CN117448332A - 一种利用RNA结合蛋白增强mRNA蛋白表达的序列优化方法 - Google Patents
一种利用RNA结合蛋白增强mRNA蛋白表达的序列优化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117448332A CN117448332A CN202311418703.1A CN202311418703A CN117448332A CN 117448332 A CN117448332 A CN 117448332A CN 202311418703 A CN202311418703 A CN 202311418703A CN 117448332 A CN117448332 A CN 117448332A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mrna
- protein
- sequence
- protein expression
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 40
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 21
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000005457 optimization Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 102000055765 ELAV-Like Protein 1 Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108700015856 ELAV-Like Protein 1 Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 13
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 6
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 5
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 5
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims description 4
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 abstract description 10
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 108020005176 AU Rich Elements Proteins 0.000 description 60
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 3
- 229940126582 mRNA vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108700020471 RNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710146873 Receptor-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 101710137011 Retinol-binding protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 101710183439 Riboflavin-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 102100024544 SURP and G-patch domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000007363 regulatory process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种利用RNA结合蛋白增强mRNA蛋白表达的序列优化方法，该方法利用在各个细胞中广泛表达的RNA结合蛋白HuR，通过在mRNA分子3’UTR内插入HuR蛋白特异性识别的序列，HuR蛋白特异性结合mRNA分子，增强mRNA稳定性，提高蛋白质的表达。本发明采用上述的一种利用RNA结合蛋白增强mRNA蛋白表达的序列优化方法，能够解决因mRNA分子不稳定，容易降解，从而导致蛋白表达量低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种利用RNA结合蛋白增强mRNA蛋白表达的序列优化方法。
背景技术
mRNA疫苗是在第一代减毒/灭活疫苗和第二代亚单位疫苗基础上发展起来的第三代人用疫苗技术，mRNA生产工艺简单、合成快速、成本较低；且在细胞质中翻译不进入细胞核，不会产生整合宿主基因组的风险；同时作为核酸本身具有激活免疫反应的佐剂作用。从mRNA的本身特性、引发的免疫反应情况、疫苗大规模生产的有利条件等方面来看，mRNA疫苗具有其它疫苗无法比拟的优势。
但是，mRNA极不稳定，很容易被组织和血液中的RNase降解，被免疫系统快速识别清除。mRNA疫苗的应用需要解决其稳定性较差、容易被降解，蛋白表达低的问题。mRNA作为疫苗通常以线性化的DNA为模板通过体外转录获得，研究人员可以对其DNA模板和转录原料进行设计，获得分子水平精准设计的mRNA产品。其中mRNA的组成含有几个必要的元件，包括帽子结构(Cap)、5’端非翻译区(5’untranslate region 5’UTR)、编码抗原蛋白的开放阅读框(open reding frames，ORF)、3’端非翻译区(3’untranslate region，3'UTR)和聚腺苷酸尾巴Poly(A)尾结构。现阶段，提高mRNA稳定性的研究方法，主要是对以上DNA模板上的元件进行序列设计优化，从而提高mRNA的稳定性和翻译效率。
RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)是细胞中一类重要的蛋白质，RBP通过识别特殊的RNA序列与RNA互作，广泛参与到RNA的剪切、转运、序列编辑、胞内定位及翻译控制等多个转录后调控过程中。本发明提出了一种在3’UTR中插入一段RNA结合蛋白特异性结合的序列，该序列为一段富含腺嘌呤和尿嘧啶的短序列，简称为ARE(AU-rich element)元件。HuR是一种在机体各组织中广泛表达的重要RNA结合蛋白，HuR通过结合ARE元件，增强了mRNA分子的稳定性，提高了蛋白质的表达。在提高mRNA蛋白质表达上，本发明是一种新型的利用胞内RNA结合蛋白质进行mRNA序列优化的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用RNA结合蛋白增强mRNA蛋白表达的序列优化方法，解决因mRNA分子不稳定，容易降解，从而导致蛋白表达量低的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种提高蛋白质表达和增强mRNA稳定性的ARE，包括如下的一种：
ARE-0，其核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示；
ARE-5，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
ARE-9，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
ARE-V8，其核苷酸序列为ATTTATTTA；
ARE-T8，其核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示。
本发明还提供了mRNA，在其DNA模板序列的3’UTR的前面、中间或后面插入如权利要求1所述的ARE得到所述mRNA。
本发明还提供了包含上述ARE的质粒载体。
本发明还提供了ARE在提高蛋白质表达和增强mRNA稳定性中的应用。
本发明还提供了一种利用RNA结合蛋白增强mRNA蛋白表达的序列优化方法，包括以下步骤：
S1、设计上述mRNA的DNA模板序列，构建表达荧光素酶的质粒；
S2、设计引物，应用PCR反应，从质粒上扩增出载体的线状基因片段，应用Gibson反应，连接线性载体和ARE，使载体内插入ARE，在已设计质粒的基础上，应用定点突变，变换不同的ARE或对ARE进行截短和设计；
S3、提取质粒，酶切线性化，加入酶、核苷酶、缓冲液等原料体外转录出mRNA；
S4、mRNA和脂质体以一定比例混合，合成脂质纳米粒；
S5、转染细胞，mRNA在细胞内翻译出蛋白质；
S6、添加荧光素底物试剂，充分裂解细胞，酶标仪检测化学发光；
S7、RNA pull down验证ARE是否结合HuR蛋白。
优选的，所述mRNA与脂质体的体积比为3：1。
优选的，所述脂质体中各组分摩尔比为阳离子脂质体：辅助脂质：胆固醇：聚乙二醇＝50：10：38.5：1.5。
本发明所述的一种利用RNA结合蛋白增强mRNA蛋白表达的序列优化方法的优点和积极效果是：
1、本发明提供了一种新型的mRNA序列优化的方法，即利用细胞内表达的RNA结合蛋白结合特定的序列元件，来上调mRNA分子的稳定性，进而提高开放阅读框的蛋白量，实现翻译能力和生物利用度的增加。
2、本发明通过RNA pull downs实验结合western blot检测手段，与阴性对照相比，ARE元件上结合到了HuR蛋白，荧光素酶的表达量有显著性差异。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明实施例中ARE元件前、中、后的插入位置示意图；
图2为本发明实施例中插入ARE元件的DNA模板电泳图；
图3为本发明实施例中ARE-F、ARE-M、ARE-R的细胞转染结果图；
图4为本发明实施例中ARE1-13的细胞转染结果图；
图5为本发明实施例中AREV1-V10的细胞转染结果图；
图6为本发明实施例中ARET1-T2、ARET4-T8的细胞转染结果图；
图7为本发明实施例中Western blot结果图。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
本发明以易检测蛋白表达量的荧光素酶为例，首先，在DNA模板的3’UTR的不同位置插入ARE元件，与未插入ARE元件的序列Non-ARE做对比，显示RNA结合蛋白结合ARE元件增强蛋白质表达量，并且增强效果最显著的是ARE在3’UTR前。
其次，在确定ARE在3’UTR前为最优位置的基础上，通过定点突变更换13条不同的ARE元件序列，13条不同的ARE元件均来自于自然基因库，探究ARE元件的最优序列。
最后，在最优序列和自然基因库中筛选的基础上，探究保证ARE元件功能的最短和最长作用序列。因此，本发明采用一种利用RNA结合蛋白增强mRNA蛋白表达的序列优化方法，能够解决因mRNA分子不稳定，容易降解，从而导致蛋白表达量低问题。
实施例
一、设计DNA序列：以PUC57-Kan为质粒载体，选择XbaL I和Pci I为目的基因两侧的酶切位点，目的基因序列依次为T7启动子序列、5’UTR序列、优化后的荧光素酶序列、3’UTR序列、polyA序列。
1、ARE元件最优位置：ARE元件的插入位置如图1所示，ARE元件插入3’UTR序列前面标记为ARE-F，ARE元件插入3’UTR序列中间标记为ARE-M，ARE元件插入3’UTR序列后面标记为ARE-R，未插入ARE元件的质粒命名为Non-ARE。
2、从自然基因库中筛选的ARE元件：从自然基因库中选取了13条序列，除ARE元件的DNA序列同ARE-F不同，质粒上的其他基因均同ARE-F相同。13条序列中的ARE元件依次命名为序号ARE1-13，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4-16所示。
3、ARE元件的截短和设计：对ARE-F的ARE-0元件进行截短和设计。截短的序列依次命名为ARE-V1(SEQ ID NO.17)、ARE-V2(SEQ ID NO.18)、ARE-V3(SEQ ID NO.19)、ARE-V4(SEQ ID NO.20)、ARE-V5(SEQ ID NO.21)、ARE-V6(SEQ ID NO.22)、ARE-V7(SEQ IDNO.23)、ARE-V8(ATTTATTTA)、ARE-V9(SEQ ID NO.24)、ARE-V10(SEQ ID NO.25)，设计的ARE元件依次命名为ARE-T1、(SEQ ID NO.26)ARE-T2(TATTTATTT)、ARE T4-T8，其核苷酸序列如SEQ ID NO.27-31所示。
二、插入ARE元件：设计引物，通过PCR获得带有同源末端的载体和插入片段的ARE片段。通过Gibson组装3’UTR内含有ARE元件的质粒。通过PCR反应获得载体的引物序列如表1所示(SEQ ID NO.32-37)，PCR反应参数如表2所示。
表1载体的引物序列
表2载体PCR反应参数
三、通过PCR反应获得ARE元件的引物序列如表3所示(SEQ ID NO.38-43)，PCR反应参数如表4所示。
表3ARE元件的引物序列
表4ARE元件PCR反应参数
四、PCR反应纯化：采用PCR反应纯化试剂盒，按说明书操作步骤，得到纯化后的载体和ARE元件。利用超微量紫外分光光度计对DNA进行定性和定量分析，进行琼脂糖凝胶电泳验证DNA模板的完整性及纯度。电泳图谱如图2所示。图2种左图各条带依次为5k marker(从大到小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、800bp、500bp、300bp)、F-载体、F载体；中间图各条带依次为5k、M-载体、R载体；右图为2k marker(从大到小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)、ARE-F元件、ARE-M元件、ARE-R元件。由图2我们可以看出通过设计引物及PCR反应，载体条带全部位于3000bp-5000bp之间，插入的ARE元件条带全部小于100bp，条带大小均符合预期。因此正确得到同源末端的载体和插入片段的ARE片段。
五、Gibon组装载体和插入ARE元件
(1)克隆反应体系
(2)轻轻混合，将样品在50℃下孵育1h。反应结束后，将离心管置于冰上冷却数秒。将样品储存在–20℃或直接用于后续转化。已插入ARE-0(SEQ ID NO.44)元件的ARE-F的载体序列如SEQ ID NO.1所示，ARE-M的载体序列如SEQ ID NO.2所示，ARE-R的载体序列如SEQID NO.3所示。
六、ARE元件的定点突变
在ARE-F的质粒基础上，将ARE元件进行定点突。通过点突变过程中，第一步使用PCR酶进行指数扩增引入突变序列。第二步是用含激酶、连接酶和Dpn I酶的特殊混合液处理，快速环化PCR产物和去除模板。第三步是高效转入化学感受态细胞。第四步是从菌液中提取质粒，测序，得到正确的突变后的DNA序列。
七、Gibson和定点突变重组产物转化到感受态细胞。
(1)E.coli DH5α感受态细胞使用前在冰上融化。
(2)50μL的细胞加入2μL Gibson重组产物，轻弹管壁混匀。
(3)冰浴30min，迅速放入42℃水浴中热击45s，再迅速转至冰中静置2min。
(4)添加SOC培养基，补足体积至1mL。
(5)37℃振荡培养1小时。
(6)浓缩：5000×g离心1min，弃掉900μL上清，剩余部分吹打混匀。
(7)将100μL菌液涂布于100mg/L Kan抗性的LB平板上，37℃正置直至菌液被吸收。
(8)37℃过夜倒置培养。
(9)次日，从平板上挑取单菌落接种到Kan抗性的LB培养基中，37℃摇床充分振荡培养12–16小时。
八、体外转录RNA：提取质粒，酶切线性化的DNA模板，据体外转录试剂盒，在体外加入RNA转录酶、帽子、三磷酸核苷酸和DNA模板等转录原料，37℃孵育2h，以DNA为模板转录得mRNA。
九、脂质体的配置：按照以下配比配置脂质体。其中阳离子脂质体：辅助脂质：胆固醇：聚乙二醇的摩尔比为50：10：38.5：1.5。阳离子脂质体为SM-102，辅助脂质为二油酰磷脂酰乙醇胺，缩写为DOPE，聚乙二醇为二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000，缩写为DMG-PEG 2000。
十、合成脂质纳米粒：根据脂质体和mRNA的体积比为3：1，配置所需体积的纳米粒，轻微震荡混匀，制得转染细胞所需的脂质纳米粒。
十一、细胞转染：转染的前一天细胞铺板，观察细胞状态，使细胞密度生长大约为70％-90％后，转染ARE-F、ARE-M、ARE-R到Hela、HEK-293T、4T1、A549细胞中，转染ARE1-13、AREV1-V10、ARET1-T2、ARET4-T8 RNA于Hela细胞中。转染后轻微震荡混匀，放入细胞培养箱中培养。
十二、24h后检测荧光强度：转染24h后，将孔板取出，平衡至室温后，加入荧光素底物，使细胞充分裂解3分钟后，在酶标仪检测发光信号。其中ARE-F、ARE-M、ARE-R的转染结果如图3所示，ARE1-13的转染结果如图4所示，AREV1-V10转染结果如图5所示，ARET1-T2、ARET4-T8 RNA的转染结果如图6所示。
由图3可以看出，相同细胞中ARE-F的转染效果较好，因此对ARE-F进行了截短设计(AREV1-V10)，截短后的序列的转染效果如图5所示，从图5中可以看出，序列AREV8的转染效果较好，说明序列AREV8可以显著增强蛋白表达量。
图4为从自然基因库中筛选的13条序列，由图4的结果可知，对比Non-ARE，ARE-5和ARE-9的转染效果接近ARE-F，说明ARE-5和ARE-9同样可以显著增强蛋白表达量。
图6为人工设计的7条序列，由图6的结果可知，ARET8的转染效果优异，说明ARET8可以显著增强蛋白表达量。
十三、RNApull down确认ARE结合蛋白HuR。
1、细胞裂解
1)将Hela细胞培养于10cm的大皿中，培养3个大皿。
2)弃去培养基，用预冷的PBS洗3次，尽量吸尽上清。取4mL RIPA，加40μL PSMF，混匀置于冰上。
3)每个大皿加入1230μL RIPA裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，冰上裂解30min。
4)用细胞刮板将细胞刮下，用裂解液吹打几下，收集裂解后的样品14000g离心5分钟，取上清，取10-20μL左右上清至新管中，作为实验input组。
5)BCA测定蛋白浓度。
2、磁珠和RNA结合
1)磁珠混匀
2)取3个50μL置于磁力架上，去除上清
3)用50μL 20mM Tris(pH7.5)洗一遍，重悬磁珠，置于磁力架上，弃上清。
4)重复步骤3)一次。
5)加入50μL RNACapture Buffer，重悬磁珠。
6)加入10μL RNA(Biotin-ARE、Biotin-polyA、无酶水)于磁珠中，用移液枪轻轻混匀。
7)室温下震荡孵育30min。
3、HuR蛋白结合RNA-磁珠
1)将磁珠和RNA混合液置于磁力架上，弃上清。
2)用50uL 20mM Tris(pH7.5)洗一遍，重悬磁珠，置于磁力架上，弃上清。
3)重复步骤3)一次。
4)稀释10×protein RNAbinding buffer。
5)加入100μL 1×protein RNAbinding buffer于磁珠中混匀，置于磁力架上，弃上清。
6)准备细胞裂解液混合物。
7)加入100μL细胞裂解液混合物于已结合了RNA的磁珠中，用移液枪轻轻混匀。
8)4℃，震荡孵育30-60min。
4、洗脱RNA结合蛋白复合物
1)磁珠置于磁力架上，弃上清。
2)用100μL 1×wash buffer洗涤磁珠，置于磁力架上，弃上清。
3)重复步骤2)一次。
4)加50μL 1×SDS loading buffer煮沸5-10min。
5)后置于置于磁力架上，收集上清用于Western blot分析，剩余样品可以-20℃保存。
十四、Western blot结果如图7所示。
由图7的结果可知，ARE结合了蛋白HuR，从而提高了蛋白质的表达量。
因此，本发明采用上述的一种利用RNA结合蛋白增强mRNA蛋白表达的序列优化方法，HuR蛋白通过ARE元件特异性地结合mRNA，从而提高蛋白质的表达量，能够解决因mRNA分子不稳定，容易降解，从而导致蛋白表达量低的问题。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种提高蛋白质表达和增强mRNA稳定性的ARE，其特征在于，包括如下的一种：
ARE-0，其核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示；
ARE-5，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
ARE-9，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
ARE-V8，其核苷酸序列为ATTTATTTA；
ARE-T8，其核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示。
2.mRNA，其特征在于：在其DNA模板序列的3’UTR的前面、中间或后面插入如权利要求1所述的ARE得到所述mRNA。
3.包含如权利要求1所述的ARE的质粒载体。
4.如权利要求1所述的ARE，在提高蛋白质表达和增强mRNA稳定性中的应用。
5.一种利用RNA结合蛋白增强mRNA蛋白表达的序列优化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、设计如权利要求2中所述的mRNA的DNA模板序列，构建表达荧光素酶的质粒；
S2、设计引物，应用PCR反应，从质粒上扩增出载体的线状基因片段，应用Gibson反应，连接线性载体和ARE，使载体内插入ARE，在已设计质粒的基础上，应用定点突变，变换不同的ARE或对ARE进行截短和设计；
S3、提取质粒，酶切线性化，加入酶、核苷酶、缓冲液等原料体外转录出mRNA；
S4、mRNA和脂质体以一定比例混合，合成脂质纳米粒；
S5、转染细胞，mRNA在细胞内翻译出蛋白质；
S6、添加荧光素底物试剂，充分裂解细胞，酶标仪检测化学发光；
S7、RNA pull down验证ARE是否结合HuR蛋白。
6.根据权利要求5所述的一种利用RNA结合蛋白增强mRNA蛋白表达的序列优化方法，其特征在于：所述mRNA与脂质体的体积比为3：1。
7.根据权利要求6所述的一种利用RNA结合蛋白增强mRNA蛋白表达的序列优化方法，其特征在于：所述脂质体中各组分摩尔比为阳离子脂质体：辅助脂质：胆固醇：聚乙二醇＝50：10：38.5：1.5。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2023109850212 | 2023-08-07 | ||
| CN202310985021 | 2023-08-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117448332A true CN117448332A (zh) | 2024-01-26 |
Family
ID=89584962
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311418703.1A Pending CN117448332A (zh) | 2023-08-07 | 2023-10-30 | 一种利用RNA结合蛋白增强mRNA蛋白表达的序列优化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117448332A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060008802A1 (en) * | 2002-04-17 | 2006-01-12 | Manfred Auer | Method for the identification of inhibitors of the binding of are-containing mrna and a hur protein |
| CN101928706A (zh) * | 2009-06-19 | 2010-12-29 | 中国医学科学院基础医学研究所 | DRD1 mRNA 3端非编码区ARE元件通过稳定DRD1 mRNA上调其表达 |
| US20110086904A1 (en) * | 2007-09-17 | 2011-04-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | GENERATION OF HYPERSTABLE mRNAs |
| CN108707584A (zh) * | 2009-11-17 | 2018-10-26 | Musc研究发展基金会 | 针对人核仁素的人单克隆抗体 |
| CN113817778A (zh) * | 2021-09-13 | 2021-12-21 | 大连理工大学 | 一种利用核仁素增强mRNA稳定表达的方法 |
| US20220213052A1 (en) * | 2019-05-01 | 2022-07-07 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Inhibitors of rna-binding proteins, compositions thereof, and therapeutic uses therof |
-
2023
- 2023-10-30 CN CN202311418703.1A patent/CN117448332A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060008802A1 (en) * | 2002-04-17 | 2006-01-12 | Manfred Auer | Method for the identification of inhibitors of the binding of are-containing mrna and a hur protein |
| US20110086904A1 (en) * | 2007-09-17 | 2011-04-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | GENERATION OF HYPERSTABLE mRNAs |
| CN101928706A (zh) * | 2009-06-19 | 2010-12-29 | 中国医学科学院基础医学研究所 | DRD1 mRNA 3端非编码区ARE元件通过稳定DRD1 mRNA上调其表达 |
| CN108707584A (zh) * | 2009-11-17 | 2018-10-26 | Musc研究发展基金会 | 针对人核仁素的人单克隆抗体 |
| US20220213052A1 (en) * | 2019-05-01 | 2022-07-07 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Inhibitors of rna-binding proteins, compositions thereof, and therapeutic uses therof |
| CN113817778A (zh) * | 2021-09-13 | 2021-12-21 | 大连理工大学 | 一种利用核仁素增强mRNA稳定表达的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107502608B (zh) | 用于敲除人ALDH2基因的sgRNA、ALDH2基因缺失细胞株的构建方法及应用 | |
| CN105518135B (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA | |
| CN108018301B (zh) | 确定miR-27a基因的核心启动子及其内转录因子Myod结合位点的方法 | |
| CN113278635B (zh) | 一种促进环状rna成环的序列组合及其应用 | |
| CN113215193B (zh) | 小分子化合物提高基因敲除和碱基编辑系统活性的方法及其应用方法 | |
| CN111607613A (zh) | 一种表达细胞免疫疫苗mRNA的质粒载体及其构建方法和应用 | |
| CN108148866B (zh) | 一种hcbp6基因敲除细胞系及其构建方法 | |
| CN111613272B (zh) | 程序化框架gRNA及其应用 | |
| WO2023081311A1 (en) | Methods of purifying dna for gene synthesis | |
| CN113817778B (zh) | 一种利用核仁素增强mRNA稳定表达的方法 | |
| CN114395568A (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆及其构建方法与应用 | |
| WO2022057094A1 (zh) | 基于合成基因和酿酒酵母同源重组机制的分子克隆方法 | |
| CN117448332A (zh) | 一种利用RNA结合蛋白增强mRNA蛋白表达的序列优化方法 | |
| CN103509823A (zh) | 一种利用cho细胞生产重组蛋白的真核表达载体及系统 | |
| US20210388392A1 (en) | CRISPR-LpCas9 GENE EDITING SYSTEM AND APPLICATION THEREOF | |
| CN109706126B (zh) | 一种外源基因定点整合t7噬菌体基因组的方法及应用 | |
| CN113151354A (zh) | 一种用于条件性敲除目的基因的载体及条件性敲除目的基因的方法 | |
| CN117363644B (zh) | Vigs沉默效率报告质粒、评价沉默效率的方法及应用 | |
| CN110628799A (zh) | 一种细菌启动子报告载体的构建方法及其应用 | |
| CN117683755B (zh) | 一种C-to-G碱基编辑系统 | |
| CN118256506B (zh) | 人工设计的5'utr结构增强目的基因的表达 | |
| CN114517199B (zh) | 企鹅珍珠贝Mitf基因的启动子及其应用 | |
| CN114891791B (zh) | 特异性靶向犬Rosa26基因的sgRNA及其应用 | |
| CN113234759A (zh) | 一种nampt基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法 | |
| Hirai et al. | Structure of rice chloroplast DNA |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |