CN113025637A - 一种细菌源性的抗肿瘤PNPase基因及其制备方法与应用 - Google Patents

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CN113025637A CN202110161495.6A CN202110161495A CN113025637A CN 113025637 A CN113025637 A CN 113025637A CN 202110161495 A CN202110161495 A CN 202110161495A CN 113025637 A CN113025637 A CN 113025637A
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Abstract

本发明公开了一种细菌源性的抗肿瘤PNPase基因及其制备方法与应用，抗肿瘤PNPase基因为PNPase基因序列3'末端添加SV40核定位信号序列的核苷酸片段，抗肿瘤PNPase基因DNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用细菌PNPase的强效RNA外切水解特性，利用基因工程技术使其表达并定位于癌细胞核内，直接水解癌细胞核内转录的多种RNAs，阻断RNA蛋白翻译和多种生理功能，抑制癌细胞的增殖和侵袭。

Description

一种细菌源性的抗肿瘤PNPase基因及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤技术领域，涉及一种细菌源性的抗肿瘤PNPase基因及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤治疗是当今医学领域的一个重要课题，也是一个无法回避的社会性问题，据2018年《全球癌症报告》指出，由于中国人的不良生活习惯、人口老龄化、环境污染和未普及肿瘤早筛等诸多原因，中国癌症发病率和死亡率居高不下，肺癌、肝癌和胃癌这三种肿瘤发病率和死亡率占全球一半左右，导致我国当前医疗任务异常艰巨。目前，在全球范围内，肿瘤治疗的主要手段有手术切除、放疗化疗、免疫治疗等，但这些方法的效果差强人意，搜寻新的有效治疗手段和方法已成为当前肿瘤临床治疗的迫切任务。
基因治疗是一种将外源基因导入靶细胞，纠正或补偿由于基因异常或缺陷而引起疾病的方法，该方法始于1989年美国用逆转录病毒进行遗传标记肿瘤浸润淋巴细胞的“归巢”研究，并在次年成功治愈了4岁小女孩的免疫系统缺陷疾病。基因治疗，包括肿瘤基因治疗的关键和决定成功与否的重要因素之一是获得有效的靶基因或治疗基因。细菌PNPase是一种进化保守的具有3'→5'外切酶活性的RNA水解酶，与定位于人细胞线粒体内的PNPase属于同源蛋白。在蛋白结构上，PNPase N-端的两个RNA酶PH-样结构域被α-螺旋(AAHD)域分开，C-端有KH和S1 RNA结合域；在活性蛋白结构上，PNPase 组成一个同三聚体复合体，发挥生物学功能。细菌PNPase具有多种生物学功能，如调控RNA成熟和进行RNA质量控制，但其主要功能是通过水解单链RNA 3'-末端的磷酯键而逐步水解RNA。不仅mRNA、rRNA和tRNA是PNPase的作用对象，同时sRNA等非编码小RNA也是其水解对象。由于PNPase对RNA水解作用的广泛性，因此，PNPase可以广泛降解细胞内表达紊乱的多种RNAs，以抑制失调细胞的生长增殖、迁移和侵袭。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种细菌源性的抗肿瘤PNPase基因及其制备方法与应用，将PNPase通过基因改造使其表达于癌细胞核内，直接水解细胞核内的多种RNAs，阻断RNA翻译及生物学功能，抑制癌细胞增殖和侵袭，以解决现有技术中存在的技术问题。
本发明采取的技术方案为：一种细菌源性的抗肿瘤PNPase基因，抗肿瘤 PNPase基因为PNPase基因序列3'末端添加SV40核定位信号序列的核苷酸片段，抗肿瘤PNPase基因DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
抗肿瘤PNPase基因的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
一种细菌源性的抗肿瘤PNPase基因的应用，细菌源性的抗肿瘤PNPase 基因在抑制肿瘤方面的应用。
一种细菌源性的抗肿瘤PNPase基因的制备方法，该方法为：克隆大肠杆菌DH5α的PNPase基因的蛋白编码区，并通过基因工程技术在其3'末端添加编码细胞核定位信号的寡核苷酸序列，使细胞内表达的PNPase融合蛋白定位于真核细胞核内。
本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明利用细菌PNPase的强效 RNA外切水解特性，利用基因工程技术使其表达并核定位于癌细胞核内，直接水解细胞核内转录的RNAs，阻断RNA蛋白翻译和多种生理功能，抑制癌细胞的增殖和侵袭。
附图说明
图1为PNPase基因克隆及其真核表达载体构建图，图中，A，PNPase基因克隆；B，真核表达载体pDsRed1-PNPase；
图2为pDsRed1-PNPase转染肝癌细胞Hep G2图；
图3为PNPase融合基因稳转单克隆肝癌细胞株图；
图4为PNPase融合基因单克隆稳转肝癌细胞的蛋白表达变化图；
图5为PNPase融合基因稳转的单克隆肝癌细胞的生长速率、迁移和侵袭能力图，图中，左，细胞生长速率；中，细胞迁移能力；右，细胞侵袭能力。
**P<0.01；
图6为PNPase融合基因稳转的单克隆肝癌细胞的mRNAs丰度和稳定性图，图中，A，细胞内HuR和COX-2的mRNAs丰度；B，细胞内HuR mRNA 稳定性；C，细胞内COX-2mRNA稳定性。
具体实施方式
下面结合附图及具体的实施例对本发明进行进一步介绍。
实施例1：一种细菌源性的抗肿瘤PNPase基因，抗肿瘤PNPase基因为 PNPase基因序列3'末端添加SV40核定位信号序列的核苷酸片段，抗肿瘤 PNPase基因DNA序列如SEQ IDNO.1所示。
抗肿瘤PNPase基因的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2：一种细菌源性的抗肿瘤PNPase基因的应用，细菌源性的抗肿瘤PNPase基因在抑制肿瘤方面的应用。
实施例3：一种细菌源性的抗肿瘤PNPase基因的制备方法，该方法为：克隆大肠杆菌DH5α的PNPase基因的蛋白编码区，并通过基因工程技术在其3'末端添加编码细胞核定位信号的寡核苷酸序列，使细胞内表达的PNPase融合蛋白定位于真核细胞内，利用PNPase的RNA水解特性，在细胞核内直接水解多种RNAs，阻断RNA蛋白翻译和发挥多种生理功能，从而抑制癌细胞的生长增殖和侵袭。
一、实验试剂、材料和仪器
1、实验试剂和材料
血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、
Figure RE-GDA0003078023890000041
G×L DNA Polymerase、MiniBESTAgarose Gel DNAExtraction Kit(Ver.4.0)、pMD18-T载体、Xho I和EcoR I、DNAA-Tailing Kit试剂盒、无内毒素质粒抽提试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自TakKaRa公司。新生牛血清购自杭州四季青。DMEM 粉末培养基、Lipofectamine 2000购自Lifetechnology公司。细胞培养耗材来自NEST。Matrigel胶购自北京索莱宝公司。HuR抗体购自Millipore。COX-2 购自武汉三鹰生物。RFP抗体购自LSBio公司。HRP标记的二抗、ECL发光液购自Biogot。E-plate16、CIM-Plate 16购自艾森生物。PCR引物合成、DNA 测序由上海生工完成。Hep G2肝癌细胞系购自上海细胞库。pDsRed1-N1保存于本实验室。
2、实验仪器
Bio-Rad CFX-96荧光定量PCR仪(美国)；Thermo二氧化碳培养箱(美国)；Bio-Rad凝胶成像系统(美国)；Nanodrop核酸定量仪(美国)；Sigma 冷冻高速离心机(美国)；NIKON导致荧光显微镜(日本)；xCELLigence实时无标记细胞分析仪(中国)。
二、实验方法与流程
(一)实验方法
1、细菌基因组抽提
用LB培养基复苏并震荡培养大肠杆菌(E.coli)DH5α，培养条件为37℃、 200rpm、12h。取1.5ml菌液，12000rpm离心1min，弃取上清液，收集沉淀菌体。按“血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒”说明书依次加入200μl GA 缓冲液并混匀、加入20μl Proteinase K并混匀、加入200μl GB缓冲液混匀并在70℃静止10min，加入200μl无水乙醇并温和混匀，瞬时离心并将液体转移到吸附柱上，短暂离心，吸附柱上依次加入去蛋白液500μl和漂洗液600μl(2 次)，离心室温控干，加入DNA洗脱液100μl溶解吸附柱中DNA，离心收集、紫外分光光度法测定浓度、-20低温保存备用。
2、引物合成、目的基因克隆
根据NCBI中细菌PNPase基因组序列号(NC_000913)合成PCR引物，上游引物序列5'-TCTCGAGCCACCATGATGGCTCGTCAGGCTACTGCCGCTG-3'，下游引物序列5'-TGGATCCTCCACCTTCCGCTTCTTCTTTGGCCGCTCGCCCTGTTCAGCAGCCGGAGCTTCCG-3'，其中“下划线”部分为DNA模板对应/配对部分。
利用长链高保真PCR酶
Figure RE-GDA0003078023890000052
G×L DNA Polymerase扩增细菌 PNPase基因。扩增体系按说明书配制，具体如表1所示。扩增程序：预变性[95℃, 30s]，扩增[95℃,15s；55℃,30s；72℃,2min.32cycles]，稳定[72℃,5min]。
表1长链高保真PCR反应体系及反应程序
Figure RE-GDA0003078023890000051
Figure RE-GDA0003078023890000061
用1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并用DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带，纯化产物用DNAA-Tailing Kit试剂盒加“A”，加“A”产物用pMD18-T 载体进行TA克隆。产物经细菌转化、氨苄青霉素筛选培养、单克隆扩大培养、质粒抽提、限制性核酸内切酶(Xho I/EcoRI)酶切鉴定、DNA测序鉴定，重复测序后序列一致的质粒命名为pMD18-T-PNPase。
3、重组真核表达载体构建
用限制性核酸内切酶(Xho I/EcoR I)酶解pMD18-T-PNPase和骨架载体 pDsRed1-N1，1％琼脂糖凝胶电泳获取PNPase基因片段和线性化载体骨架，用T4 DNAligase在4℃下连接环化。重组质粒转化细菌、卡那霉素筛选培养、单克隆扩大培养、质粒抽提、限制性核酸内切酶(Xho I/EcoR I)酶切鉴定、 DNA测序鉴定，重组正确的真核表达载体命名为pDsRed1-PNPase。
4、细胞培养
肝癌细胞Hep G2用添加10％新生牛血清的DMEM培养液在37℃、5％ CO2培养箱中培养。当细胞融合至85-90％时，用0.25％胰酶消化传代。
5、细胞转染与稳转单克隆细胞株筛选培养
无内毒素质粒抽提试剂盒抽提获得的DNA质粒用脂质体法导入培养的肝癌细胞中。具体过程如下：转染前16h，将细胞按最大融合率的50％铺于6 孔板，转染前1小时更换为无血清DMEM；用100μl DMEM稀释2μg重组质粒，用100μl DMEM稀释4μl Lipofectamine2000，将两管液体混合，室温放置20min，滴入培养细胞中，温育培养6h，用含10％新生牛血清的RPMI-1640 继续培养，转染后72小时，在荧光显微镜下观察。如果荧光细胞较多，在培养细胞中加入终浓度600μg/ml G418，筛选培养7天，将药物浓度将至 200μg/μl，继续培养直至单克隆细胞集落形成。
6、荧光分析
细胞转染后72h，将稳转细胞放在倒置荧光显微镜上观察细胞红色荧光；当细胞形成单克隆集落后，在荧光显微镜上搜寻红色荧光细胞集落，经胰酶半消化后用20μl移液枪挑取单克隆集落。
7、westernblot
收集细胞，PBS清洗2次，用细胞裂解液裂解细胞，抽提细胞蛋白，并用BCA法定量蛋白浓度。加入5×上样缓冲液，100℃煮沸3-5min，室温冷却后瞬时离心并混匀。样品先用5％浓缩胶-12％分离胶进行SDS-PAGE，然后，剥离分离胶并用1×电转移液(CAPS液)平衡30min，制成转膜三明治进行湿转(500mA，30min)，获取PVDF膜并用5％BSA封闭，TBST清洗3次、一抗4℃孵育过夜、TBST清洗3次、二抗室温孵育2h，TBST清洗3次，用ECL 发光液在伯乐凝胶成像系统中显色。
7、细胞增殖
首先，将细胞用0.25％的胰酶消化和收集，用血球计数板计算细胞悬液浓度，并将细胞悬液用10％新生牛血清的DMEM细胞培养液稀释至2×104/ml 备用。然后，取一块新的E-plate16，在16个小孔中依次加入100μl的含10％新生牛血清的DMEM细胞培养液。将E-plate16放入RTCA分析仪 (xCELLigence)上自检，通过软件分析每个孔的电路连接和电阻是否正常。取出E-plate16，按预先设计好的布置在对应小孔中加入制备好的细胞悬液，保证每孔有2000个细胞。将E-plate16再次放入RTCA分析仪中，启动设定程序，实时监测和记录细胞生长速度。
9、细胞迁移
取一块新的CIM-Plate 16，拆分上下室，并在室下中加入含10％新生牛血清DMEM0培养液170μl，组装CIM-Plate 16，在上室中每孔中加入60μl无血清DMEM0培养液，放入RTCA分析仪中通过软件分析每个孔的电路连接和电阻是否正常。
将细胞用0.25％的胰酶消化和收集后，用血球计数板计算细胞悬液浓度，并将细胞悬液用含10％新生牛血清DMEM0培养液稀释至5×105/ml备用。取出CIM-Plate 16，按预先设计好的布置在对应小孔中加入制备好的细胞悬液 100μl，保证每孔有50000个细胞。将E-plate16再次放入RTCA分析仪中，启动设定程序，实时监测和记录细胞迁移数。
10、细胞侵袭
在冰浴中融化matrigel胶，用预冷的枪头和无血清DMEM细胞培养液将其按1:11稀释。取一块新的CIM-Plate 16，在上室孔中按布置每孔加入50μl 稀释的matrigel胶，细胞培养箱中放置4-6h，弃去未凝固的基质胶液体。其余操作与“细胞迁移”一致。
11、mRNA稳定性分析
在6孔板中铺入70％融合率的细胞，铺板培养24h后，更换新鲜的细胞培养基，并加入终浓度为10μg/ml的放线菌素D，在细胞培养箱中温育。分别取温育0h、1h、2h的细胞抽提总RNA，通过RT-PCR反转录成cDNA，并用荧光定量PCR检测靶mRNA的相对丰度。
12、荧光定量PCR
按说明书配制荧光定量PCR反应体系，每孔按20μl计算。反应程序为3 步法：95℃，15s；退火温度，30s；72℃，30s；荧光强度监测；40个循环。循环结束后，进行融解曲线制作(65～95℃，递增温度0.5℃)。荧光定量PCR 引物如表2所示。
表2荧光定量PCR引物
Figure RE-GDA0003078023890000091
三、实验结果
1、成功克隆细菌PNPase基因并构建重组真核表达质粒pDsRed1-PNPase
以大肠杆菌(E.coli)DH5α基因组为模板，克隆PNPase基因，PCR产物经3'末端加“A”后插入pMD18-T载体中，并经过转化、筛选培养、酶切鉴定等，获得目的条带与PNPase基因蛋白编码区大小一致的克隆质粒 pMD18-T-PNPase(图1A)。测序确定DNA序列，并用XhoI/EcoR I水解 pMD18-T-PNPase获得靶基因片段，将其与Xho I/EcoR I线性化的骨架载体pDsRed1-N1(线性化)用T4 DNA ligase环化后获得重组真核表达载体 pDsRed1-PNPase(图1B)。对其用Xho I/EcoR I酶切鉴定(图1A)，并进行 DNA正反测序。用BioXM 2.6进行序列比对和分析，其核苷酸序列与NCBI 上的序列存在多个点突变，但编码的蛋白序列具有高度保真性(如提供的基因序列1和序列2)，并在PNPase基因3'末端成功添加了SV40核定位信号序列(如提供的基因序列1和序列2)。
2、成功构建核内表达PNPase的单克隆稳转Hep G2肝癌细胞株
将构建的真核表达质粒pDsRed1-PNPase通过脂质体2000导入肝癌细胞Hep G2中，通过G418药物筛选和单克隆挑取培养，获得PNPase稳转肝癌细胞株，该细胞株在荧光显微镜下，其细胞核显示红色荧光(图2-图3)。对该细胞株进行westernblot分析，RFP标签抗体显示RFP荧光蛋白所在位置正是融合蛋白PNPase-NLS-RFP所在的位置(图4)。证明PNPase稳转Hep G2肝癌细胞株稳定表达外源融合蛋白PNPase-NLS-RFP。
3、PNPase稳转Hep G2肝癌细胞的生长增殖速率变缓、转移和侵袭能力下降
与对照细胞相比，PNPase稳转Hep G2肝癌细胞的生长和增殖速度明显下降(图5A)，稳转细胞的迁移能力显著低于对照细胞(图5B)，且肝癌细胞不发生浸润现象(图5C)。
4、PNPase稳转Hep G2肝癌细胞内基因表达发生改变
如图5所示，当肝癌细胞Hep G2内稳定表达PNPase后，细胞内癌蛋白 HuR和COX-2表达明显下降。用放线菌酮D处理肝癌细胞后，抽提细胞内 RNAs并进行荧光定量分析。结果显示PNPase稳转细胞内HuR基因的mRNA 和COX-2基因的mRNA稳定性均明显下降(图6)，证明细胞核内表达的 PNPase可以通过降低HuR和COX-2的mRNAs稳定性而抑制对应的蛋白表达，从而抑制肝癌细胞的生长增殖、迁移和侵袭。
四、实验结论
1、成功克隆大肠杆菌DH5α的核酸外切酶基因PNPase的蛋白编码区，并通过基因工程技术在其3'末端添加核定位信号序列。
2、将PNPase蛋白表达于肝癌细胞Hep G2的细胞核内，发现可以显著抑制肝癌细胞的生长增殖、迁移和侵袭。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内，因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 贵州医科大学
<120> 一种细菌源性的抗肿瘤PNPase基因及其制备方法和应用
<160> 7
<210> 1
<211> 2113
<212> DNA
<213> 抗肿瘤PNPase基因DNA序列
<400> 1
CTCGAGCCACCATGATGGCTCGTCAGGCTACTGCCGCTGTTATGGTTAGCATGGATGACA 60
CCGCGGTATTTGTTACCGTTGTTGGCCAGAAAAAAGCCAAACCAGGTCAGGACTTCTTCC 120
CACTGACCGTTAACTATCAGGAGCGTACCTACGCTGCTGGTCGTATCCCGGGTAGCTTCT 180
TCCGTCGTGAAGGCCGCCCAAGCGAAGGCGAAACCCTGATCGCGCGTCTGATTGACCGCC 240
CGATTCGCCCGCTGTTCCCGGAAGGCTTCGTCAACGAAGTTCAGGTTATCGCCACCGTGG 300
TTTCTGTTAACCCGCAAGTTAACCCGGATATCGTCGCGATGATTGGTGCTTCCGCAGCAC 360
TGTCTCTGTCTGGTATTCCGTTCAATGGTCCGATTGGTGCTGCTCGCGTAGGTTACATCA 420
ATGACCAGTACGTACTGAACCCGACTCAGGACGAGCTGAAAGAGAGCAAACTGGATCTGG 480
TTGTTGCCGGTACTGAAGCCGCTGTTCTGATGGTTGAATCTGAAGCTGAACTGCTGAGCG 540
AAGACCAGATGCTGGGCGCAGTAGTGTTCGGTCATGAACAACAGCAGGTTGTTATTCAGA 600
ACATCAATGAACTGGTGAAAGAAGCCGGTAAACCACGTTGGGACTGGCAGCCGGAGCCGG 660
TAAACGAAGCGCTGAACGCGCGCGTTGCTGCACTGGCTGAAGCTCGCCTGAGCGATGCTT 720
ACCGCATCACCGACAAACAAGAGCGTTATGCGCAGGTTGATGTCATCAAATCTGAAACCA 780
TCGCGACGCTGCTTGCTGAAGACGAAACCCTGGACGAAAACGAACTGGGTGAAATTCTGC 840
ACGCTATCGAGAAAAACGTTGTTCGTAGCCGCGTACTGGCAGGCGAACCGCGTATCGACG 900
GTCGTGAAAAAGATATGATCCGTGGTCTGGATGTGCGTACTGGCGTGCTGCCGCGTACTC 960
ACGGTTCTGCGCTGTTCACCCGCGGTGAAACGCAGGCACTGGTCACTGCAACGCTGGGTA 1020
CCGCTCGTGACGCGCAGGTTCTTGATGAACTGATGGGCGAACGTACCGATACCTTCCTGT 1080
TCCACTACAACTTCCCTCCGTACTCCGTAGGCGAAACCGGCATGGTCGGTTCTCCGAAGC 1140
GTCGTGAAATTGGTCACGGTCGTCTGGCGAAGCGCGGCGTGCTGGCAGTCATGCCGGATA 1200
TGGACAAATTCCCGTACACCGTACGTGTAGTGTCTGAAATCACCGAATCCAACGGTTCTT 1260
CTTCTATGGCTTCCGTGTGCGGCGCGTCTCTGGCGCTGATGGACGCAGGTGTGCCAATCA 1320
AAGCTGCCGTTGCGGGTATCGCAATGGGTCTGGTGAAAGAAGGCGACAACTACGTTGTAC 1380
TGTCTGACATTTTGGGCGACGAAGATCACCTGGGCGATATGGACTTCAAAGTTGCAGGTT 1440
CCCGCGACGGTATCTCTGCACTGCAGATGGATATCAAAATTGAAGGTATCACCAAAGAGA 1500
TCATGCAGGTTGCGCTGAACCAGGCTAAAGGTGCGCGTCTGCATATCCTGGGCGTAATGG 1560
AACAGGCGATCAACGCGCCGCGTGGCGATATCTCTGAGTTCGCACCGCGTATCCATACCA 1620
TCAAGATCAACCCGGATAAGATCAAAGACGTTATCGGTAAAGGCGGCTCTGTTATCCGTG 1680
CCCTGACCGAAGAAACTGGCACTACCATCGAAATCGAAGATGACGGTACTGTGAAGATCG 1740
CAGCGACCGACGGCGAGAAAGCGAAACATGCTATTCGTCGTATCGAAGAGATCACTGCAG 1800
AAATCGAAGTGGGCCGCGTCTACACTGGTAAAGTGACCCGTATCGTTGACTTTGGCGCAT 1860
TTGTTGCCATCGGCGGCGGTAAAGAAGGTCTGGTCCACATCTCTCAAATCGCTGACAAAC 1920
GCGTTGAGAAAGTGACCGATTACCTGCAGATGGGTCAGGAAGTACCGGTGAAAGTTCTGG 1980
AAGTTGATCGCCAGGGCCGTATCCGTCTGAGCATTAAAGAAGCGACTGAGCAGTCTCAAC 2040
CTGCTGCAGCACCGGAAGCTCCGGCTGCTGAACAGGGCGAGCGGCCAAAGAAGAAGCGGA 2100
AGGTGGAGGATCC 2113
<210> 2
<211> 701
<212> DNA
<213> 抗肿瘤PNPase基因蛋白序列
<400> 2
MMARQATAAVMVSMDDTAVFVTVVGQKKAKPGQDFFPLTVNYQERTYAAGRIPGSFFRRE 60
GRPSEGETLIARLIDRPIRPLFPEGFVNEVQVIATVVSVNPQVNPDIVAMIGASAALSLS 120
GIPFNGPIGAARVGYINDQYVLNPTQDELKESKLDLVVAGTEAAVLMVESEAELLSEDQM 180
LGAVVFGHEQQQVVIQNINELVKEAGKPRWDWQPEPVNEALNARVAALAEARLSDAYRIT 240
DKQERYAQVDVIKSETIATLLAEDETLDENELGEILHAIEKNVVRSRVLAGEPRIDGREK 300
DMIRGLDVRTGVLPRTHGSALFTRGETQALVTATLGTARDAQVLDELMGERTDTFLFHYN 360
FPPYSVGETGMVGSPKRREIGHGRLAKRGVLAVMPDMDKFPYTVRVVSEITESNGSSSMA 420
SVCGASLALMDAGVPIKAAVAGIAMGLVKEGDNYVVLSDILGDEDHLGDMDFKVAGSRDG 480
ISALQMDIKIEGITKEIMQVALNQAKGARLHILGVMEQAINAPRGDISEFAPRIHTIKIN 540
PDKIKDVIGKGGSVIRALTEETGTTIEIEDDGTVKIAATDGEKAKHAIRRIEEITAEIEV 600
GRVYTGKVTRIVDFGAFVAIGGGKEGLVHISQIADKRVEKVTDYLQMGQEVPVKVLEVDR 660
QGRIRLSIKEATEQSQPAAAPEAPAAEQGERPKKKRKVEDX 701
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
TCTCGAGCCACCATGATGGCTCGTCAGGCTACTGCCGCTG 40
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<212> DNA
<213> 人工合成
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TGGATCCTCCACCTTCCGCTTCTTCTTTGGCCGCTCGCCCTGTTCAGCAGCCGGAGCTTCCG 62
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<212> DNA
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GACCATGACCCAGAAGGACGTAGAAG 26
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<400> 10
AGGAATCTCGGCGTAGTAC 19

Claims (4)

1.一种细菌源性的抗肿瘤PNPase基因，其特征在于：所述的抗肿瘤PNPase基因为PNPase基因序列3'末端添加SV40核定位信号序列的核苷酸片段，抗肿瘤PNPase基因DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种细菌源性的抗肿瘤PNPase基因，其特征在于：抗肿瘤PNPase基因的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种细菌源性的抗肿瘤PNPase基因的应用，其特征在于：细菌源性的抗肿瘤PNPase基因在抑制肿瘤方面的应用。
4.一种细菌源性的抗肿瘤PNPase基因的制备方法，其特征在于：该方法为：克隆大肠杆菌DH5α的PNPase基因的蛋白编码区，并通过基因工程技术在其3'末端添加编码细胞核定位信号的寡核苷酸序列，使细胞内表达的PNPase融合蛋白定位于真核细胞核内。
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