CN108148866B

CN108148866B - 一种hcbp6基因敲除细胞系及其构建方法

Info

Publication number: CN108148866B
Application number: CN201810052325.2A
Authority: CN
Inventors: 钟彦伟; 范华昊; 张敏; 史策
Original assignee: 302th Hospital of PLA
Current assignee: 302th Hospital of PLA
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2038-01-19
Also published as: CN108148866A

Abstract

本发明公开了一种HCBP6基因敲除细胞系及其构建方法。本发明所提供的构建HCBP6基因敲除细胞系的方法，是采用CRISPER/Cas9技术构建HCBP6基因敲除细胞系，所述方法以HCBP6蛋白的编码序列中符合5’‑N_X‑NGG‑3’或5’‑CCN‑N_X‑3’序列排列规则的片段为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。本发明为HCV感染机制研究打下基础。本发明构建的HCBP6基因敲除是在基因组水平上形成移码突变，故可以随着细胞的分裂、增殖传递到下一代，形成稳定的HCBP6基因敲除细胞系。

Description

一种HCBP6基因敲除细胞系及其构建方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种HCBP6基因敲除细胞系及其构建方法。

背景技术

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病原之一。目前主要的治疗手段是干扰素加利巴韦林，但是效果不十分理想，特别是不能用于肝硬化失代偿期的患者。因此，进一步深入研究HCV的发病机制，研制新型抗病毒药物具有十分重要的意义。

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6(Hepatitis C Virus Core-Binding Protein6)是一种可以与丙型肝炎病毒核心蛋白相结合的蛋白。研究发现，HCBP6蛋白能够上调和下调一系列不同基因的表达水平，这些差异表达的基因与细胞信号的转导、增生、分化及生长调节密切相关。鉴于HCBP6在细胞核酸代谢和HCV感染中的重要作用，敲除HCBP6蛋白在HCBP6的功能研究中是十分重要的手段。但目前敲除或降低HCBP6表达的方法仅限于RNAi，该方法仅能瞬时降低HCBP6蛋白的表达，不能形成稳定敲除，更难以建立HCBP6表达缺失的细胞系，而且降低的程度也有限，不能完全敲除HCBP6的表达。因此，有必要研发一种从基因组中完全敲除HCBP6基因的方法。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/cas，规律成簇的间隔短回文重复序列)技术又称为CRISPR/Cas9(CRISPR associated protein9，CRISPR相关蛋白9)核酸酶技术是新出现的一种基因组编辑工具，它能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。crRNA(CRISPRderived RNA，CRISPR衍生RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA，反式激活RNA)结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9核酸酶蛋白在crRNA引导序列的靶定位点剪切双链DNA，从而达到对基因组DNA进行剪切或修饰的目的。

CRISPR/Cas9技术的定点剪切编辑技术最常用的是针对单个位点设计sgRNA引导Cas9在靶标序列上进行定向剪切，切割后细胞内固有的非同源末端连接途径(NHEJ)修复过程，会造成碱基的插入与删除，进而造成目的基因移码突变来实现基因敲除的目的。

目前，尚未见有关利用CRISPR/Cas9系统将HCBP6基因序列进行敲除的报道。

发明内容

本发明的目的是针对目前瞬时敲除HCBP6方法的不稳定性和不彻底性，提供一种从基因组中稳定敲除HCBP6基因的方法，该方法除用于HCBP6功能研究外，还可以用于建立HCBP6表达缺失细胞系。

第一，本发明要求保护一种构建HCBP6基因敲除细胞系的方法。

本发明所提供的构建HCBP6基因敲除细胞系的方法，具体是采用CRISPER/Cas9技术构建HCBP6基因敲除细胞系，其特征在于：所述方法以HCBP6蛋白的编码序列中符合5’-N_X-NGG-3’或5’-CCN-N_X-3’序列排列规则的片段的“Nx”为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；

所述HCBP6蛋白的编码序列共有5条，分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5。

在本发明中，所述X具体为20。

进一步地，所述靶序列具体为SEQ ID No.6或SEQ ID No.7。

更进一步地，根据所述靶序列的不同，所述方法为如下方法A或方法B：

方法A(靶序列为SEQ ID No.6)，具体可包括如下步骤：

(a1)合成名称为正向单链DNA1和名称为反向单链DNA1的两个单链DNA；所述正向单链DNA1的序列如SEQ ID No.8所示；所述反向单链DNA1的序列如SEQ ID No.9所示；

(a2)将所述正向单链DNA1和所述反向单链DNA1进行退火反应，得到双链DNA1；

(a3)将所述双链DNA1连接到LentiCRISPRv2质粒的限制性内切酶BsmB I的切割位点处，得到的重组质粒记为LentiCRISPRv2-HCBP6-1；

(a4)将psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和步骤(a3)构建的重组质粒LentiCRISPRv2-HCBP6-1共转染人胚肾细胞HEK 293T，得到重组细胞，培养所述重组细胞得到慢病毒上清；

(a5)将步骤(a4)得到的慢病毒上清感染HepG2细胞，从感染后的细胞中获得HCBP6基因被敲除的细胞系。

方法B(靶序列为SEQ ID No.7)，包括如下步骤：

(b1)合成名称为正向单链DNA2和名称为反向单链DNA2的两个单链DNA；所述正向单链DNA2的序列如SEQ ID No.10所示；所述反向单链DNA2的序列如SEQ ID No.11所示；

(b2)将所述正向单链DNA2和所述反向单链DNA2进行退火反应，得到双链DNA2；

(b3)将所述双链DNA2连接到LentiCRISPRv2质粒的限制性内切酶BsmB I的切割位点处，得到的重组质粒记为LentiCRISPRv2-HCBP6-2；

(b4)将psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和步骤(b3)构建的重组质粒LentiCRISPRv2-HCBP6-2共转染人胚肾细胞HEK 293T，得到重组细胞，培养所述重组细胞得到慢病毒上清；

(b5)将步骤(b4)得到的慢病毒上清感染HepG2细胞，从感染后的细胞中获得HCBP6基因被敲除的细胞系。

第二，本发明要求保护利用上述方法制备得到的HCBP6基因敲除细胞系。

更加具体地，在本发明中，所述HCBP6基因敲除细胞系为将HepG2细胞中的HCBP6基因中SEQ ID No.1的第1-23位缺失后得到的细胞系(即实施例中的18号克隆)；或者为将HepG2细胞中的HCBP6基因中SEQ ID No.1的第21位和第22位之间插入一个碱基G后得到的细胞系(即实施例中的36号克隆)。

第三，本发明要求保护如下质粒或成套质粒。

所述质粒为前文所述的LentiCRISPRv2-HCBP6-1或者LentiCRISPRv2-HCBP6-2。

所述成套质粒由psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和前文所述的LentiCRISPRv2-HCBP6-1组成；或者由psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和前文所述的LentiCRISPRv2-HCBP6-2组成。

第四，本发明要求保护前文所述质粒或成套质粒的用途。

所述用途为基于CRISPR-Cas9敲除HepG2细胞中的HCBP6基因。

第五，本发明要求保护用于构建HCBP6基因敲除细胞系的试剂盒。

本发明所提供的用于构建HCBP6基因敲除细胞系的试剂盒，含有前文所述的质粒或成套质粒及说明书；所述说明书中记载有前文所述的“构建HCBP6基因敲除细胞系的方法”。

第六，本发明要求保护利用前文所述的“构建HCBP6基因敲除细胞系的方法”构建得到的HCBP6基因敲除细胞系在如下任一中的应用：

(I)研究丙型肝炎的发病机制，或制备用于研究丙型肝炎发病机制的细胞模型；

(II)筛选抗丙型肝炎病毒的药物，或制备用于筛选抗丙型肝炎病毒药物的细胞模型；

(III)筛选治疗和/或预防脂肪肝的药物，或制备用于筛选治疗和/或预防脂肪肝的药物的细胞模型。

HepG2细胞由于来源的肝癌组织类型为肝母细胞瘤，因此该细胞适合用于肝细胞代谢方面的研究。

本发明针对人源HCBP6基因设计2个脱靶效应最低的sgRNA，利用CRISPR-v2质粒构建同时表达Cas9和靶向HCBP6sgRNA的慢病毒骨架质粒，包装重组慢病毒并感染HepG2细胞，用嘌呤霉素筛选细胞克隆，提取细胞克隆的基因组DNA，对HCBP6 sgRNA靶点附近的DNA序列进行PCR扩增，纯化PCR产物测序分析鉴定HCBP6基因敲除结果，利用NCBI ORFfinder预测移码突变后形成的开放读码框，用蛋白免疫印迹验证HCBP6表达情况。结果通过DNA测序和蛋白免疫印迹确定成功建立了2株HCBP6基因敲除的HepG2细胞系。本发明为HCV感染机制研究打下基础。本发明构建的HCBP6基因敲除是在基因组水平上形成移码突变，故可以随着细胞的分裂、增殖传递到下一代，形成稳定的HCBP6基因敲除细胞系。

附图说明

图1为lentiCRISPRv2载体的功能结构图。

图2为HCBP6靶向敲除区PCR引物最佳退火温度的测试结果。

图3为Western blot检测HCBP6基因敲除克隆中HCBP6蛋白表达水平。1为阳性对照：HepG2野生型；2为18号克隆；3为21号克隆；4为36号克隆。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

lentiCRISPR V2载体：Addgene公司，产品目录号52961。

psPAX2质粒：Addgene公司，产品目录号12260。

pCMV-VSVG质粒：Addgene公司，产品目录号8454。

人胚肾细胞HEK 293T：ATCC，产品目录号CRL-11268。

HepG2细胞：ATCC，产品目录号HB-8065。

实施例1、基于CRISPR-Cas9敲除肝癌细胞HepG2中的HCBP6基因

一、人的HCPB6基因敲除sgRNA设计

美国生物科技信息中心网站(National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)，人的HCBP6基因位于人类基因组X号染色体上，全长30128bp，其蛋白编码序列为151..283(SEQ ID No.1)，6615..6765(SEQ ID No.2)，19721..19796(SEQ IDNo.3)，24882..25013(SEQ ID No.4)，27807..27884(SEQ ID No.5)，将上述5段编码序列分别输入sgRNA在线设计网站：http://crispr.mit.edu/，序列类型一栏(sequence type)选择unique genomic region(23-500nt)，找出系列sgRNA，再加上lentiCRISPRV2载体(图1)上的反向互补序列即设计出所要敲除基因的sgRNA。

这段多聚寡核苷酸要与目标基因3’端含有NGG PAM(proto-spacer adjacentmotif)前面的20bp碱基互补，基于lentiCRISPRv2载体被BsmB I酶切后的特点，被插入的两条多聚寡核苷酸结构对应如下：

引物1：5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；

引物2：3’-CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’。

HCBP6基因中所有5段编码序列的潜在sgRNA序列分别在以下网页：

http://crispr.mit.edu:8079/guides/3462530538775156(151..283)；

http://crispr.mit.edu:8079/guides/1503955178521275(6615..6765)；

http://crispr.mit.edu:8079/guides/4981419064550625(19721..19796)；

http://crispr.mit.edu:8079/guides/3342477595958136(24882..25013)；

http://crispr.mit.edu:8079/guides/2960612222550073(27807..27884)。

本发明选择了系列sgRNA，部分序列如下：

“CCACTTGGCTTCCGGCACGT”；

“ACCACTTGGCTTCCGGCACG”；

“CCCACGTGCCGGAAGCCAAGTGG”；

“ACGTAGAGGATCTGCGCGGTAGG”；

“TTCGGTGAGCTTGTCTCGCGAGG”；

“GACAACTGCGCGCCACTCCGCGG”；

“CACTTGGCTTCCGGCACGTGGGG”；

“GCGAGACAAGCTCACCGAAATGG”；

“ACGTGCCGGAAGCCAAGTGGTGG”；

“TGTCGCCACCACTTGGCTTCCGG”；

“GAAACATCTGCCCCACGTGCCGG”；

“TTGACTGGACGCGGCCATTTCGG”；

“GCTTCTTAGCAAATTCCGCA”；

“TTCAGCAGAAAAGTATAGCG”；

“ACGCTATACTTTTCTGCTGA”；

“TTTTGAGTCACTGGACCTTG”；

“GTGGCAACCCAGCTGTTCAT”；

“GTGGCGTAAGCTGTTCGGGC”；

“GACACCTCCAATGAACAGCT”；

“TGACACCTCCAATGAACAGC”。

结果发现，“CCACTTGGCTTCCGGCACGT(SEQ ID No.6)”和“ACCACTTGGCTTCCGGCACG(SEQ ID No.7)”这两个sgRNA序列，脱靶效应(off-target)最低。

根据lentiCRISPR V2载体的质粒序列设计的HCBP6sgRNA1引物序列如下：

HCBP6-sgRNA-F1：5’-CACCGCCACTTGGCTTCCGGCACGT-3’(SEQ ID No.8)；

HCBP6-sgRNA-R1：5’-AAACACGTGCCGGAAGCCAAGTGGC-3’(SEQ ID No.9)。

根据lentiCRISPR V2载体的质粒序列设计的HCBP6sgRNA2引物序列如下：

HCBP6-sgRNA2-F：5’-CACCGACCACTTGGCTTCCGGCACG-3’(SEQ ID No.10)；

HCBP6-sgRNA2-R：5’-AAACCGTGCCGGAAGCCAAGTGGTC-3’(SEQ ID No.11)。

二、sgRNA表达载体lentiCRISPRv2-HCBP6的构建

1、LentiCRISPRv2质粒线性化

LentiCRISPRv2质粒5μg，BsmB I 1μl，10×Buffer 3.1 2μl，加去离子水至总体积为20μl。55℃过夜。1％琼脂糖凝胶电泳酶切产物，切胶回收约为13kb的DNA条带，用小牛肠碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,Calf Intestinal,CIP)37℃处理1小时，用胶回收试剂盒回收PCR产物。

2、sgRNA引物退火及磷酸化

取引物1(100μM)1μl，引物2(100μM)1μl，10×T4DNA连接酶缓冲液(含有磷酸化必需的ATP)1μl，T4磷酸化酶0.5μl，加入去离子水至总体积为10μl，将样品放入PCR仪上按照以下程序设置反应条件：

37℃30min，95℃5min随后以5℃/min的速度梯度降温，至温度降为25℃。将上述退火后的引物按1:200稀释后备用。

3、sgRNA引物退火与LentiCRISPRv2酶切产物的连接

BsmB I酶切后的LentiCRISPRv2产物50ng 5μl，引物退火产物1μl，10×T4 DNA连接酶缓冲液1μl，T4DNA连接酶1μl，加入去离子水至总体积为10μl，16℃过夜连接。

4、连接产物的转化、测序

连接产物转化Stbl3感受态细胞之后，挑取单克隆菌落到含有氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养(12-16h)，细菌培养产物提取质粒，测序。测序正确的重组质粒命名为lentiCRISPRv2-HCBP6。具体而言，对应于sgRNA1的重组质粒命名为lentiCRISPRv2-HCBP6-1；对应于sgRNA2的重组质粒命名为lentiCRISPRv2-HCBP6-2。

三、重组慢病毒制备

在6孔板中加入1ml胶原蛋白液体包被6孔板，1小时后，用PBS洗3遍，每孔加入5×10⁵个人胚肾细胞HEK 293T，置于37℃，5％CO₂培养箱中过夜培养；待细胞密度长到80％左右时准备转染，转染前30min吸走培养基，每孔中加入1ml Opti-MEM培养基；在0.5ml Opti-MEM培养基中加入5μl

2000转染试剂，轻轻吹打混匀，室温静置5min；在另一0.5ml Opti-MEM培养基中加入1.25μg psPAX2质粒，0.58μg pCMV-VSVG质粒和0.83μglentiCRISPRv2-HCBP6质粒(lentiCRISPRv2-HCBP6-1或者lentiCRISPRv2-HCBP6-2)，轻轻吹打混匀；将上述混好的

2000一滴一滴的缓慢加入到混有三种质粒的0.5ml Opti-MEM培养基中，轻轻吹打混匀，室温静置20min；将上一步中的混合液体一滴一滴的缓慢加入6孔细胞培养板中，轻轻摇晃混匀，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养3-4h；吸走6孔细胞培养皿中的Opti-MEM培养基，加入2ml DMEM正常细胞培养基，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养72h；吸取慢病毒上清，2000rpm离心10min，将上清分装至20个1.5ml的EP管中，置于-80℃超低温冰箱中保存。

四、测定人的肝癌细胞系HepG2对嘌呤霉素(Puromycin)的敏感性

在6孔细胞培养皿中接种2×10⁵个HepG2细胞，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h；分别按0μg/ml，0.5μg/ml，1.0μg/ml，1.5μg/ml，2.0μg/ml，2.5μg/ml，3.0μg/m，3.5μg/ml，4.0μg/ml，4.5μg/ml，5.0μg/ml，6.0μg/ml的终浓度向每个孔中加入嘌呤霉素进行筛选，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养一周左右，每隔3天换一次含有对应浓度嘌呤霉素的DMEM细胞培养基；观察细胞存活状态，确定嘌呤霉素对HepG2细胞系的最低致死浓度。

结果显示：当细胞培养体系中的嘌呤霉素浓度超过2.0μg/ml时，通过一周的药物筛选细胞全部发生死亡，因此确定嘌呤霉素对HepG2的最低致死浓度为2.0μg/ml。

五、慢病毒梯度稀释感染HepG2细胞筛选HCBP6基因敲除的单克隆细胞株

在10cm细胞培养皿中接种1×10⁶个HepG2细胞，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h；待细胞生长至密度约为20-30％时准备用慢病毒进行感染；在5ml DMEM培养基(不含胎牛血清)中分别加入50μl，25μl，12.5μl，6.25μl，3.125μl，1.5625μl慢病毒，充分混匀，保证慢病毒均匀分布在培养基中，每管中加入4μl 10mg/ml的polybrene溶液(溴化己二甲铵，主要用于提高慢病毒感染细胞的效率，通过中和细胞表面的唾液酸和病毒粒子之间的电荷排斥实现)；吸弃10cm细胞培养皿中的培养基，加入含有慢病毒的DMEM培养基，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h；吸弃10cm细胞培养皿中的培养基，加入10ml正常细胞培养基，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h；每个10cm细胞培养皿中加入20μl浓度为1mg/ml的嘌呤霉素(puromycin)溶液，使其终浓度为2μg/ml，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每隔3天换一次含有2μg/ml嘌呤霉素的DMEM细胞培养基；连续培养3到5周，在某些培养皿中能看到独立的单细胞克隆形成；用记号笔在培养皿上克隆对应的位置画上标记，在cylinder的保护下，每个克隆中加入20μl胰蛋白酶消化细胞，大约消化3min后向每个cylinder中加入50μl含有血清的DMEM细胞培养基；吹打重悬克隆，将细胞转移到24孔细胞培养板中，每孔加入0.5mlDMEM细胞培养基，置于培养箱中培养6-8h；待细胞贴壁后，吸走细胞培养液，加入新的含有2μg/ml嘌呤霉素的DMEM细胞培养基，置于培养箱中培养；连续培养1到3周，每隔3天换一次含有2μg/ml嘌呤霉素的DMEM细胞培养基；当细胞密度达到80％以上时，用胰蛋白酶消化细胞转移到12孔板中，每隔3天换一次含有2μg/ml嘌呤霉素的DMEM细胞培养基；当12孔板中的细胞密度达到80％以上时，提取细胞基因组或用蛋白裂解液提取细胞蛋白，通过DNA测序及免疫印迹法检测基因敲除情况。

六、Sanger测序法鉴定单克隆细胞株HCBP6基因敲除情况

用胰蛋白酶消化细胞后加入200μl PBS溶液重悬细胞，用基因组提取试剂盒提取细胞基因组DNA，通过PCR扩增sgRNA靶点序列附近750bp左右的DNA片段(期间摸索了HCBP6靶向敲除区PCR引物最佳退火温度，结果如图2所示，在后续实验中，在扩增sgRNA1和sgRNA2靶向序列附近序列时，以63.1℃为最佳退火温度，PCR产物进行测序。

其中，利用primer 4.0设计用来扩增HCBP6基因sgRNA1靶向序列“CCACTTGGCTTCCGGCACGT(SEQ ID No.6)”和sgRNA2靶向序列“ACCACTTGGCTTCCGGCACG(SEQID No.7)”附近区域序列的PCR引物及测序引物：

正向PCR引物HCBP6-sg1-PCR-F：5’-ATCTCGGTGCATCTGTTGGG-3’；

反向PCR引物HCBP6-sg1-PCR-R：5’-ACGTGCTCCACTGCGAATTA-3’；

PCR产物测序引物：

正向PCR引物HCBP6-sg1-PCR-F：5’-ATCTCGGTGCATCTGTTGGG-3’。

DNA测序结果显示，HCBP6基因敲除细胞系18号克隆(HCBP6#18，sgRNA1靶序列)、21号克隆(HCBP6#21，sgRNA1靶序列)、36号克隆(HCBP6#36，sgRNA1靶序列)在靶向序列附近有23bp缺失、117bp缺失、1bp插入，说明在DNA水平上，这三个克隆的HCBP6基因都发生了突变，都在基因水平实现了基因敲除。

其中，18号克隆(HCBP6#18，sgRNA1靶序列)为将HepG2细胞中的HCBP6基因中SEQID No.1的第1-23位缺失后得到的细胞系。21号克隆(HCBP6#21，sgRNA1靶序列)为将HepG2细胞中的的HCBP6基因中SEQ ID No.1的第18-133位和SEQ ID No.2的第1位缺失后得到的细胞系(共缺失117bp)。36号克隆(HCBP6#36，sgRNA1靶序列)为将HepG2细胞中的HCBP6基因中SEQ ID No.1的第21位和第22位之间插入一个碱基G后得到的细胞系。

七、Western Blot鉴定单克隆细胞株HCBP6基因敲除情况

为了更进一步确认相关HCBP6基因的敲除，我们通过western blot来检测这3株基因敲除细胞系(18号克隆、21号克隆和36号克隆)中HCBP6的蛋白表达。

使用RIPA蛋白裂解液裂解细胞，离心后测定蛋白浓度，取20μg蛋白样品与6×SDS蛋白上样缓冲液混匀后100℃煮沸5-10分钟，上层8％浓缩胶、下层12％的分离胶进行SDS-PAGE蛋白电泳，80V 30分钟后120V 50分钟；半干转仪恒压15V转膜1h；用含5％脱脂牛奶的TBST室温封闭1小时；兔抗人HCBP6多克隆抗体(Abnova公司，货号H00065991-D02P)1:1000、鼠抗人β-actin单克隆抗体(Abnova公司，货号H00000060-M0)1:2000分别稀释于TBST溶液中，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10分钟；羊抗兔二抗1:2000和羊抗鼠二抗1:2000分别稀释于TBST溶液，室温下孵育1小时。TBST洗涤3次，每次10分钟。将ECL显色液A液和B液各取1ml混合后利用凝胶成像仪成像。

结果显示：#18、#36号克隆中没有相应HCBP6蛋白的表达，说明#18、#36号克隆在基因水平和蛋白水平上同时实现了HCBP6基因敲除。而#21号克隆中仍然能观察到HCBP6蛋白表达水平的明显下降，提示#21号克隆中未实现HCBP6的基因敲除。具体见图3。

CRICPR/Cas9技术因其简单高效、成本低廉、能精确靶向编辑目标基因位点等广泛应用于生物医学领域，但目前此技术最大的问题就是脱靶效应的存在，如何尽量避免或降低脱靶效应是在运用CRICPR/Cas9技术进行基因敲除时必须考虑的问题，本发明的应对策略是在设计sgRNA时利用sgRNA设计网站选择脱靶效应尽可能低的sgRNA。另外，针对同一靶基因进行基因敲除时，需要设计多对sgRNA序列，才能保证敲除的效果。同时设计多条sgRNA，最后在获得的基因敲除克隆中挑选出没有明显脱靶效应存在的克隆。在进行基因敲除时另一个问题是如何保证基因在DNA水平和蛋白质水平上同时敲除。本发明发现，当一个基因具有多个CDS时，针对CCDS的sgRNA通常情况下并不是靶向敲除所有CDS。为了能高效的实现基因的完全敲除，设计的sgRNA所对应基因上的靶标序列要尽量是所有CDS所必需的。

本发明利用CRICPR/Cas9系统构建的HCBP6基因敲除细胞系，与RNAi技术比较，是在DNA水平对HCBP6基因产生了编辑，完全沉默了HCBP6的表达，为HCBP6功能和作用机制研究方面提供了一种实用工具，在新药研发等方面具有较高应用价值。

<110> 中国人民解放军第三0二医院

<120> 一种HCBP6基因敲除细胞系及其构建方法

<130> GNCLN180271

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 133

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

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atggaaacat ctgccccacg tgccggaagc caagtggtgg cgacaactgc gcgccactcc 60

gcggcctacc gcgcagatcc tctacgtgtg tcctcgcgag acaagctcac cgaaatggcc 120

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<213> 人（Homo sapiens）

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gaaactttga gggaaatttt gagtcactgg accttgcgga atttgctaag aagcagccat 60

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gtgcacaggt ttcatattcc agaaggttgg aaagttggct gcaacagctg tgggaggtgg 60

attttttctc cttcag 76

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cttgcaaacc atactgggta catcaaagtt gactggcaac gagtggagaa ggacatgaag 60

aaagccaaag agcagctgaa gatccgtaag agcaatcaga tacctactga ggtcaggagc 120

aaagctgagg ag 132

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<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 5

gtggtgtcat ttgtgaagaa gaatgttcta gtaactgggg gatttttcgg aggctttctg 60

cttggcatgg catcctaa 78

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

ccacttggct tccggcacgt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

accacttggc ttccggcacg 20

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

caccgccact tggcttccgg cacgt 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

aaacacgtgc cggaagccaa gtggc 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

caccgaccac ttggcttccg gcacg 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 11

aaaccgtgcc ggaagccaag tggtc 25

Claims

1.一种构建HCBP6基因敲除细胞系的方法，是采用CRISPER/Cas9技术构建HCBP6基因敲除细胞系，其特征在于：所述方法以HCBP6蛋白的编码序列中SEQ ID No.6或SEQ ID No.7为靶序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法为如下方法A或方法B：

方法A，包括如下步骤：

（a1）合成名称为正向单链DNA1和名称为反向单链DNA1的两个单链DNA；所述正向单链DNA1的序列如SEQ ID No.8所示；所述反向单链DNA1的序列如SEQ ID No.9所示；

（a2）将所述正向单链DNA1和所述反向单链DNA1进行退火反应，得到双链DNA1；

（a3）将所述双链DNA1连接到LentiCRISPRv2质粒的限制性内切酶BsmB I的切割位点处，得到的重组质粒记为LentiCRISPRv2-HCBP6-1；

（a4）将psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和步骤（a3）构建的重组质粒LentiCRISPRv2-HCBP6-1共转染人胚肾细胞HEK 293T，得到重组细胞，培养所述重组细胞得到慢病毒上清；

（a5）将步骤（a4）得到的慢病毒上清感染HepG2细胞，从感染后的细胞中获得HCBP6基因被敲除的细胞系；

方法B，包括如下步骤：

（b1）合成名称为正向单链DNA2和名称为反向单链DNA2的两个单链DNA；所述正向单链DNA2的序列如SEQ ID No.10所示；所述反向单链DNA2的序列如SEQ ID No.11所示；

（b2）将所述正向单链DNA2和所述反向单链DNA2进行退火反应，得到双链DNA2；

（b3）将所述双链DNA2连接到LentiCRISPRv2质粒的限制性内切酶BsmB I的切割位点处，得到的重组质粒记为LentiCRISPRv2-HCBP6-2；

（b4）将psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和步骤（b3）构建的重组质粒LentiCRISPRv2-HCBP6-2共转染人胚肾细胞HEK 293T，得到重组细胞，培养所述重组细胞得到慢病毒上清；

（b5）将步骤（b4）得到的慢病毒上清感染HepG2细胞，从感染后的细胞中获得HCBP6基因被敲除的细胞系。

3.质粒，其特征在于：所述质粒为权利要求2中所述的LentiCRISPRv2-HCBP6-1或者LentiCRISPRv2-HCBP6-2。

4.成套质粒，其特征在于：所述成套质粒由psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和权利要求2中所述的LentiCRISPRv2-HCBP6-1组成；或者由psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和权利要求2中所述的LentiCRISPRv2-HCBP6-2组成。

5.权利要求3所述质粒或权利要求4所述的成套质粒的用途，其特征在于：所述用途为基于CRISPR-Cas9敲除HepG2细胞中的HCBP6基因。

6.用于构建HCBP6基因敲除细胞系的试剂盒，含有权利要求3所述的质粒或权利要求4所述的成套质粒及说明书；所述说明书中记载有权利要求1或2所述的方法。