CN117711481A - 基于RNA修饰的RMR Score模型及在前列腺癌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于RNA修饰的RMR Score模型及在前列腺癌中的应用。本发明通过基于对8种RNA修饰中几十余种RNA修饰调节因子进行分析，以构建了一种新的预测模型，即RMR Score。通过筛选获得特定的RNA修饰调节因子按照公式计算获得RMR Score，能够用于对前列腺癌进行辅助诊断以及预后评估。本发明所筛选得到的RNA修饰调节因子与前列腺癌的进展存在高度关联性。本发明对于前列腺癌提前诊断，解决个体间临床疗效差异与退缩效果/预后评估空白的难题，更好地实现精准治疗具有重要的现实意义。为人类攻克前列腺癌提供了一个新的思路，从而为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向，具有极高的社会价值和市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及基于RNA修饰的RMR Score模型及在前列腺癌中的应用。
背景技术
最近的研究显示前列腺癌(prostate cancer，PCa)已成为男性第2大常见恶性肿瘤，其对男性健康产生了严重威胁。在局限性前列腺癌阶段，临床上常通过根治性前列腺癌切除术或放射疗法进行治疗。而在PCa的复发或晚期阶段常用雄激素剥夺疗法、内分泌治疗和免疫治疗等。但由于前列腺癌的异质性，目前在治疗后的监测、个性化药物选择等方仍面临着诸多挑战，当前的临床指标等难以满足现代医学中个体化治疗的需要，这往往容易导致治疗不足或过度治疗。因此，需要对前列腺癌异质性进行更深入的研究。
肿瘤异质性是发生展过程中的关键特征。肿瘤的异质性不仅建立在慢性或偶发性基因组不稳定性和由此产生的肿瘤细胞遗传异质性的基础上，而且还与非突变表观遗传异质性有关。非突变表观遗传异质性主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA修饰、染色质重塑等，其中RNA修饰是目前研究较为广泛的领域之一，然而RNA修饰在前列腺癌中所发挥的角色和功能仍有待深入挖掘。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中所存在的前列腺癌难以得到提前诊断、无法准确评估个体间临床疗效差异与预后的技术问题，从而提供了一种基于RNA修饰的RMR Score模型用于对前列腺癌进行辅助诊断和预后评估。通过对前列腺癌患者体内特定RNA修饰调节因子表达水平进行检测并分析，从而对患者生化复发风险以及预后等进行有效预测，可作为一种风险评估工具筛选出生化复发高风险的前列腺癌患者，以进行合理的提前预防和治疗，指导前列腺癌患者的个体化精准治疗，进一步优化前列腺癌患者的管理，避免因治疗不及时而导致的疾病进展或因治疗过度导致的医疗资料浪费。
为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。
本发明第一方面提供了一种基于RNA修饰的用于前列腺癌辅助诊断和/或预后评估的RMR Score模型，所述RMR Score按照如下公式进行计算：
其中N代表RNA修饰调节因子的数量，Coefi代表RNA修饰调节因子在“CoxRidge”中的系数，Expression level of RNAi代表RNA修饰调节因子的表达水平。
应理解的是，在没有特别说明的情况下，在本发明上下文中，RMR Score、RMR-Score、RMR SCR、RMR-SCR、RMR评分、RMR得分、RMCoEs等表述，均为同一意思的表达，即为RNAModification Regu lators’Co-Expression Score的简化表述，理解为对患者罹患前列腺癌进行辅助诊断和/或对前列腺癌患者预后进行评估的方式，进而对前列腺癌患者罹患前列腺癌的风险、生化复发风险、生存率、预后等进行合理预测。本发明上下文中所述的“模型”即为临床预测模型，本领域技术人员能够理解所述的“模型”为一种产品。临床上通过使用参数/半参数/非参数数学模型来评估受试者当前患有某种疾病的概率或将来发生某种结局的可能性。通过该模型，可利用已知特征来计算未知结局发生的概率。临床预测模型一般采用各种回归分析方法建模，回归分析的统计本质是寻找一种定量因果关系，可用于对疾病进行诊断和/或预后评估，从而在诊断治疗决策、患者预后管理、公共卫生资源配置等方面发挥作用。
作为优选地，所述RNA修饰调节因子选自RPUSD3、WBSCR22、TR MT61A、NSUN5中的一种或多种；最优选地，所述RNA修饰调节因子由RPUSD3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5组成。
作为优选地，所述预后评估的指标包括生化复发发生率、生化复发发生时间、五年生存率、RMR Score中的一种或多种。
本发明第二方面提供了检测生物标志物表达水平的试剂在制备用于对前列腺癌进行辅助诊断和/或预后评估的产品中的应用，所述标志物由RPUSD3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5组成。
作为优选地，所述检测标志物表达水平的试剂包括用于检测标志物基因表达水平的引物对和/或检测标志物基因编码的蛋白含量的试剂。
作为优选地，所述检测标志物表达水平的试剂包括用于检测标志物基因表达水平的引物对和/或检测标志物基因编码的蛋白含量的试剂选自RPUSD3(sc-393209，SantaCruz)、WBSCR22 antibody(A7317，Abclonal)、TRMT61A(NBP2-94200，Novus)、NSUN5antibody(sc-376147，Santa Cruz)中的一种或多种。
应理解的是，在没有特别说明的情况下，在本发明上下文中，所述引物和/或引物对是指用于在PCR中合成各标志物基因cDNA链的PCR引物，从而用于检测各标志物基因的表达水平。除本发明所列出的引物和/或引物对外，本领域技术人员完全有能力根据各标志物的基因序列采用包括但不限于分子生物学等本领域的常规方法手段进行相应引物和/或引物对的设计，并通过常规实验手段对所设计的引物和/或引物对进行筛选，只要能够实现特异性检测各标志物表达水平即可。同时，对于所述用于检测各标志物基因编码的蛋白含量的抗体试剂，本领域技术人员可以通过市售获得，也可以根据各标志物基因序列和/或蛋白结构自行设计完成。
作为优选地，所述预后评估的指标包括生化复发发生率、生化复发发生时间、五年生存率、RMR Score中的一种或多种。
作为优选地，所述试剂盒还包括PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光底物中的一种或多种。
作为优选地，所述荧光底物选自Syber Green或荧光标记的探针。
本发明第三方面提供了一种用于前列腺癌辅助诊断和/或预后评估的系统，包括：
输入单元，用于输入待评估患者的数据；
分析单元，用于对待评估患者的样本中的标志物表达水平进行检测，所述标志物由RPUSD3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5组成；
评估单元，用于对分析单元分析得到的数据按照如下公式进行计算，以获得患者的RMR Score值，并根据RMR Score值将患者分为RMR Score高得分组或RMR Score低得分组，最后对患者罹患前列腺癌的风险和/或预后作出评估：
其中N代表RNA修饰调节因子的数量，Coefi代表RNA修饰调节因子在“CoxRidge”中的系数，Expression level of RNAi代表RNA修饰调节因子的表达水平。
作为优选地，输入单元中所述数据包括但不限于患者的血液样本数据、肿瘤组织样本数据、癌旁组织样本数据中的一种或多种。
作为优选地，所述评估单元中按照如下标准对患者罹患前列腺癌的风险和/或预后进行评估：
(a)RMR Score高得分组罹患前列腺癌的风险高于RMR Score低得分组；RMR Score得分越高，罹患前列腺癌的风险相对越高，RM R Score得分越低，罹患前列腺癌的风险相对越低；
(b)RMR Score高得分组总体生存率低于RMR Score低得分组；RMR Score得分越高，总体生存率相对越低，RMR Score得分越低，总体生存率相对越高；
(c)RMR Score高得分组前列腺癌生化复发率高于RMR Score低得分组；RMR Score得分越高，前列腺癌生化复发率相对越高，RM R Score得分越低，前列腺癌生化复发率相对越低；
以及(d)RMR Score高得分组远处转移率高于RMR Score低得分组；RMR Score得分越高，远处转移率相对越高，RMR Score得分越低，远处转移率相对越低。
本发明第四方面提供了一种计算机可读的存储介质，其中存储有处理器可执行的指令，所述处理器可执行的指令在处理器执行时执行上述用于前列腺癌辅助诊断和/或预后评估的系统。
本发明第五方面提供了抑制RNA修饰调节因子表达水平的抑制剂在制备治疗前列腺癌的药物中的应用，所述RNA修饰调节因子选自RPUSD3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5中的一种或多种。
作为优选地，所述抑制剂选自基于RNA修饰调节因子设计的siR NA。
作为优选地，所述siRNA选自si-1，si-2，si-3，si-4，si-5，si-6，si-7，si-8，si-9，si-10，si-11，si-12中的一种或多种，其中si-1，si-2，si-3，si-4，si-5，si-6，si-7，si-8，si-9，si-10，si-11，si-12序列分别为：
si-1：GCCCUGUUACCUGCUGGAUTT；si-2：CGAGCAUUGGAGCUUCUUUA UTT；si-3：CAGUGCCAAAGCAAAGAAAUUTT；si-4：GUCGCCUCCAGAAGUAC UUCATT；si-5：CUUCAGGUUGUCCGAGCAUCUTT；si-6：CCUGAAACUGGAAC ACAUUTT；si-7：GGCAUACGAGGAGCUGAUCAATT；si-8：GCGGCACUCAGUU GACCUUAUTT；si-9：GCAGAUCCUCUACUCCACAGATT；si-10：GACCUGCUC CGAUGAUGUAGUTT；si-11：CCGAUGAUGUAGUUGAUUATT；si-12：AUGAAG ACGUGGUGCGAGATT。
由于前列腺癌是一种有着高度异质性的恶性肿瘤，现有的临床指标无论在其复发、转移、治疗抵抗的不同阶段应用仍有局限性。随着高通量测序的新兴技术发展，RNA修饰的表观遗传机制在近年来受到关注，是认识前列腺癌异质性的一个重要突破口。有超过100种不同类型的合成后修饰已被证明存在于RNA上，例如m6A是真核生物RNA中最常见的、丰度最高的修饰方式，m5C则有着中等丰度，在mRNA中，pseudouridine(Ψ)修饰丰度最高。n4-乙酰胞苷(ac4C)是一种高度保守的RNA修饰，是mRNA中描述的第一个乙酰化事件；a-to-i(AI)RNA编辑是一种转录后修饰，将RNA转录物中的腺苷转化为肌苷。选择性聚腺苷酸化(APA)是一种广泛观察到的进化保守的调控机制，负责在mRNA中产生多种3'端。n1-甲基腺苷(m1A)是一种可逆的转录后RNA修饰，存在于tRNA、rRNA和mRNA中。
在被修饰的RNA类型上，近年来由于RNA修饰被认为不仅仅是蛋白质合成(mRNA)或效应分子(tRNA和rRNA)的中介，RNA修饰已经获得了突出的地位。这表明，主要在tRNA和rRNA中发现的已知RNA修饰也可能存在于其他RNA形式中，可能跨越所有RNA类型，并在其功能中发挥调节作用，最近在mRNA、miRNA和lncRNA中发现了这一点。由此可见，RNA修饰的作用途径是多样的，不同类型的RNA修饰能作用于各种各样的RNA，然而前列腺癌中相关研究依旧有限，需要进一步深入探索。
为了验证RNA修饰在前列腺癌中的作用，本发明猜想这些不同类型修饰功能也不是孤立的，很可能存着一个RNA修饰调控网络，于是在本发明中，通过基于对8种RNA修饰中几十余种RNA修饰调节因子进行分析，并通过多中心前列腺癌RNA测序与临床预后数据构建并验证了一个全新的预测模型，即RMR Score，能够用于对前列腺癌进行辅助诊断以及预后评估。本发明发现在多中心的原发性前列腺癌集合中，RMR Score高得分组患者生化复发时间显著提前，在晚期的前列腺癌患者中，RMR Score高得分组患者在雄激素受体信号抑制剂(AR SI)和多西他赛治疗中获益明显更少。通过功能富集分析发现，RMR Score主要富集在不同的代谢通路，这提示了RNA修饰很可能在前列腺癌的不同阶段均发挥着重要作用。多组学分析中发现，无论是在arm-level还是gene-level的CNV中，RMR Score高得分组与低得分组均存在着显著差异，且CNV突变组的RMR Score得分明显更高，证明了RNA修饰调节因子不仅作用于RNA层面，同时也能够在DNA层面影响着前列腺癌。通过一系列体外实验进行验证发现，本发明所筛选得到的4种RNA修饰调节因子与前列腺癌的发生发展存在高度关联性，当RPUSD3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5高表达时，能够明显促进前列腺癌细胞的侵袭和增殖，而当抑制这些调节因子的表达水平时，则能够显著抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭。
本发明相对于现有技术具有如下技术效果：
(1)本发明对RNA修饰在前列腺癌的发病、发展中的机制和作用进行了深入研究，发现RNA修饰调剂因子的整体状况水平对于前列腺癌的诊断和预后具有关键意义，并对8种RNA修饰中几十余种RNA修饰调节因子进行分析，以构建了一种新的可量化预测模型，即RMRScore。通过筛选获得特定的RNA修饰调节因子按照公式计算获得RMR Score，从而能够通过对受试者体内特定标志物表达水平的分析，更加准确地对前列腺癌患者尤其是行根治性治疗后的原发性前列腺癌患者的预后及生存率状态进行合理预测和评估。
(2)本发明揭示了RMR Score与前列腺癌进展之间的关联性，能够快速、稳定、精准地对患者罹患前列腺癌的风险以及前列腺癌患者预后进行合理评估，以便于精准识别出需要积极干预的高风险患者，避免因判断错误而导致的治疗不足或过度治疗；同时本发明所提供的RMR Score需要检测的基因数量显著少，临床检测程序简单，可有效避免医疗资源的浪费。本发明的RMR Score对于填补实现前列腺癌精准诊断和预后评估空白，更好地实现前列腺癌患者的个体化精准治疗具有重要的现实意义，具有极高的社会价值和市场应用前景。
附图说明
图1为利用RMR Score在TCGA-PRAD训练集中通过Kaplan-Meie r生存分析结果示意图。
图2为利用RMR Score在TCGA-PRAD训练集中进行单因素和多因素回归分析结果示意图。
图3为利用RMR Score在CPC和Stockholm数据集中通过Kapla n-Meier生存分析结果示意图。
图4为利用RMR Score在CPC和Stockholm数据集中进行单因素和多因素回归分析结果示意图。
图5为利用KEGG中的代谢通路进行GSVA分析结果示意图。
图6为RMR Score高得分组和RMR Score低得分组中富集得到的前两位的代谢通路。
图7为对RMR Score在前列腺癌中突变组学分析结果示意图。
图8为RMR Score对接受ARSI治疗的前列腺癌患者影响结果示意图。
图9为RMR Score对接受多西他赛治疗的前列腺癌患者影响结果示意图。
图10为通过对RMR Score进行CMap分析以筛选用于前列腺癌治疗的潜在药物靶点结果示意图。
图11为前列腺癌组织芯片免疫组化结果示意图。
图12为利用WB检测三种siRNA对RPUSD3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5表达水平影响结果示意图。
图13为利用siRNA抑制RPUSD3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5表达后对于前列腺癌细胞增殖影响结果示意图。
图14为利用siRNA抑制RPUSD3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5表达后对于前列腺癌细胞克隆形成影响结果示意图。
图15为利用siRNA抑制RPUSD3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5表达后对于前列腺癌细胞侵袭影响结果示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在无特别说明的情况下，本发明上下文中所使用的试剂中，均通过市售获得。对于临床标本的使用，均与患者签署了知情同意书，相关程序及方法符合医学伦理学要求以及药物临床试验质量管理规范。本发明所使用的实验方法，例如模型构建、生物信息学分析、免疫组化、细胞生物学实验、分子生物学实验等均为本领域的常规方法和技术。
生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean±SD和mean±SEM展示。所有实验至少重复三次。数据采用GraphPad Prism9.0或R软件(版本4.0.1)软件进行分析。采用t检验、卡方检验、方差分析等常规医学统计学方法比较两组或两组以上的平均值差异。p＜0.05被认为是一个显著的差异。
实施例1
以TCGA-PRAD作为训练集，利用PCaDB网站中“Transcriptome Analysis-Prognostic Medel”模块的“CoxRidge”方法对包括ac4d、AI、APA、m1A、m5C、m6A、m7G、pseudouridine在内的8种RNA修饰中的RNA修饰调节因子进行筛选，得到了81个RNA修饰调节因子；对该81个RNA修饰调节因子于TCGA-PRAD中进行单因素COX回归分析，并根据HR的高到低排序，获得了4个相关RNA修饰调节因子，分别为RPUSD3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5，按照如下公式进行RMR Score的计算：
其中N代表RNA修饰调节因子的数量，Coefi代表RNA修饰调节因子在“CoxRidge”中的系数，Expression level of RNAi代表RNA修饰调节因子的表达水平，根据RMR Score的cutoff值分为高得分组和低得分组。其中cutoff值为2.96063630563198，RPUSD3的Coe fi值为0.53152799，WBSCR22的Coefi值为0.034413142,TRMT61A的Coefi值为-0.005955568,NSUN5的Coefi值为-0.042361922。
利用上述构建得到的RMR Score模型，在TCGA-PRAD训练集中通过Kaplan-Meier生存分析发现，RMR Score高得分患者生化复发时间明显更快，三个不同时间点的AUC均大于0.7，提示RMR Score对于前列腺癌患者生化复发有着稳定的预测性能(参见图1)。通过单因素和多因素回归分析发现，RMR Score可作为独立的预后评估因子(参见图2)。
进一步地的外部验证发现，CPC、Stockholm数据集中的Kaplan-Meier生产分析也均提示RMR Score高得分患者有着更快的生化复发速率(参见图3-4)，提示RMR Score在CPC和Stockholm数据集中可作为独立的预后评估因子。上述结果共同证实了无论是在训练集还是在验证集中RMR Score的高得分均预示着前列腺癌患者的不良预后。
为了探究RMR Score在前列腺癌中的作用通路，从MSigDB数据库获取h.all.v7.4.symbols.gmt基因集，使用Spearman相关性分析评估上述RNA修饰因子与所有mRNA之间的相关性；将所有mRNA按照相关系数排序，并进一步使用clusterProfiler包进行GSEA分析，false discovery rate(FDR)＜0.05的基因集被认为是显著富集。结果显示，RMRScore富集到的前五位激活通路分别为ribosome、oxidative_phosphorylation、parlomspms_disease、dna_replication、systemic_lupus_erythematosus；前五位抑制通路分别为valin e leucine_and isoleucine_degradation、propanoate metabolism、adherens junction、citrate cycle tca cycle、lysosome。由此可见，RMR Score在前列腺癌中主要富集于一些代谢通路，为了更好地识别RMR Score与代谢之间的关系，利用KEGG中的代谢通路进行了GSVA分析发现，结果显示大部分的代谢通路在RMR Score高得分与低得分组中存在着显著差异(p＜0.05)(参见图5)，且在RMR Scor e高得分组中富集到的前两位代谢通路分别为oxidative_phosphory lation和steroid hormone biosynthesis，在RMRScore低得分组中富集到的前两位代谢通路分别为propanoate metabolism和valin eleucine_and isoleucine_degradation(参见图6)。由上述结果可知，RNA修饰调节因子可能是通过代谢通路来影响前列腺癌进展。
实施例2
前述实验中证实了RMR Score在前列腺癌中有着可靠的临床应用价值，同时对RMRScore中相关RNA修饰调节因子的作用机制进行了初步探索。除了与肿瘤RNA的相互作用外，为了明确该RNA修饰调节因子是否同样与DNA存在作用关系，通过突变组学进行了深入分析。结果如图7所示，结果显示，在somatic mutation中，P53和LRP1B在RMR Score高得分组中突变频率更高；同样地，TP53和FOXA1突变组中RMR Score更高。而在排名前十的拷贝数变异增加(Gain of CNV)和拷贝数变异减少(Loss of CNV)(arm-level和gene-level)中，RMRScore高得分组与RMR Score低得分组均有着显著的差异(p＜0.05)。除此以外，对于排名前十的CNV是否存在突变的分组中，突变组的RMR Score得分明显更高(p＜0.05)。上述结果表明，在前列腺癌中RNA修饰调节因子可能和CNV存在着密切的相互作用。
对于晚期前列腺癌患者，药物治疗往往是主要的干预手段，因此有必要研究RMRScore与前列腺癌药物治疗反应之间的关系。通过在SU2C cohort中发现，对于接受ARSI治疗的前列腺癌患者，无论是以OS还是以PFS作为观察终点，RMR Score高得分组患者相对于RM R Score低得分组患者的预后明显更差(p＜0.05)(参见图8)；而对于接受了多西他赛化疗药物治疗的晚期前列腺癌患者，RMR Score高得分组患者相对于RMR Score低得分组患者的治疗效果明显更差(p＜0.05)(参见图9)。上述结果证实了RMR Score可用于晚期前列腺癌危险分层以及治疗反应预测作用，对此，可使用RMR Score进行前列腺癌潜在治疗药物和靶点的筛选，通过CMap分析发现，retinyl、III606050、levonorgestrel等可作为针对RMRScore高得分前列腺癌患者的潜在治疗药物(参见图10)。
实施例3
为了进一步验证RMR Score及相关RNA修饰调节因子在前列腺癌中的作用，使用前列腺癌组织芯片进行免疫组化分析发现，RPUSD3主要定位于细胞核，WBSCR22、TRMT61A、NSUN5则在细胞核和细胞浆中均有表达(参见图11)。随后，使用22Rv1细胞系验证4种RNA修饰调节因子对前列腺癌表型的影响。首先基于RPUSD3、WBSCR22、TR MT61A、NSUN5的序列分别设计了3种siRNA，分别为si-1～si-12，其序列分别如下：si-1：GCCCUGUUACCUGCUGGAUTT；si-2：CGAGCAUU GGAGCUUCUUUAUTT；si-3：CAGUGCCAAAGCAAAGAAAUUTT；si-4：GUCGCCUCCAGAAGUACUUCATT；si-5：CUUCAGGUUGUCCGAGCAUCUTT；si-6：CC UGAAACUGGAACACAUUTT；si-7：GGCAUACGAGGAGCUGAUCAATT；si-8：GCGGCACUCAGUUGACCUUAUTT；si-9：GCAGAUCCUCUACUCCACAGATT；si-10：GACCUGCUCCGAUGAUGUAGUTT；si-11：CCGAUGAUGUAGUUGAUUATT；si-12：AUGAAGACGUGGUGCGAGATT。其中si-1、si-2和si-3为针对WBSCR22的siRNA，si-4、si-5和si-6为针对RPUSD3的siRNA，si-7、si-8和si-9为针对TRMT61A的siRNA，si-10、si-11和si-12为针对NSUN5的siRNA。将si-1～si-12分别转染至22Rv1细胞中，并对其中RPUSD3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5各自表达情况进行检测，结果如图12所示。结果显示，si-1～si-12均能够对RPUSD3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5的表达产生不同程度的抑制作用。随后针对4种RN A修饰调节因子分别选择抑制效果最高的两种siRNA验证其对22Rv1细胞增殖、克隆形成以及侵袭能力的影响。
其中细胞增殖实验步骤具体如下：
(1)将siRNA分别转染至22Rv1细胞中(其中针对WBSCR22选择si-2和si-3，针对RPUSD3选择si-4和si-5，针对TRMT61A选择si-7和si-9，针对NSUN5选择si-10和si-11)。
(2)待细胞生长至对数期时，胰酶消化并计数，5000个细胞/孔接种到96孔板中(3个重复)。
(3)于37℃培养箱中进行培养，并分别于0h、24h、48h、72h、96h时检测细胞活性。每孔按10μL：90μL比例加入CCK-8试剂及完全培养基，随后将培养板置于培养箱内孵育4h，测定450nm吸光度，评估细胞的增殖状况。
细胞克隆形成实验步骤具体如下：
(1)将siRNA分别转染至22Rv1细胞中(其中针对WBSCR22选择si-2和si-3，针对RPUSD3选择si-4和si-5，针对TRMT61A选择si-7和si-9，针对NSUN5选择si-10和si-11)。
(2)待细胞生长至对数期时，胰酶消化并计数，按1000个细胞/孔接种到含2mL 37℃预温培养液的六孔板中，“十字法”轻揉晃动培养板动，使细胞分散均匀，随后置于细胞培养箱中培养10天。
(3)培养板培养细胞10天时，终止培养，弃去培养基，用PBS小心浸洗2次，每孔加入含0.1％结晶紫的甲醇溶液1mL，染色30min；弃甲醇，用PBS清洗残留的甲醇，即可观察到细胞克隆。
细胞侵袭实验步骤具体如下：
(1)将ECM Gel原液提前1h放在4℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中；将1.5mL EP管、枪头和细胞小室，置于冰上预冷。
(2)按照ECM Gel：无血清培养基＝1：7.5的比例在冰上稀释成使用液。将枪头剪去一小段(约3μm)后在冰上吸取40μL/孔ECM Ge l使用液轻轻加入小室的上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部；随后置于37℃培养箱15min，待胶凝固。
(3)待转染有siRNA的22Rv1细胞(其中针对WBSCR22选择si-2和si-3，针对RPUSD3选择si-4和si-5，针对TRMT61A选择si-7和si-9，针对NSUN5选择si-10和si-11)生长至对数期时，胰酶消化并计数，按40000个细胞/200μL/孔的密度用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液。
(4)按照每孔200μL，将细胞悬液加入上室，同时在下室加入含10％ FBS的培养基500μL，放入37℃培养箱培养。
(5)24小时后取出，吸去上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。
(6)在上室中加入0.1％结晶紫染液，染色5min，回收染液，用PBS缓缓冲去染液，再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。
(7)在正置显微镜上放置一块载玻片，将细胞小室倒置于载玻片上，在100倍视野下进行拍照，对膜的上下左右及中间计数。
实验结果如图13-15所示。结果显示，在利用siRNA对RPUSD3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5基因进行沉默后，可显著抑制前列腺癌细胞生长，差异具有统计学意义。相较于空白载体si-NC组，在利用siRNA对RPUSD3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5基因进行沉默后，可显著抑制前列腺癌细胞克隆形成，差异具有统计学意义。细胞侵袭实验结果显示，相较于空白载体si-NC组，在利用siRNA抑制细胞内RPU SD3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5的表达水平后，均能够显著抑制前列腺癌细胞的侵袭能力，该差异具有统计学意义。上述结果共同证实了本发明的RMR Score以及相关RNA修饰调节因子与前列腺癌存在密切关联性，通过抑制上述各RNA修饰调节因子的表达水平，能够显著抑制前列腺癌的增殖和侵袭能力，避免前列腺癌的进一步进展。
本发明通过基于对8种RNA修饰中几十余种RNA修饰调节因子进行分析，以构建了一种新的预测模型，即RMR Score。通过筛选获得特定的RNA修饰调节因子按照公式计算获得RMR Score，能够用于对前列腺癌进行辅助诊断以及预后评估。本发明发现在多中心的原发性前列腺癌集合中，RMR Score高得分组患者生化复发时间显著提前，在晚期的前列腺癌患者中，RMR Score高得分组患者在ARSI和多西他赛治疗中获益明显更少。通过功能富集分析发现，RMR Score主要富集在不同的代谢通路，这提示了RNA修饰很可能在前列腺癌的不同阶段均发挥着重要作用。多组学分析中发现，无论是在arm-level还是gene-level的CNV中，RMR Score高得分组与低得分组均存在着显著差异，且CNV突变组的RMR Score得分明显更高，证明了RNA修饰调节因子不仅作用于RNA层面，同时也能够在DNA层面影响着前列腺癌。通过一系列体外实验进行验证发现，本发明所筛选得到的4种RNA修饰调节因子与前列腺癌的发生发展存在高度关联性，当RPUSD 3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5高表达时，能够明显促进前列腺癌细胞的侵袭和增殖，而当抑制这些调节因子的表达水平时，则能够显著抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭。本发明对于前列腺癌提前诊断、解决个体间临床疗效差异与退缩效果/预后评估空白的难题，更好地实现精准治疗具有重要的现实意义。为人类攻克前列腺癌提供了一个新的思路，从而为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向，具有极高的社会价值和市场应用前景。
以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于RNA修饰的用于前列腺癌辅助诊断和/或预后评估的RMR Score模型，其特征在于，所述RMR Score按照如下公式进行计算：
其中N代表RNA修饰调节因子的数量，Coefi代表RNA修饰调节因子在“CoxRidge”中的系数，Expression level of RNAi代表RNA修饰调节因子的表达水平。
2.根据权利要求1所述的基于RNA修饰的用于前列腺癌辅助诊断和/或预后评估的RMRScore模型，其特征在于，所述RNA修饰调节因子选自RPUSD3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5中的一种或多种。
3.检测生物标志物表达水平的试剂在制备用于对前列腺癌进行辅助诊断和/或预后评估的产品中的应用，其特征在于，所述标志物由RPUSD3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5组成。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测标志物表达水平的试剂包括用于检测标志物基因表达水平的引物对和/或检测标志物基因编码的蛋白含量的试剂。
5.抑制RNA修饰调节因子表达水平的抑制剂在制备治疗前列腺癌的药物中的应用，其特征在于，所述RNA修饰调节因子选自RPUSD 3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抑制剂选自基于RNA修饰调节因子设计的siRNA。
7.一种用于前列腺癌辅助诊断和/或预后评估的系统，其特征在于，包括：
输入单元，用于输入待评估患者的数据；
分析单元，用于对待评估患者的样本中的标志物表达水平进行检测，所述标志物由RPUSD3、WBSCR22、TRMT61A、NSUN5组成；
评估单元，用于对分析单元分析得到的数据按照如下公式进行计算，以获得患者的RMRScore值，并根据RMR Score值将患者分为RMR Score高得分组或RMR Score低得分组，最后对患者罹患前列腺癌的风险和/或预后作出评估：
其中N代表RNA修饰调节因子的数量，Coefi代表RNA修饰调节因子在“CoxRidge”中的系数，Expression level of RNAi代表RNA修饰调节因子的表达水平。
8.根据权利要求7所述的系统，其特征在于，输入单元中所述数据包括但不限于患者的血液样本数据、肿瘤组织样本数据、癌旁组织样本数据中的一种或多种。
9.根据权利要求7所述的系统，其特征在于，所述评估单元中按照如下标准对患者罹患前列腺癌的风险和/或预后进行评估：
(a)RMR Score高得分组罹患前列腺癌的风险高于RMR Score低得分组；RMR Score得分越高，罹患前列腺癌的风险相对越高，RM R Score得分越低，罹患前列腺癌的风险相对越低；
(b)RMR Score高得分组总体生存率低于RMR Score低得分组；RMR Score得分越高，总体生存率相对越低，RMR Score得分越低，总体生存率相对越高；
(c)RMR Score高得分组前列腺癌生化复发率高于RMR Score低得分组；RMR Score得分越高，前列腺癌生化复发率相对越高，RM R Score得分越低，前列腺癌生化复发率相对越低；
以及(d)RMR Score高得分组远处转移率高于RMR Score低得分组；RMR Score得分越高，远处转移率相对越高，RMR Score得分越低，远处转移率相对越低。
10.一种计算机可读的存储介质，其特征在于，其中存储有处理器可执行的指令，所述处理器可执行的指令在处理器执行时执行根据权利要求7-9任一项所述的用于前列腺癌辅助诊断和/或预后评估的系统。
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| CN117925845A (zh) * | 2024-03-22 | 2024-04-26 | 广东辉锦创兴生物医学科技有限公司 | 前列腺癌诊断或鉴别的甲基化分子标志物、试剂盒及其应用 |
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2023
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| CN117925845B (zh) * | 2024-03-22 | 2024-06-11 | 广东辉锦创兴生物医学科技有限公司 | 前列腺癌诊断或鉴别的甲基化分子标志物、试剂盒及其应用 |
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