WO2015067089A1 - 外源线粒体导入到哺乳动物细胞中的方法 - Google Patents

外源线粒体导入到哺乳动物细胞中的方法 Download PDF

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WO2015067089A1
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dna
mitochondrial
exogenous
mammalian
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刘兴国
裴端卿
刘景磊
刘雪宾
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中国科学院广州生物医药与健康研究院
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to the field of biological genetic engineering, and in particular to a method for introducing foreign mitochondria into mammalian cells. Background technique
  • Mitochondria are the most important organelles of eukaryotes, responsible for more than 90% of the energy supply of cells. Mitochondria carry independent genomes, mitochondrial DNA, independent genetic transcription and protein translation structures different from the nuclear genome, mammalian cell mitochondrial DNA coding. There are 22 tRNAs, 2 rRNAs, and 13 peptides. These encoded polypeptides are very critical subunits in various protein complexes of mitochondria for aerobic respiration. Numerous studies have shown that mutations or decreased expression of these polypeptides can significantly inhibit cellular aerobic respiration.
  • the third option is to use the techniques of nuclear transfer or cell cytoplasmic hybridization to increase the proportion of exogenous wild-type mitochondria to achieve the transformation of mitochondrial genetic behavior. This type of method does not eradicate endogenous mitochondria and DNA, and this method adds an extra amount of exogenous cytoplasmic components, which introduces some uncertainties.
  • the fourth option is to express TALEN molecules that target mitochondria to achieve destruction of the target sequence.
  • This method has been reported to successfully disrupt mitochondrial DNA with large fragment deletions and specific point mutations, and is the most effective technique for engineering mitochondrial DNA that has been reported so far.
  • this method can only specifically destroy specific sequences, yet The method is to achieve fixed point genetic modification and gene introduction.
  • Humans have discovered mitochondria for more than a hundred years, and have discovered mitochondrial DNA and committed to mitochondrial DNA transformation for decades.
  • effective genetic modification of mitochondrial DNA in mammals has not been achieved, effective mammalian line cells.
  • the mitochondrial genetic modification technology is a world-class technical problem. The entire sequence of mouse mitochondrial DNA, but without any modification, did not achieve artificial synthesis of mitochondria
  • one of the objects of the present invention is to provide a mammalian cell containing exogenous mitochondria.
  • the technical solution to achieve this is as follows:
  • Mammalian cells containing exogenous mitochondria having endocytic function endocytosis.
  • the mitochondria are artificially synthesized mitochondria obtained by introducing exogenous DNA into mitochondria or mitochondrial vesicles, and may also be isolated mammalian cell mitochondria.
  • the exogenous DNA may be artificially synthesized mitochondrial DNA or may be isolated DNA.
  • the exogenous DNA is artificially synthesized mitochondrial DNA, and the source thereof is not limited.
  • the synthetic mitochondrial DNA is an artificially genetically engineered mammalian cell mitochondrial DNA.
  • the synthetic mitochondrial DNA may also be wild-type mammalian cell mitochondrial DNA.
  • the mammalian cell of the present invention refers to a cell having endocytic function, and most preferably a macrophage.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing the above-described cells containing exogenous mitochondria.
  • Exogenous mitochondria are added to a cell culture system in which mammalian cells having endocytosis are cultured, and the cells are cultured to obtain cells containing exogenous mitochondria.
  • the mammalian cell is a macrophage; the culture condition is: 36-38 ° C, a water-saturated closed incubator, 4.5-5.5% C0 2 .
  • Another object of the invention is to provide a synthetic mitochondria.
  • a method for preparing a synthetic mitochondria includes the following steps:
  • the exogenous DNA is isolated wild type DNA; or the exogenous DNA is synthetic mitochondrial DNA, and the synthetic mitochondrial DNA preparation comprises the following steps:
  • Another object of the present invention is to provide a method of introducing foreign mitochondria into a cell.
  • a method of introducing a foreign mitochondria into a mammalian cell comprising the steps of:
  • the exogenous mitochondria obtained in the step (1) are added to a cell culture system in which mammalian cells having endocytosis are cultured, and culture is continued to obtain cells containing exogenous mitochondria.
  • the exogenous mitochondria are mitochondria of isolated mammalian cells Body.
  • the exogenous mitochondria are synthetic mitochondria obtained by introducing exogenous DNA into mitochondria or mitochondrial vesicles.
  • the exogenous DNA is isolated wild type DNA.
  • the exogenous DNA is synthetic mitochondrial DNA
  • the synthetic mitochondrial DNA preparation comprises the steps of:
  • the mammalian cell is a macrophage.
  • the culture condition is: 36-38 ° C, water-saturated closed incubator, 4.5-5.5%
  • the invention utilizes synthetic biological technology to artificially synthesize the complete sequence of mitochondrial DNA, and realizes the fusion expression of GFP and COX-I on the basis of the wild type sequence, which provides a simple and effective technical method for cloning the mitochondrial genome.
  • the invention introduces exogenous mitochondrial DNA into cells based on macrophage endocytosis, enables the gene in the exogenous mitochondria to be stably expressed in mammalian cells, and can be effectively passaged, thereby realizing the utilization of exogenous mitochondria in the cell. Effective function.
  • the method can be used as a novel mitochondrial molecular cloning method to achieve site-directed mutagenesis, gene insertion, gene knockout, gene rearrangement, etc. in mitochondria, thereby realizing any molecular cloning transformation of mammalian mitochondrial DNA without source limitation. High purity is of great significance for the treatment of diseases with mitochondrial DNA mutations.
  • Figure 1 shows the results of exogenous mitochondria entering macrophages as described in Example 1.
  • Figure 1A shows the results of DsRed2 detection, indicating exogenous mitochondria derived from NIH3T3.
  • Figure 1B shows the results of the EYFP assay, which represents the endogenous mitochondria of macrophages.
  • Figure 1C shows the two-color overlay effect.
  • Figure 2 is an in vitro assembled synthetic mitochondria as described in Example 3; Figure 2A is the detection of the correct transcript in the assembled synthetic mitochondria, and Figure 2B is the detection of DNA replication in the assembled synthetic mitochondria.
  • Figure 3 is a fusion expression of GFP-COX I described in Example 4 in mouse macrophage RAW264.7, and Figure 3A shows the location of all mitochondria in the cell indicated by Mito-Tracker Red dye staining.
  • the mitochondria-specific dye Figure 3B shows the GFP signal of the green GFP-COX I fusion gene
  • Figure 3C shows the DAPI staining result, indicating the position of the nucleus
  • Figure 3D shows the result of the three-color overlay.
  • the genetic modification in the present invention refers to the construction of a target sequence of deoxyribonucleic acid (DNA) molecules by in vitro design and total synthesis, and these molecules can be any artificially designed sequences.
  • the genetic modification of the present invention can be designed according to the requirements of the mammalian mitochondrial DNA sequence. Sequences that are identical to wild-type or undergo any sequence modification, including site-directed mutagenesis, gene insertion, gene knockout, and gene rearrangement.
  • Endocytosis also known as inoculation, is the process of transporting extracellular substances into cells through the deformation movement of the plasma membrane. Endocytosis can be divided into three types depending on the size of the influent material and the mechanism of cell entry: phagocytosis, swallowing, receptor-mediated endocytosis.
  • Example 1 The experimental methods in the following examples which do not specify the specific conditions are usually prepared according to the conditions described in the conventional conditions, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), or according to the manufacturing conditions. The conditions recommended by the manufacturer. The various common chemical reagents used in the examples are commercially available products.
  • Example 1 The various common chemical reagents used in the examples are commercially available products.
  • the mitochondrial endogenous mitochondria were labeled with EYFP by stably expressing the mitochondrial-targeted fluorescent protein EYFP in macrophages, and the mitochondrial fluorescent protein DsRed2 was stably expressed in NIH3T3 cells, and the mitochondria of NIH3T3 cells were labeled with DsRed2. Isolation of NIH3T3 mitochondria with DsRed2 labeling, and addition to macrophage culture system, 12 hours later, in the confocal microscope, DsRed2-labeled mitochondria enter macrophages, which can be expressed with macrophages.
  • the mitochondria consistent morphology of the EYFP marker. Specifically:
  • Mouse macrophage cell line RAW264.7 cells and NIH3T3 cell culture medium (high glucose DMEM (purchased from Hyclone, article number: SH30022.01B); 10% fetal bovine serum (purchased from GIBCO, article number: 16000-044); Double antibody (containing 10000 U/ml penicillin and 1000 g/ml streptomycin, diluted 1:100, purchased from GIBCO, Cat. No.: 15140-122)), cultured according to the conventional method.
  • high glucose DMEM purchased from Hyclone, article number: SH30022.01B
  • 10% fetal bovine serum purchased from GIBCO, article number: 16000-044
  • Double antibody containing 10000 U/ml penicillin and 1000 g/ml streptomycin, diluted 1:100, purchased from GIBCO, Cat. No.: 15140-122)
  • the mitoDsRed2 and mitoEYFP plasmids were constructed by molecular cloning, using standard Ds ed2 ( GenBank: AFS63392.1 ) and EYFP ( GenBank: AC048266.1 ) fluorescent protein sequences at the N-terminus plus mitochondrial localization sequence signals.
  • MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSL was constructed in pMXs vector, transfected into corresponding cells by electroporation, and serially cultured in a single cell to obtain a cell line stably expressing fluorescent protein.
  • a circular mitochondrial DNA ie, a circular mitochondrial DNA containing a GFP-COX-I fusion gene, is obtained by introducing a GFP and a Linker sequence into a mouse mitochondrial DNA by inserting a GFP and a Linker sequence, primer synthesis, and DNA splicing. .
  • This example is to obtain circular mitochondrial DNA by gene introduction into mouse mitochondrial DNA, ie, inserting GFP and Linker sequences, specifically, based on the known mitochondrial DNA sequence of wild-type C57 BL/6J mice (sequence source) : NCBI GenBank: EF108336 ) and inserted the GFP gene and Linker sequence at 5328 (specifically as shown in Seq. ID No.1), designed to obtain a circular mitochondria containing GFP-COX-I fusion gene of about 5Kb. DNA.
  • a plurality of DNA fragments of 50 bp to 60 bp to be spliced are obtained by a common primer synthesis method.
  • the Gibson isothermal one-step method is used for DNA splicing
  • the Gibson isothermal one-step enzyme system is: 320 ⁇ l 5 ⁇ ISO buffer (25% PEG-8000, 500 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM MgCl). 2 , 50 mM DTT, 4 dNTPs each 1 mM, 5 mM NAD), 0.64 ⁇ 10 U/ ⁇ T5 exonuclease Epicentre, 20 ⁇ 2 U/ ⁇ Phusion polymerase, 160 ⁇ 40 U/ ⁇ Taq ligase Mix, add sterile water to 1.2 ml, and store at -20 °C after stocking;
  • the fragments to be spliced are mixed in equal proportions to a final concentration of 2 ng/ ⁇ ; 5 ⁇ 1 mixture, 15 ⁇ 1 of the above enzyme system, mixed, and incubated at 50 ° C for 1 hour, Get the correct stitched piece.
  • This example describes the in vitro assembly of the mitochondrial DNA obtained in Example 2 with the mitochondrial vesicle of NIH3T3 RhoO cells to prepare a synthetic mitochondria, and the process of extracting and identifying RNA and DNA from artificially synthesized mitochondria.
  • Figure 2 shows the correct transcript (Figure 2A) and DNA replication ( Figure 2B) detected in synthetic mitochondria.
  • NIH3T3 RhoO medium high glucose DMEM, 10% fetal bovine serum, 5 ( ⁇ g/mL uridine, llO g/mL sodium pyruvate, penicillin and streptomycin)
  • Incubation buffer 1 40mM Tri-HCl 7.4; 25mM NaCl; 5mM MgC12; 10% glycerol
  • lml washing buffer (10% glycerol; 1 OmM Tri-HCl 7.4; 150 mM NaCl; ImM EDTA) was washed three times and centrifuged at 1000 g/min at 4 ° C for 10 min.
  • RNA eluted in the EP tube is re-column, centrifuged at room temperature for more than 8000 g for 1 min;
  • RNA 8 ⁇ 1 (2) After digestion, add ⁇ stop buffer and treat lOmin at 65 °C;
  • the PCR reaction system is as follows:
  • PrimeSTAR enzyme (2.5 U/ ⁇ ) 0.5 ⁇
  • the PCR product was electrophoresed on a 1.5% agarose gel and photographed. The results are shown in Figure 1A.
  • the "positive” lane is the PCR product of the cDNA isolated from the mitochondrial RNA in NIH3T3 cells.
  • the "pathway” is the PCR product of the cDNA isolated after electroporation, and the "negative” lane is the PCR product using only water as a template.
  • This example is a process in which a synthetic mitochondria containing a GFP-COX-I fusion gene is endocytosed into a mouse macrophage cell line, and the results are shown in Fig. 3.
  • Mouse macrophage cell line RAW264.7 cell culture medium high glucose DMEM (purchased from Hyclone, article number: SH30022.01B), 10% fetal bovine serum (purchased from GIBCO, article number: 16000-044), double antibody (containing 10000 U/ml penicillin and lOOOO g/ml streptomycin, 1:100 diluted use, purchased from GIBCO, item number: 15140-122)), according to the conventional method, plate culture;
  • Example 3 The artificially synthesized mitochondria obtained by electroporation in Example 3 were precipitated, resuspended in 20 ( ⁇ LRAW264.7 cell culture medium, uniformly added to the divided culture medium, and the water-saturated closed incubator was stirred at 37 °C. After cultured at 5% C0 2 , mouse macrophages containing exogenous mitochondria expressing green fluorescent protein were observed after 12 hours of endocytosis. After 12 hours of culture, the cells were changed and cultured for 12 hours. Identification, the results obtained are shown in Figure 3.
  • Fig. 3A shows the results of Mittotracker Red staining of the mitochondria-specific dye.
  • Figure 3B shows the results of GFP detection.
  • Figure 3C is DAPI staining indicating the nuclear position.
  • Figure 3D shows the three-color overlay effect.
  • This example demonstrates stable expression in macrophages by the designed GFP-COX I fusion gene.
  • the isolated untransformed mitochondria for example, isolated mitochondria, or synthetic mitochondria whose DNA sequence is wild-type mammalian mitochondrial DNA

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Abstract

公开一种将外源DNA导入到线粒体或线粒体空壳中得到的人工合成线粒体，再将人工合成线粒体，通过内吞作用，进入哺乳动物细胞，得到含有外源线粒体的细胞，实现了外源线粒体在细胞内发挥有效功能。导入后的人工合成线粒体DNA基因能够稳定表达，并可有效传代。外源线粒体导入到细胞中的方法，可作为全新的线粒体分子克隆方法，在线粒体中实现基因敲除，基因敲入，基因重排等，从而实现针对哺乳动物线粒体DNA的任意分子克隆改造，对线粒体DNA突变的疾病治疗有重要意义。

Description

外源线粒体导入到哺乳动物细胞中的方法 技术领域
本发明涉及生物遗传工程领域， 特别是涉及一种外源线粒体导入到哺乳动 物细胞中的方法。 背景技术
线粒体是真核生物最重要的细胞器， 负责了细胞 90%以上的能源供给， 线 粒体携带独立的基因组， 线粒体 DNA， 具有与核基因组不同的独立的基因转录 和蛋白翻译结构， 哺乳动物细胞线粒体 DNA编码了 22条 tRNA， 2条 rRNA， 13条多肽。 这些编码的多肽是线粒体进行有氧呼吸作用的各种蛋白复合体中非 常关键的亚基， 大量的研究表明， 这些多肽的突变或表达降低均能明显抑制细 胞有氧呼吸作用。
随着近代分子生物学的飞速发展， 人类已经可以实现在核基因组中进行各 种基因改造活动， 如基因导入、 基因敲除、 定点突变、 基因重排等等。 然而， 截至目前， 人类对于线粒体的基因改造技术还非常不成熟， 目前仅能在酵母等 低等真核生物中实现线粒体基因改造， 却一直没能在高等哺乳动物中实现。 针 对哺乳动物线粒体改造， 目前已经报道的有多种尝试的方案， 但总体而言， 仍 然没能真正实现。 一种方案是在核基因组中表达目的基因， 增加定位序列后导 入线粒体， 这种方案存在一些问题： 首先， 哺乳动物线粒体基因组大部分基编 码的是功能 RNA， 而目前核基因组编码的 RNA进入线粒体的机制还不是很清 楚， 已知的需要增加一段定位 RNA序列， 但这段序列是否会影响目标 RNA的 功能还是未知。 另一方面， 经过亿万年的进化， 目前留在哺乳动物线粒体基因 组中的这 13条多肽与大部分核基因有很大不同， 在核基因组中表达这些多肽有 存在细胞毒性的可能， 且这些多肽往往疏水性很强， 不利于核基因组表达。 第 二种方案是开发线粒体特异性的转染介质， 将目标基因转染进入线粒体。 这方 面有很多的文献报道， 但由细胞外侧跨越三层膜结构而将目标核酸转入线粒体， 是非常困难的， 已经报道的例如地喹氯铵质体（DQAsome )、 聚乙烯亚胺（PEI ) 及衍生物等等方法成功者寥寥无几， 且已有的文献报道的方法引用率低， 重复 性不佳， 因此该类方法也无法真正实现目标。 第三种方案是利用核移植或者细 胞胞质体杂交等技术， 增加外源性野生型线粒体的比例从而实现改造线粒体遗 传行为。 这类方法无法根除内源性的线粒体和 DNA， 且该类方法会额外增加大 量的外源细胞质成分， 会带来一些不确定因素。 第四种方案是表达靶向线粒体 的 TALEN分子， 实现目标序列的破坏。 这种方法已报道能成功破坏大片段缺失 和特定点突变的线粒体 DNA， 是目前已报道的最有效的改造线粒体 DNA的技 术方法。 但该方法依然存在很多的不足， 一方面， 对于特定的点突变， TALEN 能否实现特异性选择目标序列仍有很多的疑问， 另一方面， 该方法只能针对性 的破坏特定序列， 还没法做到定点基因改造和基因导入。 人类发现线粒体已经 一百多年，发现线粒体 DNA并致力于实现线粒体 DNA改造也有几十年的时间， 但直到目前， 仍没能实现哺乳动物中线粒体 DNA的有效基因改造， 有效的哺乳 动物线细胞内粒体基因改造技术是一个世界级的技术难题。 鼠线粒体 DNA全序列， 但没有对其进行任何改动， 也未实现人工合成线粒体
发明内容 基于此， 本发明的目的之一在于提供一种含有外源线粒体的哺乳动物细胞。 实现该目的的技术方案如下：
含有外源线粒体的哺乳动物细胞， 所述哺乳动物细胞具有内吞功能 （内吞 作用）。
所述线粒体是通过将外源 DNA导入到线粒体或线粒体空壳中得到的人工合 成线粒体， 也可是分离得到的哺乳动物细胞线粒体。
所述外源 DNA可以是人工合成的线粒体 DNA，也可以是分离得到的 DNA, 在其中一个实施例中， 所述外源 DNA是人工合成的线粒体 DNA， 其来源不受 限制。
在其中一个实施例中， 所述人工合成的线粒体 DNA是经过人工基因改造的 哺乳动物细胞线粒体 DNA。 当然， 所述人工合成的线粒体 DNA也可以是野生 型哺乳动物细胞线粒体 DNA。
本发明所述的哺乳动物细胞， 是指具有内吞功能的细胞， 最优选的是巨噬 细胞。
本发明的另一目的是提供上述含有外源线粒体的细胞的制备方法。
具体技术方案如下： 外源线粒体加入到培养有具有内吞作用的哺乳动物细胞的细胞培养体系中， 继 续培养， 即得含有外源线粒体的细胞。
在其中一个实施例中，所述哺乳动物细胞是巨噬细胞；所述培养条件： 36-38 °C， 水饱和密闭培养箱， 4.5-5.5% C02。
本发明的另一目的是提供一种人工合成线粒体。
具体技术方案如下： 一种人工合成线粒体，其是通过将外源 DNA导入到线粒体或线粒体空壳中 得到的。 人工合成线粒体的制备方法， 包括以下步骤：
( 1 )得到外源 DNA;
( 2 )制备到线粒体空壳或分离到的线粒体；
( 3 )将步骤（ 1 )所得的外源 DNA电击转化导入步骤（ 2 ) 所述线粒体空 壳或分离到的线粒体中， 即得人工合成线粒体。
在其中一个实施例中， 所述外源 DNA为分离得到的野生型 DNA; 或所述 外源 DNA是人工合成线粒体 DNA，所述人工合成线粒体 DNA制备包括以下步 骤：
( 1 )在哺乳动物线粒体 DNA序列的基础上， 通过基因导入、 基因敲除、 定点突变、 基因重排中的至少一种基因改造方式， 设计新的 DNA序列组成； 或 得到野生型 DNA序列组成；
( 2 )根据 DNA序列的组成， 合成 50bp~60bp的 DNA片段， 通过 Gibson 等温一步法拼接而成， 获得人工合成线粒体 DNA。
本发明的另一目的是提供一种外源线粒体导入到细胞中的方法。
实现该目的的技术方案如下：
一种外源线粒体导入到哺乳动物细胞中的方法， 包括以下步骤：
( 1 )得到外源线粒体，
( 2 )将步骤（1 ) 所得的外源线粒体加入到培养有内吞作用的哺乳动物细 胞的细胞培养体系中， 继续培养， 得到含有外源线粒体的细胞。
在其中一个实施例中， 所述外源线粒体是分离得到的哺乳动物细胞的线粒 体。
在其中一个实施例中，所述外源线粒体是通过将外源 DNA导入到线粒体或 线粒体空壳中得到的人工合成线粒体。
在其中一个实施例中， 所述外源 DNA是分离得到的野生型 DNA。
在其中一个实施例中， 所述外源 DNA是人工合成线粒体 DNA， 所述人工 合成线粒体 DNA制备包括以下步骤：
( 1 )在哺乳动物线粒体 DNA序列的基础上， 通过基因导入、 基因敲除、 定点突变、 和基因重排中的至少一种基因改造方式， 设计新的 DNA序列组成； 或得到野生型 DNA序列组成；
( 2 )根据 DNA序列的组成， 合成 50bp~60bp的 DNA片段， 通过 Gibson 等温一步法拼接而成， 获得人工合成线粒体 DNA。
在其中一个实施例中， 所述哺乳动物细胞是巨噬细胞。
在其中一个实施例中，所述培养条件： 36-38°C，水饱和密闭培养箱，4.5-5.5%
C02。
本发明利用合成生物学技术， 人工合成线粒体 DNA全序列， 在野生型序列 基础上实现了 GFP与 COX-I的融合表达，这为线粒体基因组分子克隆提供了简 单有效的技术方法。 我们成功首次开发出基于巨噬细胞内吞作用的将外源线粒 体 DNA导入细胞内的方法， 获得了稳定表达 GFP的， 可稳定传代的转人工合 成线粒体 DNA细胞。 本发明基于巨噬细胞内吞作用的将外源线粒体 DNA导入细胞内，可使外源线粒 体中基因得以在哺乳动物细胞中稳定表达， 并可有效传代， 从而实现了外源线 粒体在细胞内发挥有效功能。 本发明所述的将外源线粒体导入到哺乳动物细胞 中的方法， 可作为全新的线粒体分子克隆方法在线粒体中实现定点突变、 基因 插入、 基因剔除、 基因重排等， 从而实现针对哺乳动物线粒体 DNA的任意分子 克隆改造， 不存在来源局限性， 且纯度高， 对线粒体 DNA突变的疾病治疗具 有重要意义。 附图说明
图 1为实施例 1中所描述的外源线粒体进入巨噬细胞的结果。 图 1A为 DsRed2检测结果， 表示来源于 NIH3T3的外源线粒体。 图 1B为 EYFP检测结 果， 表示巨噬细胞内源的线粒体。 图 1C为双色叠加效果。
图 2为实施例 3中所述的体外组装的人工合成线粒体； 图 2A是组装的人工 合成线粒体中检测到正确的转录产物， 图 2B是组装的人工合成线粒体中检测到 DNA的复制。 附图标记说明： M: 分子量 Marker; 阳性： 阳性对照； 组装： 组 装的人工合成线粒体； 阴性： 阴性对照。
图 3为实施例 4中所述的 GFP-COX I在小鼠巨噬细胞 RAW264.7中融合表 达， 图 3A为 Mito-Tracker Red染料染色后指示的细胞内所有线粒体的位置 Mito-Tracker Red为线粒体特异性的染料， 图 3B为绿色 GFP-COX I融合基因的 GFP信号， 图 3C为 DAPI染色结果， 指示细胞核的位置， 图 3D为三色叠加的 结果。 具体实施方式
本发明中的所述的基因改造， 是指通过体外设计与全合成的方法， 构建目 标序列的脱氧核糖核酸（DNA )分子， 这些分子可以是任意人为设计的序列。 本发明所述的基因改造， 参照哺乳动物线粒体 DNA序列， 根据需求， 可设计为 与野生型完全一致的序列或进行任意序列改造， 包括定点突变、 基因插入、 基 因剔除、 基因重排。
内吞作用 （ endocytosis ) 又称入胞作用， 是通过质膜的变形运动将细胞外 物质转运入细胞内的过程。 根据入胞物质的不同大小， 以及入胞机制的不同， 可将内吞作用分为三种类型： 吞噬作用、 吞饮作用、 受体介导的内吞作用。 为了能够更清楚地理解本发明的技术内容， 特举以下实施例， 结合附图详 细说明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明， 而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 例如 Sambrook 等人， 分子克隆： 实验室手册（ New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 实施例中所用到的各种 常用化学试剂， 均为市售产品。 实施例 1
通过 在巨噬细胞中稳定表达定位于线粒体的荧光蛋白 EYFP，将巨噬细胞内源的线粒 体标记上 EYFP， 在 NIH3T3细胞中稳定表达定位于线粒体的荧光蛋白 DsRed2， 将 NIH3T3细胞的线粒体标记上 DsRed2， 分离带有 DsRed2标记的 NIH3T3线 粒体， 加入巨噬细胞的培养体系中， 12小时后在共聚焦显微镜中观 能观 到 DsRed2标记的线粒体进入巨噬细胞中， 可以呈现出与巨噬细胞内源的 EYFP 标记的线粒体一致的形态。 具体为：
1、小鼠巨噬细胞系 RAW264.7细胞及 NIH3T3细胞培养基（高糖 DMEM (购 自 Hyclone，货号： SH30022.01B ); 10%胎牛血清(购自 GIBCO,货号： 16000-044 ); 双抗（含 10000U/ml青霉素和 lOOOO g/ml链霉素， 1 : 100稀释使用，购自 GIBCO, 货号： 15140-122 ) )， 按照常规方法， 分盘培养。
2、 mitoDsRed2及 mitoEYFP质粒是通过分子克隆手段构建获得， 用标准的 Ds ed2 ( GenBank: AFS63392.1 )和 EYFP ( GenBank: AC048266.1 )荧光蛋白序 列在 N端加上线粒体定位序列信号
( MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSL )，在 pMXs载体中构建， 电转法转 染对应的细胞， 流式分选单克隆培养， 获得稳定表达荧光蛋白的细胞株。
3、 利用普利莱线粒体和胞浆蛋白制备试剂盒分离线粒体：
( 1 )用 PBS洗涤细胞一次， 以 6000rpm 离心 5min， 弃去上清液；
( 2 )收集管底的细胞沉淀， 以 1.5ml冰预冷的 Mito-Cyto buffer重悬为细胞 悬液， 充分混匀， 例如用特小号针头的 5ml注射器来回抽吸细胞悬液约 40次， 得细胞勾浆物；
( 3 )将上述细胞匀浆物转移到离心管， 以 800xg在 4。C下离心 5min， 此步 骤可使细胞核、 大的膜碎片、 未裂解细胞等沉积在管底；
( 4 )弃去沉淀， 将上清液转移到新的离心管中， 再次以 800xg在 4。C下离 心 5min;
( 5 ) 弃去沉淀， 将上清液转移到新的离心管， 以 12,000xg在 4。C下离心 lOmin, 此时线粒体空壳沉淀在管底。
4、 将上述所得的线粒体空壳沉淀， 用 20(^LRAW264.7细胞培养基重悬， 均匀加入分好的培养亚中， 在 37°C， 水饱和密闭培养箱， 5% C02下培养， 经过 内吞后， 12小时后即可观察， 所得结果如图 1所示。 实施例 2 本实施例是向小鼠线粒体 DNA中通过基因导入， 即插入 GFP和 Linker序 列， 引物合成、 DNA拼接来获得设计序列的环状线粒体 DNA， 即含 GFP-COX-I 融合基因的环状线粒体 DNA。
1、 设计新的人工环状线粒体 DNA:
本实施例是向小鼠线粒体 DNA中通过基因导入， 即插入 GFP和 Linker序 列来获得环状线粒体 DNA， 具体来说， 基于已知的野生型 C57 BL/6J小鼠的线 粒体 DNA序列 （序列来源： NCBI GenBank: EF108336 ) 并在其 5328位点插入 了 GFP基因和 Linker的序列 （具体如 Seq. ID No.l所示）， 设计得到 5Kb左右 的含 GFP-COX-I融合基因的环状线粒体 DNA。
2、 根据上述设计后的环状线粒体 DNA的具体组成， 利用普通引物合成方 法， 获得多个待拼接的 50bp~60bp的 DNA片段。
3、 DNA拼接：
( 1 )根据现有技术， 釆用 Gibson等温一步法进行 DNA拼接， 所用 Gibson 等温一步法的酶体系为：取 320μ1 5Χ ISO buffer( 25% PEG-8000、 500mM Tris-HCl pH 7.5、 50 mM MgCl2、 50 mM DTT、 4种 dNTPs各 1 mM、 5 mM NAD )、 0.64 μΐ 10 U/μΙ T5外切酶 Epicentre, 20 μΐ 2 U/μΙ Phusion聚合酶、 160 μΐ 40 U/μΙ Taq 连接酶并混合， 加无菌水至 1.2 ml， 分装后 -20°C保存备用；
( 2 ) 釆用 Gibson等温一步法， 将待拼接片段按等比例混勾， 终浓度为 2 ng/μΐ; 取 5μ1混合物， 15μ1上述酶体系， 混匀， 在 50°C孵育 1小时， 即可获得 拼接正确的片段。
4、 DNA的收集、 纯化， 并通过测序， 测定拼接的片段为上面所设计的环状 线粒体 DNA。 实施例 3
本实施例描述将实施例 2中所获得的环状线粒体 DNA与 NIH3T3 RhoO细 胞的线粒体空壳进行体外组装， 制成人工合成线粒体的过程， 以及对人工合成 线粒体的 RNA和 DNA的提取和鉴定过程。 图 2所示为人工合成线粒体中检测 到正确的转录产物 （图 2A )和 DNA复制 （图 2B )。
一、 不含线粒体 DNA的 RhoO细胞的培养：
1、 向 NIH3T3细胞培养基中加入 1.5 g/mL地特氯胺 （ ditercalinium ) 或 250ng/mL溴化乙锭 、 5(^g/mL的尿嘧啶核苷（Sigma公司） 以及 llO g/mL丙 酮酸钠；
2、 按照常规方法， 连续培养一个月；
3、 用 NIH3T3 RhoO培养基（高糖 DMEM， 10%胎牛血清， 5(^g/mL的尿 嘧啶核苷， llO g/mL丙酮酸钠， 青霉素和链霉素双抗）培养；
4、 收集细胞， 即获得不含线粒体 DNA的 NIH3T3 RhoO细胞。
二、 RhoO细胞线粒体空壳的分离：
1、 利用普利莱线粒体和胞浆蛋白制备试剂盒分离线粒体：
( 1 )用 PBS洗涤细胞一次， 以 6000rpm 离心 5min， 弃去上清液；
( 2 )收集管底的细胞沉淀， 以 1.5ml冰预冷的 Mito-Cyto buffer重悬为细胞 悬液， 充分混匀， 例如用特小号针头的 5ml注射器来回抽吸细胞悬液约 40次， 得细胞勾浆物；
( 3 )将上述细胞匀浆物转移到离心管， 以 800xg在 4。C下离心 5min， 此步 骤可使细胞核、 大的膜碎片、 未裂解细胞等沉积在管底；
( 4 )弃去沉淀， 将上清液转移到新的离心管中， 再次以 800xg在 4。C下离 心 5min; ( 5 ) 弃去沉淀， 将上清液转移到新的离心管， 以 12,000xg在 4。C下离心 lOmin, 此时线粒体空壳沉淀在管底。
三、 线粒体空壳与 DNA序列的组装（电击转化 ):
( 1 )用 50μ1电转 buffer ( 0.33M蔗糖， 10%甘油 )重悬线粒体空壳沉淀；
( 2 ) 向管内加入 1 O g线粒体基因组（空白组加入 1 Ομΐ TE buffer )， 混匀；
( 3 )将混匀的悬液放入 lmm 电击杯中， 加以电击一次（参数： 电场强度： 12~16Kv/cm, 电容： 25 F， 电阻： 400Ω );
( 4 ) 电击后， 立即往电击杯内加入 1ml Incubation buffer 1 ( 40mM Tri-HCl 7.4; 25mM NaCl; 5mM MgC12; 10%甘油）， 用移液枪吹打混匀；
( 5 )转移至新的 2ml离心管中， 以 21000g/min在 4°C 下离心 10min， 弃 去上清液；
( 6 )用 lml Incubation buffer 1 洗涤沉淀两次。
四、 人工合成线粒体的 RNA的提取、 反转录和鉴定：
1、 人工合成线粒体 RNA的初步提取：
( 1 ) 用 50μ1 Incubation buffer 2 ( 40mM Tri-HCl 7.4 ; 25mM NaCl ; 5mM MgCl2; 10%甘油； ImM 丙酮酸盐； ImM ATP; lmg/ml BSA )重悬沉淀， 在 37 °C下孵育 3h;
( 2 )加入 lml Incubation buffer 2 , 洗涤三次， 在 4°C下以 lOOOg/min, lOmin 离心；
( 3 )用移液枪尽量吸尽上清液后， 加入 ΙΟμΙ Roche DNase I、 5μ1 lOxDNase I buffer ( l lOmM Tris-HCl 7.4; 32.5mM MgCl2 ) 以及 35μ1 Incubation buffer 2,重 悬， 在 37°C下孵育 30min;
( 4 )用 lml washing buffer ( 10%甘油； 1 OmM Tri-HCl 7.4; 150mM NaCl； ImM EDTA ) 洗涤三次， 在 4°C下 1000g/min, lOmin离心。
2、 用 Qiagen RNA提取试剂盒提取人工合成线粒体 RNA:
( 1 )加入 700μ1 QIAzol Lysis Reagent,用移液枪吹打重悬， 室温放置 5min; ( 2 )加入 140μ1氯仿， 充分震荡 15s， 室温放置 2~3min;
( 3 ) 以 12000 g转速， 在 4°C下离心 15min;
( 4 )转移上清液至新的 EP离心管内（ RNase free )， 加入 1.5倍体积的无水 乙醇， 吹打混匀；
( 5 )将混勾后的溶液加入离心柱内（柱容量为 700μ1，余下的可分次加入）， 以大于 8000 g转速在室温下离心 15s;
( 6 )加入 700μ1 Buffer WT， 以大于 8000 g转速在室温下离心 15s;
( 7 )加入 500μ1 Buffer RPE, 以大于 8000 g转速在室温下离心 15s;
( 8 )加入 500μ1 Buffer RPE, 以大于 8000 g转速在室温下离心 2min;
( 9 )换一个 2ml收集管， 21000g/min, 室温离心 lmin;
( 10 )将离心柱转移至一个新的 1.5mlEP管中， 加入 40μ1 的无 RNase水， 以大于 8000 g转速在室温下离心 lmin;
( 11 )将 EP管内洗脱下来的 RNA重新上柱， 以大于 8000 g转速在室温下 离心 lmin;
3、 人工合成线粒体 RNA的体外反转录：
( 1 ) 消化 RNA中的 DNA: 以 Promega DNase I在 37 °C下消化 30min， 消 化体系如下：
10X DNase I buffer Ιμΐ
DNase I Ιμΐ
RNA 8μ1 ( 2 ) 消化后， 加入 Ιμΐ stop buffer, 在 65°C下处理 lOmin;
( 3 ) RNA的反转录： 取消化后的 RNA， 在 65°C下处理 5min， 处理体系如 消化后的 RNA 8μ1
随机引物 Ιμΐ
lOmM dNTP Ιμΐ
处理结束后， 立即取出放置冰上冷却；
( 4 )加入以下试剂并吹打混匀：
10X T buffer 2μ1
25mM MgC12 4μ1
0.1M DTT 2μ1
RNase OUT Ιμΐ
Super Script 1 μΐ
依次进行下列温度处理：
25 °C lOmin
50 °C 50min
85 °C 5min
处理结束后， 立即取出放置冰上冷却；
( 5 )加入 Ιμΐ RNase H, 混匀， 37°C孵育 20min， 得到的 cDNA于 -20°C保 、 用 PrimeSTAR酶鉴定 cDNA中转录产物：
( 1 ) PCR反应体系如下：
5 xPrimeSTAR® Buffer ( Mg2+ plus ) 10 μΐ dNTP Mixture (各 2.5 mM ) 4 μ1
Primer 1 ( 10 μΜ ) 1 μΐ
Primer 2 ( 10 μΜ ) 1 μΐ
模板 DNA 2 μ1
PrimeSTAR酶（ 2.5 U/μΙ ) 0.5 μΐ
灭菌蒸馏水 31.5 μΐ
反应条件：
98。C 10 sec
55 °C 12 sec
72 °C
循环数： 30个循环。
( 2 )对 PCR产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳， 并拍照检测， 所得结果如图 1A 所示， 其中 "阳性" 泳道为 NIH3T3细胞中分离线粒体 RNA反转的 cDNA为模 板的 PCR产物， "组装" 泳道为电转后分离获得的 cDNA的 PCR产物， "阴性" 泳道为只用水做模板的 PCR产物。
五、 人工合成线粒体 DNA的体外复制检测：
1、 将电转后的线粒体沉淀用 50μ1 Incubation buffer 2重悬， 加入含 Ιμα alpha-32p-dCTP 的 dNTP， 37 °C 下孵育 3h;
2、 用天根细胞总 DNA提取试剂盒收集总 DNA;
3、 用 BstUI限制性内切酶 65 °C下酶切过夜；
4、 以酶切产物进行 5%丙烯酰胺凝胶电泳， 结束后取出凝胶， 在通风橱中 晾干， 用放射自显影曝光检测， 所得结果如图 1B所示， 图中 "阳性" 泳道为 NIH3T3细胞中分离线粒体的线粒体 DNA同位素掺入后的产物， "组装"泳道为 电转后的线粒体 DNA同位素掺入后的产物， "阴性" 泳道为只用水做的同位素 掺入后的产物。 实施例 4
本实施例是含 GFP-COX-I融合基因的人工合成线粒体经内吞进入小鼠巨噬 细胞系的过程， 所得结果如图 3所示。
( 1 )小鼠巨噬细胞系 RAW264.7细胞培养基（高糖 DMEM (购自 Hyclone, 货号： SH30022.01B ), 10%胎牛血清（购自 GIBCO, 货号： 16000-044 )， 双抗 (含 10000U/ml青霉素和 lOOOO g/ml链霉素， 1: 100稀释使用， 购自 GIBCO, 货号： 15140-122 ) )， 按照常规方法， 分盘培养；
( 2 ) 将实施例 3 中电击转化后所得的人工合成线粒体沉淀， 用 20(^LRAW264.7细胞培养基重悬， 均匀加入分好的培养亚中， 在 37°C， 水饱和 密闭培养箱， 5% C02下培养， 经过内吞后， 12小时后即可观察到表达绿色荧光 蛋白的含有外源线粒体的小鼠巨噬细胞， 培养 12小时后换液， 再培养 12小时 后， 观察鉴定， 所得结果如图 3所示。
该结果清晰的表明我们设计的 GFP-COX I融合基因能正确的在线粒体中表 达。 图 3中， 图 3A为线粒体特异性染料 Mitotracker Red染色的结果。 图 3B为 GFP检测结果。 图 3C为 DAPI染色， 指示细胞核位置。 图 3D为三色叠加效果。 本实施例通过设计的 GFP-COX I融合基因证实其在巨噬细胞中能稳定表达。 当然， 分离得到的未经过基因改造的线粒体（例如分离得到的线粒体， 或者是 人工合成线粒体， 其 DNA序列为野生型的哺乳动物线粒体 DNA )， 也可以通过 吞噬作用， 进入巨噬细胞， 从而在巨噬细胞中稳定表达。 但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。 应当指出的是， 对于本领域 的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和 改进， 这些都属于本发明的保护范围。 因此， 本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。

Claims

权利要求书
1、 含有外源线粒体的哺乳动物细胞， 所述细胞具有内吞功能。
2、 根据权利要求 1所述的哺乳动物细胞， 其特征是， 所述外源线粒体是通 过将外源 DNA导入到线粒体或线粒体空壳中得到的人工合成线粒体。
3、 根据权利要求 2所述的哺乳动物细胞， 其特征是， 所述外源 DNA是人 工合成的线粒体 DNA。
4、 根据权利要求 3所述的哺乳动物细胞， 其特征是， 所述人工合成的线粒 体 DNA是经过人工基因改造的哺乳动物细胞线粒体 DNA。
5、 根据权利要求 1所述的哺乳动物细胞， 其特征是， 所述外源线粒体是分 离得到的哺乳动物细胞线粒体。
6、 根据权利要求 1-5任一项所述的哺乳动物细胞， 其特征是， 所述细胞是 巨噬细胞。 是， 包括以下步骤：
将所得外源线粒体加入到培养有具有内吞功能的哺乳动物细胞的细胞培养 体系中， 继续培养， 即得含有外源线粒体的细胞。
8、 根据权利要求 7中所述的制备方法， 其特征是，
所述具有内吞功能的哺乳动物细胞是巨噬细胞；
所述培养条件： 36-38°C， 水饱和密闭培养箱， 4.5-5.5% C02。
9、 一种人工合成线粒体， 其特征是， 其是通过将外源 DNA导入到线粒体 或线粒体空壳中得到的。
10、 权利要求 9所述的人工合成线粒体的制备方法， 其特征是， 包括以下 步骤： ( 1 )得到外源 DNA;
( 2 )制备到线粒体空壳或分离得到线粒体；
( 3 )将所述外源 DNA电击转化导入所述线粒体空壳或分离到的线粒体中， 即得人工合成线粒体。
11、 根据权利要求 10所述的制备方法， 其特征是，
所述外源 DNA为分离得到的野生型 DNA;
或所述外源 DNA是人工合成线粒体 DNA，所述人工合成线粒体 DNA制备 包括以下步骤：
( 1 )参照哺乳动物线粒体 DNA序列，根据需求， 通过基因导入、基因敲除、 定点突变和基因重排中的至少一种基因改造方式， 设计新的 DNA序列组成； 或 得到野生型 DNA序列组成；
( 2 )根据 DNA序列的组成， 合成 50bp~60bp的 DNA片段， 通过 Gibson等 温一步法拼接而成， 获得人工合成线粒体 DNA。
12、 一种外源线粒体导入到哺乳动物细胞中的方法， 其特征是， 包括以下 步骤：
( 1 )得到外源线粒体；
( 2 )将所得外源线粒体加入到培养有具有内吞功能的哺乳动物细胞的细胞 培养体系中， 继续培养， 得到含有外源线粒体的细胞。
13、 根据权利要求 12所述的方法， 其特征是， 所述外源线粒体是分离得到 的哺乳动物细胞线粒体。
14、 根据权利要求 12所述的方法， 其特征是， 所述外源线粒体是通过将外 源 DNA导入到线粒体或线粒体空壳中得到的人工合成线粒体。
15、 根据权利要求 14所述的方法， 其特征是， 所述外源 DNA是分离得到 的野生型 DNA。
16、 根据权利要求 14所述的方法， 其特征是， 所述外源 DNA是人工合成
( 1 )参照哺乳动物线粒体 DNA序列，根据需求， 通过基因导入、基因敲除、 定点突变和基因重排中的至少一种基因改造方式， 设计新的 DNA序列组成； 或 得到野生型 DNA序列组成；
( 2 )根据 DNA序列的组成， 合成 50bp~60bp的 DNA片段， 通过 Gibson等 温一步法拼接而成， 获得人工合成线粒体 DNA。
17、 根据权利要求 12-16任一项所述的方法，其特征是， 所述哺乳动物细胞 是巨噬细胞。
18、 根据权利要求 17所述的方法， 其特征是， 所述培养条件： 36-38°C，水 饱和密闭培养箱， 4.5-5.5% C02。
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