JPWO2002008443A1 - コムギ胚芽無細胞タンパク質合成システムを用いるタンパク質の一般的標識手段 - Google Patents
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Abstract
コムギ胚芽無細胞タンパク質合成システムを利用し、コムギ胚芽抽出物から該胚芽抽出物に混入する胚乳を完全に除去して得た無細胞タンパク質合成用細胞抽出物中のメチオニンをセレメチオニンに変えた後、メチオニンの代わりにセレメチオニンを含むタンパク質合成反応液組成を使って、バッチ条件下または透析条件下で、無細胞タンパク質合成を行うことを特徴とするセレメチオニン標識タンパク質の製造方法および該製造されたタンパク質を提供する。さらに、同様の手法を用いる重水素標識タンパク質の製造方法および該製造されたタンパク質を提供する。
Description
技術分野
本発明は、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成システムを利用した、セレノメチオニンによるタンパク質の標識手段、および重水素によるタンパク質の標識手段に関する。
背景技術
ゲノム計画の完了を間近に控えて、研究課題の中心が遺伝子構造解析から遺伝子機能解析へと急速に展開してきている。細胞内におけるタンパク質は、それが単独で機能しているのではなく、多種多様なタンパク質因子、核酸、低分子種や細胞膜成分等と協調して相互作用することにより機能発現し、さらに該相互作用の総和として生物学的機能が営まれているものと考えられている。ポストゲノム計画の中心課題の一つは、多種多様なタンパク質因子の複合体の構造と機能の関係を解析することである。ここから得られる成果は、構造生物学や生化学を含む基礎生物学などの研究から、その応用としての医学分野における遺伝子翻訳産物と病因との関係解明、さらには医薬の開発に至る広い分野に極めて重要な知見を提供することになると期待されている。
タンパク質の構造生物学的研究には、Ｘ線結晶解析法、ＮＭＲスペクトロスコピー法や中性子散乱法が用いられている。これらの方法を駆使するためには、それぞれ、重原子標識、同位体標識や重水素標識され且つ活性を保持したタンパク質を大量に調製することが必須である。従来のＸ線結晶解析法では、少なくとも２種類の結晶、すなわち天然型タンパク質の結晶と格子定数決定のためにこの結晶に重原子を侵入させた重原子標識結晶とが必要である。後者の結晶を得るには困難を伴うことが多く、このために前者の結晶化に成功しているにも拘わらず結晶構造が解明できない事例が多い。この解決方法として提案され、一部利用されている技術としてメチオニンのイオウ原子を重原子であるセレンに置換したセレノメチオニンを利用する方法がある。それは、目的とする遺伝子を培養細胞や大腸菌に導入してセレノメチオニンを含む培地中で培養することにより、該遺伝子がコードするタンパク質を発現させる遺伝子工学的手法を利用して、該タンパク質にセレノメチオニンを導入する方法である。
一方、ＮＭＲスペクトロスコピー法や中性子散乱法によるタンパク質立体構造解析および分子内における水分子の局在性分析には、タンパク質の水素原子を重水に置換することが必要である。この方法としては、目的とする遺伝子を大腸菌などの微生物に導入し、これらを重水素標識アミノ酸含有培地中で培養することにより遺伝子産物を発現させ、重水素標識タンパク質を調製する手段が用いられている。
含セレノメチオニンタンパク質は、該タンパク質から得られる１種類の結晶で構造解析が可能であるために有用であり、このことは既に実証されている。しかし、従来行われていたタンパク質のセレノメチオニン標識法には多くの欠点が存在する。それは、（１）メチオニンが細胞でタンパク質合成のみならず種々の代謝にも関与する必須アミノ酸であり、またセレンそれ自体が強い細胞毒性を示すので、培地中のメチオニンをすべてセレノメチオニンに入れ替えることはできず、そのため必要量の含セレノメチオニンタンパク質を調製するには大量培養が必要となること、（２）セレノメチオニンは高価であると同時に毒性が強いので、培養後のセレノメチオニンを高濃度に含む培地の廃棄方法に重大な問題が残されることである。
他方、タンパク質の重水素標識は、ＮＭＲスペクトロスコピー法や中性子散乱法によるタンパク質立体構造解析に必須な要件であるが、これまでは上記のように微生物の培養を利用する方法が唯一であった。この方法は、１）操作が煩雑、２）標識効率が低い、３）大量の重水素標識アミノ酸を必要とするためにコストが極めて高く、またその強い毒性により培地の廃棄方法に重大な問題が残される、などの解決しなければならない多くの欠点があった。
さらに同様の理由から、ＮＭＲスペクトロスコピー法に用いるための炭素１３（１３Ｃ）または窒素１５（１５Ｎ）で標識されたアミノ酸を含むタンパク質を調製する遺伝子工学的手法を用いた実用的な手段は開発されていない。
このような現状において、目的のタンパク質の活性を保持したままで該タンパク質分子中の所望のアミノ酸を所望のように標識化できる、効率がよく安価で且つ廃液量の少ない標識タンパク質の調製手段が待望されていた。
発明の開示
本発明の一態様は、コムギ胚芽抽出物から該胚芽抽出物に混入する胚乳を完全に除去して得た無細胞タンパク質合成用細胞抽出物中のメチオニンをセレノメチオニンに変えた後、メチオニンの代わりにセレノメチオニンを含むタンパク質合成反応液組成を使って、バッチ条件下または透析条件下で、無細胞タンパク質合成を行うことを特徴とするセレノメチオニン標識タンパク質の製造方法である。
また本発明の一態様は、上記製造方法で得たセレノメチオニン標識タンパク質である。
さらに本発明の一態様は、コムギ胚芽抽出物から該胚芽抽出物に混入する胚乳を完全に除去して得た無細胞タンパク質合成用細胞抽出物中の天然型アミノ酸を重水素標識アミノ酸に変えた後、天然型アミノ酸の代わりに重水素標識アミノ酸を含むタンパク質合成反応液組成を使って、バッチ条件下または透析条件下で、無細胞タンパク質合成を行うことを特徴とする重水素含有アミノ酸標識タンパク質の製造方法である。
さらにまた本発明の一態様は、上記製造方法で得た重水素含有アミノ酸標識タンパク質である。
発明を実施するための最良の形態
本発明に係る標識タンパク質の製造方法は、無細胞タンパク質合成システムを利用したものである。該製造方法は標識タンパク質の合成効率が高く、且つ純度が高い標識タンパク質を提供し得るという利点を有し、またこれらの利点のために廃液量が少ない。従って本発明に係る標識タンパク質の製造方法は、従来法と比較して極めて優れた方法である。
本発明において、無細胞タンパク質合成システムで用いる細胞抽出物は、コムギ胚芽抽出物、好ましくは胚乳成分の夾雑が実質的に完全に排除されているコムギ胚芽抽出物である。該コムギ胚芽抽出物は、その原料として後述する実施例１に示した方法で得ることのできる、白色を呈する小傷部分をもつ胚芽および茶や黒などの色をもつ胚芽を完全に除去した黄色の胚芽のみからなるコムギ胚芽を原料として調製したものが特に好ましい。
タンパク質をセレノメチオニン標識するときは、コムギ胚芽抽出物中のメチオニンをセレノメチオニンに置換する。置換の方法は、具体的には後述する実施例に記載する。例えば、予めメチオニンを除いてセレノメチオニンを添加した２０種類のアミノ酸混合液（１９種類のアミノ酸とセレノメチオニンとを含む溶液）を含む抽出用溶液を用いてまずコムギ胚芽から抽出物を調製する。または従来どおりの２０種類全てのアミノ酸を含む抽出用溶液を用いてコムギ胚芽から抽出物を調製してもよい。次いでこの胚芽抽出物のゲルろ過を、メチオニンを除いた１９種類のアミノ酸にセレノメチオニンを追加した２０種類のアミノ酸を含む溶液を用いて行い、メチオニンの代わりにセレノメチオニンを含むコムギ胚芽抽出物を調製する。
タンパク質を重水素標識するときは、コムギ胚芽抽出物中の天然型アミノ酸を重水素標識アミノ酸に置換する。置換の方法は、具体的には後述する実施例に記載する。例えば、標識したい天然型アミノ酸を予め除きその代わりに重水素標識した当該アミノ酸を添加した抽出用溶液、または２０種類の重水素標識アミノ酸混合液を含む抽出用溶液を用いてコムギ胚芽から抽出物を調製する。次いでこのコムギ胚芽抽出物のゲルろ過を、目的とする重水素標識アミノ酸を含む溶液または２０種類の重水素標識アミノ酸混合液を含む溶液で平衡化したゲルろ過カラムで行い、抽出物中のアミノ酸のうち目的とするアミノ酸または２０種類のすべてのアミノ酸を重水素標識アミノ酸と交換したコムギ胚芽抽出物を調製する。
本発明において使用するタンパク質合成反応液組成は、セレノメチオニン標識タンパク質を得るときには、従来既知の無細胞タンパク質合成系（無細胞タンパク質合成のための反応系）で使用される組成においてメチオニンをセレノメチオニンに置き換えたものであり得る。例えば、該反応液は、容量の２４％のコムギ胚芽抽出液（濃度は、２００Ａ２６０ｎｍ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）に対して、１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ）、３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、９５ｍＭ 酢酸カリウム、２．６５ｍＭ 酢酸マグネシウム、２．８５ｍＭ ジチオスレイトール、０．５ｍｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ、１．２ｍＭ アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、０．２５ｍＭ グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、１６ｍＭ クレアチンリン酸、０．３８０ｍＭ スペルミジン、メチオニンの代わりにセレノメチオニンを含む２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）、０．０５％ ＮＰ−４０等を加えてなる。
また、重水素標識タンパク質を得るときは、上記同様に従来既知の無細胞タンパク質合成系で使用される組成において、標識したい天然型アミノ酸を重水素標識した当該アミノ酸に、または２０種類のアミノ酸全てを重水素標識アミノ酸に置き換えたものを用いればよい。
このタンパク質合成反応溶液に、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡを添加してタンパク質合成を行う。ｍＲＮＡは自体公知の方法で調製したものが使用できるが、本発明においては、タンパク質合成の翻訳鋳型となるｍＲＮＡの合成を行うために、遠藤が構築した汎用性のあるプラスミド（ｐＥＵ）を利用した（図４を参照）。このプラスミドは、▲１▼プロモーター機能を担持した塩基配列と、▲２▼その下流にあたる領域に少なくともアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）リーダー配列、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ＲＮＡの５’末端非翻訳配列（５’ＵＴＲ）に存在するオメガ（Ｏｍｅｇａ）（Ω）配列、配列表の配列番号１若しくは２若しくは３に記載の塩基配列、またはこれらの配列と７０％以上の相同性を有し且つＣＡＰ構造が存在するｍＲＮＡの翻訳開始活性と比較して約７０％以上の翻訳開始活性を有するｍＲＮＡを与えうる塩基配列の、転写鋳型となる塩基配列と、▲３▼その下流にあたる領域に複数の制限酵素切断部位と、▲４▼ＯＲＦ（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）の終止コドンの下流にあたる領域に少なくとも５００塩基以上からなる３’末端非翻訳配列（３’ＵＴＲ）とが配置されていることを特徴とする無細胞タンパク質合成系において鋳型として用いるプラスミドである。このプラスミドから転写されたｍＲＮＡは、その５’末端非翻訳配列にＡＭＶリーダー配列、ＴＭＶΩ配列、または配列表の配列番号１若しくは２若しくは３に記載の塩基配列を有し、且つ長い３’末端非翻訳配列を有するため、安定で且つ翻訳効率が高い。配列表の配列番号１若しくは２若しくは３に記載の塩基配列は、５’末端非翻訳配列として用いるためにＡＭＶリーダー配列およびＴＭＶΩ配列に基づいて設計して得たポリヌクレオチドである。
このプラスミドを環状型のままで用いると、該プラスミドには特別な転写終結部位を挿入していないので、転写産物であるｍＲＮＡは種々の分子サイズのｍＲＮＡとして合成される。転写終結部位を規定するターミネーター機能を担持する配列をプロモーター領域の上流に配置し、転写産物の分子サイズを一定にすることもできる。また、このプラスミドを転写反応に先だって制限酵素で切断して開環し、直鎖型プラスミドとして用いてもよい。
本発明において翻訳鋳型として用いるｍＲＮＡは、上記プラスミドを利用して調製したものであってもよいし、また自体公知の方法を用いて得たものであってもよい。
安定で且つ翻訳効率の高いｍＲＮＡとして、その５’末端側に上記ＡＭＶリーダー配列やＴＭＶΩ配列、または次のようなウイルスが持つ５’末端非翻訳配列（５’ＵＴＲ）が配置されたｍＲＮＡを使用することが好ましい；タバコエチウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ）（ＥＴＶ）〔Ｎｉｅｐｅｌ，Ｍ．ａｎｄ Ｇａｌｌｉｅ，Ｄ．Ｒ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３，９０８０−９０８８〕〔Ｋａｗａｒａｓａｋｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１６，５１７−５２１〕、タバコベインモトリングウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｖｅｉｎ Ｍｏｔｔｌｉｎｇ Ｖｉｒｕｓ）、ポテトウイルス（Ｐｏｔａｔｏ Ｖｉｒｕｓ）プラムポックスウイルス（Ｐｌｕｍ Ｐｏｘ Ｖｉｒｕｓ）。また、下記のウイルスの５’末端に存在するインターナルリボゾーマルエントリーサイト（ＩＲＥＳ）配列も、上記５’末端非翻訳配列として使用可能である；エンセファロミィオカルディティスウイルス（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、セイラーズムリンエンセファロミィオカルディティスウイルス（Ｔｈｅｉｌｅｒ’ｓ Ｍｕｒｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、口蹄疫ウイルス（Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−Ｍｏｕｔｈ Ｖｉｒｕｓ）、クラシカル豚熱ウイルス（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ Ｓｗｉｎｅ Ｆｅｖｅｒ Ｖｉｒｕｓ）、ボバインヴァイラルダイアリアウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ Ｖｉｒａｌ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ）。
また、安定で且つ翻訳効率の高いｍＲＮＡを構築するために、その３’末端側に配置する非翻訳配列として、例えばトマトブッシースタントウイルス（Ｔｏｍａｔｏ Ｂｕｓｈｙ Ｓｔｕｎｔ Ｖｉｒｕｓ）〔Ｗｕ，Ｂ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｋ．Ｄ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３，８９８２−８９８８〕のものを使用することができる。
さらにまた、サテライトタバコネクロシスウイルス（Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）〔Ｔｉｍｍｅｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，９５０４−９５１０〕およびバーレイイエロードウォーフルテオウイルス（Ｂａｒｌｅｙ Ｙｅｌｌｏｗ Ｄｗａｒｆ Ｌｕｔｅｏ Ｖｉｒｕｓ）〔Ｇｕｏ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ７，１１０３−１１０９〕では、５’末端非翻訳配列と３’末端非翻訳配列の相互作用により効率的な翻訳反応が行われることが知られており、目的とするｍＲＮＡの構築にこれらの５’末端非翻訳配列と３’末端非翻訳配列を使用してもよい。
また、ランダム配列のＲＮＡプールから、既報〔Ｏｗｅｎｓ，Ｇ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｓｃｉ．９８，１４７１−１４７６〕〔Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ，Ａ．ａｎｄ Ｄａｓｇｕｐｔａ，Ａ．，（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１，２８２６−２８３７〕に記載の方法に従って効率のよい翻訳機能を持った配列をスクリーニングして得て、その配列をｍＲＮＡの構築に利用することも可能である。また、これら文献に記載の塩基配列をｍＲＮＡの５’末端非翻訳配列または３’末端非翻訳配列として利用することもできる。
また、ｍＲＮＡを構築するときに鋳型として用いるＤＮＡは環状のプラスミドＤＮＡに限らず、ＰＣＲで増幅した直鎖状の二重鎖ＤＮＡも使用できる。この場合、転写反応のプロモーターにはＴ７ＲＮＡポリメラーゼのものを用い、それに続きＥＴＶの５’非翻訳領域、目的とするタンパク質の遺伝子と最後にＴ７ＲＮＡポリメラーゼターミネーター配列を配置した遺伝子をＴ７ＲＮＡポリメラーゼで転写し、ｍＲＮＡを調製してもよいし、調製後引き続き無細胞タンパク合成系にて反応させてもよい。
本発明においてタンパク質合成は、上記方法で調製したコムギ胚芽抽出物およびタンパク質合成反応液を用いて、無細胞タンパク質合成法により行う。当該無細胞タンパク質合成は、従来通りバッチ式で行うことができる。また、目的の遺伝子を挿入した上記プラスミドを用いて、ｍＲＮＡ合成（転写）とタンパク質合成（翻訳）とを連続して同一容器内で行うことが可能な透析法や限外ろ過膜を利用した一体型無細胞タンパク質合成システムで行うこともできる。以下に一体型無細胞タンパク質合成システムとバッチ式による無細胞タンパク質合成法とについて説明する。
バッチ式無細胞タンパク質合成法は、ｍＲＮＡ合成反応を行って得られたｍＲＮＡを、無細胞タンパク質合成反応に加え、反応を開始してから該反応が終了するまでの１回の反応によるタンパク質合成を意味する。ｍＲＮＡ合成は自体公知の方法を用いて得ることができるし、上記プラスミドを利用して合成してもよい。タンパク質合成は、コムギ胚芽抽出物を利用した無細胞タンパク質合成に関する遠藤の既報告〔Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０〕〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９〜５６４（２０００）〕に記載の方法に準じて行なうことができる。
一方、一体型透析式無細胞タンパク質合成システムでは、上記プラスミドに目的の遺伝子を挿入し、これを環状型のまま、または直鎖型にしてＲＮＡ合成反応液に添加し、摂氏２３〜３７度好ましくは摂氏３０度で５分程度好ましくは１０分間の予備反応を行う。この予備反応段階は所望により省略してもよいが、この予備反応段階で鋳型ＤＮＡのプロモーター領域にＲＮＡポリメラーゼが結合して転写開始反応が効率的に進行するために次の保温段階におけるｍＲＮＡ合成量が増加して、その結果翻訳反応段階におけるタンパク質の合成量が増加するので、好適には行った方がよい。ＲＮＡ合成反応液は、鋳型ＤＮＡ、４種類の基質リボヌクレオシド−５’−３リン酸、さらに必要に応じてＣＡＰ分子、ＲＮＡポリメラーゼ、スペルミジン、マグネシウムイオンおよび適当な緩衝液などからなる。具体的には、例えば８０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、１６ｍＭ 酢酸マグネシウム、２ｍＭ スペルミジン、１０ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２．５ｍＭの各ヌクレオシド−５’−３リン酸〔ＮＴＰ；ＡＴＰ、ＧＴＰ、ウリジン−５’−３リン酸（ＵＴＰ）、シチジン−５’−３リン酸（ＣＴＰ）〕、リボヌクレアーゼ阻害剤（１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（３，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）からなるＲＮＡ合成反応液を用いることができる。なお５’末端にＣＡＰ構造を有するＲＮＡを合成する場合は、この溶液に５ｍＭの７ｍＧｐｐｐＧを追加すればよい。
次に、上記プラスミドを含むＲＮＡ合成反応液と上記タンパク質合成反応液（セレノメチオニン標識タンパク質の調製にはメチオニンの代わりにセレノメチオニンを添加したものを、また重水素標識タンパク質の調製には天然型アミノ酸の代わりに重水素標識アミノ酸を含むもの）を混合する。この混液を透析膜チューブに移した後、これを予め準備しておいたタンパク質合成用透析外液（上記メチオニンの代わりにセレノメチオニンを添加したもの、または重水素標識タンパク質の調製には天然型アミノ酸の代わりに重水素標識アミノ酸を含むもの）を満たした容器に浸す。反応を摂氏３０度で約３時間静置条件下で行うことによって、まず主にｍＲＮＡが合成される。
次の段階として、反応温度を摂氏２６度に低下させて、透析しながら静置条件下で反応を持続させる。この過程で透析膜内の低分子、特にｍＲＮＡ合成の至適濃度に合わせて高濃度に設定しておいたＡＴＰ、ＧＴＰやマグネシウムイオンの濃度が透析の進行とともに低下し、タンパク質合成反応液（前記メチオニンの代わりにセレノメチオニンを添加したもの、または、重水素標識タンパク質の調製には天然型アミノ酸の代わりに重水素標識アミノ酸を含むもの）からなる透析外液濃度に近づき、やがて透析膜内の溶液成分はタンパク質合成反応の至適濃度に達する。
これに伴ってタンパク質合成反応が促進され、その反応速度が最大となり、タンパク質が合成される。この無細胞タンパク質合成反応は６０時間以上にわたって持続し、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を合成したとき、反応容量１ｍｌ当り４ｍｇ程度のタンパク質を得ることができた。
透析膜を利用するこのシステムには、環状型、直鎖型のいずれのプラスミドも用いることができる。しかし、合成収量とコストを考慮して、環状型プラスミドを用いることが好ましい。また翻訳開始活性を促進するＣＡＰの存在下、非存在下のいずれの条件下でも、このシステムは実施可能である。しかし、ｍＲＮＡ合成に使用するＣＡＰ自身がタンパク質合成に必要な因子に強く結合してこれを阻害しタンパク質合成の効率が低くなるため、ＣＡＰ非存在下で行うことが実用的である。
さらに、限外ろ過膜を利用した、ｍＲＮＡ合成後に引き続いて無細胞タンパク質合成を同一容器内で行う転写と翻訳とを一体化した無細胞タンパク質合成システムによっても上記同様に、タンパク質のセレノメチオニン標識および重水素含有アミノ酸標識を行うことができる。
まず、上記プラスミドを鋳型として、限外ろ過膜を備えたスピンカラムを用いた透析法でｍＲＮＡを合成する。合成反応は上記ＲＮＡ合成反応液を用いて摂氏３０〜３７度で行い、反応時間は必要なＲＮＡ合成量に応じて決定されるが、通常の場合はおおよそ３〜５時間でよい。また、ここで用いるスピンカラムに備えられた限外ろ過フィルターの分子量カットサイズは、合成されたＲＮＡとＲＮＡ合成のための基質や合成の副生成物などの低分子物質との分離が可能な孔径であれば特に限定されないが、５，０００〜１００，０００であることが好ましい。それらフィルターの孔径は、１０〜５０オングストロームである。
反応終了後に反応容器であるスピンカラムを遠心して洗浄することにより、純化されたｍＲＮＡをフィルター上に補集する。次に、コムギ胚芽抽出物を含む上記無細胞タンパク質合成反応液を同スピンカラムに添加し、上記無細胞タンパク質合成反応液からなる透析外液（メチオニンの代わりにセレノメチオニンを含む２０種類のＬ型アミノ酸、または天然型アミノ酸の代わりに重水素標識アミノ酸を含む２０種類のＬ型アミノ酸を含有する）を満たした容器に浸して摂氏２３度で無細胞タンパク質合成反応を開始し、静置条件下で反応させる。
このシステムにより得られるタンパク質合成収率は、透析膜を用いる前記のシステムによる収量とほぼ同程度である。また、スピンカラムのフィルター上のｍＲＮＡをフィルターのまま、前記透析膜を利用するシステムにおいて透析チューブに投入することによってもタンパク質合成が可能である。さらに本発明において、ＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡについても全く同様にその合成および精製に続いて効率的なタンパク質合成反応を行うことができる。
限外ろ過膜を利用するシステムには、環状型、直鎖型のいずれのプラスミドも用いることができ、またＣＡＰ存在下、非存在下のいずれの条件下でも、このシステムは実施可能である。５’末端にＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡを用いる方がタンパク質合成収量は高いが、直鎖型プラスミドから合成した５’末端にＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡと環状型プラスミドからＣＡＰ非存在下に合成したｍＲＮＡとの両者の合成収量に大きな差はなく、コストを考慮するとＣＡＰ非存在下に環状型プラスミドを用いることが好ましい。
前記２つの一体型無細胞タンパク質合成システムは、いずれもまずｍＲＮＡ合成を行いその後引き続いてタンパク質合成を同一の反応容器内で行う連続式システムであり、転写・翻訳非共役システムである。これらのシステムでは、少なくともタンパク質合成反応の翻訳鋳型となるｍＲＮＡ、エネルギー再生系酵素、基質（メチオニンの代わりにセレノメチオニンを含む２０種類のＬ型アミノ酸、または天然型アミノ酸の代わりに重水素標識アミノ酸を含む２０種類のＬ型アミノ酸）、およびエネルギー源から選ばれた１種または２種以上の要素について、反応開始後、要時にまたは継続的に追加して添加する手段を導入してもよい。これらは、極少量を継続的に添加してもよいし、一定時間ごとに添加してもよい。また、これらのシステムでは、上記無細胞タンパク質合成反応に必要な物質を、該合成反応の効率を維持するために、該合成反応の開始後に反応途中で交換する処置を導入してもよい。例えば、無細胞タンパク質合成反応液（メチオニンの代わりにセレノメチオニンを含む２０種類のＬ型アミノ酸、または天然型アミノ酸の代わりに重水素標識アミノ酸を含む２０種類のＬ型アミノ酸）からなる透析外液の所望の量を、継続的または断続的に交換する手段を導入できる。
さらに、これらのシステムは、上記無細胞タンパク質合成反応に必要な物質を追加添加または交換するために、必要とする物質を保存しておく手段を備えていてもよい。さらにまた、これらのシステムは、無細胞タンパク質合成反応の副生成物を該合成反応から除くための排出手段を備えていてもよい。必要とする物質や副生成物の追加、保存、交換、および／または排出のための手段は１種または２種以上を選択し、組み合わせて導入することが可能である。
また、これらのシステムにおいて、反応容器中の反応液が接する面のうち少なくとも透析手段または分子篩手段に関与する面、例えば透析膜または限外ろ過膜にタンパク質コーティングを予め施せば、タンパク質合成の効率がさらに向上する。すなわち、タンパク質を用いたコーティング処理により、ｍＲＮＡ転写の効率およびそれに続いて起こるタンパク質翻訳の効率を上昇させることができる。コーティングに用いるタンパク質は、アルブミンが例示されるが必ずしもこれに限定されない。また、コーティングに用いるタンパク質は、透析手段または分子篩手段に関与する面に格別に固定しておく必要はなく、タンパク質含有溶液で数回洗浄することでも効果が得られる。この方法は簡便であり好ましいがこれに限定されるものではない。例えば、透析膜をアルブミンでコーティングする場合、内液として水とアルブミンとの混合溶液を用い、外液として水を使用して数時間透析を行えばよい。むろん、内液と外液の組成が逆であってもよい。コーティング用タンパク質含有溶液の濃度は格別限定されないが、溶解飽和濃度であれば十分であり、それ以下でもよい。
なお、本発明においては、コムギ胚芽抽出物を使用して前記の一体型またはバッチ式無細胞タンパク質合成を行う場合、タンパク質合成反応は反応液を撹拌することのない静置条件下で行うことが好ましい。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１
グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）のセレノメチオニンによる標識を、コムギ胚芽抽出物を用いた無細胞タンパク質合成法により行った。
コムギ胚芽抽出物の調製および該コムギ胚芽抽出物を用いた無細胞タンパク質合成法は既報（Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００），９７，５５９〜５６４）に準じて行った。
まず、コムギ胚芽をジョンストンらの方法（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｆ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９５７）Ｎａｔｕｒｅ，１７９，１６０−１６１）を改良した方法で得た。まず、北海道産のチホクコムギ種子（未消毒）を１分間に１００ｇの割合でミル（Ｆｒｉｔｓｃｈ社製Ｒｏｔｏｒ Ｓｐｅｅｄ Ｍｉｌｌ ｐｕｌｖｅｒｉｓｅｔｔｅ １４型）に添加し、回転数８，０００ｒｐｍで種子を温和に破砕した。これを再度６，０００ｒｐｍで破砕し、篩で粗胚芽画分（メッシュサイズ０．７１ｍｍ〜１．００ｍｍ）を得た後、該胚芽画分に混在する種皮などの不純物をポリエチレン板などの静電気帯電体を用いて吸着除去した。
さらに胚芽粒子を篩と静電気帯電体を用いて、小粒（０．７１ｍｍ〜０．８５ｍｍ）、中粒（０．８５ｍｍ〜１ｍｍ）、軽粒（０．８５ｍｍ〜１ｍｍで且つ軽量）の３画分に分別し、最後に肉眼による分別を行って黄色の胚芽を採取した。小粒画分が最も高いタンパク質合成活性を示した。軽粒は、種子破砕時に胚芽に生じた小傷胚芽が浮選操作中に破壊が進行したものであると推察される。次に、このようにして得た黄色の胚芽からなる試料からコムギ胚乳成分を完全に除去するため、ガーゼに得られたコムギ胚芽を入れて冷却しながら冷蒸留水（ＤＤＷ）で洗浄した後に非イオン性界面活性剤であるＮＰ−４０の０．５％溶液に懸濁し、超音波洗浄器を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄を繰り返した。蒸留水の存在下に再度１回の超音波洗浄後、吸引ろ過によってコムギ胚芽を収集し、それを冷蒸留水（ＤＤＷ）で何度も洗浄してコムギ胚芽を純化した。かくして純化されたコムギ胚芽は、コムギ胚芽に夾雑する内因性のタンパク質合成阻害因子、トリチン、チオニン、およびリボヌクレアーゼなどが実質的に除去されたもの、すなわち実質的に胚乳成分の夾雑が無いものであった。
コムギ胚芽からの抽出物の調製は常法（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６，３８−５０）に準じた。以下の操作は摂氏４度で行う。上記純化コムギ胚芽を液体窒素で凍結して乳鉢中で粉砕し、得られた粉体１ｇ当たり１ｍｌのパターソンらの方法を一部改変した抽出用溶液（８０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、２００ｍＭ 酢酸カリウム、２ｍＭ 酢酸マグネシウム、４ｍＭ 塩化カルシウム、８ｍＭ ジチオスレイトール、各０．６ｍＭのメチオニンを除くＬ型アミノ酸１９種類、各１μＭのタンパク質分解酵素阻害剤であるＦＵＴ、Ｅ−６４およびＰＭＳＦを含む）を加えて、泡が発生しないように注意しながら撹拌した。その後、３０，０００ｇで１５分間遠心処理し、その上清を胚芽抽出物として回収して、予め溶液（４０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ 酢酸カリウム、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、４ｍＭ ジチオスレイトール、メチオニンを除くＬ型１９種類アミノ酸にセレノメチオニンを補った２０種類のアミノ酸）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カラム（Ｃｏａｒｓｅ）でゲルろ過を行った。または、上記抽出用溶液の代わりに、従来どおりの２０種類全てのアミノ酸を含む抽出用溶液を用いて上記同様に胚芽抽出物を調製した。この場合は、ゲルろ過操作を予めメチオニンを除いた１９種類のアミノ酸を含むゲルろ過溶液で平衡化したゲルろ過カラムで行い、得られたメチオニンを含まないコムギ胚芽抽出物にセレノメチオニンを補足してコムギ胚芽抽出物を調製した。試料の濃度は、１７０〜２５０Ａ２６０ｎｍ（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．５）に調整した。
タンパク質合成反応液は、容量の２４％のコムギ胚芽抽出液（濃度は、２００Ａ２６０ｎｍ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ）、３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、９５ｍＭ 酢酸カリウム、２．６５ｍＭ 酢酸マグネシウム、２．８５ｍＭ ジチオスレイトール、０．５ｍｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ、１．２ｍＭ ＡＴＰ、０．２５ｍＭ ＧＴＰ、１６ｍＭ クレアチンリン酸、０．３８０ｍＭ スペルミジン、メチオニンの代わりにセレノメチオニンを含む２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）、０．０５％ ＮＰ−４０からなるものを用いた。
ｇｆｐ ｍＲＮＡまたはｄｈｆｒ ｍＲＮＡ合成用プラスミドは、プラスミドｐＰＳＰ６５を基にして、ＳＰ６プロモーターまたはＴ７プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼが結合する塩基配列を挿入し、その下流にｍＲＮＡの翻訳開始反応に重要な機能を持つＡＭＶ−Ω配列の転写鋳型となる塩基配列を挿入し、さらにその下流にｇｆｐ遺伝子またはｄｈｆｒ遺伝子を導入し、３’末端にｇｆｐまたはｄｈｆｒ遺伝子由来の３’ＵＴＲとポリ（Ａ）１００をコードする配列とを挿入して作成した（図４）。このプラスミドは、ポリ（Ａ）配列下流に導入した制限酵素部位（ＨｉｎｄＩＩＩ部位）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して開環し、直鎖型プラスミドＤＮＡとして用いた。
上記直鎖型プラスミドからｍＲＮＡを転写するために、反応容器は容器底部が透析フィルターからなるミクロスピンカラム（アミコン社製ＹＭ−１０）を用いた。この直鎖型プラスミドＤＮＡを含むＲＮＡ合成反応液｛８０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、１６ｍＭ 酢酸マグネシウム、２ｍＭ スペルミジン、１０ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２．５ｍＭの各ヌクレオシド−５’−３リン酸〔ＮＴＰ；ＡＴＰ、ＧＴＰ、ウリジン−５’−３リン酸（ＵＴＰ）、シチジン−５’−３リン酸（ＣＴＰ）〕、リボヌクレアーゼ阻害剤（１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（３，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）｝を摂氏３７度で２時間保温することによってｍＲＮＡを合成した。なおＹＭ−１０は、牛血清アルブミンでコーティング処理して用いた。
反応終了後にこの反応容器（ミクロスピンカラム）を遠心処理した。遠心処理により、溶液中のヌクレオチド３リン酸やＣＡＰなどの基質、副生成物のピロリン酸、イオン、および緩衝液などの低分子はフィルター孔を通して除去され、合成されたｍＲＮＡなどの高分子はフィルター上に留まる。溶液に水を加えてこの操作を数回繰り返し、合成されたｍＲＮＡ画分からピロリン酸などの低分子のタンパク質合成阻害物質を完全に除き、合成されたｍＲＮＡをフィルター上に捕集した。なお、この純化操作において鋳型ＤＮＡは除去されずにフィルター上に残るが、翻訳反応に対する阻害作用は示さなかった。
ｍＲＮＡは、該ｍＲＮＡが捕集されたフィルターから水溶液として回収するかまたはフィルター上に捕集したままで、無細胞タンパク質合成系に使用した。
かくして得られたｍＲＮＡを、上記無細胞タンパク質合成反応液に添加してバッチ式または一体型無細胞タンパク質合成系タンパク質合成を行った。水溶液として回収したｍＲＮＡを使用するときは、上記無細胞タンパク質合成反応液に０．２μＭとなるように添加した。タンパク質合成反応、すなわち翻訳反応は摂氏２６度で静置反応条件下で行った。
バッチ式無細胞タンパク質合成法におけるＧＦＰとＤＨＦＲの合成量は放射性同位体のトリクロル酢酸不溶画分への取り込みにより測定し、さらに合成されたタンパク質をオートラジオグラフィーで分析した。
透析法で大量に合成したタンパク質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法およびクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色法により検出した〔Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０〕〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９〜５６４（２０００）〕。
ＧＦＰの精製と蛍光分光光度計を用いた発光スペクトルの分析による活性測定はＤｅｓｃｈａｍｐｓらの方法〔Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，６，５５５−５５８〕に準じて行った。発光スペクトル測定には島津ＲＦ−５０００型蛍光光度計を用いた。ＤＨＦＲ活性はＳｔａｎｌｅｙらの方法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８，１９５−１９９（１９７１）〕で測定した。
その結果を以下に示す。
図１に、メチオニンをセレノメチオニンに置換したタンパク質合成反応系においてバッチ式でＧＦＰとＤＨＦＲを合成したときのそれぞれの合成量（Ａ）と、それぞれの合成産物をオートラジオグラフィーで分析した結果〔（Ｂ）および（Ｃ）〕を示した。図１の（Ｂ）はＧＦＰ、図１の（Ｃ）はＤＨＦＲについての結果を示し、図中のＭｅｔ（メチオニン）は天然型タンパク質を、Ｓｅ−ｍｅｔ（セレノメチオニン）は含セレノメチオニンタンパク質を意味する。オートラジオグラムから明らかなように、含セレノメチオニンＧＦＰおよび含セレノメチオニンＤＨＦＲは共にそれぞれのメチオニンを含む天然型タンパク質と同じ電気泳動移動度を示した。また、経時的にバンドが濃くなっていることから反応時間の経過とともにこれらの合成量が増加していることがわかる。図１の（Ａ）に示したように、メチオニンをセレノメチオニンに置換した合成反応系における含セレノメチオニンＧＦＰ合成（●―●）は対照の天然型ＧＦＰ合成（○―○）に比べて２０−２５％程度の合成量の低下が見られるものの、含セレノメチオニンＧＦＰが効率よく合成されることが分かる。含セレノメチオニンＤＨＦＲ合成（■―■）と対照の天然型ＤＨＦＲ合成（□―□）についても同様の結果が得られた。
一方、メチオニンおよびセレノメチオニンの両者を含まない反応系における実験では、合成反応が１時間で完全に停止した（○−−○）。この間に合成されたＧＦＰは、セレノメチオニン存在下で４時間のバッチ式反応で合成された含セレノメチオニンＧＦＰ量の約１２％に当たる。このことは、ゲルろ過操作で除去できずに胚芽抽出物中に残存していたメチオニンが反応開始後の１時間タンパク質合成に利用されたことを示している。さらにこのことは、セレノメチオニン存在下にバッチ式で合成されたＧＦＰ量の１２％は含メチオニンＧＦＰであり、８８％が含セレノメチオニンＧＦＰであることを示している。後述するように、透析式無細胞タンパク質合成システムにおける大量合成においては、含セレノメチオニンＧＦＰ合成が持続してその含有量が増加するとともに天然型ＧＦＰの混入量の割合は低下するため、現実的には無視できる微量となる。同様の知見は、ＤＨＦＲ遺伝子を鋳型とした含セレノメチオニンＤＨＦＲ合成においても確認できた〔図１の（Ａ）〕（□−−□）。
次に、一体型透析式無細胞タンパク質合成法を用いて、含セレノメチオニンＧＦＰおよび含セレノメチオニンＤＨＦＲの多量合成を行い、これらの反応液からタンパク質を精製した。図２には、この方法により４８時間の反応で合成し精製したＧＦＰ（Ａ）とＤＨＦＲ（Ｂ）のそれぞれの天然型（レーン２と３）および含セレノメチオニンタンパク質（レーン４と５）のＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動図を示した。図中の矢印はそれぞれのタンパク質のバンドを示す。図２から天然型および含セレノメチオニンタンパク質ともに添加した鋳型に依存して効率よく合成されていることが分かる。レーン１は対照として鋳型非存在下で反応させた反応液の電気泳動パターンである。ＧＦＰ、ＤＨＦＲ共に一体型透析式無細胞タンパク質合成法での合成効率が高いために反応液中のこれらの産物含有量が高くなるので、常法によって簡便に精製することが可能である（レーン３および４）。図２の（Ｂ）に示したＤＨＦＲの例では、メトトレキセートをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィー法で精製したところ、１回のクロマトグラフィー操作によって天然型と含セレノメチオニンＤＨＦＲ共にその純度が１００％に近い試料を調製することができた（レーン３および４）。
さらにこのレーン３および４に示した実験結果は、含セレノメチオニンＤＨＦＲが天然型ＤＨＦＲと同様に、リガンドであるメトトレキセートに対して強い親和性を有することを示している。このことは、合成した含セレノメチオニンＤＨＦＲが天然型ＤＨＦＲと同様の酵素活性を有することを意味しているものと考えられる。
さらに重要な点は、一体型透析式無細胞タンパク質合成法で上記のように得られた合成タンパク質中のセレノメチオニン含有量がきわめて高いことである。言い換えれば、得られる含セレノメチオニン非天然型タンパク質が高純度であるということである。図１で示したセレノメチオニン存在下における反応４時間後に合成されたＧＦＰとＤＨＦＲ中のセレノメチオニン含有量とメチオニンおよびセレノメチオニン非存在下における合成カイネティクスの結果とにより、セレノメチオニン含有量を計算することができる。バッチ式反応４時間後に合成されたタンパク質量は、反応液１ｍｌ当りＧＦＰは０．４ｍｇ、ＤＨＦＲは０．４５ｍｇであり、これらタンパク質のメチオニン残基の少なくとも約８０％がセレノメチオニン（含メチオニンタンパク質の割合は最大で約２０％程度）であることから、含メチオニンＧＦＰ量は、０．０８ｍｇ、また、含メチオニンＤＨＦＲ量は０．０９ｍｇと計算できる。一方、一体型透析式無細胞タンパク質合成系での４８時間反応後の合成量は、ＧＦＰおよびＤＨＦＲそれぞれ２．８ｍｇおよび３．１ｍｇであった。すなわち、一体型透析式無細胞タンパク質合成系によって大量調製した含セレノメチオニンタンパク質の純度は、上述のように計算すると、ＧＦＰおよびＤＨＦＲともに９７．１％であった。
このように、本発明によるセレノメチオニンのタンパク質への導入率は従来行われていた方法に比べてはるかに高い。従来利用されていたセレノメチオニンのタンパク質への導入法は大腸菌を大量培養して行うものであるが、その導入率は最大でも５３％であることが報告されている〔Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（１９６７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４１，５８７−５９９〕。従って、本発明に係る非天然型アミノ酸導入法は従来法と比較して極めて優れている。
次に、精製したこれら含セレノメチオニンタンパク質の酵素学的性質を生化学的に調べた。図２に示した精製ＧＦＰ標品の一定濃度を波長３９５ｎｍで励起したときの蛍光発光スペクトルを、４１０ｎｍから６００ｎｍの範囲で測定し、その結果を図３に示した。図３から明らかなように、天然型である含メチオニンＧＦＰ〔図３の（Ａ）〕と含セレノメチオニンＧＦＰ〔図３の（Ｂ）〕の蛍光発光スペクトルには差が認められない。すなわち、メチオニン残基をセレノメチオニンに置換することによるＧＦＰ活性の変化は通常の測定感度以下であると言える。
また、ＤＨＦＲの酵素学的性質を調べた結果を表１にまとめた。表１から明らかなように、天然型である含メチオニンＤＨＦＲ（Ｍｅｔ−ＤＨＦＲ）と含セレノメチオニンＤＨＦＲ（ＳｅＭｅｔ−ＤＨＦＲ）の酵素化学的性質を表すパラメーターである還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）に対するミカエリス定数（Ｋｍ）と最大速度Ｖｍａｘは、ともに両酵素の間で差は認められない。すなわち、メチオニン残基をセレノメチオニンに置換したＤＨＦＲは天然型ＤＨＦＲと同等の酵素活性を保持していることが明らかとなった。
次に、タンパク質合成時にｍＲＮＡ上のメチオニンコドンが指示する部位にセレノメチオニンが取り込まれたこと、すなわちタンパク質分子中の本来はメチオニン残基である部位にセレノメチオニンが導入されたことを確認する目的で、質量分析を行った。天然型タンパク質（対照）と含セレノメチオニンタンパク質の質量差から、含セレノメチオニンＧＦＰは５．９個の原子セレンを、また含セレノメチオニンＤＨＦＲは４．８個のセレンを含むことが確認された。これらの測定値は、ＧＦＰとＤＨＦＲの各々のメチオニン残基数が６個と５個である事実とよく一致する。さらに、質量分析の分布から、これらの含セレノメチオニンタンパク質に不純物として含まれる非標識タンパク質の割合は、約２％から約４％程度で、この値は図１および図２の実験値から得た上記計算値とよく一致するものであった。
以上、本発明により含セレノメチオニンタンパク質をそのタンパク質の活性を維持したまま且つ高い効率で合成することができることを示した。このことは、上記コムギ胚芽無細胞タンパク質合成反応においては、メチオニルｔＲＮＡ合成、４０Ｓリボソーム亜粒子と翻訳開始アミノアシルｔＲＮＡ（メチオニルｔＲＮＡ）複合体形成、ペプチド鎖伸長反応、および翻訳終止反応に関与する因子群のいずれも、セレノメチオニンをメチオニンと同様に認識してこのアミノ酸類似化合物をタンパク質に取り込む性質を保持していることを示している。
実施例２
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の重水素による標識を、コムギ胚芽抽出物を用いた無細胞タンパク質合成系を利用して行った。
コムギ胚芽は実施例１に記載の方法で調製した実質的に胚乳成分の夾雑がないものを用いた。また、コムギ胚芽からの抽出物の調製は実施例１と全く同じ方法で行った。ただし、抽出用溶液およびゲルろ過に使用する溶液は、セレノメチオニンを含む２０種類のＬ型アミノ酸の代わりに、重水素標識Ｌ型アミノ酸２０種類を含む。調製した抽出物の濃度は、１７０−２５０Ａ２６０ｎｍ（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．５）に調整した。
タンパク質合成反応液の組成は実施例１に記載したものと同じであるが、セレノメチオニンを含む２０種類のＬ型アミノ酸の代わりに重水素標識Ｌ型アミノ酸２０種類を含む。
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）合成のためのプラスミド、ｍＲＮＡ合成方法、タンパク質合成方法、および合成されたタンパク質の分析は、実施例１に記載の方法と同様に行った。
その結果を以下に示す。
図５に、２０種類のＬ型天然型アミノ酸をすべて重水素標識Ｌ型アミノ酸に置換したＤＨＦＲの一体型透析式無細胞タンパク質合成系における合成量を示した。反応開始後０、１２、２４、４８時間目にそれぞれ１μｌの反応液を採取してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行って該反応液中に含まれるタンパク質を検出した。図中、矢印は生成されたＤＨＦＲのバンドを示している。このバンドの染色強度をデンシトメーターにより測定したところ、ＤＨＦＲの合成が経時的にほぼ直線的に進行すること、さらに重水素標識ＤＨＦＲの合成量と天然型ＤＨＦＲのそれとの間に差が認められないことが判明した。このことから、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いる本発明に係る方法が重水素標識タンパク質の合成に有効な方法であると言える。４８時間合成反応を行った後に、メトトレキセートカラムを用いて精製した重水素標識ＤＨＦＲの収量は、３．５ｍｇであった。また、電気泳動における重水素標識ＤＨＦＲの移動度が天然型ＤＨＦＲよりも僅かながら低下していることが拡大した電気泳動図（実線部）および、その精製標品の泳動図からも確認できる。この重水素標識ＤＨＦＲにみられるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の移動度低下現象は、質量数の増加に起因するものと考えられ、重水素含有ＤＨＦＲが合成されていることを直接的に示している。
次に、精製した重水素標識ＤＨＦＲの酵素学的性質を実施例１と同様に生化学的に調べた。表２から明らかなように、天然型ＤＨＦＲと重水素標識ＤＨＦＲの酵素化学的性質を表すパラメーターであるＮＡＤＰＨに対するミカエリス定数（Ｋｍ）とＶｍａｘは、ともに両酵素の間で差は認められない。すなわち、重水素標識アミノ酸からなるＤＨＦＲは、天然型ＤＨＦＲとほぼ同等の酵素活性を保持していることが明らかとなった。
以上の結果から、本発明により２０種類のＬ型重水素標識アミノ酸含有タンパク質をそのタンパク質の活性を維持したまま且つ高い効率で合成することができることが確認できた。
産業上の利用可能性
本発明に係る標識タンパク質の製造方法によれば、純度が高い標識タンパク質を高い効率で製造できる。従って無細胞タンパク質合成システムを利用した本発明に係る標識タンパク質の製造方法はＸ線解析用の結晶標品調製手段として有用である。また、ここで記載した標識方法は、重水素含有タンパク質の調製にも同様に有用であり、さらにこの方法によって、任意のアミノ酸をそれに対応する同位体標識アミノ酸などで標識する一般的手段として利用できる。
さらに重要な点は、重水素のみならず１３Ｃ、１５Ｎなどの同位体標識タンパク質の調製に有効であり、タンパク質の構造解析に広く用いることができるものと期待できる。
このように本発明に係る標識タンパク質の製造方法は、タンパク質のＸ線結晶解析、核磁気共鳴解析、および中性子散乱法などによる高次構造解析用試料の調製、または同位体効果を利用するタンパク質の触媒機構の解明等に利用することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号１：５’非翻訳領域として用いられる設計されたポリヌクレオチド
配列番号２：５’非翻訳領域として用いられる設計されたポリヌクレオチド
配列番号３：５’非翻訳領域として用いられる設計されたポリヌクレオチド
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、セレノメチオニンで標識されたグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）のバッチ式無細胞タンパク質合成法による経時的な合成量を、１４Ｃ−ロイシンのタンパク質への取り込み（Ａ）と、オートラジオグラフィー〔（Ｂ）および（Ｃ）〕により調べた結果を示す。図１の（Ａ）において●―●および■―■は、セレノメチオニンを用いて行った合成反応系における含セレノメチオニンＧＦＰ合成量および含セレノメチオニンＤＨＦＲ合成量をそれぞれ示す。また、メチオニンを用いて行った合成反応系における天然型のＧＦＰ合成量およびＤＨＦＲ合成量は、それぞれ〇―〇および□―□で示した。メチオニンおよびセレノメチオニンを含まない合成反応系におけるＧＦＰ合成量およびＤＨＦＲ合成量はそれぞれ〇−−○および□−−□で示した。図１の（Ｂ）および（Ｃ）中で、ＭｅｔまたはＳｅ−ｍｅｔは、それぞれメチオニンまたはセレノメチオニンを取り込んだタンパク質を意味する。
図２は、透析式無細胞タンパク質合成法により４８時間合成して精製したＧＦＰ（Ａ）とＤＨＦＲ（Ｂ）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。図２の（Ａ）および（Ｂ）ともに、レーン２および３は天然型タンパク質を、レーン４および５は含セレノメチオニンタンパク質の泳動結果である。また、レーン２および４は合成反応後の溶液そのものの、レーン３および５は該溶液から精製したそれぞれのタンパク質の泳動結果を示す。レーン１は、対照としてタンパク質翻訳鋳型非存在下で合成反応を行った結果を示す。図中、矢印は生成されたタンパク質のバンドを示し、ＭＭは分子量マーカーを意味する。
図３は、精製した含セレノメチオニンＧＦＰの蛍光発光スペクトルを示した図である。
図４は、汎用性のある無細胞タンパク質合成用鋳型分子合成プラスミド（ｐＥＵ１）の構成を示す模式図である。
図５は、透析式無細胞タンパク質合成法により合成された重水素標識ＤＨＦＲと、４８時間合成後に精製したＤＨＦＲの電気泳動図である。図中、矢印は生成されたタンパク質のバンドを、各数字は反応時間を示す。また、”Ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ”および”Ｎａｔｕｒａｌ”は天然型アミノ酸を使ったときの、”Ｄｅｕｔｅｒａｔｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ”および”Ｄｅｕｔｅｒａｔｅｄ”は重水素標識Ｌ型アミノ酸を使ったときのＤＨＦＲ合成結果を示す。”Ｅｎｌａｒｇｅｄ”は拡大電気泳動図、”Ｐｕｒｉｆｉｅｄ”は精製されたＤＨＦＲの電気泳動図である。
本発明は、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成システムを利用した、セレノメチオニンによるタンパク質の標識手段、および重水素によるタンパク質の標識手段に関する。
背景技術
ゲノム計画の完了を間近に控えて、研究課題の中心が遺伝子構造解析から遺伝子機能解析へと急速に展開してきている。細胞内におけるタンパク質は、それが単独で機能しているのではなく、多種多様なタンパク質因子、核酸、低分子種や細胞膜成分等と協調して相互作用することにより機能発現し、さらに該相互作用の総和として生物学的機能が営まれているものと考えられている。ポストゲノム計画の中心課題の一つは、多種多様なタンパク質因子の複合体の構造と機能の関係を解析することである。ここから得られる成果は、構造生物学や生化学を含む基礎生物学などの研究から、その応用としての医学分野における遺伝子翻訳産物と病因との関係解明、さらには医薬の開発に至る広い分野に極めて重要な知見を提供することになると期待されている。
タンパク質の構造生物学的研究には、Ｘ線結晶解析法、ＮＭＲスペクトロスコピー法や中性子散乱法が用いられている。これらの方法を駆使するためには、それぞれ、重原子標識、同位体標識や重水素標識され且つ活性を保持したタンパク質を大量に調製することが必須である。従来のＸ線結晶解析法では、少なくとも２種類の結晶、すなわち天然型タンパク質の結晶と格子定数決定のためにこの結晶に重原子を侵入させた重原子標識結晶とが必要である。後者の結晶を得るには困難を伴うことが多く、このために前者の結晶化に成功しているにも拘わらず結晶構造が解明できない事例が多い。この解決方法として提案され、一部利用されている技術としてメチオニンのイオウ原子を重原子であるセレンに置換したセレノメチオニンを利用する方法がある。それは、目的とする遺伝子を培養細胞や大腸菌に導入してセレノメチオニンを含む培地中で培養することにより、該遺伝子がコードするタンパク質を発現させる遺伝子工学的手法を利用して、該タンパク質にセレノメチオニンを導入する方法である。
一方、ＮＭＲスペクトロスコピー法や中性子散乱法によるタンパク質立体構造解析および分子内における水分子の局在性分析には、タンパク質の水素原子を重水に置換することが必要である。この方法としては、目的とする遺伝子を大腸菌などの微生物に導入し、これらを重水素標識アミノ酸含有培地中で培養することにより遺伝子産物を発現させ、重水素標識タンパク質を調製する手段が用いられている。
含セレノメチオニンタンパク質は、該タンパク質から得られる１種類の結晶で構造解析が可能であるために有用であり、このことは既に実証されている。しかし、従来行われていたタンパク質のセレノメチオニン標識法には多くの欠点が存在する。それは、（１）メチオニンが細胞でタンパク質合成のみならず種々の代謝にも関与する必須アミノ酸であり、またセレンそれ自体が強い細胞毒性を示すので、培地中のメチオニンをすべてセレノメチオニンに入れ替えることはできず、そのため必要量の含セレノメチオニンタンパク質を調製するには大量培養が必要となること、（２）セレノメチオニンは高価であると同時に毒性が強いので、培養後のセレノメチオニンを高濃度に含む培地の廃棄方法に重大な問題が残されることである。
他方、タンパク質の重水素標識は、ＮＭＲスペクトロスコピー法や中性子散乱法によるタンパク質立体構造解析に必須な要件であるが、これまでは上記のように微生物の培養を利用する方法が唯一であった。この方法は、１）操作が煩雑、２）標識効率が低い、３）大量の重水素標識アミノ酸を必要とするためにコストが極めて高く、またその強い毒性により培地の廃棄方法に重大な問題が残される、などの解決しなければならない多くの欠点があった。
さらに同様の理由から、ＮＭＲスペクトロスコピー法に用いるための炭素１３（１３Ｃ）または窒素１５（１５Ｎ）で標識されたアミノ酸を含むタンパク質を調製する遺伝子工学的手法を用いた実用的な手段は開発されていない。
このような現状において、目的のタンパク質の活性を保持したままで該タンパク質分子中の所望のアミノ酸を所望のように標識化できる、効率がよく安価で且つ廃液量の少ない標識タンパク質の調製手段が待望されていた。
発明の開示
本発明の一態様は、コムギ胚芽抽出物から該胚芽抽出物に混入する胚乳を完全に除去して得た無細胞タンパク質合成用細胞抽出物中のメチオニンをセレノメチオニンに変えた後、メチオニンの代わりにセレノメチオニンを含むタンパク質合成反応液組成を使って、バッチ条件下または透析条件下で、無細胞タンパク質合成を行うことを特徴とするセレノメチオニン標識タンパク質の製造方法である。
また本発明の一態様は、上記製造方法で得たセレノメチオニン標識タンパク質である。
さらに本発明の一態様は、コムギ胚芽抽出物から該胚芽抽出物に混入する胚乳を完全に除去して得た無細胞タンパク質合成用細胞抽出物中の天然型アミノ酸を重水素標識アミノ酸に変えた後、天然型アミノ酸の代わりに重水素標識アミノ酸を含むタンパク質合成反応液組成を使って、バッチ条件下または透析条件下で、無細胞タンパク質合成を行うことを特徴とする重水素含有アミノ酸標識タンパク質の製造方法である。
さらにまた本発明の一態様は、上記製造方法で得た重水素含有アミノ酸標識タンパク質である。
発明を実施するための最良の形態
本発明に係る標識タンパク質の製造方法は、無細胞タンパク質合成システムを利用したものである。該製造方法は標識タンパク質の合成効率が高く、且つ純度が高い標識タンパク質を提供し得るという利点を有し、またこれらの利点のために廃液量が少ない。従って本発明に係る標識タンパク質の製造方法は、従来法と比較して極めて優れた方法である。
本発明において、無細胞タンパク質合成システムで用いる細胞抽出物は、コムギ胚芽抽出物、好ましくは胚乳成分の夾雑が実質的に完全に排除されているコムギ胚芽抽出物である。該コムギ胚芽抽出物は、その原料として後述する実施例１に示した方法で得ることのできる、白色を呈する小傷部分をもつ胚芽および茶や黒などの色をもつ胚芽を完全に除去した黄色の胚芽のみからなるコムギ胚芽を原料として調製したものが特に好ましい。
タンパク質をセレノメチオニン標識するときは、コムギ胚芽抽出物中のメチオニンをセレノメチオニンに置換する。置換の方法は、具体的には後述する実施例に記載する。例えば、予めメチオニンを除いてセレノメチオニンを添加した２０種類のアミノ酸混合液（１９種類のアミノ酸とセレノメチオニンとを含む溶液）を含む抽出用溶液を用いてまずコムギ胚芽から抽出物を調製する。または従来どおりの２０種類全てのアミノ酸を含む抽出用溶液を用いてコムギ胚芽から抽出物を調製してもよい。次いでこの胚芽抽出物のゲルろ過を、メチオニンを除いた１９種類のアミノ酸にセレノメチオニンを追加した２０種類のアミノ酸を含む溶液を用いて行い、メチオニンの代わりにセレノメチオニンを含むコムギ胚芽抽出物を調製する。
タンパク質を重水素標識するときは、コムギ胚芽抽出物中の天然型アミノ酸を重水素標識アミノ酸に置換する。置換の方法は、具体的には後述する実施例に記載する。例えば、標識したい天然型アミノ酸を予め除きその代わりに重水素標識した当該アミノ酸を添加した抽出用溶液、または２０種類の重水素標識アミノ酸混合液を含む抽出用溶液を用いてコムギ胚芽から抽出物を調製する。次いでこのコムギ胚芽抽出物のゲルろ過を、目的とする重水素標識アミノ酸を含む溶液または２０種類の重水素標識アミノ酸混合液を含む溶液で平衡化したゲルろ過カラムで行い、抽出物中のアミノ酸のうち目的とするアミノ酸または２０種類のすべてのアミノ酸を重水素標識アミノ酸と交換したコムギ胚芽抽出物を調製する。
本発明において使用するタンパク質合成反応液組成は、セレノメチオニン標識タンパク質を得るときには、従来既知の無細胞タンパク質合成系（無細胞タンパク質合成のための反応系）で使用される組成においてメチオニンをセレノメチオニンに置き換えたものであり得る。例えば、該反応液は、容量の２４％のコムギ胚芽抽出液（濃度は、２００Ａ２６０ｎｍ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）に対して、１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ）、３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、９５ｍＭ 酢酸カリウム、２．６５ｍＭ 酢酸マグネシウム、２．８５ｍＭ ジチオスレイトール、０．５ｍｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ、１．２ｍＭ アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、０．２５ｍＭ グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、１６ｍＭ クレアチンリン酸、０．３８０ｍＭ スペルミジン、メチオニンの代わりにセレノメチオニンを含む２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）、０．０５％ ＮＰ−４０等を加えてなる。
また、重水素標識タンパク質を得るときは、上記同様に従来既知の無細胞タンパク質合成系で使用される組成において、標識したい天然型アミノ酸を重水素標識した当該アミノ酸に、または２０種類のアミノ酸全てを重水素標識アミノ酸に置き換えたものを用いればよい。
このタンパク質合成反応溶液に、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡを添加してタンパク質合成を行う。ｍＲＮＡは自体公知の方法で調製したものが使用できるが、本発明においては、タンパク質合成の翻訳鋳型となるｍＲＮＡの合成を行うために、遠藤が構築した汎用性のあるプラスミド（ｐＥＵ）を利用した（図４を参照）。このプラスミドは、▲１▼プロモーター機能を担持した塩基配列と、▲２▼その下流にあたる領域に少なくともアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）リーダー配列、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ＲＮＡの５’末端非翻訳配列（５’ＵＴＲ）に存在するオメガ（Ｏｍｅｇａ）（Ω）配列、配列表の配列番号１若しくは２若しくは３に記載の塩基配列、またはこれらの配列と７０％以上の相同性を有し且つＣＡＰ構造が存在するｍＲＮＡの翻訳開始活性と比較して約７０％以上の翻訳開始活性を有するｍＲＮＡを与えうる塩基配列の、転写鋳型となる塩基配列と、▲３▼その下流にあたる領域に複数の制限酵素切断部位と、▲４▼ＯＲＦ（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）の終止コドンの下流にあたる領域に少なくとも５００塩基以上からなる３’末端非翻訳配列（３’ＵＴＲ）とが配置されていることを特徴とする無細胞タンパク質合成系において鋳型として用いるプラスミドである。このプラスミドから転写されたｍＲＮＡは、その５’末端非翻訳配列にＡＭＶリーダー配列、ＴＭＶΩ配列、または配列表の配列番号１若しくは２若しくは３に記載の塩基配列を有し、且つ長い３’末端非翻訳配列を有するため、安定で且つ翻訳効率が高い。配列表の配列番号１若しくは２若しくは３に記載の塩基配列は、５’末端非翻訳配列として用いるためにＡＭＶリーダー配列およびＴＭＶΩ配列に基づいて設計して得たポリヌクレオチドである。
このプラスミドを環状型のままで用いると、該プラスミドには特別な転写終結部位を挿入していないので、転写産物であるｍＲＮＡは種々の分子サイズのｍＲＮＡとして合成される。転写終結部位を規定するターミネーター機能を担持する配列をプロモーター領域の上流に配置し、転写産物の分子サイズを一定にすることもできる。また、このプラスミドを転写反応に先だって制限酵素で切断して開環し、直鎖型プラスミドとして用いてもよい。
本発明において翻訳鋳型として用いるｍＲＮＡは、上記プラスミドを利用して調製したものであってもよいし、また自体公知の方法を用いて得たものであってもよい。
安定で且つ翻訳効率の高いｍＲＮＡとして、その５’末端側に上記ＡＭＶリーダー配列やＴＭＶΩ配列、または次のようなウイルスが持つ５’末端非翻訳配列（５’ＵＴＲ）が配置されたｍＲＮＡを使用することが好ましい；タバコエチウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ）（ＥＴＶ）〔Ｎｉｅｐｅｌ，Ｍ．ａｎｄ Ｇａｌｌｉｅ，Ｄ．Ｒ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３，９０８０−９０８８〕〔Ｋａｗａｒａｓａｋｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１６，５１７−５２１〕、タバコベインモトリングウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｖｅｉｎ Ｍｏｔｔｌｉｎｇ Ｖｉｒｕｓ）、ポテトウイルス（Ｐｏｔａｔｏ Ｖｉｒｕｓ）プラムポックスウイルス（Ｐｌｕｍ Ｐｏｘ Ｖｉｒｕｓ）。また、下記のウイルスの５’末端に存在するインターナルリボゾーマルエントリーサイト（ＩＲＥＳ）配列も、上記５’末端非翻訳配列として使用可能である；エンセファロミィオカルディティスウイルス（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、セイラーズムリンエンセファロミィオカルディティスウイルス（Ｔｈｅｉｌｅｒ’ｓ Ｍｕｒｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、口蹄疫ウイルス（Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−Ｍｏｕｔｈ Ｖｉｒｕｓ）、クラシカル豚熱ウイルス（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ Ｓｗｉｎｅ Ｆｅｖｅｒ Ｖｉｒｕｓ）、ボバインヴァイラルダイアリアウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ Ｖｉｒａｌ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ）。
また、安定で且つ翻訳効率の高いｍＲＮＡを構築するために、その３’末端側に配置する非翻訳配列として、例えばトマトブッシースタントウイルス（Ｔｏｍａｔｏ Ｂｕｓｈｙ Ｓｔｕｎｔ Ｖｉｒｕｓ）〔Ｗｕ，Ｂ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｋ．Ｄ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３，８９８２−８９８８〕のものを使用することができる。
さらにまた、サテライトタバコネクロシスウイルス（Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）〔Ｔｉｍｍｅｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，９５０４−９５１０〕およびバーレイイエロードウォーフルテオウイルス（Ｂａｒｌｅｙ Ｙｅｌｌｏｗ Ｄｗａｒｆ Ｌｕｔｅｏ Ｖｉｒｕｓ）〔Ｇｕｏ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ７，１１０３−１１０９〕では、５’末端非翻訳配列と３’末端非翻訳配列の相互作用により効率的な翻訳反応が行われることが知られており、目的とするｍＲＮＡの構築にこれらの５’末端非翻訳配列と３’末端非翻訳配列を使用してもよい。
また、ランダム配列のＲＮＡプールから、既報〔Ｏｗｅｎｓ，Ｇ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｓｃｉ．９８，１４７１−１４７６〕〔Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ，Ａ．ａｎｄ Ｄａｓｇｕｐｔａ，Ａ．，（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１，２８２６−２８３７〕に記載の方法に従って効率のよい翻訳機能を持った配列をスクリーニングして得て、その配列をｍＲＮＡの構築に利用することも可能である。また、これら文献に記載の塩基配列をｍＲＮＡの５’末端非翻訳配列または３’末端非翻訳配列として利用することもできる。
また、ｍＲＮＡを構築するときに鋳型として用いるＤＮＡは環状のプラスミドＤＮＡに限らず、ＰＣＲで増幅した直鎖状の二重鎖ＤＮＡも使用できる。この場合、転写反応のプロモーターにはＴ７ＲＮＡポリメラーゼのものを用い、それに続きＥＴＶの５’非翻訳領域、目的とするタンパク質の遺伝子と最後にＴ７ＲＮＡポリメラーゼターミネーター配列を配置した遺伝子をＴ７ＲＮＡポリメラーゼで転写し、ｍＲＮＡを調製してもよいし、調製後引き続き無細胞タンパク合成系にて反応させてもよい。
本発明においてタンパク質合成は、上記方法で調製したコムギ胚芽抽出物およびタンパク質合成反応液を用いて、無細胞タンパク質合成法により行う。当該無細胞タンパク質合成は、従来通りバッチ式で行うことができる。また、目的の遺伝子を挿入した上記プラスミドを用いて、ｍＲＮＡ合成（転写）とタンパク質合成（翻訳）とを連続して同一容器内で行うことが可能な透析法や限外ろ過膜を利用した一体型無細胞タンパク質合成システムで行うこともできる。以下に一体型無細胞タンパク質合成システムとバッチ式による無細胞タンパク質合成法とについて説明する。
バッチ式無細胞タンパク質合成法は、ｍＲＮＡ合成反応を行って得られたｍＲＮＡを、無細胞タンパク質合成反応に加え、反応を開始してから該反応が終了するまでの１回の反応によるタンパク質合成を意味する。ｍＲＮＡ合成は自体公知の方法を用いて得ることができるし、上記プラスミドを利用して合成してもよい。タンパク質合成は、コムギ胚芽抽出物を利用した無細胞タンパク質合成に関する遠藤の既報告〔Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０〕〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９〜５６４（２０００）〕に記載の方法に準じて行なうことができる。
一方、一体型透析式無細胞タンパク質合成システムでは、上記プラスミドに目的の遺伝子を挿入し、これを環状型のまま、または直鎖型にしてＲＮＡ合成反応液に添加し、摂氏２３〜３７度好ましくは摂氏３０度で５分程度好ましくは１０分間の予備反応を行う。この予備反応段階は所望により省略してもよいが、この予備反応段階で鋳型ＤＮＡのプロモーター領域にＲＮＡポリメラーゼが結合して転写開始反応が効率的に進行するために次の保温段階におけるｍＲＮＡ合成量が増加して、その結果翻訳反応段階におけるタンパク質の合成量が増加するので、好適には行った方がよい。ＲＮＡ合成反応液は、鋳型ＤＮＡ、４種類の基質リボヌクレオシド−５’−３リン酸、さらに必要に応じてＣＡＰ分子、ＲＮＡポリメラーゼ、スペルミジン、マグネシウムイオンおよび適当な緩衝液などからなる。具体的には、例えば８０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、１６ｍＭ 酢酸マグネシウム、２ｍＭ スペルミジン、１０ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２．５ｍＭの各ヌクレオシド−５’−３リン酸〔ＮＴＰ；ＡＴＰ、ＧＴＰ、ウリジン−５’−３リン酸（ＵＴＰ）、シチジン−５’−３リン酸（ＣＴＰ）〕、リボヌクレアーゼ阻害剤（１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（３，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）からなるＲＮＡ合成反応液を用いることができる。なお５’末端にＣＡＰ構造を有するＲＮＡを合成する場合は、この溶液に５ｍＭの７ｍＧｐｐｐＧを追加すればよい。
次に、上記プラスミドを含むＲＮＡ合成反応液と上記タンパク質合成反応液（セレノメチオニン標識タンパク質の調製にはメチオニンの代わりにセレノメチオニンを添加したものを、また重水素標識タンパク質の調製には天然型アミノ酸の代わりに重水素標識アミノ酸を含むもの）を混合する。この混液を透析膜チューブに移した後、これを予め準備しておいたタンパク質合成用透析外液（上記メチオニンの代わりにセレノメチオニンを添加したもの、または重水素標識タンパク質の調製には天然型アミノ酸の代わりに重水素標識アミノ酸を含むもの）を満たした容器に浸す。反応を摂氏３０度で約３時間静置条件下で行うことによって、まず主にｍＲＮＡが合成される。
次の段階として、反応温度を摂氏２６度に低下させて、透析しながら静置条件下で反応を持続させる。この過程で透析膜内の低分子、特にｍＲＮＡ合成の至適濃度に合わせて高濃度に設定しておいたＡＴＰ、ＧＴＰやマグネシウムイオンの濃度が透析の進行とともに低下し、タンパク質合成反応液（前記メチオニンの代わりにセレノメチオニンを添加したもの、または、重水素標識タンパク質の調製には天然型アミノ酸の代わりに重水素標識アミノ酸を含むもの）からなる透析外液濃度に近づき、やがて透析膜内の溶液成分はタンパク質合成反応の至適濃度に達する。
これに伴ってタンパク質合成反応が促進され、その反応速度が最大となり、タンパク質が合成される。この無細胞タンパク質合成反応は６０時間以上にわたって持続し、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を合成したとき、反応容量１ｍｌ当り４ｍｇ程度のタンパク質を得ることができた。
透析膜を利用するこのシステムには、環状型、直鎖型のいずれのプラスミドも用いることができる。しかし、合成収量とコストを考慮して、環状型プラスミドを用いることが好ましい。また翻訳開始活性を促進するＣＡＰの存在下、非存在下のいずれの条件下でも、このシステムは実施可能である。しかし、ｍＲＮＡ合成に使用するＣＡＰ自身がタンパク質合成に必要な因子に強く結合してこれを阻害しタンパク質合成の効率が低くなるため、ＣＡＰ非存在下で行うことが実用的である。
さらに、限外ろ過膜を利用した、ｍＲＮＡ合成後に引き続いて無細胞タンパク質合成を同一容器内で行う転写と翻訳とを一体化した無細胞タンパク質合成システムによっても上記同様に、タンパク質のセレノメチオニン標識および重水素含有アミノ酸標識を行うことができる。
まず、上記プラスミドを鋳型として、限外ろ過膜を備えたスピンカラムを用いた透析法でｍＲＮＡを合成する。合成反応は上記ＲＮＡ合成反応液を用いて摂氏３０〜３７度で行い、反応時間は必要なＲＮＡ合成量に応じて決定されるが、通常の場合はおおよそ３〜５時間でよい。また、ここで用いるスピンカラムに備えられた限外ろ過フィルターの分子量カットサイズは、合成されたＲＮＡとＲＮＡ合成のための基質や合成の副生成物などの低分子物質との分離が可能な孔径であれば特に限定されないが、５，０００〜１００，０００であることが好ましい。それらフィルターの孔径は、１０〜５０オングストロームである。
反応終了後に反応容器であるスピンカラムを遠心して洗浄することにより、純化されたｍＲＮＡをフィルター上に補集する。次に、コムギ胚芽抽出物を含む上記無細胞タンパク質合成反応液を同スピンカラムに添加し、上記無細胞タンパク質合成反応液からなる透析外液（メチオニンの代わりにセレノメチオニンを含む２０種類のＬ型アミノ酸、または天然型アミノ酸の代わりに重水素標識アミノ酸を含む２０種類のＬ型アミノ酸を含有する）を満たした容器に浸して摂氏２３度で無細胞タンパク質合成反応を開始し、静置条件下で反応させる。
このシステムにより得られるタンパク質合成収率は、透析膜を用いる前記のシステムによる収量とほぼ同程度である。また、スピンカラムのフィルター上のｍＲＮＡをフィルターのまま、前記透析膜を利用するシステムにおいて透析チューブに投入することによってもタンパク質合成が可能である。さらに本発明において、ＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡについても全く同様にその合成および精製に続いて効率的なタンパク質合成反応を行うことができる。
限外ろ過膜を利用するシステムには、環状型、直鎖型のいずれのプラスミドも用いることができ、またＣＡＰ存在下、非存在下のいずれの条件下でも、このシステムは実施可能である。５’末端にＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡを用いる方がタンパク質合成収量は高いが、直鎖型プラスミドから合成した５’末端にＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡと環状型プラスミドからＣＡＰ非存在下に合成したｍＲＮＡとの両者の合成収量に大きな差はなく、コストを考慮するとＣＡＰ非存在下に環状型プラスミドを用いることが好ましい。
前記２つの一体型無細胞タンパク質合成システムは、いずれもまずｍＲＮＡ合成を行いその後引き続いてタンパク質合成を同一の反応容器内で行う連続式システムであり、転写・翻訳非共役システムである。これらのシステムでは、少なくともタンパク質合成反応の翻訳鋳型となるｍＲＮＡ、エネルギー再生系酵素、基質（メチオニンの代わりにセレノメチオニンを含む２０種類のＬ型アミノ酸、または天然型アミノ酸の代わりに重水素標識アミノ酸を含む２０種類のＬ型アミノ酸）、およびエネルギー源から選ばれた１種または２種以上の要素について、反応開始後、要時にまたは継続的に追加して添加する手段を導入してもよい。これらは、極少量を継続的に添加してもよいし、一定時間ごとに添加してもよい。また、これらのシステムでは、上記無細胞タンパク質合成反応に必要な物質を、該合成反応の効率を維持するために、該合成反応の開始後に反応途中で交換する処置を導入してもよい。例えば、無細胞タンパク質合成反応液（メチオニンの代わりにセレノメチオニンを含む２０種類のＬ型アミノ酸、または天然型アミノ酸の代わりに重水素標識アミノ酸を含む２０種類のＬ型アミノ酸）からなる透析外液の所望の量を、継続的または断続的に交換する手段を導入できる。
さらに、これらのシステムは、上記無細胞タンパク質合成反応に必要な物質を追加添加または交換するために、必要とする物質を保存しておく手段を備えていてもよい。さらにまた、これらのシステムは、無細胞タンパク質合成反応の副生成物を該合成反応から除くための排出手段を備えていてもよい。必要とする物質や副生成物の追加、保存、交換、および／または排出のための手段は１種または２種以上を選択し、組み合わせて導入することが可能である。
また、これらのシステムにおいて、反応容器中の反応液が接する面のうち少なくとも透析手段または分子篩手段に関与する面、例えば透析膜または限外ろ過膜にタンパク質コーティングを予め施せば、タンパク質合成の効率がさらに向上する。すなわち、タンパク質を用いたコーティング処理により、ｍＲＮＡ転写の効率およびそれに続いて起こるタンパク質翻訳の効率を上昇させることができる。コーティングに用いるタンパク質は、アルブミンが例示されるが必ずしもこれに限定されない。また、コーティングに用いるタンパク質は、透析手段または分子篩手段に関与する面に格別に固定しておく必要はなく、タンパク質含有溶液で数回洗浄することでも効果が得られる。この方法は簡便であり好ましいがこれに限定されるものではない。例えば、透析膜をアルブミンでコーティングする場合、内液として水とアルブミンとの混合溶液を用い、外液として水を使用して数時間透析を行えばよい。むろん、内液と外液の組成が逆であってもよい。コーティング用タンパク質含有溶液の濃度は格別限定されないが、溶解飽和濃度であれば十分であり、それ以下でもよい。
なお、本発明においては、コムギ胚芽抽出物を使用して前記の一体型またはバッチ式無細胞タンパク質合成を行う場合、タンパク質合成反応は反応液を撹拌することのない静置条件下で行うことが好ましい。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１
グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）のセレノメチオニンによる標識を、コムギ胚芽抽出物を用いた無細胞タンパク質合成法により行った。
コムギ胚芽抽出物の調製および該コムギ胚芽抽出物を用いた無細胞タンパク質合成法は既報（Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００），９７，５５９〜５６４）に準じて行った。
まず、コムギ胚芽をジョンストンらの方法（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｆ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９５７）Ｎａｔｕｒｅ，１７９，１６０−１６１）を改良した方法で得た。まず、北海道産のチホクコムギ種子（未消毒）を１分間に１００ｇの割合でミル（Ｆｒｉｔｓｃｈ社製Ｒｏｔｏｒ Ｓｐｅｅｄ Ｍｉｌｌ ｐｕｌｖｅｒｉｓｅｔｔｅ １４型）に添加し、回転数８，０００ｒｐｍで種子を温和に破砕した。これを再度６，０００ｒｐｍで破砕し、篩で粗胚芽画分（メッシュサイズ０．７１ｍｍ〜１．００ｍｍ）を得た後、該胚芽画分に混在する種皮などの不純物をポリエチレン板などの静電気帯電体を用いて吸着除去した。
さらに胚芽粒子を篩と静電気帯電体を用いて、小粒（０．７１ｍｍ〜０．８５ｍｍ）、中粒（０．８５ｍｍ〜１ｍｍ）、軽粒（０．８５ｍｍ〜１ｍｍで且つ軽量）の３画分に分別し、最後に肉眼による分別を行って黄色の胚芽を採取した。小粒画分が最も高いタンパク質合成活性を示した。軽粒は、種子破砕時に胚芽に生じた小傷胚芽が浮選操作中に破壊が進行したものであると推察される。次に、このようにして得た黄色の胚芽からなる試料からコムギ胚乳成分を完全に除去するため、ガーゼに得られたコムギ胚芽を入れて冷却しながら冷蒸留水（ＤＤＷ）で洗浄した後に非イオン性界面活性剤であるＮＰ−４０の０．５％溶液に懸濁し、超音波洗浄器を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄を繰り返した。蒸留水の存在下に再度１回の超音波洗浄後、吸引ろ過によってコムギ胚芽を収集し、それを冷蒸留水（ＤＤＷ）で何度も洗浄してコムギ胚芽を純化した。かくして純化されたコムギ胚芽は、コムギ胚芽に夾雑する内因性のタンパク質合成阻害因子、トリチン、チオニン、およびリボヌクレアーゼなどが実質的に除去されたもの、すなわち実質的に胚乳成分の夾雑が無いものであった。
コムギ胚芽からの抽出物の調製は常法（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６，３８−５０）に準じた。以下の操作は摂氏４度で行う。上記純化コムギ胚芽を液体窒素で凍結して乳鉢中で粉砕し、得られた粉体１ｇ当たり１ｍｌのパターソンらの方法を一部改変した抽出用溶液（８０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、２００ｍＭ 酢酸カリウム、２ｍＭ 酢酸マグネシウム、４ｍＭ 塩化カルシウム、８ｍＭ ジチオスレイトール、各０．６ｍＭのメチオニンを除くＬ型アミノ酸１９種類、各１μＭのタンパク質分解酵素阻害剤であるＦＵＴ、Ｅ−６４およびＰＭＳＦを含む）を加えて、泡が発生しないように注意しながら撹拌した。その後、３０，０００ｇで１５分間遠心処理し、その上清を胚芽抽出物として回収して、予め溶液（４０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ 酢酸カリウム、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、４ｍＭ ジチオスレイトール、メチオニンを除くＬ型１９種類アミノ酸にセレノメチオニンを補った２０種類のアミノ酸）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カラム（Ｃｏａｒｓｅ）でゲルろ過を行った。または、上記抽出用溶液の代わりに、従来どおりの２０種類全てのアミノ酸を含む抽出用溶液を用いて上記同様に胚芽抽出物を調製した。この場合は、ゲルろ過操作を予めメチオニンを除いた１９種類のアミノ酸を含むゲルろ過溶液で平衡化したゲルろ過カラムで行い、得られたメチオニンを含まないコムギ胚芽抽出物にセレノメチオニンを補足してコムギ胚芽抽出物を調製した。試料の濃度は、１７０〜２５０Ａ２６０ｎｍ（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．５）に調整した。
タンパク質合成反応液は、容量の２４％のコムギ胚芽抽出液（濃度は、２００Ａ２６０ｎｍ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ）、３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、９５ｍＭ 酢酸カリウム、２．６５ｍＭ 酢酸マグネシウム、２．８５ｍＭ ジチオスレイトール、０．５ｍｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ、１．２ｍＭ ＡＴＰ、０．２５ｍＭ ＧＴＰ、１６ｍＭ クレアチンリン酸、０．３８０ｍＭ スペルミジン、メチオニンの代わりにセレノメチオニンを含む２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）、０．０５％ ＮＰ−４０からなるものを用いた。
ｇｆｐ ｍＲＮＡまたはｄｈｆｒ ｍＲＮＡ合成用プラスミドは、プラスミドｐＰＳＰ６５を基にして、ＳＰ６プロモーターまたはＴ７プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼが結合する塩基配列を挿入し、その下流にｍＲＮＡの翻訳開始反応に重要な機能を持つＡＭＶ−Ω配列の転写鋳型となる塩基配列を挿入し、さらにその下流にｇｆｐ遺伝子またはｄｈｆｒ遺伝子を導入し、３’末端にｇｆｐまたはｄｈｆｒ遺伝子由来の３’ＵＴＲとポリ（Ａ）１００をコードする配列とを挿入して作成した（図４）。このプラスミドは、ポリ（Ａ）配列下流に導入した制限酵素部位（ＨｉｎｄＩＩＩ部位）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して開環し、直鎖型プラスミドＤＮＡとして用いた。
上記直鎖型プラスミドからｍＲＮＡを転写するために、反応容器は容器底部が透析フィルターからなるミクロスピンカラム（アミコン社製ＹＭ−１０）を用いた。この直鎖型プラスミドＤＮＡを含むＲＮＡ合成反応液｛８０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、１６ｍＭ 酢酸マグネシウム、２ｍＭ スペルミジン、１０ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２．５ｍＭの各ヌクレオシド−５’−３リン酸〔ＮＴＰ；ＡＴＰ、ＧＴＰ、ウリジン−５’−３リン酸（ＵＴＰ）、シチジン−５’−３リン酸（ＣＴＰ）〕、リボヌクレアーゼ阻害剤（１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（３，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）｝を摂氏３７度で２時間保温することによってｍＲＮＡを合成した。なおＹＭ−１０は、牛血清アルブミンでコーティング処理して用いた。
反応終了後にこの反応容器（ミクロスピンカラム）を遠心処理した。遠心処理により、溶液中のヌクレオチド３リン酸やＣＡＰなどの基質、副生成物のピロリン酸、イオン、および緩衝液などの低分子はフィルター孔を通して除去され、合成されたｍＲＮＡなどの高分子はフィルター上に留まる。溶液に水を加えてこの操作を数回繰り返し、合成されたｍＲＮＡ画分からピロリン酸などの低分子のタンパク質合成阻害物質を完全に除き、合成されたｍＲＮＡをフィルター上に捕集した。なお、この純化操作において鋳型ＤＮＡは除去されずにフィルター上に残るが、翻訳反応に対する阻害作用は示さなかった。
ｍＲＮＡは、該ｍＲＮＡが捕集されたフィルターから水溶液として回収するかまたはフィルター上に捕集したままで、無細胞タンパク質合成系に使用した。
かくして得られたｍＲＮＡを、上記無細胞タンパク質合成反応液に添加してバッチ式または一体型無細胞タンパク質合成系タンパク質合成を行った。水溶液として回収したｍＲＮＡを使用するときは、上記無細胞タンパク質合成反応液に０．２μＭとなるように添加した。タンパク質合成反応、すなわち翻訳反応は摂氏２６度で静置反応条件下で行った。
バッチ式無細胞タンパク質合成法におけるＧＦＰとＤＨＦＲの合成量は放射性同位体のトリクロル酢酸不溶画分への取り込みにより測定し、さらに合成されたタンパク質をオートラジオグラフィーで分析した。
透析法で大量に合成したタンパク質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法およびクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色法により検出した〔Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０〕〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９〜５６４（２０００）〕。
ＧＦＰの精製と蛍光分光光度計を用いた発光スペクトルの分析による活性測定はＤｅｓｃｈａｍｐｓらの方法〔Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，６，５５５−５５８〕に準じて行った。発光スペクトル測定には島津ＲＦ−５０００型蛍光光度計を用いた。ＤＨＦＲ活性はＳｔａｎｌｅｙらの方法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８，１９５−１９９（１９７１）〕で測定した。
その結果を以下に示す。
図１に、メチオニンをセレノメチオニンに置換したタンパク質合成反応系においてバッチ式でＧＦＰとＤＨＦＲを合成したときのそれぞれの合成量（Ａ）と、それぞれの合成産物をオートラジオグラフィーで分析した結果〔（Ｂ）および（Ｃ）〕を示した。図１の（Ｂ）はＧＦＰ、図１の（Ｃ）はＤＨＦＲについての結果を示し、図中のＭｅｔ（メチオニン）は天然型タンパク質を、Ｓｅ−ｍｅｔ（セレノメチオニン）は含セレノメチオニンタンパク質を意味する。オートラジオグラムから明らかなように、含セレノメチオニンＧＦＰおよび含セレノメチオニンＤＨＦＲは共にそれぞれのメチオニンを含む天然型タンパク質と同じ電気泳動移動度を示した。また、経時的にバンドが濃くなっていることから反応時間の経過とともにこれらの合成量が増加していることがわかる。図１の（Ａ）に示したように、メチオニンをセレノメチオニンに置換した合成反応系における含セレノメチオニンＧＦＰ合成（●―●）は対照の天然型ＧＦＰ合成（○―○）に比べて２０−２５％程度の合成量の低下が見られるものの、含セレノメチオニンＧＦＰが効率よく合成されることが分かる。含セレノメチオニンＤＨＦＲ合成（■―■）と対照の天然型ＤＨＦＲ合成（□―□）についても同様の結果が得られた。
一方、メチオニンおよびセレノメチオニンの両者を含まない反応系における実験では、合成反応が１時間で完全に停止した（○−−○）。この間に合成されたＧＦＰは、セレノメチオニン存在下で４時間のバッチ式反応で合成された含セレノメチオニンＧＦＰ量の約１２％に当たる。このことは、ゲルろ過操作で除去できずに胚芽抽出物中に残存していたメチオニンが反応開始後の１時間タンパク質合成に利用されたことを示している。さらにこのことは、セレノメチオニン存在下にバッチ式で合成されたＧＦＰ量の１２％は含メチオニンＧＦＰであり、８８％が含セレノメチオニンＧＦＰであることを示している。後述するように、透析式無細胞タンパク質合成システムにおける大量合成においては、含セレノメチオニンＧＦＰ合成が持続してその含有量が増加するとともに天然型ＧＦＰの混入量の割合は低下するため、現実的には無視できる微量となる。同様の知見は、ＤＨＦＲ遺伝子を鋳型とした含セレノメチオニンＤＨＦＲ合成においても確認できた〔図１の（Ａ）〕（□−−□）。
次に、一体型透析式無細胞タンパク質合成法を用いて、含セレノメチオニンＧＦＰおよび含セレノメチオニンＤＨＦＲの多量合成を行い、これらの反応液からタンパク質を精製した。図２には、この方法により４８時間の反応で合成し精製したＧＦＰ（Ａ）とＤＨＦＲ（Ｂ）のそれぞれの天然型（レーン２と３）および含セレノメチオニンタンパク質（レーン４と５）のＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動図を示した。図中の矢印はそれぞれのタンパク質のバンドを示す。図２から天然型および含セレノメチオニンタンパク質ともに添加した鋳型に依存して効率よく合成されていることが分かる。レーン１は対照として鋳型非存在下で反応させた反応液の電気泳動パターンである。ＧＦＰ、ＤＨＦＲ共に一体型透析式無細胞タンパク質合成法での合成効率が高いために反応液中のこれらの産物含有量が高くなるので、常法によって簡便に精製することが可能である（レーン３および４）。図２の（Ｂ）に示したＤＨＦＲの例では、メトトレキセートをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィー法で精製したところ、１回のクロマトグラフィー操作によって天然型と含セレノメチオニンＤＨＦＲ共にその純度が１００％に近い試料を調製することができた（レーン３および４）。
さらにこのレーン３および４に示した実験結果は、含セレノメチオニンＤＨＦＲが天然型ＤＨＦＲと同様に、リガンドであるメトトレキセートに対して強い親和性を有することを示している。このことは、合成した含セレノメチオニンＤＨＦＲが天然型ＤＨＦＲと同様の酵素活性を有することを意味しているものと考えられる。
さらに重要な点は、一体型透析式無細胞タンパク質合成法で上記のように得られた合成タンパク質中のセレノメチオニン含有量がきわめて高いことである。言い換えれば、得られる含セレノメチオニン非天然型タンパク質が高純度であるということである。図１で示したセレノメチオニン存在下における反応４時間後に合成されたＧＦＰとＤＨＦＲ中のセレノメチオニン含有量とメチオニンおよびセレノメチオニン非存在下における合成カイネティクスの結果とにより、セレノメチオニン含有量を計算することができる。バッチ式反応４時間後に合成されたタンパク質量は、反応液１ｍｌ当りＧＦＰは０．４ｍｇ、ＤＨＦＲは０．４５ｍｇであり、これらタンパク質のメチオニン残基の少なくとも約８０％がセレノメチオニン（含メチオニンタンパク質の割合は最大で約２０％程度）であることから、含メチオニンＧＦＰ量は、０．０８ｍｇ、また、含メチオニンＤＨＦＲ量は０．０９ｍｇと計算できる。一方、一体型透析式無細胞タンパク質合成系での４８時間反応後の合成量は、ＧＦＰおよびＤＨＦＲそれぞれ２．８ｍｇおよび３．１ｍｇであった。すなわち、一体型透析式無細胞タンパク質合成系によって大量調製した含セレノメチオニンタンパク質の純度は、上述のように計算すると、ＧＦＰおよびＤＨＦＲともに９７．１％であった。
このように、本発明によるセレノメチオニンのタンパク質への導入率は従来行われていた方法に比べてはるかに高い。従来利用されていたセレノメチオニンのタンパク質への導入法は大腸菌を大量培養して行うものであるが、その導入率は最大でも５３％であることが報告されている〔Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（１９６７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４１，５８７−５９９〕。従って、本発明に係る非天然型アミノ酸導入法は従来法と比較して極めて優れている。
次に、精製したこれら含セレノメチオニンタンパク質の酵素学的性質を生化学的に調べた。図２に示した精製ＧＦＰ標品の一定濃度を波長３９５ｎｍで励起したときの蛍光発光スペクトルを、４１０ｎｍから６００ｎｍの範囲で測定し、その結果を図３に示した。図３から明らかなように、天然型である含メチオニンＧＦＰ〔図３の（Ａ）〕と含セレノメチオニンＧＦＰ〔図３の（Ｂ）〕の蛍光発光スペクトルには差が認められない。すなわち、メチオニン残基をセレノメチオニンに置換することによるＧＦＰ活性の変化は通常の測定感度以下であると言える。
また、ＤＨＦＲの酵素学的性質を調べた結果を表１にまとめた。表１から明らかなように、天然型である含メチオニンＤＨＦＲ（Ｍｅｔ−ＤＨＦＲ）と含セレノメチオニンＤＨＦＲ（ＳｅＭｅｔ−ＤＨＦＲ）の酵素化学的性質を表すパラメーターである還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）に対するミカエリス定数（Ｋｍ）と最大速度Ｖｍａｘは、ともに両酵素の間で差は認められない。すなわち、メチオニン残基をセレノメチオニンに置換したＤＨＦＲは天然型ＤＨＦＲと同等の酵素活性を保持していることが明らかとなった。
以上、本発明により含セレノメチオニンタンパク質をそのタンパク質の活性を維持したまま且つ高い効率で合成することができることを示した。このことは、上記コムギ胚芽無細胞タンパク質合成反応においては、メチオニルｔＲＮＡ合成、４０Ｓリボソーム亜粒子と翻訳開始アミノアシルｔＲＮＡ（メチオニルｔＲＮＡ）複合体形成、ペプチド鎖伸長反応、および翻訳終止反応に関与する因子群のいずれも、セレノメチオニンをメチオニンと同様に認識してこのアミノ酸類似化合物をタンパク質に取り込む性質を保持していることを示している。
実施例２
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の重水素による標識を、コムギ胚芽抽出物を用いた無細胞タンパク質合成系を利用して行った。
コムギ胚芽は実施例１に記載の方法で調製した実質的に胚乳成分の夾雑がないものを用いた。また、コムギ胚芽からの抽出物の調製は実施例１と全く同じ方法で行った。ただし、抽出用溶液およびゲルろ過に使用する溶液は、セレノメチオニンを含む２０種類のＬ型アミノ酸の代わりに、重水素標識Ｌ型アミノ酸２０種類を含む。調製した抽出物の濃度は、１７０−２５０Ａ２６０ｎｍ（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．５）に調整した。
タンパク質合成反応液の組成は実施例１に記載したものと同じであるが、セレノメチオニンを含む２０種類のＬ型アミノ酸の代わりに重水素標識Ｌ型アミノ酸２０種類を含む。
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）合成のためのプラスミド、ｍＲＮＡ合成方法、タンパク質合成方法、および合成されたタンパク質の分析は、実施例１に記載の方法と同様に行った。
その結果を以下に示す。
図５に、２０種類のＬ型天然型アミノ酸をすべて重水素標識Ｌ型アミノ酸に置換したＤＨＦＲの一体型透析式無細胞タンパク質合成系における合成量を示した。反応開始後０、１２、２４、４８時間目にそれぞれ１μｌの反応液を採取してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行って該反応液中に含まれるタンパク質を検出した。図中、矢印は生成されたＤＨＦＲのバンドを示している。このバンドの染色強度をデンシトメーターにより測定したところ、ＤＨＦＲの合成が経時的にほぼ直線的に進行すること、さらに重水素標識ＤＨＦＲの合成量と天然型ＤＨＦＲのそれとの間に差が認められないことが判明した。このことから、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いる本発明に係る方法が重水素標識タンパク質の合成に有効な方法であると言える。４８時間合成反応を行った後に、メトトレキセートカラムを用いて精製した重水素標識ＤＨＦＲの収量は、３．５ｍｇであった。また、電気泳動における重水素標識ＤＨＦＲの移動度が天然型ＤＨＦＲよりも僅かながら低下していることが拡大した電気泳動図（実線部）および、その精製標品の泳動図からも確認できる。この重水素標識ＤＨＦＲにみられるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の移動度低下現象は、質量数の増加に起因するものと考えられ、重水素含有ＤＨＦＲが合成されていることを直接的に示している。
次に、精製した重水素標識ＤＨＦＲの酵素学的性質を実施例１と同様に生化学的に調べた。表２から明らかなように、天然型ＤＨＦＲと重水素標識ＤＨＦＲの酵素化学的性質を表すパラメーターであるＮＡＤＰＨに対するミカエリス定数（Ｋｍ）とＶｍａｘは、ともに両酵素の間で差は認められない。すなわち、重水素標識アミノ酸からなるＤＨＦＲは、天然型ＤＨＦＲとほぼ同等の酵素活性を保持していることが明らかとなった。
産業上の利用可能性
本発明に係る標識タンパク質の製造方法によれば、純度が高い標識タンパク質を高い効率で製造できる。従って無細胞タンパク質合成システムを利用した本発明に係る標識タンパク質の製造方法はＸ線解析用の結晶標品調製手段として有用である。また、ここで記載した標識方法は、重水素含有タンパク質の調製にも同様に有用であり、さらにこの方法によって、任意のアミノ酸をそれに対応する同位体標識アミノ酸などで標識する一般的手段として利用できる。
さらに重要な点は、重水素のみならず１３Ｃ、１５Ｎなどの同位体標識タンパク質の調製に有効であり、タンパク質の構造解析に広く用いることができるものと期待できる。
このように本発明に係る標識タンパク質の製造方法は、タンパク質のＸ線結晶解析、核磁気共鳴解析、および中性子散乱法などによる高次構造解析用試料の調製、または同位体効果を利用するタンパク質の触媒機構の解明等に利用することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号１：５’非翻訳領域として用いられる設計されたポリヌクレオチド
配列番号２：５’非翻訳領域として用いられる設計されたポリヌクレオチド
配列番号３：５’非翻訳領域として用いられる設計されたポリヌクレオチド
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、セレノメチオニンで標識されたグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）のバッチ式無細胞タンパク質合成法による経時的な合成量を、１４Ｃ−ロイシンのタンパク質への取り込み（Ａ）と、オートラジオグラフィー〔（Ｂ）および（Ｃ）〕により調べた結果を示す。図１の（Ａ）において●―●および■―■は、セレノメチオニンを用いて行った合成反応系における含セレノメチオニンＧＦＰ合成量および含セレノメチオニンＤＨＦＲ合成量をそれぞれ示す。また、メチオニンを用いて行った合成反応系における天然型のＧＦＰ合成量およびＤＨＦＲ合成量は、それぞれ〇―〇および□―□で示した。メチオニンおよびセレノメチオニンを含まない合成反応系におけるＧＦＰ合成量およびＤＨＦＲ合成量はそれぞれ〇−−○および□−−□で示した。図１の（Ｂ）および（Ｃ）中で、ＭｅｔまたはＳｅ−ｍｅｔは、それぞれメチオニンまたはセレノメチオニンを取り込んだタンパク質を意味する。
図２は、透析式無細胞タンパク質合成法により４８時間合成して精製したＧＦＰ（Ａ）とＤＨＦＲ（Ｂ）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。図２の（Ａ）および（Ｂ）ともに、レーン２および３は天然型タンパク質を、レーン４および５は含セレノメチオニンタンパク質の泳動結果である。また、レーン２および４は合成反応後の溶液そのものの、レーン３および５は該溶液から精製したそれぞれのタンパク質の泳動結果を示す。レーン１は、対照としてタンパク質翻訳鋳型非存在下で合成反応を行った結果を示す。図中、矢印は生成されたタンパク質のバンドを示し、ＭＭは分子量マーカーを意味する。
図３は、精製した含セレノメチオニンＧＦＰの蛍光発光スペクトルを示した図である。
図４は、汎用性のある無細胞タンパク質合成用鋳型分子合成プラスミド（ｐＥＵ１）の構成を示す模式図である。
図５は、透析式無細胞タンパク質合成法により合成された重水素標識ＤＨＦＲと、４８時間合成後に精製したＤＨＦＲの電気泳動図である。図中、矢印は生成されたタンパク質のバンドを、各数字は反応時間を示す。また、”Ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ”および”Ｎａｔｕｒａｌ”は天然型アミノ酸を使ったときの、”Ｄｅｕｔｅｒａｔｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ”および”Ｄｅｕｔｅｒａｔｅｄ”は重水素標識Ｌ型アミノ酸を使ったときのＤＨＦＲ合成結果を示す。”Ｅｎｌａｒｇｅｄ”は拡大電気泳動図、”Ｐｕｒｉｆｉｅｄ”は精製されたＤＨＦＲの電気泳動図である。
Claims (4)
- コムギ胚芽抽出物から該胚芽抽出物に混入する胚乳を完全に除去して得た無細胞タンパク質合成用細胞抽出物中のメチオニンをセレノメチオニンに変えた後、メチオニンの代わりにセレノメチオニンを含むタンパク質合成反応液組成を使って、バッチ条件下または透析条件下で、無細胞タンパク質合成を行うことを特徴とするセレノメチオニン標識タンパク質の製造方法。
- 請求の範囲第１項の製造方法で得たセレノメチオニン標識タンパク質。
- コムギ胚芽抽出物から該胚芽抽出物に混入する胚乳を完全に除去して得た無細胞タンパク質合成用細胞抽出物中の天然型アミノ酸を重水素標識アミノ酸に変えた後、天然型アミノ酸の代わりに重水素標識アミノ酸を含むタンパク質合成反応液組成を使って、バッチ条件下または透析条件下で無細胞タンパク質合成を行うことを特徴とする重水素含有アミノ酸標識タンパク質の製造方法。
- 請求の範囲第３項に記載の製造方法で得た重水素含有アミノ酸標識タンパク質。
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