgac ccuaagaaga uggccccucc accuaaagag guggaagagg acagcgagga 180

cgaggaaaug uccgaggacg aagaggacga cagcagcggc gaggaagugg ucaucccuca 240

gaagaagggc aagaaggccg cugccaccag cgccaagaaa gugguggugu ccccuaccaa 300

aaagguggcc guggccacac cagccaaaaa ggcugcugug accccuggaa agaaagccgc 360

cgcuacuccc gccaaaaaga ccgugacacc agcuaaggcc gugacaaccc cuggcaaaaa 420

gggcgccaca ccuggaaaag cccugguggc uacaccggga aagaagggcg cagccauucc 480

ugccaagggc gcuaagaacg ggaagaacgc uaagaaagag gacuccgacg aagaggaaga 540

ugacgacagc gaggaagaug aagaggacga cgaggaugag gacgaggacg aagaugagau 600

ugagccugcc gccaugaagg ccgcagcugc ugcuccugcu agcgaagaug aggaugauga 660

agaugaugag gaugacgagg acgaugauga cgacgaagaa gaugacagcg aagaggaagc 720

cauggaaaca accccagcca aaggcaagaa agcugccaag guggugcccg ugaaggccaa 780

gaauguggcc gaggaugaag augaagaaga ggacgacgag gacgaagaug augaugacga 840

ugaggacgac gaagaugacg augacgagga ugaugaagaa gaggaggaag aagaggaaga 900

ggaacccguc aaagaggccc caggcaagcg gaagaaagag auggccaagc agaaggcugc 960

cccugaggcc aaaaagcaga aaguggaagg caccgagccu accaccgccu ucaaucuguu 1020

cgugggcaac cugaacuuca acaagagcgc cccugagcug aaaaccggca ucuccgaugu 1080

guucgccaag aacgaucugg ccguggugga ugugcggauc ggcaugacca gaaaguucgg 1140

cuacguggac uucgagagcg ccgaggaucu ggaaaaggcu cuggaacuga ccggccugaa 1200

gguguucggc aacgagauca agcuggaaaa acccaagggc aaagacagca agaaagagcg 1260

ggacgccaga acacugcugg ccaaaaaccu gccuuacaaa gugacccagg acgagcugaa 1320

agagguguuc gaggacgccg ccgagaucag acuggugucc aaggauggca agagcaaggg 1380

aaucgccuac aucgaguuca agaccgaggc cgacgccgag aaaaccuucg aggaaaagca 1440

gggcaccgag aucgacggca gauccaucag ccuguacuac accggcgaga agggccagaa 1500

ccaggauuac agaggcggca agaacagcac uuggagcggc gagucuaaga cccuggugcu 1560

gagcaaccug agcuacagcg ccaccgaaga gacacugcaa gaaguguuug agaaggccac 1620

cuucaucaag gugccccaga aucagaacgg caaguccaag ggcuacgccu uuaucgaguu 1680

cgccagcuuc gaggaugcca aagaagcccu gaacagcugc aacaagagag agauugaggg 1740

cagagccauc cggcuggaac ugcagggacc uagaggcagc ccuaacgcca gaagccagcc 1800

uagcaagacc cuguucguga agggccugag cgaggauacc accgaggaaa cccugaaaga 1860

guccuucgac ggcucugugc gggccagaau cgugaccgau agagagacag gcagcagcaa 1920

aggcuucggc uuuguggauu ucaacuccga agaggacgcu aaagaagcca uggaggacgg 1980

cgagaucgau ggcaacaaag ugacacugga cugggccaag ccuaaaggcg aaggcggcuu 2040

uggcggaaga ggcggaggua gaggcggauu cgguggccgc ggagguggcc gagguggcag 2100

aggcgguuuu ggagguagag gacgcggagg cuuuggaggc cgaggcggcu uuagaggcgg 2160

ccguggcgga ggcggagauc acaaaccuca gggcaaaaag acaaaguucg agggaagcgg 2220

agcuacuaac uucagccugc ugaagcaggc uggagacgug gaggagaacc cuggaccuga 2280

agaugccaag aacaucaaga agggcccugc uccauucuac ccucuggaag auggaacagc 2340

cggcgagcag cugcacaagg ccaugaagag auaugcccug gugccuggca caaucgccuu 2400

cacagaugcc cacaucgagg uggacaucac cuacgccgag uacuucgaga ugucugugcg 2460

gcuggccgaa gcuaugaagc gcuacggccu gaacaccaac caccggaucg ucgugugcag 2520

cgagaacagc cugcaguucu ucaugccugu gcugggcgcc cuguucaucg gaguugcugu 2580

ggccccugcc aacgacaucu acaacgagcg cgagcugcug aacagcaugg gcaucucuca 2640

gcccaccgug guguucgugu ccaagaaggg acugcagaaa auccugaacg ugcagaagaa 2700

gcugcccauc auccagaaaa ucaucaucau ggacagcaag accgacuacc agggcuucca 2760

gagcauguac accuucguga ccagccaucu gccaccuggc uucaacgagu acgacuucgu 2820

gcccgagagc uucgaccggg acaagacaau cgcccugauc augaacagca gcggcucuac 2880

cggacugccc aaagguguug cccugccuca uagaacugcc ugcgugcggu uuagccacgc 2940

cagagauccc aucuucggca accagaucau ccccgacaca gccauccuga gcguggugcc 3000

uuuucaccac ggcuucggca uguucaccac acugggcuac cugaucugcg gcuucagagu 3060

ggugcugaug uaccgcuucg aggaagaacu guuccugcgg agccugcagg acuacaagau 3120

ccagucugcu cugcuggugc cuacucuguu cagcuucuuu gccaagagca cccugaucga 3180

uaaguacgac cugagcaacc ugcacgagau cgccucuggc ggagccccuc ugucuaaaga 3240

agugggagaa gccgucgcca agcgguucca ucugccuggc aucagacaag gcuauggccu 3300

gaccgagaca accagcgcca uucugauuac cccugagggc gacgauaagc cuggcgcugu 3360

gggaaaagug gugccauucu ucgaggccaa ggugguggau cuggacaccg gcaaaacacu 3420

gggcguuaac cagaggggcg agcugugugu uagaggcccu augaucauga gcggcuacgu 3480

gaacaacccc gaggccacaa acgcucugau cgacaaggau ggauggcugc acagcggcga 3540

cauugccuac ugggacgaag augagcacuu cuucaucgug gaccggcuga agucccugau 3600

caaguacaag ggcuaccagg uggccccagc cgagcuggaa ucuauucugc ugcaacaccc 3660

caacaucuuc gaugccggcg uugcaggacu gcccgaugau gaugcuggcg aacugccagc 3720

ugcuguggug gugcuggaac acggcaagac caugaccgag aaagaaaucg uggacuacgu 3780

ggccagccaa gugaccaccg ccaagaaacu gagaggcggc gugguguuug uggacgaggu 3840

gccaaaaggc cugacaggca agcuggacgc ccggaagauc agagagaucc ugauuaaggc 3900

caagaaaggc ggcaagaucg ccgugugaug agcucgcuuu cuugcugucc aauuucuauu 3960

aaagguuccu uuguucccua aguccaacua cuaaacuggg ggauauuaug aagggccuug 4020

agcaucugga uucugccuaa uaaaaaacau uuauuuucau ugcgcucgcu uucuugcugu 4080

ccaauuucua uuaaagguuc cuuuguuccc uaaguccaac uacuaaacug ggggauauua 4140

ugaagggccu ugagcaucug gauucugccu aauaaaaaac auuuauuuuc auugcgcucg 4200

cuuucuugcu guccaauuuc uauuaaaggu uccuuuguuc ccuaagucca acuacuaaac 4260

ugggggauau uaugaagggc cuugagcauc uggauucugc cuaauaaaaa acauuuauuu 4320

ucauugcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440

aaaaaaaagg agaagucugc cguuacug 4468

Claims (9)

1.一种利用核仁素增强mRNA稳定表达的方法，其特征在于，主要包括如下步骤：

(1)合成依次为T7启动子序列、5’UTR序列、优化后的核仁素序列、连接元件P2A序列、荧光素酶序列和3’UTR序列的目的基因序列，连接到质粒载体中，构建含有目的基因的质粒；

(2)设计引物，将步骤(1)得到的质粒通过PCR反应获得目的基因尾部添加了polyT序列的线性目的基因片段；

(3)以步骤(2)得到的线性目的基因片段为模板，转录获得mRNA；

(4)通过加帽酶系统对步骤(3)得到的mRNA进行加帽反应，获得5’端携带cap1帽子结构的mRNA；

(5)将步骤(4)得到的携带cap1帽子结构的mRNA和脂质体以特定比例混合，获得脂质纳米粒；

(6)将步骤(5)得到的脂质纳米粒转染细胞，增强细胞中mRNA的稳定表达；

5’UTR序列如SEQ ID NO：2所示，优化后的核仁素序列如SEQ ID NO：3所示，3’UTR序列如SEQ ID NO：6所示；

步骤(6)中所述细胞为人宫颈癌细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的所述质粒载体为PUC57-Kan。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中T7启动子序列如SEQ ID NO：1所示，连接元件P2A序列如SEQ ID NO：4所示，荧光素酶序列如SEQ ID NO：5所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中正向引物的核苷酸序列如SEQID NO：7所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，PCR反应试剂包括BeyoFusion^TMPCR Master Mix预混液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述线性目的基因片段通过磁珠纯化法获得。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述转录的具体过程为：将线性目的基因片段、RNA转录酶、缓冲液、核苷三磷酸在室温下混合，于37℃条件下孵育3h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中转录完成后，加入Dnase Ⅰ，37℃孵育15min，以去除DNA模板。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的加帽酶系统为牛痘病毒加帽酶系统。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中mRNA和脂质体的体积比为(1:1)～(1:5)，脂质体中阳离子脂质体、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇的摩尔比为50：10：37.5：2.5，所述阳离子脂质体为4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯，辅助脂质为二硬脂酰基磷脂酰胆碱。

Images