CN108676881A

CN108676881A - 特异性识别chaf1a的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的用途

Info

Publication number: CN108676881A
Application number: CN201810509941.6A
Authority: CN
Inventors: 王德强; 束永前; 李小琴; 陈德玉; 顾汉刚; 朱雯
Original assignee: Affiliated Hospital of Jiangsu University; Jiangsu Province Hospital
Current assignee: Affiliated Hospital of Jiangsu University; Jiangsu Province Hospital
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2018-05-24
Publication date: 2018-10-19

Abstract

本发明通过广泛而深入的研究，首次揭示了CHAF1A与非贲门胃癌患者的总生存（overall survival，OS）和无病生存（disease‑free survival，DFS）均显著相关。CHAF1A是非贲门胃癌患者OS和DFS的独立预测因素。CHAF1A也与小肿瘤及神经侵犯（perineural invasion，PNI）阴性胃癌患者的OS显著相关。这些研究成果，为胃癌的判断、和/或预后评估提供了新思路。

Description

特异性识别CHAF1A的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的用途

技术领域

本发明属于生物医学研究领域，具体涉及特异性识别CHAF1A的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的用途。

背景技术

尽管癌症基因组图谱计划(The Cancer Genome Atlas，TCGA)极大地拓展了我们对胃癌分子基础的认识，但是该研究基于多种高通量测序平台，技术手段复杂且代价高昂，临床难以推广。另一方面，人类基因组中大部分基因的功能仍然有待探索，而对已知功能的基因在持续的研究中也不断有新的发现。上述事实表明，在后基因组时代，以寻找新的预后标志及治疗靶标为目的，继续研究参与胃癌发生发展的基因仍然是十分必要的。

CHAF1A(p150)是染色质组装因子1的亚单位之一。CHAF1A不仅参与核小体组装，而且在表观遗传修饰、细胞周期调控、DNA损伤修复等方面发挥重要作用，提示CHAF1A可能参与恶性肿瘤的发生发展。

CHAF1A与胃癌的关系仍未见报道。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供特异性识别CHAF1A的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的用途。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供CHAF1A用于制备或筛选胃癌检测试剂的用途。

在一种实施方式中，CHAF1A作为生物标志物。

在一种实施方式中，所述胃癌检测试剂用于胃癌的判断、和/或预后评估。

在一种实施方式中，所述胃癌选自非贲门胃癌、小肿瘤或神经侵犯(perineuralinvasion，PNI)阴性胃癌。

本发明的试验数据表明：CHAF1A与非贲门胃癌患者的OS和DFS均显著相关。CHAF1A是非贲门胃癌患者OS和DFS的独立预测因素。CHAF1A也与小肿瘤及PNI阴性胃癌患者的OS显著相关。

需要说明的是，所述胃癌检测试剂并不限定为必须为液体形式。

在一种实施方式中，所述胃癌检测试剂为特异性识别CHAF1A的试剂。

在一种实施方式中，特异性识别CHAF1A的试剂选自特异性识别CHAF1A基因的试剂或特异性识别CHAF1A蛋白的试剂。

在一种实施方式中，可基于所述的CHAF1A的基因序列，制备或筛选特异性识别CHAF1A基因的试剂，从而作为胃癌检测试剂。

在一种实施方式中，所述特异性识别CHAF1A基因的试剂选自以下任一种或多种：

(1)特异性扩增CHAF1A基因或转录本的引物；

(2)特异识别CHAF1A基因或转录本的探针。

在一种实施方式中，基于所述的CHAF1A的蛋白序列，制备或筛选特异性识别CHAF1A蛋白的试剂，从而作为胃癌检测试剂。

在一种实施方式中，所述特异性识别CHAF1A蛋白的试剂为CHAF1A蛋白的抗体或配体。

在一种实施方式中，所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明的第二方面，提供特异性识别CHAF1A的试剂用于制备胃癌检测试剂盒的用途。

在一种实施方式中，CHAF1A作为生物标志物。

在一种实施方式中，所述胃癌检测试剂盒用于胃癌的判断、和/或预后评估。

在一种实施方式中，所述胃癌选自非贲门胃癌、小肿瘤或PNI阴性胃癌。

需要说明的是，特异性识别CHAF1A的试剂并不限定为必须为液体形式。

在一种实施方式中，所述特异性识别CHAF1A的试剂选自特异性识别CHAF1A基因的试剂或特异性识别CHAF1A蛋白的试剂。

(1)特异性扩增CHAF1A基因或转录本的引物；

(2)特异识别CHAF1A基因或转录本的探针。

本发明的第三方面，提供一种胃癌检测试剂盒，所述试剂盒中至少包括特异性识别CHAF1A的试剂。

在一种实施方式中，CHAF1A作为生物标志物。

(1)特异性扩增CHAF1A基因或转录本的引物；

(2)特异识别CHAF1A基因或转录本的探针。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过广泛而深入的研究发现，首次揭示了CHAF1A与非贲门胃癌患者的OS和DFS均显著相关。CHAF1A是非贲门胃癌患者OS和DFS的独立预测因素。CHAF1A也与小肿瘤及PNI阴性胃癌患者的OS显著相关。这些研究成果，为胃癌的判断、和/或预后评估提供了新思路。

附图说明

图1：CHAF1A mRNA在人胃癌细胞系中的相对表达。

图2：CHAF1A mRNA在人胃癌组织及癌旁正常组织中的表达，T:tumor tissues；ANT:adjacent normal tissues(ANT)。

图3：野生型P53、MKI67及CHAF1A在胃癌组织中的表达，(200×)a和b:野生型P53高和低表达；c和d:MKI67高和低表达；e和f:CHAF1A高和低表达。

图4：胃癌组织中CHAF1A与MKI67mRNA表达水平的关系，a:基于TCGA的mRNA测序数据；b:基于本研究的mRNA测序数据。

图5：CHAF1A蛋白表达水平与胃癌患者总生存和无病生存的关系CHAF1A高表达对预后的显著影响见于总体人群(A and B)、非贲门癌(C and D)、小肿瘤(G)及神经侵犯阴性(H)的患者，而未见于贲门癌患者(E and F)。

图6：34例胃癌患者中CHAF1A高低表达两组间差异表达基因的热图。

图7：基于KEGG和BioCarta数据库，CHAF1A高低表达两组间差异最为显著的信号通路(a:表达上调的信号通路；b:表达下调的信号通路)。

图8：CHAF1A上调糖酵解相关酶的mRNA表达。

图9：基于mRNA测序数据和GSEA软件，在各临床亚组中与CHAF1A表达(高表达vs低表达)相关的信号通路A:在非贲门癌(Aa)、贲门癌(Ab)以及两组间比较(CHAF1A高表达：贲门vs非贲门；Ac)中最为显著的10个上调(黑色填充)和下调(白色填充)的信号通路；B:在神经侵犯阳性(Ba)、神经侵犯阴性(Bb)以及两组间比较(CHAF1A高表达：神经侵犯阳性vs阴性；Bc)中最为显著的10个上调和下调的信号通路；C:在大肿瘤(Ba)、小肿瘤(Bb)以及两组间比较(CHAF1A高表达：大肿瘤vs小肿瘤；Bc)中最为显著的10个上调和下调的信号通路；D:CHAF1A在大肿瘤中显著上调氧化磷酸化及其相关信号通路。GSEA软件对P值分析结果仅保留至小数点后三位，因此-LgP最大值为3。

具体实施方式

本研究展开了系统研究：1)检测CHAF1A蛋白和mRNA在胃癌中的表达情况；2)分析CHAF1A蛋白表达水平与胃癌患者临床病理特征、OS及DFS的关系；3)对胃癌组织样本行二代高通量mRNA测序，研究CHAF1A临床意义背后的分子基础。

本研究首次揭示了CHAF1A对胃癌预后的影响及其分子基础，提供了新的胃癌预后预测分子标志及潜在的治疗靶标，为胃癌个体化及精准防治提供了新的理论基础，具有重要的科学及临床意义。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1 CHAF1A在胃癌中的表达情况

一、方法

1、细胞系和细胞培养：人胃癌细胞系MGC-803、SGC-7901、MKN-45及BGC-823均购自中科院上海生化所，培养于37℃、5％CO₂培养箱中，使用RPMI 1640或DMEM(GIBCO-BRL)培养基。

2、研究对象和组织样本：

2.1对2012至2016年间在江苏大学附属医院做了胃癌手术的患者进行筛选，入选标准为：年龄为18-75周岁，肿瘤组织的质量和重量均能满足需要(石蜡包埋组织用于免疫组织化学染色)，病理学确诊的胃腺癌患者；排除标准为：临床病理资料不全，术前有化疗、放疗或生物靶向治疗史(包括新辅助治疗)。最终665例患者入选，其中男性486例，女性179例，中位年龄为62岁。收集所有患者的资料，临床和临床病理分级及肿瘤分期均参照美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)标准。本研究经江苏大学附属医院伦理委员会批准。

2.2 34例新鲜癌及癌旁正常组织样本取自随机挑选的江苏大学附属医院2016年胃癌手术患者，肿瘤在术中切除后立即取样，在液氮中冷冻后转入-80℃冰箱冻存，组织的质量和重量需满足高通量测序的需要。

2.3 375例TCGA胃癌患者的肿瘤mRNA高通量测序数据从TCGA的基因组数据共享数据门户网站(Genomic Data Commons Data Portal:https://portal.gdc.cancer.gov/)免费下载。

3、实验方法

3.1实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chainreaction，qRT-PCR)：

3.1.1细胞总RNA抽提(也可参考Invitrogen公司的Trizol操作说明书)

1)收集细胞，1000rpm离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1ml Trizol，迅速吹打后室温静置5min，然后转移至新的1.5ml eppendorf管中；

2)每管加入200μl氯仿，用手上下颠倒eppendorf管15s，室温静置10min；

3)4℃，12000rpm，离心15min；

4)吸取上清移至新的1.5ml eppendorf管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃沉淀10min；

5)4℃，12000rpm离心10min后，去上清；

6)加入至少1ml 75％乙醇(用DEPC处理过的水新鲜配制)，洗涤沉淀；

7)4℃，10000rpm离心5min，弃去大部分上清；

8)4℃，10000rpm再次离心5min，吸去上清；

9)室温干燥；

10)待RNA基本透明时，加入20μl RNase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。

3.1.2 RNA逆转录获得cDNA(也可参考Promega公司的M-MLV操作说明书)

M-MLV逆转录酶和dNTPs购自Promega公司，Oligo dT购自上海生工，RNase-free的物品都购自Axygen，具体步骤如下：

1)将1μl Oligo dT(0.5μg/μl)和2.0μg Total RNA加入到PCR小管中，补充DEPC-H2O至9ul；混匀后离心，70℃温浴10min；之后立即置于0℃冰水混合物中冰浴，使Oligo dT和模板退火；

2)配制反应体系(冰上进行)：在每管分别加入4μl 5×RT buffer、2μl10mMdNTPs、0.5μl Rnasin(40U/ul)、1μl M-MLV-RTase(200U/ul)、3.5μl DEPC H2O，混匀，短暂离心。注：dNTPs是dATP,dCTP,dGTP,dTTP的混合，浓度为10mM；

3)上述体系在42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使RT酶失活；

4)将得到的RT产物--cDNA置于-80℃保存备用。

3.1.3Real-time PCR检测

1)CHAF1A引物和GAPDH引物采用软件Beacon designer 2设计，GAPDH-F(上游)：TGACTTCAACAGCGACACCCA(SEQ ID NO.1)；GAPDH-R(下游)：CACCCTGTTGCTGT AGCCAAA(SEQID NO.2)；CHAF1A-F(上游)：AGGGAAGGTGCCTATGGTG(SEQ ID NO.3)；CHAF1A-R(下游)：CAGGGACGAATGGCTGAGTA(SEQ ID NO.4)；

2)配置反应体系：在每管分别加入10μl SYBR premix ex taq、0.5μl上游引物(2.5μM)、0.5μl下游引物(2.5μM)、1μl cDNA、8μl水；

3)设定程序为两步法Real-Time PCR：预变性95℃，15S；之后每一步变性95℃，5S；退火延伸60℃，30S；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值；

4)制作熔解曲线：PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4S,同时读取吸光值；

5)以2^-ΔΔCt反映各样品相对胃癌细胞目的基因的相对表达水平：ΔCt＝目的基因Ct值-GAPDH Ct值，-ΔΔCt＝细胞ΔCt平均值-各样品ΔCt。

3.2免疫组织化学检测

1)在60℃恒温箱中烘烤石蜡切片2小时；

2)脱蜡和水化：二甲苯20min两次，无水乙醇5min两次，95％乙醇5min两次，90％乙醇5min，80％乙醇5min，PBS 5min两次，蒸馏水5min；

3)抗原修复：枸橼酸钠缓冲液(10mM，PH6.0)，淹没切片，压力锅内煮沸，上汽3分钟后缓慢冷却；

4)PBS 5min两次；

5)正常血清封闭：取出切片，保持组织呈湿润状态，擦净周围水分，滴加兔血清，37℃，15分钟；

6)滤纸吸去血清，滴加一抗，37℃孵育2小时；

7)PBS 5min两次；

8)滴加二抗，37℃，40min；

9)PBS 5min两次；

10)滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37℃，30min；

11)PBS 5min两次；

12)DAB显色10min，自来水冲洗；

13)苏木素复染，室温，30min，自来水冲洗返蓝，15min；

14)梯度酒精脱水及透明：80％乙醇2min，95％乙醇2min，无水乙醇5min两次；二甲苯5min两次；

15)中性树脂封片，加盖玻片。

3.3免疫组化结果判读：

1)选择10个高倍视野(×400)，每个视野计数100个细胞中阳性细胞数，计算每张切片中阳性细胞的百分比，并分级为0级：阳性细胞<10％，1级：10％～25％，2级：26％～75％，3级：51％-75％为，4级：76％-100％；

2)对染色强度分级为0级：无着色，1级：浅棕色，2级：棕色，3级：深棕色；3)根据染色阳性细胞数比例与染色强度等级之乘积，判读<6为低表达，≥6为高表达。结果判读同时由两位资深病理科医师独立实施，不同判读结果经讨论后由第三人决定。

3.4基于二代测序(Next Generation Sequencing，NGS)平台的高通量(high-throughput sequencing，HiSeq)mRNA测序：

3.4.1组织总RNA抽提(根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行)

1)取1.5ml EP管，加入1ml TRIZOL裂解液；

2)将待研磨的组织样品从液氮或者-80℃中取出，用灭菌刀片把组织样品切割成3mmⅹ3mmⅹ3mm大小，置于装有裂解液的EP管中；

3)将超细匀浆机工作头浸入TRIZOL裂解液中5-10s灭活RNA酶，后进行组织研磨；

4)研磨完后4℃，5000rpm 3min离心，弃沉淀，吸取上清移至新的1.5ml EP管中进行样本RNA抽提；

5)每管加入200μl氯仿，用手上下颠倒eppendorf管15s，室温静置10min；

6)4℃，12800rpm，离心10min；

7)吸取上层液体移至新的1.5ml EP管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃静置10min；

8)4℃，12800rpm离心10min后，弃上清；

9)加入1ml 75％乙醇(用DEPC水新鲜配制)，洗涤沉淀；

10)4℃，11800rpm离心5min，弃去大部分上清；

11)4℃，11800rpm离心5min，弃去上清；室温干燥；

12)待RNA沉淀基本透明时，加入RNase-free水(加入体积视RNA沉淀量而定)至完全溶解，Nanodrop 2000/2000C分光光度计分析测定所抽提RNA的浓度及质量。

3.4.2构建测序文库

3.4.2.1文库预处理：构建文库前，需要分别对基因组DNA进行打断处理包括组织提取的DNA和白细胞提取的DNA样本，以及血浆ctDNA大小片段的分离。

3.4.2.2基因组DNA的打断

(1)根据DNA浓度吸取一定体积的DNA，总量2ug，不足2ug按照最大量进入，离心浓缩，配置成100ul体系，放入破碎管中；

(2)待机器水温降至4℃，按顺序将管子放入Holder上，设定好程序，开始破碎；

(3)破碎完成以后用掌上离心机将管壁上水珠甩下，吸取200ng跑电泳，验证破碎效果；

(4)加入一定量Beads到破碎后的DNA中，移液器混匀；

(5)室温放置5min，磁力架上放置5min；

(6)转移上清，80％乙醇清洗2次，去除残留，用一定体积水洗脱beads；

(7)室温放置5min，磁力架上放置5min，转移出上清，进入文库构建流程

3.4.2.3 DNA片段末端修复，加上A碱基末端：

(1)配置反应液Mix；

(2)将反应液Mix加入至待建库样本管中，上相应的末端修复程序的PCR仪，进行反应。

3.4.2.4加上Adaptor：

(1)根据DNA总量配置adaptor反应液

(2)将adaptor反应液加入到上步反应管中,简短离心，并用p200充分混合。上连接程序的PCR仪，20℃反应15min，立即进行下一步反应

3.4.2.5加上接头的DNA产物纯化

(1)加入一定量Beads到上步反应管中，移液器混匀；

(2)室温放置5min，磁力架上放置5min至上清澄清，小心移去并遗弃上清；

(3)转移上清置于磁力分离架上，80％乙醇清洗2次，去除残留，用一定体积水洗脱beads；

(4)室温放置5min，磁力架上放置5min，转移出上清

3.4.2.6对基因组DNA进行片段的选择(ctDNA样本无此步骤)

(1)加入一定量Beads到上步转移出的样本管中，移液器混匀；

(2)室温放置5min，磁力架上放置5min；

(3)取出上清，加入另一个管中，向管中一定体积的Beads；

(4)室温放置5min，磁力架上放置5min直至上清澄清；

(5)弃掉上清，80％乙醇清洗2次，去除残留，用一定体积水洗脱beads；

(6)室温放置5min，磁力架上放置5min，转移出上清；

(7)取出1ul测量浓度，其余保存在beads中，进行on－beads PCR

3.4.2.7样本PCR扩增反应

(1)配置PCR反应液

(2)将PCR反应液加入到每管待PCR的管中，移液器混匀；

(3)根据样本总量差异，选择合适的循环数，上扩增程序的PCR仪，进行反应

(4)PCR产物纯化：1XAxygen Beads磁珠纯化

(5)加入一定量Axygen Beads到扩增的文库管中，移液器混匀。

(6)室温放置5min，磁力架上放置5min直至上清澄清，小心移去并遗弃上清；

(7)置于磁力分离架上，排枪吸取200ul新鲜配制的80％乙醇清洗2次，去除残留，用一定体积水洗脱beads；

(8)室温放置5min，磁力架上放置5min.转移出上清，至1.5ml离心管中

3.4.3利用探针靶向富集目标基因片段

3.4.3.1靶向富集相关试剂配制

(1)封闭引物配制

(2)杂交液配制

(3)Wash Buffer配制

(4)PCR Mix配制

(5)QC PCR Mix配制

3.4.3.2靶向富集主要操作步骤

(1)根据基因组DNA文库样品数量和浓度计算需要混合的样品量此流程

(2)在文库池中加入封闭引物

(3)真空离心干燥上述DNA混合物

(4)对于每个杂交反应，加入杂交溶液后静置10min，然后用p20移液枪上下混匀10次确保DNA完全溶解，并转移到0.2ml MAXYmum Recovery PCR管中

(5)加入1.5pmole/ul DNA捕获探针，并用P20移液器混匀，将加入探针的杂交混合液置于PCR仪中运行hyb-t程序

(6)PCR仪中65℃，热盖加热过夜(16-18小时)

(7)捕获DNA及其清洗和回收

(8)将2×Beads Wash Buffer和10×Wash Buffer(I、Ⅱ、Ⅲ和Stringent)在室温解冻。上述溶液按照配方稀释成1X溶液：

3.4.3.3准备和清洗链霉亲和素磁珠

(1)蜗旋10s,混匀之后吸取磁珠至一个1.5ml Eppendorf DNA lobind tube，并置于室温30min。

(2)放于磁力架上约1min，待液体澄清后小心取出并遗弃液体，用1XBead WashBuffer重悬。将离心管放于1.5ml磁力架上约1min，待液体澄清后小心取出并遗弃液体，若多管磁珠清洗，每管最多可清洗5X beads.Bead Wash Buffer根据实际清洗beads计算。

(3)重复第2步操作

(4)用1XBead Wash Buffer重悬。转移磁珠到MAXYmum Recovery PCR管中。放于0.2ml磁力架上约1min，待液体澄清后小心取出并遗弃液体，保证所有的磁珠仍保留在PCR管中。

3.4.3.4捕获文库与链霉亲和素磁珠结合

(1)将过夜富集的杂交液从PCR仪中取出，短暂离心后，加入到含有链霉亲和素磁珠的管中，P20移液枪混匀。

(2)将捕获反应65℃孵育45min。

(3)每隔15min使用P20移液器上下吹吸混匀5次。

3.4.3.5磁珠捕获文库清洗，65℃

(1)加入65℃提前预热的1X Wash Buffer I。用p200移液枪上下混匀10次.并转移到一个新的1.5ml Eppendorf DNA lobind tube,涡旋10s,放于1.5ml磁力分离架上约1min，待液体澄清后小心取出并遗弃含有未结合DNA的上清液体。

(2)加入65℃提前预热的1X Strigent Wash Buffer。用p200移液枪上下混匀10次。并在65℃加热块上400rpm孵育5min。放于1.5ml磁力分离架上约1min，待液体澄清后小心取出并遗弃上清液体。

(3)重复步骤上述步骤

(4)加入室温1X Wash Buffer I。并涡旋震荡2min。放于1.5ml磁力分离架上约1min，待液体澄清后小心取出并遗弃上清液体

(5)加入室温1X Wash Buffer II。并涡旋震荡1min。放于1.5ml磁力分离架上约1min，待液体澄清后小心取出并遗弃上清液体

(6)加入室温1X Wash Buffer III。并涡旋震荡30s。放于1.5ml磁力分离架上约1min，待液体澄清后小心取出并遗弃上清液体

(7)尽量取出全部液体，并让磁珠在室温下干燥3min

3.4.3.6单链模板PCR反应

(1)磁珠稍干燥后，加入无酶水重悬磁珠，用p200移液枪上下混匀10次。

(2)分别取适量beads加入标记的#1和#2 0.2mlMAXYmum Recovery PCR管中。#1&#2同时进行on beads PCR。

(3)捕获富集DNA文库PCR富集

3.4.3.7PCR仪运行程序

(1)纯化PCR产物，1.5*/0.8*Axygen Beads磁珠

(2)取微量磁珠上下混匀PCR产物

(3)室温放置5min，磁力架上5min

(4)至于磁力架上，取出上清，加入80％乙醇，30s后弃上清。

(5)室温放5min.用无酶水重悬磁珠，混匀磁珠10次

(6)室温放5min，磁力架上放5min，取出上清，将得到的最终产物进入下一步测序流程

3.4.4上样测序

按照Hiseq 4000User Guide准备测序试剂，将携有cluster的flow cell上机(Hiseq 4000，Illumina)。选用paired-end程序，进行双端测序，南京世和基因生物技术有限公司生产的416panel作为肿瘤相关基因捕获探针。测序过程由Illumina提供的datacollection software进行控制，并进行实时数据分析。

3.4.5生物信息学分析

Hiseq4000测序仪器测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列即Raw Data数据，其中包含了测序序列的序列信息以及其对应的测序质量信息。其中可能含有总体质量较低、含有测序引物、末端质量偏低等不合格的reads，这些不合格的reads可能对分析质量造成一定影响，对raw data数据首先进行质控。

4.统计分析

统计软件为SPSS 19.0software(SPSS,Chicago,IL)。计数资料采用双侧卡方检验。相关系数的计算基于线性模型，采用普通最小二乘回归法。双侧p<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.CHAF1A mRNA在四种人胃癌细胞系中的表达

CHAF1A mRNA在人胃癌细胞系MGC-803、SGC-7901、MKN-45及BGC-823中的相对表达(CHAF1A/GAPDH)分别为1.399、3.083、2.208及2.062(如图1所示)，提示CHAF1A mRNA在人胃癌细胞系中表达。

2.CHAF1A mRNA在人胃癌组织及癌旁正常组织中的表达

如图2A所示，与癌旁正常组织相比，CHAF1A mRNA表达升高见于34例胃癌组织中的22例(64.7％)。如图2B所示，在TCGA有配对癌旁正常组织的32例胃癌样本中，CHAF1A mRNA表达升高见于其中30例(93.8％)。

3.CHAF1A蛋白在人胃癌组织及癌旁正常组织中的表达

如图3所示，CHAF1A蛋白阳性染色主要见于细胞核。CHAF1A蛋白高表达见于44.7％(297/665)的胃癌组织和13.1％(87/665)的癌旁正常组织，两者间比较，差异具有统计学意义(P<0.001)。

4.CHAF1A与野生型P53及MKI67蛋白表达水平的关系

由于胃癌常见P53突变及增殖标记MKI67高表达，我们进一步检测了这两个分子的表达水平。如图3所示，野生型(Wild-type)P53及MKI67蛋白阳性染色主要见于细胞核。如表1所示，在MKI67高表达的胃癌组织中，CHAF1A高表达率为51.5％，显著高于MKI67低表达胃癌组织的32.2％(P<0.001)；在野生型P53高表达的胃癌组织中，CHAF1A高表达率为41.3％，显著低于野生型P53低表达胃癌组织的50.2％(P＝0.026)。

表1.CHAF1A与野生型P53及MKI67蛋白表达水平的关系

5.CHAF1A与MKI67mRNA表达水平的关系

如图4a所示，在TCGA的375例胃癌组织(有mRNA表达资料)中，CHAF1A与MKI67mRNA表达水平呈显著正相关(r²＝0.344，P<0.0001)；如图4b所示，在本研究的34例进行了mRNA测序的胃癌组织中，CHAF1A与MKI67mRNA表达水平同样呈显著正相关(r²＝0.298，P＝0.0008)。

实施例2 CHAF1A的临床意义及其相应的分子基础

一、方法

1.免疫组化及高通量测序同实施例1。

2.随访生存随访采用电话方式进行。随访时间截至2017年12月31日。DFS定义为手术日期直到复发、转移或随访截止日期的时间。OS定义为手术日期直到随访截止或肿瘤相关死亡日期的时间。

3.统计学分析生存分析采用Kaplan–Meier法及Log-rank检验。OS和DFS的影响因素分析采用单因素及多因素Cox比例风险模型，各因素对预后的影响以风险比(hazardratio，HR)进行描述。双侧p<0.05为差异有统计学意义。所有分析均使用SPSS 19.0统计软件。在基因表达谱分析中，信号通路富集分析(pathway enrichment analysis)基于京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)和BioCarta数据库。基因本体论(Gene Ontology，GO)分析采用基因集合富集分析(Gene Set EnrichmentAnalysis，GSEA)软件v3.0版。

二、结果

1.CHAF1A与胃癌患者的特定临床病理特征有关

利用免疫组化，我们检测了665例胃癌患者石蜡包埋肿瘤样本中的CHAF1A表达水平。如表2所示，CHAF1A高表达更常见于非贲门癌，与贲门癌中的高表达率有显著差异的趋势(48.0vs 41.1％；P＝0.073).更有趣的发现是，CHAF1A高表达者的肿瘤神经侵犯(perineural invasion，PNI)率较低表达者显著下降(38.1vs 51.9％；P<0.001).此外，CHAF1A表达水平还与肿瘤大小(P＝0.014)和组织学分级(P＝0.005)显著相关，提示其可能具有重要的临床意义。

表2.CHAF1A表达水平与胃癌患者特征

2.CHAF1A是非贲门胃癌患者的独立预后预测因素

我们进一步研究了CHAF1A表达水平与患者临床结局的关系.如图5A和B所示，CHAF1A与OS(P＝0.018)和DFS(P＝0.048)显著相关.单因素分析显示(表3)，CHAF1A显著影响OS(P＝0.035)，对DFS有显著影响的趋势(P＝0.050)。但是，多因素COX回归分析未能发现CHAF1A对OS和DFS的独立预测作用(P>0.05；表4).

CHAF1A在临床亚组中的临床意义被进一步分析。如图5C和D所示，CHAF1A与非贲门胃癌患者的OS和DFS均显著相关(均P<0.001)，但在贲门癌中却没有得出这一结果(P>0.05；图5E和F).单因素分析显示(表5)，CHAF1A显著影响非贲门癌患者的OS和DFS(均P<0.001)。更重要的是，多因素COX回归分析显示(表6)，CHAF1A是非贲门胃癌患者OS(P＝0.015)和DFS(P＝0.002)的独立预测因素。此外，CHAF1A也与小肿瘤(最大径≤4.5cm)及神经侵犯阴性胃癌患者的OS显著相关(P＝0.015和0.005；图5G和H).

表3.胃癌患者总生存和无病生存影响因素的单因素分析

HR:hazard ratio；CI:confidence interval.

表4.胃癌患者总生存和无病生存影响因素的多因素分析

HR:hazard ratio；CI:confidence interval.

表5非贲门胃癌患者总生存和无病生存影响因素的单因素分析

HR:hazard ratio；CI:confidence interval.

表6.非贲门胃癌患者总生存和无病生存影响因素的多因素分析

HR:hazard ratio；CI:confidence interval.

3.CHAF1A促进瓦博格(Warburg)效应并以患者临床特征依赖性的方式调控胃癌的生物学活动

利用GSEA软件，我们进一步分析了本研究中34例胃癌患者肿瘤组织样本的mRNA测序数据，以研究与CHAF1A临床意义相关的基因表达谱变化。以CHAF1A mRNA的中位值为分界值，患者被分为CHAF1A高低表达两组。差异表达基因的热图见图6。如图7所示，与细胞周期、DNA复制、DNA修复及代谢等相关的信号通路在CHAF1A高低表达两组间差异最为显著。

我们还发现CHAF1A高表达抑制氧化磷酸化(图7b)。为进一步验证CHAF1A与糖酵解的关系，我们利用TCGA数据比较了CHAF1A高低表达两组(以CHAF1A mRNA的中位值为分界值)间糖酵解相关酶的mRNA表达水平。如图7所示，CHAF1A高表达显著上调了所有糖酵解相关酶的mRNA表达(P<0.05)。此外，对糖酵解有关键性调控作用的一系列原癌基因如mTOR,MYC和AKT等的mRNA表达也被CHAF1A高表达所显著上调(P<0.05；图8).这些结果表明，CHAF1A抑制氧化磷酸化的同时促进糖酵解，提示CHAF1A促进瓦博格(Warburg)效应。

GO分析的结果还提示了CHAF1A的其它功能，如调控基因表达、免疫反应、蛋白功能和定位、细胞衰老和命运、细胞分化和组织发育(包括了多种上皮细胞和神经细胞)。特别是，CHAF1A可以通过多种机制调控基因表达及蛋白功能，这可能是CHAF1A作用的基础。

我们进一步分析了CHAF1A在临床亚组中生物学功能。如图9所示，与在非贲门癌中相比，CHAF1A在贲门癌中有更强的免疫调节作用，而对细胞增殖和生存的作用则减弱；与在神经侵犯(perineural invasion，PNI)阴性胃癌中相比，CHAF1A在神经侵犯阳性胃癌中对神经活动的影响增加，而对细胞增殖和生存的影响则减弱；在大和小肿瘤之间，CHAF1A高表达诱导了不同的代谢类型，氧化磷酸化在大肿瘤中上调，而相关通路在小肿瘤中下调。这些结果表明，CHAF1A的作用依赖于临床特征。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 江苏大学附属医院

江苏省人民医院

<120> 特异性识别CHAF1A的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的用途

<130> 182547

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgacttcaac agcgacaccc a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caccctgttg ctgtagccaa a 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agggaaggtg cctatggtg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagggacgaa tggctgagta 20

Claims

1.CHAF1A用于制备或筛选胃癌检测试剂的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，CHAF1A作为生物标志物。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述胃癌选自非贲门胃癌、小肿瘤或PNI阴性胃癌。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述胃癌检测试剂为特异性识别CHAF1A的试剂。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，特异性识别CHAF1A的试剂选自特异性识别CHAF1A基因的试剂或特异性识别CHAF1A蛋白的试剂。

6.特异性识别CHAF1A的试剂用于制备胃癌检测试剂盒的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述胃癌检测试剂盒用于胃癌的判断、和/或预后评估。

8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述胃癌选自非贲门胃癌、小肿瘤或PNI阴性胃癌。

9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述特异性识别CHAF1A的试剂选自特异性识别CHAF1A基因的试剂或特异性识别CHAF1A蛋白的试剂。

10.一种胃癌检测试剂盒，所述试剂中至少包括特异性识别CHAF1A的试剂。