CN104651401A - 一种mir-505双等位基因敲除的方法 - Google Patents

一种mir-505双等位基因敲除的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种mir-505双等位基因敲除的方法，包括：构建两种针对mir-505基因的打靶载体，在哺乳动物细胞中通过CRISPR/Cas系统介导打靶载体对mir-505基因进行替换敲除，利用G418抗性筛选得到mir-505单等位基因敲除细胞，并在该细胞基础上再一次利用CRISPR/Cas系统和绿色荧光打靶载体作用对另一条mir-505进行敲除，通过荧光筛选得到mir-505双等位基因敲除的细胞。本发明为构建基因彻底敲除细胞模型提供帮助，具有良好的应用前景。

Description

一种mir-505双等位基因敲除的方法
技术领域
本发明属于基因敲除领域，特别涉及一种mir-505双等位基因敲除的方法。
背景技术
1987年，日本课题组在E.coli K12的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列[IshinoY，Shinagawa H，Makino K，et al.Nucleotide sequence of the iap gene,responsible for alkalinephosphatase isozyme conversion in Escherichia coli,and identification of the gene produce.JBacteriol,1987,169(12):5429-5433]，在之后的研究中发现这类间隔重复序列广泛存在于细菌和古生菌的基因组中，在2002年，被科学家正式命名为规律成簇间隔短小回文重复序列(CRISPR)[Jansen R,van Embden J D,Gaastra W,et al.Identification of a novel family of sequencerepeats among prokaryotes.Omics:a journal of Intearative Biology,2002,6(1):23-33]、[Mojica FJ,Ferrer C,Juez G,et al.Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons ofthe archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in repliconpartitioning.Mol Microbiol,1995,17(1):85-93]、[Jansen R,Embden J D,Gaastra W,et al.Identificationof genes that are associated with DNA repeats inprokaryotes.MolMicrobiol,2002,43(6):1565-1575]。
CRISPR发现是一种细菌和古生菌的一种免疫系统，它是由一列短小的保守重复序列被具有相似大小的独特的DNA序列所间隔，一种独特的DNA序列叫做间隔区，这些间隔区通常来源于噬菌体或质粒DNA。CRISPR列和Cas(CRISPR-associated)基因形成CRISPR-Cas适应免疫系统[Horva th,P.and Barrangou,R.(2010)CRISPR/Cas,the immune system of bacteria and archaea.Science 327,167–170]、[Barrangou,R.et al.(2007)CRISPR provides acquiredresistance against viruses in prokaryotes.Science 315,1709–1712]、[Gasi unas,G.et al.(2013)Molecular mechanisms of CRISPR-mediated microbial immunity.Cel l Mol.Life Sci.http://dx.doi.or g/10.1007/s00018-013-1438-6]。CRISPR/Cas系统的功能是这样行使的：将入侵的核酸片段作为间隔区合并入宿主基因组，随后将这些间隔区作为模板，产生小RNA分子(crRNA)，这些crRNA能够和Cas蛋白结合成为效应复合物，它能够在下一轮的侵染中将外源核酸沉默掉。
Type II系统仅仅需要Cas9蛋白(以前称为Cas5或Csn1)就可以用于DNA干扰[MojicaF J,Diez-Villasenor C,Garcia-Martinez J,et al.Intervening sequences of regularly spaced prokaryoticrepeats derive from foreign genetic elements.J Mol Evol,2005,60(2):174-182]、[Sapranauskas,R.etal.(2011)The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity inEscherichia coli.Nucleic Acids Res.39,9275–9282]、[Deltcheva,E.et al.(2011)CRISPR RNAmaturation by trans-encoded small RNA and host factor Rnase III.Nature 471,602–607]、[Garneau,J.E.et al.(2010)The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage andplasmid DNA.Nature 468,67–71]。Type II系统进行靶基因的双链断裂的步骤：(i)pre-crRNA和tracrRNA从CRISPR位点被转录下来；(ii)tracrRNA和pre-crRNA中的正向重复序列杂交形成双链，并与Cas9结合，pre-crRNA通过RNase III和某未知核酸酶作用形成成熟的crRNA。该成熟的crRNA中包含有短的间隔序列；(iii)成熟crRNA:tracrRNA杂交双链引导Cas9蛋白到靶DNA位点，DNA靶点需含有protospacer和必需的PAM(protospacer adjacent motif)，这一过程是通过crRNA的间隔序列于protospacer DNA间形成杂化双链来完成；(iv)Cas9蛋白介导靶位DNA中PAM上游进行剪切，在protospacer中进行双链断裂。
2010年，Verduci L等发现miR-505能通过作用于其靶标ASF/SF2(可变剪接因子)发挥调控小鼠胚胎成纤维细胞的增殖和衰老/凋亡的作用[Verduci,L,Simili M,Rizzo M,MercatantiA,Evangelista M et al.(2010)MicroRNA(miRNA)-mediated Interaction between Leukemia/Lymphoma-related Factor(LRF)and Alternative splicing factor/splicing factor 2(ASF/SF2)affectsmouse embryonic fibroblast senescence and apoptosis.J Biol Chem,285:39551-39563]，Karni R等发现在许多细胞中转染ASF/SF2可以激活mTOR部分信号通路[Karni R,Hippo Y,Lowe SW,Krainer AR(2008)The splicing-factor oncoprotein SF2/ASF activates mTORC1.Proc Natl AcadSci USA 105(40):15323-15327]，但是ASF参与调控mTOR的具体方式还不清楚。Yamamoto Y等在研究肿瘤多药抗性时，发现miR-505是一个新的肿瘤抑制miRNA，与其呈现负相关的蛋白Akt3，与mTOR通路上的AKT属于同一基因家族[Yamamoto Y,Yoshioka Y,Minoura K,Takahashi R,Takeshita F et al.,(2011)An integrative genomic analysis revealed the relevance ofmicroRNA and gene expression for drug-resistance in human breast cancer cells.Mol Cancer,10:13539551-39563]。因此miR-505极有可能通过调控mTOR信号通路发挥其生物学功能，而mTOR通路是目前分子生物学研究的热点，它能整合细胞内和细胞间的信号，起到调控细胞代谢，生长，增殖和存活等过程的中心调控者的作用，mTOR通路的改变与多种疾病相关[Mathieu Laplante and David M.Sabatini，mTOR signaling at a glance(2009)J Cell Sci 122,3589-3594]。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种mir-505双等位基因敲除的方法，该方法为构建基因彻底敲除细胞模型提供帮助，具有良好的应用前景。
本发明的一种mir-505双等位基因敲除的方法，包括：
(1)将pIRES-neo2载体经Xho I酶切后，将扩增得到的3’同源臂，通过同源重组的方法将3’同源臂插入到pIRES-neo2载体的Xho I位点；然后载体经Nru I酶切后，将扩增得到的5’同源臂，通过同源重组的方法将5’同源臂插入到neo-Xho I载体的Nru I位点，得到neo-Xho I-NruI载体；
(2)将pIRES-neo2载体在克隆位点双酶切后，将从pEGFP-C1载体上切割下来的EGFP基因插入载体中，得到neo-EGFP载体；载体经Xho I酶切后，将扩增得到的3’同源臂，通过同源重组的方法将3’同源臂插入到neo-EGFP载体的Xho I位点；然后载体经Nru I酶切后，将扩增得到的5’同源臂，通过同源重组的方法将5’同源臂插入到neo-EGFP-Xho I载体的Nru I位点，得到neo-EGFP-Xho I-Nru I载体；
(3)将CRISPR/Cas系统载体和neo-Xho I-Nru I载体共同转染哺乳动物细胞，将mir-505基因被外源neo基因替换，通过G418抗性筛选得到mir-505单等位基因敲除细胞；再一次将CRISPR/Cas系统载体和neo-EGFP-Xho I-Nru I载体共同转染mir-505单等位基因敲除细胞，将另一条mir-505基因被外源EGFP和neo基因替换，挑选得到表达绿色荧光蛋白的细胞即mir-505双等位基因敲除细胞。
所述步骤(1)和(2)中的3’同源臂具体为：以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用Hotstart Taq酶特异性扩增得到的858bp mir-505基因的3’同源臂。
所述步骤(1)中的5’同源臂具体为：以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用HotstartTaq酶特异性扩增得到的1559bp mir-505基因的5’同源臂。
所述步骤(2)中的5’同源臂具体为：以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用HotstartTaq酶特异性扩增得到的444bp mir-505基因的5’同源臂。
所述步骤(2)中的双酶切为EcoR V和BamH I双酶切。
所述步骤(2)中的EGFP基因插入载体采用T4连接酶酶连的方法插入。
所述步骤(3)中的哺乳动物细胞为HEK293A细胞。
本发明旨在建立一种在哺乳动物细胞中将mir-505基因进行双等位基因敲除的方法。首先针对mir-505基因位点设计sgRNA，并将其插入到sgRNA表达载体(42230载体)中。随后根据mir-505基因，分别设计两种打靶载体——neo-EGFP-Xho I-Nru I载体(携带绿色荧光蛋白基因和新霉素基因的打靶载体)和neo-Xho I-Nru I载体(只携带新霉素基因的打靶载体)。由于通过CRISPR/Cas系统能够在mir-505靶点发生双链断裂，从而大大增加打靶载体发生同源重组的效率，因此在CRISPR/Cas系统介导下通过打靶载体发生同源重组将整个mir-505基因替换敲除，从而在哺乳动物细胞中将mir-505基因进行双等位基因敲除。
本发明技术方案包括分别构建两种针对mir-505基因的打靶载体，即在pIRES-neo2载体的Xho I位点和Nru I位点插入mir-505基因3’和5’同源臂，其中一个打靶载体还会在多克隆位点插入EGFP基因。构建好载体后对载体进行菌落PCR检测和测序确认，从而得到mir-505基因的打靶载体——neo-EGFP-Xho I-Nru I载体和neo-Xho I-Nru I载体。
先将构建好的neo-Xho I-Nru I载体和针对mir-505基因的CRISPR系统质粒共同转染哺乳动物细胞。转染24小时后，加入700ug/ml的G418进行抗性筛选，筛选4周后得到mir-505单等位基因敲除细胞。提取细胞基因组DNA，通过real-time PCR方法对mir-505基因拷贝数进行检测，检测基因敲除情况。在此基础上，再一次利用CRISPR系统和neo-EGFP-Xho I-NruI载体对单等位基因敲除细胞进行基因敲除，得到能表达绿色荧光蛋白的细胞就是mir-505双等位基因敲除细胞。
本发明构建了能够在哺乳动物细胞中能够将mir-505整体敲除的两种打靶载体——带EGFP打靶载体和不带EGFP打靶载体。通过两次CRISPR系统介导下结合打靶载体，分别两次对mir-505基因进行敲除，从而构建mir-505双等位基因敲除细胞。本发明在构建neo-EGFP-Xho I-Nru I载体是在pIRES-neo2载体的多克隆位点插入EGFP片段，在正确插入的载体上，再在Xho I位点和Nru I位点插入mir-505基因两条同源臂。在构建neo-Xho I-NruI载体是在pIRES-neo2载体在Xho I位点和Nru I位点插入mir-505基因两条同源臂。最后都通过菌落PCR和测序得到正确构建的打靶载体。先将构建好的neo-Xho I-Nru I载体和针对mir-505基因的CRISPR系统质粒共同转染哺乳动物细胞。转染一段时间后，加入700ug/ml的G418进行抗性筛选，筛选4周后得到mir-505单等位基因敲除细胞。提取细胞基因组DNA，通过real-time PCR方法对mir-505基因拷贝数进行检测，检测基因敲除情况。在此基础上，再一次利用CRISPR系统和neo-EGFP-Xho I-Nru I载体对单等位基因敲除细胞进行基因敲除，得到能表达绿色荧光蛋白的细胞就是mir-505双等位基因敲除细胞。由于一次敲除，通过同源重组一般只能敲除其中一条等位基因，通过两种打靶载体，两次敲除能够筛选得到双等位基因敲除细胞，为构建基因彻底敲除细胞模型提供帮助。
有益效果
本发明构建了能够在哺乳动物细胞中能够将mir-505整体敲除的两种打靶载体——带EGFP打靶载体和不带EGFP打靶载体。通过两次CRISPR系统介导下结合不同的打靶载体，分别两次对mir-505基因进行敲除，两次可以分别用不同的筛选方式进行筛选，以区分单敲除和双敲除细胞，从而构建mir-505双等位基因敲除细胞。
本发明在构建neo-EGFP-Xho I-Nru I载体是在pIRES-neo2载体的多克隆位点插入EGFP片段，在正确插入的载体上，再在Xho I位点和Nru I位点插入mir-505基因两条同源臂。在构建neo-Xho I-Nru I载体是在pIRES-neo2载体在Xho I位点和Nru I位点插入mir-505基因两条同源臂。最后都通过菌落PCR和测序得到正确构建的打靶载体。先将构建好的neo-XhoI-Nru I载体和针对mir-505基因的CRISPR系统质粒共同转染哺乳动物细胞。转染一段时间后，加入700ug/ml的G418进行抗性筛选，筛选4周后得到mir-505单等位基因敲除细胞。提取细胞基因组DNA，通过real-time PCR方法对mir-505基因拷贝数进行检测，从结果发现通过一次CRISPR系统介导的mir-505基因敲除结果普遍发生单等位基因敲除。为了能够将mir-505进行彻底敲除即双等位基因敲除,因此在此基础上，再一次利用CRISPR系统和neo-EGFP-Xho I-Nru I载体对单等位基因敲除细胞进行基因敲除，得到能表达绿色荧光蛋白的细胞就是mir-505双等位基因敲除细胞。由于一次敲除，通过同源重组一般只能敲除其中一条等位基因，通过两种打靶载体的结合使用，通过两次敲除能够筛选得到双等位基因敲除细胞，为构建基因彻底敲除细胞模型提供方法学帮助。
附图说明
图1为EGFP酶切片段及pIRES-neo2载体双酶切电泳图；其中，1为pEGFP-C1经Nhe I和Bgl II双酶切，2为pIRES-neo2载体经EcoR V和BamH I双酶切，M为DNA marker；
图2为候选neo-EGFP载体酶切鉴定电泳图；其中，1为neo-EGFP-1#酶切，2为neo-EGFP-1#未酶切，3为neo-EGFP-5#酶切，4为neo-EGFP-5#未酶切，5为neo-EGFP-6#酶切，6为neo-EGFP-6#未酶切，7为pIRES-neo2酶切，8为pIRES-neo2未酶切，M为DNA marker；
图3为mir-505基因3’同源臂扩增电泳图；其中，1-4为3’同源臂，M为DNA marker；
图4为neo-EGFP-Xho I载体菌落PCR鉴定结果；其中，1-16为单菌落，M为DNA marker；
图5为mir-505基因3’同源臂扩增电泳图；其中，1为5’同源臂，M为DNA marker；
图6为neo-EGFP-Xho I-Nru I载体菌落PCR鉴定结果；其中，1-16为单菌落，M为DNA marker；
图7为neo-Xho I载体菌落PCR鉴定结果；其中，1-16为单菌落，M为DNA marker；
图8为mir-505基因3’同源臂扩增电泳图；其中，1为5’同源臂，M为DNA marker；
图9为neo-Xho I-Nru I载体菌落PCR鉴定结果；其中，1-16为单菌落，M为DNA marker；
图10为经G418筛选后的mir-505单等位基因敲除细胞；
图11为mir-505基因拷贝数检测结果；其中，9-13#为筛选得到的mir-505knockout细胞，WT为HEK 293A细胞；
图12为mir-505双等位基因敲除细胞；
图13为本发明打靶载体构建图及敲除原理。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)构建neo-EGFP-Xho I-Nru I载体(带EGFP打靶载体)
A.EGFP片段的获得
以pEGFP-C1载体为供体，通过酶切的方式得到EGFP片段。先用Nhe I单酶切pEGFP-C1载体，并用Klenow酶将粘性末端补平，从而变成平末端，在此基础上再用Bgl II进行单酶切，从而获得一端是平末端而另一端是粘性末端的EGFP片段。酶切产物经过1％琼脂糖凝胶电泳后，如图1所示，pEGFP-C1载体的确被切出了一条750bp的小片段，这个小片段就是实验所需的EGFP片段，随后利用割胶回收的方法获得EGFP片段。
B.构建neo-EGFP载体
pIRES-neo2载体经EcoR V和BamH I双酶切线性化处理后，形成一段是平末端而另一端是粘性末端的线性化载体。而所得到的EGFP片段同样具有一端是平末端而另一端是粘性末端的特性。利用T4连接酶酶连的方法将EGFP片段插入到pIRES-neo2载体中，从而构建重组质粒neo-EGFP，随后将重组质粒进行转化。随机挑选3个单菌落(1#，5#，6#)提取质粒，并进行单酶切鉴定，结果如图2所示。经单酶切鉴定后发现，质粒大小为neo-EGFP-1#>neo-EGFP-5#＝pIRES-neo2>neo-EGFP-6#。据此判断，neo-EGFP-1#中插入了EGFP片段，而其余两个候选质粒没有插入目的片段。
C.PCR扩增mir-505基因3’同源臂
以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用Hotstart Taq酶特异性扩增mir-505基因的3’同源臂。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，能够在858bp处出现单一条带，证明扩增特异性良好，结果如图3所示。用下列一对引物进行PCR扩增：EGFP-505-R-F：CCAGCTGGGGCTCGAGGGAGCATCGCCAAGTTCG；EGFP-505-R–R：CTAGAATGCACTCGAGGCCAGTGCCTCCTTCTGA。
D.构建neo-EGFP-Xho I载体
将载体neo-EGFP经Xho I单酶切线性化处理后，3’同源臂的两端与线性化载体两端具有碱基同源性，利用同源重组的方法将插入片段整合插入neo-EGFP载体中，从而构建重组质粒neo-EGFP-Xho I。随后将重组质粒进行转化，随后挑选单菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定结果如图4所示。用下列一对引物对单菌落进行PCR鉴定：neo2-Xho I-L：TTGGGAAGACAATAGCAGGC；neo2-Xho I–R：CCATGATTACGCCAAGCTCT。经菌落PCR反应后跑琼脂糖凝胶电泳，结果会出现两种情况：一种是在173bp处出现条带，这表示目的片段并没有插入到载体中，因此扩增出短片段；另一种是在1004bp处出现条带，这表示目的片段成功插入到载体中，因此能够扩增出长片段。
为了确保插入片段的碱基是完全正确的，随后将菌落PCR筛选出的阳性克隆进行测序鉴定。测序引物：neo2-Xho I-L：TTGGGAAGACAATAGCAGGC；neo2-Xho I–R：CCATGATTACGCCAAGCTCT。
E.PCR扩增mir-505基因5’同源臂
以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用Hotstart Taq酶特异性扩增mir-505基因的5’同源臂。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，能够在444bp处出现单一条带，证明扩增特异性良好，结果如图5所示。用下列一对引物进行PCR扩增：EGFP-505-L-F：TTTTGCGCTGCTTCGCGAACGCTTGCGGATGTGATT；EGFP-505-L–R：CTGGCCCGTACATCGCGATTGGTCCTTGGCTGGTGT。
F.构建neo-EGFP-Xho I-Nru I载体
将载体neo-EGFP-Xho I经Nru I单酶切线性化处理后，5’同源臂的两端与线性化载体两端具有碱基同源性，利用同源重组的方法将插入片段整合插入neo-EGFP-Xho I载体中，从而构建重组质粒neo-EGFP-Xho I-Nru I。随后将重组质粒进行转化，随后挑选单菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定结果如图6所示。用下列一对引物对单菌落进行PCR鉴定：neo2-Nru I-L：GCTACAACAAGGCAAGGCTT；neo2-Nru I–R：GTCAACGCGTATATCTGGCC。经菌落PCR反应后跑琼脂糖凝胶电泳，结果会出现两种情况：一种是在103bp处出现条带，这表示目的片段并没有插入到载体中，因此扩增出短片段；另一种是在516bp处出现条带，这表示目的片段成功插入到载体中，因此能够扩增出长片段。
为了确保插入片段的碱基是完全正确的，随后将菌落PCR筛选出的阳性克隆进行测序鉴定。测序引物：neo2-Nru I-L：GCTACAACAAGGCAAGGCTT；neo2-Nru I–R：GTCAACGCGTATATCTGGCC。
(2)构建neo-Xho I-Nru I载体(不带EGFP打靶载体)
A.PCR扩增mir-505基因3’同源臂
以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用Hotstart Taq酶特异性扩增mir-505基因的3’同源臂。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，能够在858bp处出现单一条带，证明扩增特异性良好。用下列一对引物进行PCR扩增：505-R-F：CCAGCTGGGGCTCGAGGGAGCATCGCCAAGTTCG；505-R-R：CTAGAATGCACTCGAGGCCAGTGCCTCCTTCTGA。
B.构建neo-Xho I载体
将载体pIRES-neo2经Xho I单酶切线性化处理后，3’同源臂的两端与线性化载体两端具有碱基同源性，利用同源重组的方法将插入片段整合插入pIRES-neo2载体中，从而构建重组质粒neo-Xho I。随后将重组质粒进行转化，随后挑选单菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定结果如图7所示。用下列一对引物对单菌落进行PCR鉴定：neo2-Xho I-L：TTGGGAAGACAATAGCAGGC；neo2-Xho I–R：CCATGATTACGCCAAGCTCT。经菌落PCR反应后跑琼脂糖凝胶电泳，结果会出现两种情况：一种是在173bp处出现条带，这表示目的片段并没有插入到载体中，因此扩增出短片段；另一种是在1004bp处出现条带，这表示目的片段成功插入到载体中，因此能够扩增出长片段。
为了确保插入片段的碱基是完全正确的，随后将菌落PCR筛选出的阳性克隆进行测序鉴定。测序引物：neo2-Xho I-L：TTGGGAAGACAATAGCAGGC；neo2-Xho I–R：CCATGATTACGCCAAGCTCT。
C.PCR扩增mir-505基因5’同源臂
以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用Hotstart Taq酶特异性扩增mir-505基因的5’同源臂。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，能够在1559bp处出现单一条带，证明扩增特异性良好，结果如图8所示。用下列一对引物进行PCR扩增：505-L-F：TTTTGCGCTGCTTCGCGAAAGAGGGTGAATGCATGGGA；505-L–R：CTGGCCCGTACATCGCGACTGGAAGCTTGCACATGGTT。
D.构建neo-Xho I-Nru I载体
将载体neo-Xho I经Nru I单酶切线性化处理后，5’同源臂的两端与线性化载体两端具有碱基同源性，利用同源重组的方法将插入片段整合插入neo-Xho I载体中，从而构建重组质粒neo-Xho I-Nru I。随后将重组质粒进行转化，随后挑选单菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定结果如图9所示。用下列一对引物对单菌落进行PCR鉴定：neo2-Nru I-L：
GCTACAACAAGGCAAGGCTT；neo2-Nru I–R：GTCAACGCGTATATCTGGCC。经菌落PCR反应后跑琼脂糖凝胶电泳，结果会出现两种情况：一种是在103bp处出现条带，这表示目的片段并没有插入到载体中，因此扩增出短片段；另一种是在1631bp处出现条带，这表示目的片段成功插入到载体中，因此能够扩增出长片段。
为了确保插入片段的碱基是完全正确的，随后将菌落PCR筛选出的阳性克隆进行测序鉴定。测序引物：neo2-Nru I-L：GCTACAACAAGGCAAGGCTT；neo2-Nru I–R：GTCAACGCGTATATCTGGCC。
(3)G418筛选得到mir-505单等位基因敲除细胞
实验前将HEK293A细胞以1.5×105细胞/孔的密度铺于24孔板中，确保各孔细胞生长状态良好，密度相仿，待细胞为单层并处于对数中期，细胞汇合度在70％～80％时进行转染。将neo-Xho I-Nru I载体和CRISPR系统载体共转染HEK293A细胞，转染后细胞置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育24小时。24小时后，将细胞消化下来，重新铺到6孔板中，待细胞贴壁后，加入700ug/ml浓度G418进行抗性筛选。大约每3天更换新鲜培养基和添加新的G418。加药
筛选4周后存活的细胞则为mir-505单等位基因敲除细胞。结果如图10所示。
(4)mir-505单等位基因敲除细胞mir-505拷贝数检测
由于mir-505是双等位基因，在基因组中有两个位点，因此通过CRISPR系统介导的同源重组将mir-505进行替换的方法进行基因敲除。在所筛选出的knockout细胞中的敲除情况如何，是当等位基因敲除或是双等位基因敲除，通过Real-Time PCR的方法对筛选得到的细胞进行拷贝数的检测。有EMX1基因作为对照，因为该基因位于1号染色体上，在基因组中存在两个拷贝，通过与其进行对比，了解mir-505在knockout细胞中的拷贝数，结果如图11所示。从图中可以看出与野生型HEK 293A细胞相比，在knockout细胞中mir-505基因拷贝数明显降低，说明在细胞基因组当中，mir-505基因的确成功被外源细胞替换而被敲除，且基本上是单等位基因的敲除。
(5)mir-505双等位基因敲除细胞的获得
在mir-505单等位基因敲除细胞的基础上，再一次通过CRISPR/Cas系统介导将另一条等位基因敲除，从而实现mir-505的双等位基因敲除。实验选择无EGFP的mir-505单等位基因敲除细胞作为实验对象，在CRISPR/Cas系统介导下，经由neo-EGFP-Xho I-Nru I载体的同源重组修复，得到的带绿色荧光的细胞则是mir-505双等位基因敲除细胞。通过筛选得到的双等位基因敲除细胞如图12所示。
这就在CRISPR系统介导下，通过两个打靶载体的结合使用，从而得到mir-505双等位基因敲除细胞，为建立基因彻底敲除细胞模型提供方向。

Claims (7)

1.一种mir-505双等位基因敲除的方法，包括：
(1)将pIRES-neo2载体经Xho I酶切后，将扩增得到的3’同源臂，通过同源重组的方法将3’同源臂插入到pIRES-neo2载体的Xho I位点；然后载体经Nru I酶切后，将扩增得到的5’同源臂，通过同源重组的方法将5’同源臂插入到neo-Xho I载体的Nru I位点，得到neo-Xho I-NruI载体；
(2)将pIRES-neo2载体在克隆位点双酶切后，将从pEGFP-C1载体上切割下来的EGFP基因插入载体中，得到neo-EGFP载体；载体经Xho I酶切后，将扩增得到的3’同源臂，通过同源重组的方法将3’同源臂插入到neo-EGFP载体的Xho I位点；然后载体经Nru I酶切后，将扩增得到的5’同源臂，通过同源重组的方法将5’同源臂插入到neo-EGFP-Xho I载体的Nru I位点，得到neo-EGFP-Xho I-Nru I载体；
(3)将CRISPR/Cas系统载体和neo-Xho I-Nru I载体共同转染哺乳动物细胞，将mir-505基因被外源neo基因替换，通过G418抗性筛选得到mir-505单等位基因敲除细胞；再一次将CRISPR/Cas系统载体和neo-EGFP-Xho I-Nru I载体共同转染mir-505单等位基因敲除细胞，将另一条mir-505基因被外源EGFP和neo基因替换，挑选得到表达绿色荧光蛋白的细胞即mir-505双等位基因敲除细胞。
2.根据权利要求1所述的一种mir-505双等位基因敲除的方法，其特征在于：所述步骤(1)和(2)中的3’同源臂具体为：以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用Hotstart Taq酶特异性扩增得到的858bp mir-505基因的3’同源臂。
3.根据权利要求1所述的一种mir-505双等位基因敲除的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的5’同源臂具体为：以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用Hotstart Taq酶特异性扩增得到的1559bp mir-505基因的5’同源臂。
4.根据权利要求1所述的一种mir-505双等位基因敲除的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的5’同源臂具体为：以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用Hotstart Taq酶特异性扩增得到的444bp mir-505基因的5’同源臂。
5.根据权利要求1所述的一种mir-505双等位基因敲除的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的双酶切为EcoR V和BamH I双酶切。
6.根据权利要求1所述的一种mir-505双等位基因敲除的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的EGFP基因插入载体采用T4连接酶酶连的方法插入。
7.根据权利要求1所述的一种mir-505双等位基因敲除的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的哺乳动物细胞为HEK293A细胞。
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