CN110218725B

CN110218725B - 一个长链非编码rna及其应用

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Publication number: CN110218725B
Application number: CN201910431507.5A
Authority: CN
Inventors: 肖玲; 易黎明; 周辉; 臧慧; 陈思为
Original assignee: Central South University; Hunan Cancer Hospital
Current assignee: Central South University; Hunan Cancer Hospital
Priority date: 2019-05-22
Filing date: 2019-05-22
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2039-05-22
Also published as: CN110218725A

Abstract

本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及一个长链非编码RNA及其应用。本发明首次发现了一个新克隆的肝癌相关长链非编码基因序列，并通过荧光实时定量等方法证明该基因在肺鳞癌组织中的差异性表达，为肺鳞癌的辅助诊断提供了强有力的分子生物学工具。

Description

一个长链非编码RNA及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及一个长链非编码RNA及其应用。

背景技术

肺癌发病率位居我国恶性肿瘤首位，绝大多数为非小细胞肺癌(non-small celllung carcinoma，NSCLC)，约占肺癌总数的80％～85％。由于早期病症隐蔽，大部分NSCLC患者确诊时已属中晚期，其治疗手段主要为铂类药物联合化疗，但铂类耐药发生率高达60％，因此NSCLC病死率居首位。NSCLC病理类型中鳞癌约占总发病数30％，具有原发灶大，转移快，对铂类联合化疗不敏感，易产生耐药，疗效与预后差等特点，已成为NSCLC治疗中尤为棘手的一种类型。

低剂量螺旋CT(Low-dose computed tomography,LDCT)是发现早期肺癌和降低死亡率的有效筛查工具，2011年美国国家肺癌筛查试验(National LungScreening Trial,NLST)已经表明LDCT相比胸部X线筛查可降低20％肺癌的死亡率。基于此研究结果，国际学术组织及国外多家医疗机构已建议在高危人群中开展低剂量螺旋CT筛查，并制定了相应的肺癌筛查指南。

在我国，由中国肺癌早诊早治专家组专家及部分非专家组专家制定的《中国肺癌低剂量螺旋CT筛查指南》(2018年版)中指出：推荐中国肺癌高危人群进行LDCT筛查。然而，当建议肺癌高危个体接受LDCT筛查时，也会产生一些潜在的危害。其中，最突出的是假阳性率过高，从而导致不必要且有创的检查；另外一个潜在的危害是辐射，特别是对于肺癌发病危险较低的个体，更应该进行权衡。

血清肿瘤标志物的检测属于生物化学检测，具有费用低廉、损伤小、患者易接受和取样方便等特点，可作为早期肺癌检测的辅助手段。若联合肺癌LDCT筛查应用可降低过高的假阳性率结果。目前较为确定的、在临床中常用的肺癌标志物包括癌胚抗原(CEA)、CA125、神经特异性烯化酶(NSE)、铁蛋白(SF)和组织多肽特异性抗原(TPS)等。但肿瘤标志物在不同个体中差异很大，当然肿瘤的病理类型对肿瘤标志物的变化也有着巨大的影响，同时受到技术条件的限制，其检测的敏感性和特异性均不理想，至今尚无可靠的标志物可用于大规模普查。因此探索和发展具有高灵敏度高特异性的肿瘤标志物具有重要的科学和临床意义。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一类转录本长度超过200bp，无蛋白质编码功能的RNA，表达具有组织特异性和时空特异性。研究发现很多lncRNA在肿瘤的发生发展中有重要调节作用，它具有抑制肿瘤生长和促进肿瘤转移等生物学作用。已有的一些研究在许多肿瘤组织中发现了lncRNA的异常表达。目前肺鳞癌相关的表达研究还处在初步阶段，对作为肺鳞癌肿瘤标志物的潜力尚未有一个很好的评估。探索lncRNA在肺鳞癌的生物学功能以及lncRNA表达与肺鳞癌的关系对了解肺鳞癌的发生发展以及检测具有重大意义。

发明内容

针对现有技术存在的空白，本发明提供一个长链非编码RNA及其应用，目的是通过一个新克隆肺鳞癌相关lncRNA基因，根据该基因序列，设计并合成实时定量PCR引物和原位杂交探针，制备用于肺鳞癌辅助诊断制剂。

本发明的长链非编码RNA，序列如下：

CCCAGCTTAGTGTCAGGATACTTTCGATTCATAATTATGTATGATCCAAAGTGTGCATAATTTCATTTAACGTTAAAGAAATAGATCCAATTCCTTTCTTGCAACCAAAAATAAATAAAATACGTTGCCTCAGTATAAGGTTTGGGCTATTCTGTGTTTCTATAGAAGCAATCTGTTTTTGGTAAAATGTACTTTTAAGGATCCAGTCATCTGAAGTATTTTATGTAGAGTTAGAGATTTCACAATATTGACTATACATATATTTAAAATATAAATTATCCAGCTGATGTTTGAATTTGTCTTACTTTCCTGGCCACCTCGTTGTCCTATTTTATAAGCTGGGGAGTTAACTAGCTTAACAAAAGATGCTTAGCTTTTGTAAAAGAACAAGTGTTTCATTTTACAAAGACACTCCAAATGATAGTTACTTGATTTT。

一种表达上述长链非编码RNA序列的载体。

本发明的长链非编码RNA，用于制备肺鳞癌辅助诊断制剂：

根据lncRNA基因序列，设计并合成实时定量PCR引物和原位杂交探针，其中，用于实时定量检测的上、下游引物分别为：

5’-GCCTCAGTATAAGGTTTGGGCT-3’

5’-CGAGGTGGCCAGGAAAGTAA-3’

内参基因GAPDH的上、下游引物分别：

5’-ACAGCCTCAAGATCATCAGC-3’

5’-GGTCATGAGTCCTTCCACGAT-3’。

与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：

在lncRNA的研究中，lncRNA芯片技术应用广泛，lncRNA芯片技术主要应用于差异lncRNA的筛选，对差异lncRNA进行重注释，对差异lncRNA的靶基因进行预测，构建差异lncRNA与靶基因共表达网络，差异lncRNA与差异mRNA的共表达分析，差异lncRNA靶基因的GO analysis、pathway analysis等。

本发明的基本技术思路和验证过程如下：

(1)用lncRNA芯片检测肺鳞癌组织，得到5645个lncRNA探针显著差异表达，其中3635个lncRNA探针在肿瘤组织中表达上调，2009个lncRNA探针在肿瘤组织中表达下调，其中绝大部分的功能未知。

(2)对显著差异表达的lncRNA进行二维分层聚类分析，这些lncRNA探针可以将肺鳞癌的肿瘤组织和癌旁组织聚成两大类，说明肿瘤组织和癌旁组织的lncRNA表达模式存在显著的差异。

(3)对差异表达的lncRNA进一步做KEGG通路分析发现，与其相关的通路有细胞周期等。

(4)构建共表达网络，有67个lncRNA靶向作用于CHK2基因，有13个lncRNA倍数变化的绝对值≥10。选取50对肺鳞癌肿瘤组织和癌旁组织用qRT-PCR验证以上13个lncRNA，其中H-InvDB_1005_436等8个lncRNA表达变化与芯片结果一致。

(5)我们选取50对肺鳞癌组织和癌旁组织对芯片结果进行验证。通过qRT-PCR的方法检测该lncRNA的表达情况，通过抽提组织中总RNA，对其总RNA进行逆转录获得cDNA，通过实时定量PCR，检测了该lncRNA的表达情况，结果显示该lncRNA在肺鳞癌组织中表达下调(P<0.05)，我们随后又利用qRT-PCR的方法，进一步在大样本中验证了该lncRNA在肺鳞癌中表达显著下调(P<0.05)因此针对该lncRNA的检测制剂可用于肺鳞癌的辅助诊断。

我们还针对该lncRNA基因的序列设计了lncRNA表达载体，利用该载体在肺鳞癌细胞系中过表达该lncRNA，且发现过表达该lncRNA表达可抑制肺鳞癌细胞系的增殖、迁移、侵袭和促进凋亡，因此针对该lncRNA的过表达制剂也具有基因治疗的潜在用途。

本发明首次发现了一个新克隆的肝癌相关长链非编码基因序列，并通过荧光实时定量等方法证明该基因在肺鳞癌组织中的差异性表达，为肺鳞癌的辅助诊断提供了强有力的分子生物学工具。

附图说明

图1是本发明实施例2中构建过表达载体pcDNA3.1(+)-H-InvDB_1005_436的双酶切结果图；

图2是本发明实施例2的重组质粒结构示意图；

图3是本发明实施例2中qRT-PCR检测lncRNA H-InvDB_1005_436在细胞中的表达图。

图4是本发明实施例3中细胞增殖实验lnc RNA H-InvDB_1005_436对细胞增殖的影响图之一，(**与其它组比较，P＜0.01)；

图5是本发明实施例3中细胞增殖实验lnc RNA H-InvDB_1005_436对细胞增殖的影响图之二，(*其它组比较，P＜0.05，**与其它组比较，P＜0.01)；

图6是lnc RNA H-InvDB_1005_436对细胞迁移的影响图之一(**与其它组比较，P＜0.01)；

图7是lnc RNA H-InvDB_1005_436对细胞迁移的影响图之二(A:空白对照组，作用0小时；A1:空白对照组，作用48小时；B:NC组，作用0小时；B1:NC组，作用48小时；C:lnc组，作用0小时；C1:lnc组，作用48小时)；

图8是lnc RNA H-InvDB_1005_436对细胞增殖的影响图(A：blank组，B：NC组，C：lnc-436组)。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1：

实时荧光定量法检测证实lncRNAH-InvDB_1005_436在肺癌中表达下调。

1.1材料与方法

收集50对肺鳞癌及癌旁组织，利用Trizol从冰冻组织中抽提总RNA，用超微量核酸蛋白测定仪测定总RNA的浓度。经逆转录成cDNA，进行实时荧光定量。lncRNA H-InvDB_1005_436引物为：

5’-GCCTCAGTATAAGGTTTGGGCT-3’和5’-CGAGGTGGCCAGGAAAGTAA-3’。

构建实时荧光定量反应体系：

以总RNA为模板按照逆转录试剂盒进行逆转录。

表1 逆转录试剂盒反应体系

以上体系混匀后，瞬时离心，逆转录反应程序为：42℃60分钟，70℃10分钟。

以cDNA为模板按照qPCR试剂盒进行qPCR反应。

表2 qPCR试剂盒反应体系

反应程序按照95℃，10min，(95℃，5sec 60℃，30sec 72℃，30sec)×40

溶解曲线分析，检测温度为70℃至95℃，升温速率为0.5℃/次，恒温时间为5sec/次。

1.2结果

与癌旁组织相比，lncRNA H-InvDB_1005_436在肺鳞癌组织中呈现低表达。

实施例2：

构建过表达载体过表达lncRNA H-InvDB_1005_436。

2.1材料方法

2.1.1试剂及试剂盒

限制性核酸内切酶Hind III、EcoR I购自NEB公司，T4DNA连接酶等购自TakaRa公司；

Trizol试剂购自Invitrogen公司

无内毒素质粒提取试剂盒(#DP118-02，TIANGEN)

胶回收试剂盒(#DP209-02，TIANGEN)

逆转录试剂盒(RUIBO)

2.1.2引物设计

根据LncRNA H-InvDB_1005_436的全长，添加双酶切位点，设计PCR引物。将引物输入Blast，确保引物特异性。设计的PCR引物序列如下：

Forward 5’-gaattcCCCAGCTTAGTTAGTGTCA-3’，

Reverse 5’-gaattcAAAATCAAGTAACTAACTATCAT-3’。

2.1.3构建过表达载体

培养肺鳞癌细胞，取80％-90％融合的细胞，提取细胞的总RNA，超微量核酸蛋白测定仪测定总RNA的浓度。根据逆转录试剂盒使用说明书进行逆转录，获得cDNA。再以cDNA为模板，进行常规PCR获取目的片段。

PCR试剂及程序如下：

按以下程序进行PCR反应：94℃5min，(94℃30sec，56℃30sec，72℃45sec)×27，72℃10min。

通过1％琼脂糖凝胶电泳富集目的片段，通过胶回收试剂盒回收目的片段。

将目的片段与pcDNA3.1(+)Vector同时用Hind III、EcoR I进行双酶切反应，双酶切反应体系如下：

酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳后回收，将两个酶切产物同T4DNA连接酶连接，并通过遗传转化将连接产物转入大肠杆菌DH5α。遗传转化过程如下：

1)将连接产物加入感受态细胞中，4度冰箱中放置30min。

2)42℃水浴，90sec，冰浴，5min。

3)在超净工作台中加入800ulLB大肠杆菌培养基。

4)用保鲜膜包被好置于摇床中37℃，220rpm，1.5小时。

5)离心4000rpm，6min，去750ul上清，余液混匀沉淀，涂板(LB+氨苄)。37度培养

箱中倒扣培养24小时。

6)挑取阳性克隆的单克隆菌落于(LB+氨苄)培养液中。37度摇床中培养。

构建的重组质粒经Hind III、EcoR I双酶切鉴定，挑取条带清晰亮度最大的阳性克隆测序鉴定，鉴定后的重组质粒用于后续实验。

将构建好的克隆载体在大肠杆菌中扩大培养，将菌液与30％甘油1:1保存在-80℃冰箱中。

2.1.4细胞培养与转染

肺鳞癌细胞系sk-mes-1获赠于中南大学临床药理研究所，细胞培养所用的DMEM和胎牛血清，及消化细胞所用的0.25％胰酶均购自美国Gibco公司。lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。

将生长状态良好的肺鳞癌细胞系sk-mes-1按5×10⁵个细胞每孔接种于六孔板中，将六孔板置于37℃，5％CO₂湿润的培养箱中过夜培养，待细胞生长至70％-80％密度是即可开始进行转染，转染过程如下：

在无菌0.5毫升的离心管中加入8ul的lipofectamine 2000于100ul无血清培养基中混匀静置5min；

将构建的lncRNA H-InvDB_1005_436表达载体及pcDNA3.1(+)质粒载体分别加入到100ul无血清培养基中混匀静置5min；然后与上述含有lipofectamine 2000于100ul无血清培养基混匀，室温静置30分钟，形成脂质体与DNA的复合物；

用无血清培基洗涤细胞3次；

将上述复合物加入到800ul无血清无抗生素的培基中，温和混匀后分别加入到六孔板的一个孔中。

将六孔板置于5％CO₂湿润培养箱中，37℃培养6小时，然后弃上清，加入无抗生素含10％FBS的培养基继续培养48小时。

2.1.5qRT-PCR检测过表达lncRNA表达情况

提取各孔中的细胞总RNA，1ug的RNA经逆转录成cDNA后进行实时荧光定量PCR。反应试剂和反应条件与实施例1相同。

反应结束后反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，表达强度根据CT值、内参基因(GAPDH)标化后，采用t检验计算P值。

2.2结果

2.2.1过表达载体pcDNA3.1(+)-H-InvDB_1005_436构建成功。

经过双酶切检测(图1)与测序结果证明过表达载体pcDNA3.1(+)-H-InvDB_1005_436构建成功，重组质粒的结构示意图如图2所示.

2.2.2过表达载体可显著上调肺鳞癌细胞中lncRNA H-InvDB_1005_436的表达水平。

通过RT-qPCR检测lncRNAH-InvDB_1005_436在过表达组lnc-436组及NC组中的表达，如图3所示，在细胞中lncRNA H-InvDB_1005_436呈现明显的过表达。

实施例3

过表达lncRNA对肺鳞癌细胞细胞生物行为学的影响研究。

3.1细胞培养与转染

肺鳞癌细胞系sk-mes-1获赠于中南大学临床药理研究所，细胞培养所用的DMEM和胎牛血清(FBS)，及消化细胞所用的0.25％胰酶均购自美国Gibco公司。lipofectamine2000购自Invitrogen公司。

将生长状态良好的肺鳞癌细胞系sk-mes-1用0.25％胰酶消化后，按1×10⁶个细胞每孔接种于六孔板中，将六孔板置于37℃，5％CO₂湿润的培养箱中过夜培养，待细胞生长至70％-80％密度是即可开始进行转染，转染过程如下：

将构建的lncRNA H-InvDB_1005_436表达载体及pcDNA3.1(+)质粒载体分别加入到100ul无血清培养基中混匀静置5min；然后与上述含有lipofectamine 2000的100ul无血清培养基混匀，室温静置30分钟，形成脂质体与DNA的复合物；

用无血清培基洗涤细胞3次；

将六孔板置于5％CO₂湿润培养箱中，37℃培养6小时，然后弃上清，进行下一步实验。

3.2细胞增殖实验

将转染6小时后的细胞用不含抗生素的10％FBS的DMEM培基培养过夜后，将转染后的细胞(过表达组(lnc-436组)、空载质粒组(NC组))，用0.25％胰酶(含EDTA)消化一分钟，用不含抗生素含10％FBS的DMEM培基轻柔的将细胞重悬。再以10000个细胞每孔接种至96孔板中，过夜培养，待细胞贴壁后加入干预药物分别作用24、48小时。加入MTT检测，在490nm处检测吸光度，绘制吸光度曲线，探究lncRNA H-InvDB_1005_436对药物敏感性的影响。将细胞种板后继续培养1d、2d、3d、4d后，加入MTT检测，在490nm处检测吸光度，绘制吸光度曲线，探究lncRNA H-InvDB_1005_436对细胞增殖的影响。

3.3细胞划痕实验

细胞划痕实验是检测细胞迁移能力的实验方法。未转染的skmes-1细胞(blank组)、转染后的细胞(过表达组lnc-436组、空载质粒NC组)在六孔板中细胞密度达到90％时，用maker笔在六孔板的背面划5条平行的直线，用200ul的枪头在六孔板的每孔内划垂直于背面直线的划痕，每孔划三条。用PBS洗去划痕下来漂浮的细胞。并在显微镜下拍照观察，记录每个视野的位置。随后的24小时、48小时等时间点在同一划痕点观察划痕愈合情况，拍照，并计算各组细胞迁移率。

3.4细胞侵袭实验

Transwell实验室验证肿瘤细胞侵袭能力的实验方法。Transwell小室(孔径8um)及基质胶Matrigel均购自Corning公司。

做侵袭实验前一天晚上将基质胶从-80℃冰箱中取出于四度冰箱过夜。基质胶与PBS按1：8的比例稀释，取稀释后的基质胶100ul均匀的涂抹在Transwell小室底部膜的上室面，置于37℃培养箱中使基质胶聚合成凝胶。在使用前对基底膜进行水化。

用无血清无抗生素培基将未转染的sk-mes-1细胞、转染后的细胞(过表达组(lnc-436组)、空载质粒NC组))细胞浓度调整至1×10⁶/ml，在每个Transwell小室上层加入100ul的细胞。在小室下层加入不含抗生素含10％胎牛血清的培养基。放入培养箱中继续培养24小时。

用棉签轻轻擦掉上室中未迁移的细胞，用PBS轻柔的冲洗小室，用甲醇固定细胞30min，移除甲醇，0.1％的结晶紫溶液给细胞染色，用PBS洗细胞3遍。在显微镜下观察并拍照穿过基质胶膜的细胞。

3.5结果

3.5.1过表达lncRNA H-InvDB_1005_436抑制细胞增殖。

细胞贴壁24和48小时后加入MTT检测，在490nm处检测吸光度，绘制吸光度曲线，如图探究lncRNA H-InvDB_1005_436对药物敏感性的影响。将细胞种板后继续培养1d、2d、3d、4d后，加入MTT检测，在490nm处检测吸光度，绘制吸光度曲线，探究lncRNA H-InvDB_1005_436对细胞增殖的影响，结果如图4和图5所示，结果显示过表达lncRNA H-InvDB_1005_436能够明显抑制细胞增殖。

3.5.2过表达lncRNA H-InvDB_1005_436抑制细胞迁移。

如图6和图7所示，在作用48小时后，blank组与NC组的迁移率无明显差异，差异不具有统计学意义。而NC组与lnc-436组相比，过表达lnc RNA H-InvDB_1005_436明显抑制细胞迁移，且差异具有统计学意义(P＜0.01)。

3.5.3过表达lncRNA H-InvDB_1005_436抑制细胞侵袭。

如图8所示，细胞侵袭实验结果显示过表达lncRNA H-InvDB_1005_436能够抑制细胞侵袭。

序列表

<110> 中南大学

湖南省肿瘤医院

<120> 一个长链非编码RNA及其应用

<130> 2019052101

<141> 2019-05-21

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 436

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cccagcttag tgtcaggata ctttcgattc ataattatgt atgatccaaa gtgtgcataa 60

tttcatttaa cgttaaagaa atagatccaa ttcctttctt gcaaccaaaa ataaataaaa 120

tacgttgcct cagtataagg tttgggctat tctgtgtttc tatagaagca atctgttttt 180

ggtaaaatgt acttttaagg atccagtcat ctgaagtatt ttatgtagag ttagagattt 240

cacaatattg actatacata tatttaaaat ataaattatc cagctgatgt ttgaatttgt 300

cttactttcc tggccacctc gttgtcctat tttataagct ggggagttaa ctagcttaac 360

aaaagatgct tagcttttgt aaaagaacaa gtgtttcatt ttacaaagac actccaaatg 420

atagttactt gatttt 436

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcctcagtat aaggtttggg ct 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgaggtggcc aggaaagtaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acagcctcaa gatcatcagc 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtcatgagt ccttccacga t 21

Claims

1.过表达长链非编码RNA的载体在用于制备抑制肺鳞癌细胞增殖与侵袭制剂中的应用，所述的长链非编码RNA的序列为：