CN108148866B - 一种hcbp6基因敲除细胞系及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HCBP6基因敲除细胞系及其构建方法。本发明所提供的构建HCBP6基因敲除细胞系的方法,是采用CRISPER/Cas9技术构建HCBP6基因敲除细胞系,所述方法以HCBP6蛋白的编码序列中符合5’‑NX‑NGG‑3’或5’‑CCN‑NX‑3’序列排列规则的片段为靶序列;N表示A、G、C和T中的任一种,14≤X≤30,且X为整数,NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。本发明为HCV感染机制研究打下基础。本发明构建的HCBP6基因敲除是在基因组水平上形成移码突变,故可以随着细胞的分裂、增殖传递到下一代,形成稳定的HCBP6基因敲除细胞系。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及一种HCBP6基因敲除细胞系及其构建方法。
背景技术
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病原之一。目前主要的治疗手段是干扰素加利巴韦林,但是效果不十分理想,特别是不能用于肝硬化失代偿期的患者。因此,进一步深入研究HCV的发病机制,研制新型抗病毒药物具有十分重要的意义。
丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6(Hepatitis C Virus Core-Binding Protein6)是一种可以与丙型肝炎病毒核心蛋白相结合的蛋白。研究发现,HCBP6蛋白能够上调和下调一系列不同基因的表达水平,这些差异表达的基因与细胞信号的转导、增生、分化及生长调节密切相关。鉴于HCBP6在细胞核酸代谢和HCV感染中的重要作用,敲除HCBP6蛋白在HCBP6的功能研究中是十分重要的手段。但目前敲除或降低HCBP6表达的方法仅限于RNAi,该方法仅能瞬时降低HCBP6蛋白的表达,不能形成稳定敲除,更难以建立HCBP6表达缺失的细胞系,而且降低的程度也有限,不能完全敲除HCBP6的表达。因此,有必要研发一种从基因组中完全敲除HCBP6基因的方法。
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/cas,规律成簇的间隔短回文重复序列)技术又称为CRISPR/Cas9(CRISPR associated protein9,CRISPR相关蛋白9)核酸酶技术是新出现的一种基因组编辑工具,它能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。crRNA(CRISPRderived RNA,CRISPR衍生RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA,反式激活RNA)结合形成双链RNA,此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9核酸酶蛋白在crRNA引导序列的靶定位点剪切双链DNA,从而达到对基因组DNA进行剪切或修饰的目的。
CRISPR/Cas9技术的定点剪切编辑技术最常用的是针对单个位点设计sgRNA引导Cas9在靶标序列上进行定向剪切,切割后细胞内固有的非同源末端连接途径(NHEJ)修复过程,会造成碱基的插入与删除,进而造成目的基因移码突变来实现基因敲除的目的。
目前,尚未见有关利用CRISPR/Cas9系统将HCBP6基因序列进行敲除的报道。
发明内容
本发明的目的是针对目前瞬时敲除HCBP6方法的不稳定性和不彻底性,提供一种从基因组中稳定敲除HCBP6基因的方法,该方法除用于HCBP6功能研究外,还可以用于建立HCBP6表达缺失细胞系。
第一,本发明要求保护一种构建HCBP6基因敲除细胞系的方法。
本发明所提供的构建HCBP6基因敲除细胞系的方法,具体是采用CRISPER/Cas9技术构建HCBP6基因敲除细胞系,其特征在于:所述方法以HCBP6蛋白的编码序列中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的片段的“Nx”为靶序列;N表示A、G、C和T中的任一种,14≤X≤30,且X为整数,NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸;
所述HCBP6蛋白的编码序列共有5条,分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5。
在本发明中,所述X具体为20。
进一步地,所述靶序列具体为SEQ ID No.6或SEQ ID No.7。
更进一步地,根据所述靶序列的不同,所述方法为如下方法A或方法B:
方法A(靶序列为SEQ ID No.6),具体可包括如下步骤:
(a1)合成名称为正向单链DNA1和名称为反向单链DNA1的两个单链DNA;所述正向单链DNA1的序列如SEQ ID No.8所示;所述反向单链DNA1的序列如SEQ ID No.9所示;
(a2)将所述正向单链DNA1和所述反向单链DNA1进行退火反应,得到双链DNA1;
(a3)将所述双链DNA1连接到LentiCRISPRv2质粒的限制性内切酶BsmB I的切割位点处,得到的重组质粒记为LentiCRISPRv2-HCBP6-1;
(a4)将psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和步骤(a3)构建的重组质粒LentiCRISPRv2-HCBP6-1共转染人胚肾细胞HEK 293T,得到重组细胞,培养所述重组细胞得到慢病毒上清;
(a5)将步骤(a4)得到的慢病毒上清感染HepG2细胞,从感染后的细胞中获得HCBP6基因被敲除的细胞系。
方法B(靶序列为SEQ ID No.7),包括如下步骤:
(b1)合成名称为正向单链DNA2和名称为反向单链DNA2的两个单链DNA;所述正向单链DNA2的序列如SEQ ID No.10所示;所述反向单链DNA2的序列如SEQ ID No.11所示;
(b2)将所述正向单链DNA2和所述反向单链DNA2进行退火反应,得到双链DNA2;
(b3)将所述双链DNA2连接到LentiCRISPRv2质粒的限制性内切酶BsmB I的切割位点处,得到的重组质粒记为LentiCRISPRv2-HCBP6-2;
(b4)将psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和步骤(b3)构建的重组质粒LentiCRISPRv2-HCBP6-2共转染人胚肾细胞HEK 293T,得到重组细胞,培养所述重组细胞得到慢病毒上清;
(b5)将步骤(b4)得到的慢病毒上清感染HepG2细胞,从感染后的细胞中获得HCBP6基因被敲除的细胞系。
第二,本发明要求保护利用上述方法制备得到的HCBP6基因敲除细胞系。
更加具体地,在本发明中,所述HCBP6基因敲除细胞系为将HepG2细胞中的HCBP6基因中SEQ ID No.1的第1-23位缺失后得到的细胞系(即实施例中的18号克隆);或者为将HepG2细胞中的HCBP6基因中SEQ ID No.1的第21位和第22位之间插入一个碱基G后得到的细胞系(即实施例中的36号克隆)。
第三,本发明要求保护如下质粒或成套质粒。
所述质粒为前文所述的LentiCRISPRv2-HCBP6-1或者LentiCRISPRv2-HCBP6-2。
所述成套质粒由psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和前文所述的LentiCRISPRv2-HCBP6-1组成;或者由psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和前文所述的LentiCRISPRv2-HCBP6-2组成。
第四,本发明要求保护前文所述质粒或成套质粒的用途。
所述用途为基于CRISPR-Cas9敲除HepG2细胞中的HCBP6基因。
第五,本发明要求保护用于构建HCBP6基因敲除细胞系的试剂盒。
本发明所提供的用于构建HCBP6基因敲除细胞系的试剂盒,含有前文所述的质粒或成套质粒及说明书;所述说明书中记载有前文所述的“构建HCBP6基因敲除细胞系的方法”。
第六,本发明要求保护利用前文所述的“构建HCBP6基因敲除细胞系的方法”构建得到的HCBP6基因敲除细胞系在如下任一中的应用:
(I)研究丙型肝炎的发病机制,或制备用于研究丙型肝炎发病机制的细胞模型;
(II)筛选抗丙型肝炎病毒的药物,或制备用于筛选抗丙型肝炎病毒药物的细胞模型;
(III)筛选治疗和/或预防脂肪肝的药物,或制备用于筛选治疗和/或预防脂肪肝的药物的细胞模型。
HepG2细胞由于来源的肝癌组织类型为肝母细胞瘤,因此该细胞适合用于肝细胞代谢方面的研究。
本发明针对人源HCBP6基因设计2个脱靶效应最低的sgRNA,利用CRISPR-v2质粒构建同时表达Cas9和靶向HCBP6sgRNA的慢病毒骨架质粒,包装重组慢病毒并感染HepG2细胞,用嘌呤霉素筛选细胞克隆,提取细胞克隆的基因组DNA,对HCBP6 sgRNA靶点附近的DNA序列进行PCR扩增,纯化PCR产物测序分析鉴定HCBP6基因敲除结果,利用NCBI ORFfinder预测移码突变后形成的开放读码框,用蛋白免疫印迹验证HCBP6表达情况。结果通过DNA测序和蛋白免疫印迹确定成功建立了2株HCBP6基因敲除的HepG2细胞系。本发明为HCV感染机制研究打下基础。本发明构建的HCBP6基因敲除是在基因组水平上形成移码突变,故可以随着细胞的分裂、增殖传递到下一代,形成稳定的HCBP6基因敲除细胞系。
附图说明
图1为lentiCRISPRv2载体的功能结构图。
图2为HCBP6靶向敲除区PCR引物最佳退火温度的测试结果。
图3为Western blot检测HCBP6基因敲除克隆中HCBP6蛋白表达水平。1为阳性对照:HepG2野生型;2为18号克隆;3为21号克隆;4为36号克隆。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
lentiCRISPR V2载体:Addgene公司,产品目录号52961。
psPAX2质粒:Addgene公司,产品目录号12260。
pCMV-VSVG质粒:Addgene公司,产品目录号8454。
人胚肾细胞HEK 293T:ATCC,产品目录号CRL-11268。
HepG2细胞:ATCC,产品目录号HB-8065。
实施例1、基于CRISPR-Cas9敲除肝癌细胞HepG2中的HCBP6基因
一、人的HCPB6基因敲除sgRNA设计
美国生物科技信息中心网站(National Center for BiotechnologyInformation,NCBI),人的HCBP6基因位于人类基因组X号染色体上,全长30128bp,其蛋白编码序列为151..283(SEQ ID No.1),6615..6765(SEQ ID No.2),19721..19796(SEQ IDNo.3),24882..25013(SEQ ID No.4),27807..27884(SEQ ID No.5),将上述5段编码序列分别输入sgRNA在线设计网站:http://crispr.mit.edu/,序列类型一栏(sequence type)选择unique genomic region(23-500nt),找出系列sgRNA,再加上lentiCRISPRV2载体(图1)上的反向互补序列即设计出所要敲除基因的sgRNA。
这段多聚寡核苷酸要与目标基因3’端含有NGG PAM(proto-spacer adjacentmotif)前面的20bp碱基互补,基于lentiCRISPRv2载体被BsmB I酶切后的特点,被插入的两条多聚寡核苷酸结构对应如下:
引物1:5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’;
引物2:3’-CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’。
HCBP6基因中所有5段编码序列的潜在sgRNA序列分别在以下网页:
http://crispr.mit.edu:8079/guides/3462530538775156(151..283);
http://crispr.mit.edu:8079/guides/1503955178521275(6615..6765);
http://crispr.mit.edu:8079/guides/4981419064550625(19721..19796);
http://crispr.mit.edu:8079/guides/3342477595958136(24882..25013);
http://crispr.mit.edu:8079/guides/2960612222550073(27807..27884)。
本发明选择了系列sgRNA,部分序列如下:
“CCACTTGGCTTCCGGCACGT”;
“ACCACTTGGCTTCCGGCACG”;
“CCCACGTGCCGGAAGCCAAGTGG”;
“ACGTAGAGGATCTGCGCGGTAGG”;
“TTCGGTGAGCTTGTCTCGCGAGG”;
“GACAACTGCGCGCCACTCCGCGG”;
“CACTTGGCTTCCGGCACGTGGGG”;
“GCGAGACAAGCTCACCGAAATGG”;
“ACGTGCCGGAAGCCAAGTGGTGG”;
“TGTCGCCACCACTTGGCTTCCGG”;
“GAAACATCTGCCCCACGTGCCGG”;
“TTGACTGGACGCGGCCATTTCGG”;
“GCTTCTTAGCAAATTCCGCA”;
“TTCAGCAGAAAAGTATAGCG”;
“ACGCTATACTTTTCTGCTGA”;
“TTTTGAGTCACTGGACCTTG”;
“GTGGCAACCCAGCTGTTCAT”;
“GTGGCGTAAGCTGTTCGGGC”;
“GACACCTCCAATGAACAGCT”;
“TGACACCTCCAATGAACAGC”。
结果发现,“CCACTTGGCTTCCGGCACGT(SEQ ID No.6)”和“ACCACTTGGCTTCCGGCACG(SEQ ID No.7)”这两个sgRNA序列,脱靶效应(off-target)最低。
根据lentiCRISPR V2载体的质粒序列设计的HCBP6sgRNA1引物序列如下:
HCBP6-sgRNA-F1:5’-CACCGCCACTTGGCTTCCGGCACGT-3’(SEQ ID No.8);
HCBP6-sgRNA-R1:5’-AAACACGTGCCGGAAGCCAAGTGGC-3’(SEQ ID No.9)。
根据lentiCRISPR V2载体的质粒序列设计的HCBP6sgRNA2引物序列如下:
HCBP6-sgRNA2-F:5’-CACCGACCACTTGGCTTCCGGCACG-3’(SEQ ID No.10);
HCBP6-sgRNA2-R:5’-AAACCGTGCCGGAAGCCAAGTGGTC-3’(SEQ ID No.11)。
二、sgRNA表达载体lentiCRISPRv2-HCBP6的构建
1、LentiCRISPRv2质粒线性化
LentiCRISPRv2质粒5μg,BsmB I 1μl,10×Buffer 3.1 2μl,加去离子水至总体积为20μl。55℃过夜。1%琼脂糖凝胶电泳酶切产物,切胶回收约为13kb的DNA条带,用小牛肠碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,Calf Intestinal,CIP)37℃处理1小时,用胶回收试剂盒回收PCR产物。
2、sgRNA引物退火及磷酸化
取引物1(100μM)1μl,引物2(100μM)1μl,10×T4DNA连接酶缓冲液(含有磷酸化必需的ATP)1μl,T4磷酸化酶0.5μl,加入去离子水至总体积为10μl,将样品放入PCR仪上按照以下程序设置反应条件:
37℃30min,95℃5min随后以5℃/min的速度梯度降温,至温度降为25℃。将上述退火后的引物按1:200稀释后备用。
3、sgRNA引物退火与LentiCRISPRv2酶切产物的连接
BsmB I酶切后的LentiCRISPRv2产物50ng 5μl,引物退火产物1μl,10×T4 DNA连接酶缓冲液1μl,T4DNA连接酶1μl,加入去离子水至总体积为10μl,16℃过夜连接。
4、连接产物的转化、测序
连接产物转化Stbl3感受态细胞之后,挑取单克隆菌落到含有氨苄抗性的LB液体培养基中,37℃,220rpm过夜培养(12-16h),细菌培养产物提取质粒,测序。测序正确的重组质粒命名为lentiCRISPRv2-HCBP6。具体而言,对应于sgRNA1的重组质粒命名为lentiCRISPRv2-HCBP6-1;对应于sgRNA2的重组质粒命名为lentiCRISPRv2-HCBP6-2。
三、重组慢病毒制备
在6孔板中加入1ml胶原蛋白液体包被6孔板,1小时后,用PBS洗3遍,每孔加入5×105个人胚肾细胞HEK 293T,置于37℃,5%CO2培养箱中过夜培养;待细胞密度长到80%左右时准备转染,转染前30min吸走培养基,每孔中加入1ml Opti-MEM培养基;在0.5ml Opti-MEM培养基中加入5μl2000转染试剂,轻轻吹打混匀,室温静置5min;在另一0.5ml Opti-MEM培养基中加入1.25μg psPAX2质粒,0.58μg pCMV-VSVG质粒和0.83μglentiCRISPRv2-HCBP6质粒(lentiCRISPRv2-HCBP6-1或者lentiCRISPRv2-HCBP6-2),轻轻吹打混匀;将上述混好的2000一滴一滴的缓慢加入到混有三种质粒的0.5ml Opti-MEM培养基中,轻轻吹打混匀,室温静置20min;将上一步中的混合液体一滴一滴的缓慢加入6孔细胞培养板中,轻轻摇晃混匀,置于37℃,5%CO2培养箱中培养3-4h;吸走6孔细胞培养皿中的Opti-MEM培养基,加入2ml DMEM正常细胞培养基,置于37℃,5%CO2培养箱中培养72h;吸取慢病毒上清,2000rpm离心10min,将上清分装至20个1.5ml的EP管中,置于-80℃超低温冰箱中保存。
四、测定人的肝癌细胞系HepG2对嘌呤霉素(Puromycin)的敏感性
在6孔细胞培养皿中接种2×105个HepG2细胞,置于37℃,5%CO2培养箱中培养24h;分别按0μg/ml,0.5μg/ml,1.0μg/ml,1.5μg/ml,2.0μg/ml,2.5μg/ml,3.0μg/m,3.5μg/ml,4.0μg/ml,4.5μg/ml,5.0μg/ml,6.0μg/ml的终浓度向每个孔中加入嘌呤霉素进行筛选,置于37℃,5%CO2培养箱中培养一周左右,每隔3天换一次含有对应浓度嘌呤霉素的DMEM细胞培养基;观察细胞存活状态,确定嘌呤霉素对HepG2细胞系的最低致死浓度。
结果显示:当细胞培养体系中的嘌呤霉素浓度超过2.0μg/ml时,通过一周的药物筛选细胞全部发生死亡,因此确定嘌呤霉素对HepG2的最低致死浓度为2.0μg/ml。
五、慢病毒梯度稀释感染HepG2细胞筛选HCBP6基因敲除的单克隆细胞株
在10cm细胞培养皿中接种1×106个HepG2细胞,置于37℃,5%CO2培养箱中培养24h;待细胞生长至密度约为20-30%时准备用慢病毒进行感染;在5ml DMEM培养基(不含胎牛血清)中分别加入50μl,25μl,12.5μl,6.25μl,3.125μl,1.5625μl慢病毒,充分混匀,保证慢病毒均匀分布在培养基中,每管中加入4μl 10mg/ml的polybrene溶液(溴化己二甲铵,主要用于提高慢病毒感染细胞的效率,通过中和细胞表面的唾液酸和病毒粒子之间的电荷排斥实现);吸弃10cm细胞培养皿中的培养基,加入含有慢病毒的DMEM培养基,置于37℃,5%CO2培养箱中培养24h;吸弃10cm细胞培养皿中的培养基,加入10ml正常细胞培养基,置于37℃,5%CO2培养箱中培养24h;每个10cm细胞培养皿中加入20μl浓度为1mg/ml的嘌呤霉素(puromycin)溶液,使其终浓度为2μg/ml,置于37℃,5%CO2培养箱中培养,每隔3天换一次含有2μg/ml嘌呤霉素的DMEM细胞培养基;连续培养3到5周,在某些培养皿中能看到独立的单细胞克隆形成;用记号笔在培养皿上克隆对应的位置画上标记,在cylinder的保护下,每个克隆中加入20μl胰蛋白酶消化细胞,大约消化3min后向每个cylinder中加入50μl含有血清的DMEM细胞培养基;吹打重悬克隆,将细胞转移到24孔细胞培养板中,每孔加入0.5mlDMEM细胞培养基,置于培养箱中培养6-8h;待细胞贴壁后,吸走细胞培养液,加入新的含有2μg/ml嘌呤霉素的DMEM细胞培养基,置于培养箱中培养;连续培养1到3周,每隔3天换一次含有2μg/ml嘌呤霉素的DMEM细胞培养基;当细胞密度达到80%以上时,用胰蛋白酶消化细胞转移到12孔板中,每隔3天换一次含有2μg/ml嘌呤霉素的DMEM细胞培养基;当12孔板中的细胞密度达到80%以上时,提取细胞基因组或用蛋白裂解液提取细胞蛋白,通过DNA测序及免疫印迹法检测基因敲除情况。
六、Sanger测序法鉴定单克隆细胞株HCBP6基因敲除情况
用胰蛋白酶消化细胞后加入200μl PBS溶液重悬细胞,用基因组提取试剂盒提取细胞基因组DNA,通过PCR扩增sgRNA靶点序列附近750bp左右的DNA片段(期间摸索了HCBP6靶向敲除区PCR引物最佳退火温度,结果如图2所示,在后续实验中,在扩增sgRNA1和sgRNA2靶向序列附近序列时,以63.1℃为最佳退火温度,PCR产物进行测序。
其中,利用primer 4.0设计用来扩增HCBP6基因sgRNA1靶向序列“CCACTTGGCTTCCGGCACGT(SEQ ID No.6)”和sgRNA2靶向序列“ACCACTTGGCTTCCGGCACG(SEQID No.7)”附近区域序列的PCR引物及测序引物:
正向PCR引物HCBP6-sg1-PCR-F:5’-ATCTCGGTGCATCTGTTGGG-3’;
反向PCR引物HCBP6-sg1-PCR-R:5’-ACGTGCTCCACTGCGAATTA-3’;
PCR产物测序引物:
正向PCR引物HCBP6-sg1-PCR-F:5’-ATCTCGGTGCATCTGTTGGG-3’。
DNA测序结果显示,HCBP6基因敲除细胞系18号克隆(HCBP6#18,sgRNA1靶序列)、21号克隆(HCBP6#21,sgRNA1靶序列)、36号克隆(HCBP6#36,sgRNA1靶序列)在靶向序列附近有23bp缺失、117bp缺失、1bp插入,说明在DNA水平上,这三个克隆的HCBP6基因都发生了突变,都在基因水平实现了基因敲除。
其中,18号克隆(HCBP6#18,sgRNA1靶序列)为将HepG2细胞中的HCBP6基因中SEQID No.1的第1-23位缺失后得到的细胞系。21号克隆(HCBP6#21,sgRNA1靶序列)为将HepG2细胞中的的HCBP6基因中SEQ ID No.1的第18-133位和SEQ ID No.2的第1位缺失后得到的细胞系(共缺失117bp)。36号克隆(HCBP6#36,sgRNA1靶序列)为将HepG2细胞中的HCBP6基因中SEQ ID No.1的第21位和第22位之间插入一个碱基G后得到的细胞系。
七、Western Blot鉴定单克隆细胞株HCBP6基因敲除情况
为了更进一步确认相关HCBP6基因的敲除,我们通过western blot来检测这3株基因敲除细胞系(18号克隆、21号克隆和36号克隆)中HCBP6的蛋白表达。
使用RIPA蛋白裂解液裂解细胞,离心后测定蛋白浓度,取20μg蛋白样品与6×SDS蛋白上样缓冲液混匀后100℃煮沸5-10分钟,上层8%浓缩胶、下层12%的分离胶进行SDS-PAGE蛋白电泳,80V 30分钟后120V 50分钟;半干转仪恒压15V转膜1h;用含5%脱脂牛奶的TBST室温封闭1小时;兔抗人HCBP6多克隆抗体(Abnova公司,货号H00065991-D02P)1:1000、鼠抗人β-actin单克隆抗体(Abnova公司,货号H00000060-M0)1:2000分别稀释于TBST溶液中,4℃孵育过夜,TBST洗涤3次,每次10分钟;羊抗兔二抗1:2000和羊抗鼠二抗1:2000分别稀释于TBST溶液,室温下孵育1小时。TBST洗涤3次,每次10分钟。将ECL显色液A液和B液各取1ml混合后利用凝胶成像仪成像。
结果显示:#18、#36号克隆中没有相应HCBP6蛋白的表达,说明#18、#36号克隆在基因水平和蛋白水平上同时实现了HCBP6基因敲除。而#21号克隆中仍然能观察到HCBP6蛋白表达水平的明显下降,提示#21号克隆中未实现HCBP6的基因敲除。具体见图3。
CRICPR/Cas9技术因其简单高效、成本低廉、能精确靶向编辑目标基因位点等广泛应用于生物医学领域,但目前此技术最大的问题就是脱靶效应的存在,如何尽量避免或降低脱靶效应是在运用CRICPR/Cas9技术进行基因敲除时必须考虑的问题,本发明的应对策略是在设计sgRNA时利用sgRNA设计网站选择脱靶效应尽可能低的sgRNA。另外,针对同一靶基因进行基因敲除时,需要设计多对sgRNA序列,才能保证敲除的效果。同时设计多条sgRNA,最后在获得的基因敲除克隆中挑选出没有明显脱靶效应存在的克隆。在进行基因敲除时另一个问题是如何保证基因在DNA水平和蛋白质水平上同时敲除。本发明发现,当一个基因具有多个CDS时,针对CCDS的sgRNA通常情况下并不是靶向敲除所有CDS。为了能高效的实现基因的完全敲除,设计的sgRNA所对应基因上的靶标序列要尽量是所有CDS所必需的。
本发明利用CRICPR/Cas9系统构建的HCBP6基因敲除细胞系,与RNAi技术比较,是在DNA水平对HCBP6基因产生了编辑,完全沉默了HCBP6的表达,为HCBP6功能和作用机制研究方面提供了一种实用工具,在新药研发等方面具有较高应用价值。
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<160> 11
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<210> 1
<211> 133
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
atggaaacat ctgccccacg tgccggaagc caagtggtgg cgacaactgc gcgccactcc 60
gcggcctacc gcgcagatcc tctacgtgtg tcctcgcgag acaagctcac cgaaatggcc 120
gcgtccagtc aag 133
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<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
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ggtggcgtaa gctgttcggg caggaatctg gaccttcagc agaaaagtat agcgtggcaa 120
cccagctgtt cattggaggt gtcactggat g 151
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attttttctc cttcag 76
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<212> DNA
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gtggtgtcat ttgtgaagaa gaatgttcta gtaactgggg gatttttcgg aggctttctg 60
cttggcatgg catcctaa 78
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<212> DNA
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Claims (6)
1.一种构建HCBP6基因敲除细胞系的方法,是采用CRISPER/Cas9技术构建HCBP6基因敲除细胞系,其特征在于:所述方法以HCBP6蛋白的编码序列中SEQ ID No.6或SEQ ID No.7为靶序列。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述方法为如下方法A或方法B:
方法A,包括如下步骤:
(a1)合成名称为正向单链DNA1和名称为反向单链DNA1的两个单链DNA;所述正向单链DNA1的序列如SEQ ID No.8所示;所述反向单链DNA1的序列如SEQ ID No.9所示;
(a2)将所述正向单链DNA1和所述反向单链DNA1进行退火反应,得到双链DNA1;
(a3)将所述双链DNA1连接到LentiCRISPRv2质粒的限制性内切酶BsmB I的切割位点处,得到的重组质粒记为LentiCRISPRv2-HCBP6-1;
(a4)将psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和步骤(a3)构建的重组质粒LentiCRISPRv2-HCBP6-1共转染人胚肾细胞HEK 293T,得到重组细胞,培养所述重组细胞得到慢病毒上清;
(a5)将步骤(a4)得到的慢病毒上清感染HepG2细胞,从感染后的细胞中获得HCBP6基因被敲除的细胞系;
方法B,包括如下步骤:
(b1)合成名称为正向单链DNA2和名称为反向单链DNA2的两个单链DNA;所述正向单链DNA2的序列如SEQ ID No.10所示;所述反向单链DNA2的序列如SEQ ID No.11所示;
(b2)将所述正向单链DNA2和所述反向单链DNA2进行退火反应,得到双链DNA2;
(b3)将所述双链DNA2连接到LentiCRISPRv2质粒的限制性内切酶BsmB I的切割位点处,得到的重组质粒记为LentiCRISPRv2-HCBP6-2;
(b4)将psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和步骤(b3)构建的重组质粒LentiCRISPRv2-HCBP6-2共转染人胚肾细胞HEK 293T,得到重组细胞,培养所述重组细胞得到慢病毒上清;
(b5)将步骤(b4)得到的慢病毒上清感染HepG2细胞,从感染后的细胞中获得HCBP6基因被敲除的细胞系。
3.质粒,其特征在于:所述质粒为权利要求2中所述的LentiCRISPRv2-HCBP6-1或者LentiCRISPRv2-HCBP6-2。
4.成套质粒,其特征在于:所述成套质粒由psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和权利要求2中所述的LentiCRISPRv2-HCBP6-1组成;或者由psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和权利要求2中所述的LentiCRISPRv2-HCBP6-2组成。
5.权利要求3所述质粒或权利要求4所述的成套质粒的用途,其特征在于:所述用途为基于CRISPR-Cas9敲除HepG2细胞中的HCBP6基因。
6.用于构建HCBP6基因敲除细胞系的试剂盒,含有权利要求3所述的质粒或权利要求4所述的成套质粒及说明书;所述说明书中记载有权利要求1或2所述的方法。
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