JP2002533056A

JP2002533056A - 肺癌の治療および診断のための化合物および方法

Info

Publication number: JP2002533056A
Application number: JP2000536857A
Authority: JP
Inventors: スティーブンジー．リード，; トントンワン，
Original assignee: コリクサコーポレイション
Priority date: 1998-03-18
Filing date: 1999-03-17
Publication date: 2002-10-08
Also published as: BR9908823A; DE69933998D1; DE69933998T2; CN1299414A; EP1064372A2; NO20004631L; ATE345387T1; CA2323093A1; WO1999047674A2; EP1064372B1; NO20004631D0; ES2277432T3; IL138330A0; NZ506699A; AU3094999A; WO1999047674A3

Abstract

(57)【要約】肺癌の処置ならびに診断のための化合物および方法が提供される。本発明の化合物は、肺腫瘍タンパク質の少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドを調製するためのＤＮＡ分子と共に、そのようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む肺癌の免疫治療のためのワクチンおよび薬学的組成物もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、一般に、肺ガンの処置および診断のための組成物および方法に関す
る。本発明は、より具体的には、このようなヌクレオチド配列によりコードされ
るポリペプチドとともに、肺腫瘍組織中に優先的に発現されるヌクレオチド配列
に関する。本発明のヌクレオチド配列およびポリペプチドは、肺ガンの処置およ
び診断のためのワクチンおよび薬学的組成物において使用され得る。

【０００２】（発明の背景）肺ガンは、米国における男性および女性の両方におけるガンでの死亡の主な原
因であり、１９９４年には１７２，０００件の新しい症例が報告されたと見積も
られた。全ての肺ガン患者における５年生存率は、診断時における疾患の病期に
拘らず、１３％のみである。これは、この疾患がなお局在される場合に検出され
る症例における４６％の５年生存率と対照的である。しかし、肺ガンが拡散する
前には、その疾患の１６％が発見されるのみである。

【０００３】早期発見は難しい。なぜなら、臨床症状は、しばしば、この疾患が進行した病
期に達するまでみられないからである。現在のところ、診断は、胸部Ｘ線、痰に
含まれる細胞型の分析および気管支道の光ファイバー検査の使用により補助され
る。処置の養生法は、ガンの型および病期により決定され、そしてこれは、手術
、放射線治療および／または化学療法を含む。この疾患の治療への多くの研究に
も拘らず、肺ガンは、処置が困難なままである。

【０００４】従って、当該分野において、肺ガンに対する、改良されたワクチン、処置方法
および診断技術の必要性が依然として残っている。

【０００５】（発明の要旨）手短に述べると、本発明は、肺ガンの処置のための化合物および方法を提供す
る。第１の局面において、肺腫瘍ポリペプチド分子をコードする単離されたポリ
ヌクレオチドが提供され、このようなポリヌクレオチド分子は、以下からなる群
から選択されるヌクレオチド配列を含む：（ａ）配列番号１〜３、６〜８、１０
〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２、３４〜４９、５１、５２、５４、５５
、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３、７４、７７、７８、８０〜８２、８４
、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１、１１３、１２５、１２７、１２８、１
２９、１３１〜１３３、１４２、１４４、１４８〜１５１、１５３、１５４、１
５７、１５８、１６０、１６７、１６８および１７１において提供される配列；
において提供される配列；（ｂ）配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜
２７、２９、３０、３２、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、
６１〜６９、７１、７３、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、
１０７〜１０９、１１１、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜
１３３、１４２、１４４、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、
１６０、１６７、１６８および１７１において提供される配列に相補的な配列；
ならびに（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列に中程度のストリンジェント条件下で
ハイブリダイゼーションする配列。

【０００６】第２の局面において、肺腫瘍タンパク質またはその改変体の少なくとも免疫原
性部分を含む、単離されたポリペプチドが提供される。特定の実施態様において
、このようなポリペプチドは、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド分子によりコードされるアミノ酸配列を含む：（ａ）配
列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２、３４〜４
９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３、７４、７
７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１、１１３、
１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４、１４８〜
１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６７、１６８および１７
１において記載される配列；（ｂ）配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５
〜２７、２９、３０、３２、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９
、６１〜６９、７１、７３、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６
、１０７〜１０９、１１１、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１
〜１３３、１４２、１４４、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８
、１６０、１６７、１６８および１７１において提供される配列に相補的な配列
；ならびに（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列に中程度のストリンジェントな条件
下でハイブリダイゼーションする配列。

【０００７】関連する局面において、本発明のポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターが
、このような発現ベクターを用いて形質転換されたかまたはトランスフェクトさ
れた宿主細胞とともに提供される。好ましい実施態様において、この宿主細胞は
、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母および哺乳動物細胞からなる群から選択される。

【０００８】別の局面において、第１および第２の本発明のポリペプチド、あるいは本発明
のポリペプチドおよび公知の肺腫瘍抗原を含む融合タンパク質が提供される。

【０００９】本発明はさらに、上記のポリペプチド、融合タンパク質または融合ポリヌクレ
オチド分子の１つ以上、および生理的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物
を、免疫応答エンハンサーと組み合せてこのようなポリペプチド、融合タンパク
質または融合ポリヌクレオチド分子の１つ以上を含むワクチンとともに提供する
。

【００１０】関連する局面において、本発明は、患者における肺ガンの発達を阻害するため
の方法を提供し、この方法は、有効量の少なくとも１つの上記の薬学的組成物お
よび／またはワクチンを、患者に投与する工程を含む。

【００１１】さらに、本発明は、肺ガンの免疫診断のための方法を、そのような方法におい
て使用するためのキットとともに提供する。肺腫瘍タンパク質あるいは保存的置
換および／または改変においてのみ異なるそのタンパク質の改変体の少なくとも
免疫学的部分を含むポリペプチドが開示される。ここで、この肺腫瘍タンパク質
は、以下に示すヌクレオチド配列からなる群より選択される配列を有するポリヌ
クレオチド分子によってコードされるアミノ酸配列を含む：配列番号１〜１０９
、１１１、１１３、１１５〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０
、１６２〜１６４、１６７、１６８および１７１、ならびにその改変体。そのよ
うなポリペプチドは、肺ガンの診断およびモニタリングにおいて有用に使用され
得る。

【００１２】本発明の１つの特定の局面において、患者における肺ガンを検出するための方
法が提供され、この方法は、以下の工程を含む：（ａ）上記のポリペプチドの１
つに結合し得る結合薬剤と、患者から得られた生物学的サンプルを接触させる工
程；および（ｂ）そのサンプル中の、その結合薬剤に結合するタンパク質または
ポリペプチドを検出する工程。好ましい実施態様において、この結合薬剤は、抗
体であり、最も好ましくはモノクローナル抗体である。

【００１３】関連する局面において、患者における肺ガンの進行をモニターするための方法
が提供され、この方法は、以下の工程を含む；（ａ）上記のポリペプチドの１つ
に結合し得る結合薬剤と、患者から得られた生物学的サンプルを接触させる工程
；（ｂ）そのサンプル中の、その結合薬剤に結合するタンパク質またはポリペプ
チドの量を決定する工程；（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程；なら
びに工程（ｂ）および（ｃ）において検出されるポリペプチドの量を比較する工
程。

【００１４】関連する局面内において、本発明は、本発明のポリペプチドに結合する、抗体
、好ましくはモノクローナル抗体、およびこのような抗体を含む診断キット、な
らびに肺ガンの進展を阻害するためにこのような抗体を使用する方法を提供する
。

【００１５】本発明はさらに、以下の工程を含む、肺ガンを検出するための方法を提供する
：（ａ）患者から生物学的サンプルを得る工程：（ｂ）そのサンプルを、ポリメ
ラーゼ連鎖反応における第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマー（これ
らのオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つは、上記のポリペプチドの
１つをコードするポリヌクレオチド分子に特異的である）と接触させる工程；な
らびに（ｃ）第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で増幅す
るポリヌクレオチド配列をそのサンプル中で検出する工程。好ましい実施態様に
おいて、これらのオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つは、配列番号
１〜１０９、１１１、１１３、１１５〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５
８、１６０、１６２〜１６４、１６７、１６８および１７１からなる群から選択
される配列を含むポリヌクレオチド分子の少なくとも約１０個の連続するヌクレ
オチドを含む。

【００１６】さらなる局面において、本発明は、以下の工程を含む、患者における肺ガンを
検出するための方法を提供する：ａ）患者から生物学的サンプルを得る工程：（
ｂ）そのサンプルを、上記のポリペプチドの１つをコードするポリヌクレオチド
分子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程；ならびに（ｃ）
そのサンプル中の、オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズするポリヌク
レオチド配列を検出する工程。好ましくは、このオリゴヌクレオチドプローブは
、配列番号１〜１０９、１１１、１１３、１１５〜１５１、１５３、１５４、１
５７、１５８、１６０、１６２〜１６４、１６７、１６８および１７１からなる
群から選択される部分配列を有するポリヌクレオチド分子の少なくとも約１５個
の連続するヌクレオチドを含む。

【００１７】関連する局面において、上記のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー
を含む診断キットが提供される。

【００１８】なおさらなる局面において、患者における肺ガンの処置のための方法が提供さ
れ、この方法は、その患者からＰＢＭＣを得る工程、そのＰＢＭＣを本発明のポ
リペプチド（もしくはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）
とインキュベートして、インキュベートされたＴ細胞を提供する工程、およびこ
のインキュベートされたＴ細胞をその患者に投与する工程、を含む。本発明はさ
らに、抗原提示細胞を本発明のポリペプチド（もしくはこのようなポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド）とインキュベートして、インキュベートされた
抗原提示細胞を提供する工程、およびこのインキュベートされた抗原提示細胞を
その患者に投与する工程、を包含する、肺ガンの処置のための方法を提供する。
特定の実施態様において、この抗原提示細胞は、樹状細胞およびマクロファージ
からなる群から選択される。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドとイ
ンキュベートされたＴ細胞または抗原提示細胞を含む肺ガンの処置のための組成
物もまた提供される。本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な記載を参
考にすることで明らかである。本明細書中に開示された全ての参考文献は、各々
が個別に援用されるかのように、その全体において参考として援用される。

【００１９】（発明の詳細な説明）上記のように、本発明は、概して、肺ガンの治療および診断のための組成物お
よび方法に関する。本明細書において記載される組成物は、ポリペプチド、融合
タンパク質およびポリヌクレオチドの分子を含む。本発明にはまた、本発明のポ
リペプチドに対して結合する分子（例えば、その抗体またはフラグメント）も含
まれる。このような分子を、本明細書において「結合薬剤」と称する。

【００２０】１つの局面において、本発明は、ヒト肺腫瘍タンパク質の免疫原性部分を含む
ポリペプチドを開示する。ここで、この肺腫瘍タンパク質は、以下からなる郡よ
り選択される配列を含むポリヌクレオチド分子によってコードされるアミノ酸配
列を含む：（ａ）配列番号１〜１０９、１１１、１１３、１１５〜１５１、１５
３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６２〜１６４、１６７、１６８および
１７１に示されるヌクレオチド配列、（ｂ）このヌクレオチド配列の相補体、な
らびに（ｃ）このような配列の改変体。本明細書において使用される用語「ポリ
ペプチド」は、完全長タンパク質を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
ここでこのアミノ酸残基は、ペプチド共有結合により連結される。従って、上記
の肺腫瘍タンパク質のうちの１つの一部を含むポリペプチドは、全くこの部分か
らなり得るか、またはこの部分は、さらなる配列を含むより大きなポリペプチド
内に存在し得る。このさらなる配列は、ネイティブのタンパク質に由来し得るか
、または異種であり得、そしてこのような配列は（そうである必要はないが）、
免疫反応性および／または抗原性であり得る。以下に詳しく述べたように、この
ようなポリペプチドは、肺腫瘍組織から単離され得るか、または合成的手段また
は組み換え手段により調製され得る。

【００２１】本明細書において用いる場合、肺腫瘍タンパク質の「免疫原性部分」は、肺ガ
ンに罹患した患者において免疫応答を誘発し得、そしてそれ自体、肺ガン患者由
来の血清中に存在する抗体と結合する一部分である。このような免疫原性の部分
は、一般的に、少なくとも約５アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも約１０
アミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも約２０のアミノ酸残基を含む。
本明細書において記載されるタンパク質の免疫原性の部分は、抗体結合アッセイ
において同定され得る。このようなアッセイは、一般に、当業者に公知の任意の
種々の手段を用いて（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，
ＮＹ，１９８８に記載されているように）実施され得る。例えば、ポリペプチド
は、固体支持体上で（以下に記載のように）固定され得、そして患者の血清と接
触されて、固定されたポリペプチドに対する血清中の抗体の結合が可能にされ得
る。次いで、結合しない血清は、取り除かれ、そして結合抗体は、例えば、¹²⁵
Ｉ標識プロテインＡを用いて検出され得る。あるいは、ポリペプチドは、肺ガン
患者の血液または他の液体中のポリペプチドの検出において用いるためのモノク
ローナル抗体およびポリクローナル抗体を産生するために用いられ得る。公知の
配列の抗原の免疫原性の部分を調製および同定するための方法は、当該分野にお
いて周知であり、そしてＰａｕｌ、ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ、第３版、ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ、１９９３、２４３〜２４７頁に要約さ
れた方法を含む。

【００２２】本明細書において用いる場合、用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌ
クレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意
味し、そしてＤＮＡ分子および対応するＲＮＡ分子を含む。これは、ＨｎＲＮＡ
分子およびｍＲＮＡ分子、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含み、そして
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび組換えＤＮＡ、ならびに全合成ポリヌクレオチド
または部分合成ポリヌクレオチドを含む。ＨｎＲＮＡ分子は、イントロンを含み
、そして一般に１対１の様式でＤＮＡ分子に対応する。ｍＲＮＡ分子は、イント
ロンが切除されたＨｎＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子に対応する。ポリヌクレオチ
ドは、遺伝子全体またはその任意の部分からなり得る。作動可能なアンチセンス
ポリヌクレオチドは、対応するポリヌクレオチドのフラグメントを含み得、従っ
て、「ポリヌクレオチド」の定義には、このような作動可能なアンチセンスフラ
グメントのすべてを含む。

【００２３】本発明の組成物および方法はまた、上記のポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドの改変体を包含する。本明細書において用いる、ポリペプチドの「改変体」は
、このポリペプチドの治療的、抗原性および／または免疫原性の特性が保持され
るような保存的な置換および／または改変でのみ、示されたポリペプチドと異な
るポリペプチドである。好ましい実施態様において、改変ポリペプチドは、同定
された配列と、５アミノ酸以下の置換、欠失または付加だけ異なる。このような
改変体は、一般に、上記のポリペプチド配列の１つの改変により、および例えば
、本明細書において記載される代表的な手順を用いて、改変されたポリペプチド
の抗原性特性を評価することにより同定され得る。ポリペプチド改変体は、好ま
しくは、同定されたポリペプチドに対して、少なくとも約７０％、より好ましく
は少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性（以
下で記載されたように決定された）を示す。

【００２４】本明細書において用いる場合、「保存的置換」は、アミノ酸が類似の特性を有
する別のアミノ酸へと置換されるものであり、この結果、ペプチド化学の当業者
は、そのポリペプチドの二次構造および疎水性親水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈ
ｉｃ）の特徴が実質的に変化しないことを予想する。一般に、アミノ酸の以下の
群は保存的変換を表す：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌ
ｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）
ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈ
ｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。

【００２５】改変体はまた（または、代わりに）、他の改変を含み得、これは、ポリペプチ
ドの抗原性特性、二次構造および疎水性親水性指標に最小限の影響を有するアミ
ノ酸の欠失または付加を含む。例えば、ポリペプチドは、タンパク質の転移を翻
訳と同時にまたは翻訳後に指向するそのタンパク質のＮ末端のシグナル（または
リーダー）配列に結合され得る。このポリペプチドはまた、ポリペプチド（例え
ば、ポリ−Ｈｉｓ）の合成、精製または同定を容易にするために、または固体支
持体へのポリペプチドの結合を増強するために、リンカーまたは他の配列に結合
され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合され得る。

【００２６】ヌクレオチド「改変体」は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または付加
を有するという点で挙げられたヌクレオチド配列と異なる配列である。このよう
な改変は、標準的な変異誘発技術（例えば、Ａｄｅｌｍａｎら（ＤＮＡ、２：１
８３、１９８３）に教示されるような、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的変
異誘発を用いて容易に導入され得る。ヌクレオチド改変体は、天然に存在する対
立遺伝子改変体、または天然に存在しない改変体であり得る。改変体のヌクレオ
チド配列は、好ましくは、挙げられた配列に対して、少なくとも約７０％、より
好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の同
一性（以下で記載されたように決定された）を示す。

【００２７】本発明によって提供される抗原は、本明細書において具体的に挙げられた１つ
以上のポリヌクレオチド配列に対して実質的に相同であるポリヌクレオチド配列
によってコードされる改変体を含む。本明細書において用いる場合、「実質的な
相同性」は、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌ
クレオチド配列をいう。適切である、中程度にストリンジェントな条件としては
、以下が挙げられる：５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８．０）の溶液中での予備洗浄；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣ（または、種交
叉相同性の場合は、４５℃で０．５×ＳＳＣ）での、一晩のハイブリダイゼーシ
ョン；続いて各々０．１％ＳＤＳ含有の２×、０．５×および０．２×ＳＳＣの
それぞれを用いた２０分間、６５℃での２回の洗浄。このようなハイブリダイズ
するポリヌクレオチド配列はまた、本発明の範囲内である。なぜなら、ヌクレオ
チド配列はコードの縮重に起因して、ハイブリダイズするポリヌクレオチド配列
によりコードされる免疫原性ポリペプチドをコードするからである。

【００２８】２つのヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、その２つの配列における
ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の配列が、以下に記載のように最大一致につい
て整列されたときに同じである場合に、「同一」であるといわれる。２つの配列
の間の比較は、代表的には、比較ウインドウにわたって配列を比較して配列類似
性の局所領域を同定および比較することにより実行され得る。本明細書において
用いる場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０の連続位置、通常３０〜
約７５、４０〜約５０のセグメントをいい、ここで配列は、２つの配列が最適に
整列された後、同じ数の連続位置の参照配列と比較され得る。

【００２９】比較のための配列の最適整列は、デフォルトパラメーターを用いて、バイオイ
ンフォーマティクス（生物情報科学）のソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ
．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＬａｓｅｒｇｅｎｅｓｕｉｔｅにおけるＭｅｇ
ａｌｉｇｎプログラムを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献
において記載されたいくつかの整列スキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ．
Ｏ．（１９７８）（Ａｍｏｄｅｌｏｆｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｃｈａ
ｎｇｅｉｎｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉ
ｎｇｄｉｓｔａｎｔｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ）、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ．
Ｏ．（編）ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ、ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃ
ｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤＣ、第５巻、補遺３、３
４５〜３５８頁；ＨｅｉｎＪ．（１９９０）ＵｎｉｆｉｅｄＡｐｐｒｏａｃ
ｈｔｏＡｌｉｇｎｍｅｎｔａｎｄＰｈｙｌｏｇｅｎｅｓ６２６〜６４
５頁ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８３巻、Ａｃａｄｅｍ
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．Ｇ．およびＳｈａｒｐ、Ｐ．Ｍ．（１９８９）Ｆａｓｔａｎｄｓｅｎｓｉ
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：１０５；Ｓａｎｔｏｕ、Ｎ．Ｎｅｓ、Ｍ．（１９８７）Ｔｈｅｎｅｉｇｈｂ
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ｃｌｅｉｃａｃｉｄａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｄａｔａｂａｎｋｓＰｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：７２６〜７３０。

【００３０】好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比
較ウインドウにわたって２つの最適に整列した配列を比較することにより決定さ
れる。ここで、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの
配列の最適整列について参照配列（付加または欠失を含まない）と比較した場合
、２０％以下、通常、５〜１５％、または１０〜１２％の付加または欠失（すな
わち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、適合した位置の数を算出
するために、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の
数を決定すること、適合する位置の数を参照配列の位置の総数（すなわち、ウイ
ンドウのサイズ）で割ること、そして配列同一性のパーセンテージを算出するた
めに得られた結果を１００倍することにより算出される。

【００３１】本発明の範囲にはまた、本明細書において示したヌクレオチド配列をコードす
る遺伝子の対立遺伝子も含まれる。本明細書において使用される場合、「対立遺
伝子」または「対立遺伝子配列」とは、その核酸配列における少なくとも１つの
変異から生じ得る遺伝子の別の形態である。対立遺伝子は、変更されたｍＲＮＡ
もしくはポリペプチドを生じ得る。その構造または機能は、変化されていても、
変化されていなくてもよい。任意の所定の遺伝子は、対立遺伝子形態を有しない
かもしれず、１つまたは多くの対立遺伝子形態を有し得る。対立遺伝子を生じる
一般的な変異的変化は、一般に、天然でのヌクレオチドの欠失、付加、または置
換に帰する。これらの型の変化のおのおのは、単独で、または他の変化と組み合
せて、所定の配列内に１回以上生じ得る。

【００３２】あるいは、免疫反応性特性を有する肺腫瘍ポリペプチドについて、改変体は、
上記のポリペプチドの１つのアミノ酸配列を改変すること、およびその改変され
たポリペプチドの免疫反応性を評価することによって同定され得る。診断用結合
剤の生成について有用である肺腫瘍ポリペプチドについて、改変体は、肺ガンの
存在または非存在を検出する抗体を生成する能力について改変されたポリペプチ
ドを評価することによって同定され得る。そのような改変された配列は、例えば
、本明細書において記載された代表的な手順を用いて調製および試験され得る。

【００３３】本発明の肺腫瘍ポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド分子は、当該分野で周知の任意の種々の方法を用いて肺腫瘍組織
から単離され得る。本発明の肺腫瘍タンパク質の１つをコードする遺伝子（また
はその一部）に対応するポリヌクレオチド配列は、以下に詳細に記載するように
サブトラクション技術を用いて肺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーから単離され得る。
そのようなポリヌクレオチド配列の例は、配列番号１〜１０９、１１１、１１３
、１１５〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６２〜１６４
、１６７、１６８および１７１、ならびにその改変体に提供される。従って、得
られた部分的ポリヌクレオチド配列を使用して、ヒトゲノムＤＮＡライブラリー
から、または肺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）において、当該分野において周知の技術（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６
３、１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｔ
ｏｎＰｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）を用いて、全長ポリヌクレオ
チド配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計し得る。このアプ
ローチについて、配列特異的なプライマーは、本明細書において提供されるヌク
レオチド配列に基づいて設計され得、そして購入もしくは合成され得る。

【００３４】増幅した部分を使用して、適切なライブラリー（例えば、肺腫瘍ｃＤＮＡライ
ブラリー）から周知の技術を使用して全長遺伝子を単離し得る。このような技術
において、増幅に適した１以上のポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを
使用して、ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー）を
スクリーニングする。好ましくは、ライブラリーはより大きな分子を含むように
サイズが選択される。無作為に刺激されたライブラリー（ｒａｎｄｏｍｐｒｉ
ｍｅｄｌｉｂｒａｒｙ）もまた、遺伝子の５’領域および上流領域の同定ため
に好ましい。ゲノムライブラリーは、イントロンを入手することおよび５’配列
を伸長させることについて好ましい。

【００３５】ハイブリダイゼーション技術に関して、部分配列は、周知の技術を使用して標
識（例えば、ニックトランスレーションまたは³²Ｐでの末端標識）され得る。次
いで、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーは、標識プロー
ブと、変性した細菌コロニー（またはファージプラークを含む菌叢）を含むフィ
ルターとをハイブリダイズすることによってスクリーニングされる（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）
。ハイブリダイズするコロニーまたはプラークを選択し、そして拡大する。そし
てそのＤＮＡをさらなる分析のために単離する。ｃＤＮＡクローンを、さらなる
付加配列の量を決定するために、例えば、部分配列由来のプライマーおよびその
ベクター由来のプライマーを使用するＰＣＲによって分析し得る。制限酵素地図
および部分配列を作成して、１以上の重複クローンを同定する。次いで、標準的
な技術（これは、一連の欠失クローンを作製することを包含する）を使用して完
全配列を決定し得る。次いで、得られた重複配列を１つの連続配列中にアセンブ
ルする。周知の技術を使用して、適切なフラグメントに連結することにより全長
ｃＤＮＡ分子を生成し得る。

【００３６】あるいは、部分ｃＤＮＡ配列由来の全長コード配列を得るための多くの増幅技
術が存在する。このような技術において、増幅は、一般的に、ＰＣＲを介して行
われる。種々の市販キットのいずれかを使用して増幅工程を行い得る。当該分野
で周知の技術を使用してプライマーを設計し得（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：
２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編，ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃ
ｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）、そして当該分野で周知
のソフトウェアもまた使用し得る。プライマーは、好ましくは、長さが２２〜３
０ヌクレオチドであり、少なくとも５０％のＧＣ含有量を有し、そして標的配列
に約６８℃〜７２℃の温度でアニールする。増幅した領域を上記に記載されるよ
うにして配列決定し、そして重複配列を連続する配列へと構築する。

【００３７】このような増幅技術の１つは、インバースＰＣＲである（Ｔｒｉｇｌｉａら，
Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：８１８６，１９８８を参照のこと）。こ
の技術は、制限酵素を使用して、その遺伝子の既知の領域内のフラグメントを生
成する。次いで、このフラグメントを分子内連結により環状化し、そして既知の
領域に由来する多岐したプライマーを用いたＰＣＲのための鋳型として使用する
。代替のアプローチにおいて、部分配列に隣接した配列を、リンカー配列に対す
るプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーを使用する増幅により取り
出し得る。この増幅した配列を、代表的に、同じリンカープライマーおよび既知
の領域に特異的な第２のプライマーを使用する２回目の増幅に供する。既知の配
列から反対方向に伸長を開始する２つのプライマーを使用するこの手順について
の改変は、ＷＯ９６／３８５９１に記載される。さらなる技術としては、キャ
プチャーＰＣＲ（Ｌａｎｇｅｒｓｔｒｏｍら，ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐ
ｌｉｃ．１：１１１−１９，１９９１）およびウォーキングＰＣＲ（Ｐａｒｋｅ
ｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：３０５５−６０，１９９１）が挙げ
られる。転写媒介増幅、すなわちＴＭＡは、ＤＮＡ、ｒＲＮＡ、またはｍＲＮＡ
の増幅のために使用され得る別の方法であり、特許第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０３１
８４号に記載される。この自己触媒性でかつ等温性の、ＰＣＲに基づかない方法
は、２つのプライマーおよび２つの酵素を利用する：ＲＮＡポリメラーゼおよび
逆転写酵素。一方のプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配
列を含む。１回目の増幅において、このプロモーター−プライマーは、規定され
た部位で標的ｒＲＮＡにハイブリダイズする。逆転写酵素は、このプロモーター
−プライマーの３’末端からの伸長により、標的ｒＲＮＡのＤＮＡコピーを作製
する。得られた複合体におけるＲＮＡは分解され、そして第２のプライマーはＤ
ＮＡコピーに結合する。逆転写酵素によりＤＮＡの新しい鎖をこのプライマーの
末端から合成し、二本鎖ＤＮＡを作製する。ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型
内のプロモーター配列を認識しそして転写を開始する。この新たに合成されたＲ
ＮＡアンプリコンの各々を、再度ＴＭＡプロセスに供し、そして新しい回の複製
のための鋳型として供給してＲＮＡアンプリコンの指数関数的な増大を誘導する
。増幅を利用する他の方法もまた使用して、全長ｃＤＮＡ配列を入手する。

【００３８】特定の場合において、発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（例えば、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋより入手可能のもの）に提供される配列の分析により、全長ｃＤＮＡを
入手することが可能である。重複ＥＳＴの検索は、一般に、周知のプログラム（
例えば、ＮＣＢＩＢＬＡＳＴ検索）を使用して行われ得、そしてこのようなＥ
ＳＴを使用して連続した全長配列を生成し得る。

【００３９】一旦、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が得られると、このポ
リペプチドは、このポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入して、そして適
切な宿主においてこのポリペプチドを発現させることにより、組換え的に産生さ
れ得る。当業者に公知の任意の種々の発現ベクターを使用して、本発明の組換え
ポリペプチドを発現し得る。発現は、この組換えポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされ
た任意の適切な宿主細胞において達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核
生物細胞、酵母細胞、昆虫細胞およびより高等な真核生物細胞が挙げられる。好
ましくは、使用される宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母または哺乳動物の細胞株
（例えば、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞）である。この様式で発現されるポリヌ
クレオチド配列は、天然に存在するポリペプチド、天然に存在するポリペプチド
の部分、またはそれらの他の改変体をコードし得る。組換えポリペプチドを分泌
する適切な宿主／ベクター系に由来する上清を、最初、市販のフィルターを使用
して濃縮し得る。次いで、この濃縮物を適切な精製マトリックス（例えば、アフ
ィニティーマトリックスまたはイオン交換樹脂）に供し得る。最後に、１回以上
の逆相ＨＰＬＣ工程を使用して、この組換えポリペプチドをさらに精製し得る。

【００４０】本明細書中に開示される肺腫瘍ポリぺプチドはまた、合成的な手段によって生
成され得る。特に、約１００未満のアミノ酸を有する合成ポリぺプチド、および
一般に、約５０より少ないアミノ酸を有する合成ポリぺプチドは、当業者に周知
の技術を使用して生成され得る。例えば、このようなポリぺプチドは、市販の固
相技術（例えば、メリフィールド固相合成方法）のいずれかを使用して合成され
得る。メリフィールド固相合成方法において、アミノ酸は、伸長しているアミノ
酸鎖に順次添加される（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６，１９６３を参照のこと）。ポリぺプチドの
自動合成のための装置は供給業者（例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ａｐｐ
ｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓＤｉｖｉｓｉｏｎ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ
，ＣＡ））から市販されており、そして製造業者の取扱説明書に従って操作され
得る。

【００４１】さらに、肺腫瘍抗原は、Ｔ細胞発現クローニングによって同定され得る。腫瘍
特異的Ｔ細胞の１つの供給源は、ヒトの患者から外科的に切除された腫瘍に由来
する。腫瘍特異的Ｔ細胞を単離しそして特徴付けるための１つの方法において、
この切除した腫瘍を細かく刻み、そして数時間、酵素的に消化して、腫瘍細胞お
よび浸潤リンパ球（腫瘍浸潤Ｔ細胞、すなわちＴＩＬ）を放出させる。この細胞
をＨＢＳＳ緩衝液中で洗浄し、そしてフィコール不連続勾配（１００％／７５％
／ＨＢＳＳ）を通過させて、非生存細胞から腫瘍細胞およびリンパ球を分離する
。界面から２つのバンドを採集する；７５％／ＨＢＳＳ界面での上部バンドは主
に腫瘍細胞を含み、一方、１００％／７５％／ＨＢＳＳ界面での下部バンドは主
にリンパ球を含む。このＴＩＬを、当該分野で周知の技術により培養にて増大す
るか（好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−７および１００Ｕ／ｍｌＩＬ−２
を補充した培養培地であるが）、あるいは抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ
３）で予め吸収した組織培養プレート中で培養しそして増大する。得られたＴＩ
Ｌ培養物をＦＡＣＳにより分析して、大部分がＣＤ８＋Ｔ細胞であることを確認
する（＞９０％のゲートされた集団）。

【００４２】さらに、この腫瘍細胞もまた、当該分野で周知の技術を使用して培養にて増大
して、腫瘍細胞株を確立する。この細胞株は後に、免疫組織化学的な分析により
肺腫瘍細胞であることを確認する。この腫瘍細胞株を、ヒトＣＤ８０を発現する
ようにレトロウイルスベクターで形質導入する。ＣＤ８０、クラスＩＭＨＣ分
子およびクラスＩＩＭＨＣ分子の強力な発現レベルを確認するために、この腫
瘍細胞株をＦＡＣＳによりさらに特徴付けする。

【００４３】肺腫瘍に関するＴＩＬ株の特異性を、ＩＮＦ−γサイトカインおよび／または
ＴＮＦ−αサイトカインの放出アッセイにより確認する。例えば、２１日目の培
養物由来のＴＩＬ細胞を、自己由来の腫瘍細胞または同種異系由来の腫瘍細胞の
いずれか、ＥＢＶ不死化ＬＣＬ、あるいはコントロール細胞株のＤａｕｄｉおよ
びＫ５６２と共に同時培養し、そしてこの培養上清をサイトカインの存在につい
てＥＬＩＳＡによりモニターする。これらの特定のサイトカインの腫瘍細胞また
は陰性コントロール細胞の存在下での発現は、このＴＩＬ株が、自己由来のＭＨ
Ｃ分子により提示される腫瘍抗原を特異的にかつ潜在的に認識するか否かを示す
。

【００４４】この特徴付けした腫瘍特異的なＴＩＬ株を、当該分野で周知の方法により増大
し得、そしてクローン化し得る。例えば、このＴＩＬ株を、照射したＥＢＶ形質
転換ＬＣＬおよびＰＢＬフィーダー細胞を含む培養物中で、可溶性抗ＣＤ３抗体
を使用して、２０Ｕ／ｍｌＩＬ−２存在下でＴ細胞発現クローニングに適した
数まで増大し得る。増大したＴＩＬ株由来のクローンを、標準的な限界希釈技術
により産生し得る。特に、ＴＩＬ細胞を９６ウェルＵ底プレートに０．５個細胞
／ウェルで播種し、そして５０Ｕ／ｍｌＩＬ−２存在下で、ＣＤ−８０形質導
入自己腫瘍細胞、ＥＢＶ形質転換ＬＣＬ、およびＰＢＬフィーダー細胞で刺激す
る。これらのクローンを、⁵¹Ｃｒ微量細胞傷害性（ｍｉｃｒｏｃｙｔｏｔｏｘｉ
ｃｉｔｙ）およびＩＦＮ−γバイオアッセイにより、腫瘍特異性についてさらに
分析し得る。さらに、ＴＩＬクローンによって認識されるＭＨＣ拘束エレメント
を、当該分野で周知の抗体ブロック研究により決定し得る。

【００４５】上記に記載したＣＴＬ株またはクローンは、腫瘍特異的抗原を同定するために
使用され得る。例えば、患者由来の自己の線維芽細胞またはＬＣＬを、肺腫瘍ｃ
ＤＮＡライブラリー由来のポリヌクレオチドフラグメントを用いてトランスフェ
クトまたは形質導入して、標的細胞発現腫瘍ポリペプチドを産生し得る。このＭ
ＨＣ関連の標的細胞発現腫瘍ポリペプチドは、ＣＴＬ株またはＴ細胞活性化を生
じるクローンにより認識され、これを、サイトカイン認識アッセイによりモニタ
ーし得る。次いで、標的細胞により発現されそして腫瘍特異的ＣＴＬにより認識
される腫瘍遺伝子を上記に記載した技術により単離する。一般に、調製方法に拘
らず、本明細書中に開示したポリペプチドは、実質的に純粋な単離された形態で
調製される（すなわち、このポリペプチドは、アミノ酸組成分析および一次配列
分析により決定される場合、均質である）。好ましくは、このポリペプチドは、
少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋および最も好
ましくは少なくとも９９％純粋である。特定の好ましい実施態様（以下により詳
細に記載される）において、この実質的に純粋なポリペプチドは、本明細書中に
開示される１以上の方法における使用のための薬学的組成物またはワクチンに組
み込まれる。

【００４６】関連局面において、本発明は、本発明の第１および第２のポリペプチドを含む
融合タンパク質、あるいは、本発明のポリペプチドおよび公知の肺腫瘍抗原を含
む融合タンパク質を、このような融合タンパク質の改変体と共に提供する。本発
明の融合タンパク質は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間にリン
カーペプチドを（必要はないが）含み得る。

【００４７】本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、第１のポリペ
プチドおよび第２のポリペプチドをコードする別々のポリヌクレオチド配列がア
センブルするように、公知の組換えＤＮＡ技術を使用して適切な発現ベクター中
に構築される。第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’末端を、ペプ
チドリンカーを用いてまたはペプチドリンカー用いないで、第２のポリペプチド
をコードするＤＮＡ配列の５’末端に連結する。その結果、この配列のリーディ
ングフレームは、この２つのＤＮＡ配列のｍＲＮＡが、第１のポリペプチドおよ
び第２のポリペプチドの両方の生物学的活性を保持する単一の融合タンパク質に
翻訳されることを可能にする位相にある。

【００４８】ペプチドリンカー配列を使用して、各ポリペプチドが、その２次構造および３
次構造へと折り畳むのを確実にするのに十分な距離で第１のポリペプチドおよび
第２のポリペプチドを分離し得る。このようなペプチドリンカーは、当該分野で
周知の標準的な技術を使用して、この融合タンパク質に組み込まれる。適切なペ
プチドリンカー配列は、以下の要素に基づいて選択され得る：（１）可撓性で伸
長されるコンホメーションを採るその能力；（２）第１のポリペプチドおよび第
２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る２次構造を採ることが
できないこと；および（３）このポリペプチドの機能的エピトープと反応し得る
疎水性残基または荷電残基の欠失。好ましいエピトープリンカー配列は、Ｇｌｙ
残基、Ａｓｎ残基およびＳｅｒ残基を含む。ほぼ中性の他のアミノ酸（例えば、
ＴｈｒおよびＡｌａ）もまた、このリンカー配列に使用され得る。リンカーとし
て有用に使用され得るアミノ酸配列としては、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ４
０：３９−４６，１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：８２５８−８２６２，１９８６；米国特許第４，９３５
，２３３号および同第４，７５１，１８０号に開示されるリンカーが挙げられる
。このリンカー配列は、長さが１〜約５０のアミノ酸であり得る。第１のポリペ
プチドおよび第２のポリペプチドが、機能ドメインの分離および立体阻害の防止
のために使用され得る非必須のＮ末端アミノ酸領域を有する場合、ペプチド配列
は必要でない。

【００４９】この連結したポリヌクレオチド配列を、適切な転写調節エレメントまたは翻訳
調節エレメントに作動可能に連結する。ポリヌクレオチドの発現を担う調節エレ
メントは、第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側にのみ位置する
。同様に、翻訳の終止に必要な終止コドンおよび転写終結シグナルは、第２のポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。

【００５０】本発明のポリペプチドを、非関連免疫原性タンパク質とともに含む融合タンパ
ク質もまた提供される。好ましくは、この免疫原性タンパク質は、呼び戻し（ｒ
ｅｃａｌｌ）応答を惹起し得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タ
ンパク質、結核タンパク質および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏ
ｕｔｅら、ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３６：８６−９１（１９９７）
を参照のこと）。

【００５１】肺腫瘍タンパク質の免疫原性部分を含むポリペプチドは、一般に、肺癌の治療
のために使用され得、ここで、このポリペプチドは、肺腫瘍細胞に対する患者自
身の免疫応答を刺激する。従って、本発明は、患者の肺癌の免疫治療のために、
本明細書中に記載される１以上の化合物（これはポリペプチド分子、ポリヌクレ
オチド分子、または融合タンパク質であり得る）を使用するための方法を提供す
る。本明細書中で使用される場合、「患者」とは、任意の温血動物、好ましくは
ヒトをいう。患者は、疾患に冒されていてもよいし、または検出可能な疾患がな
くてもよい。従って、本明細書中に開示される化合物は、肺癌を処置するため、
または肺癌の発達を阻害するために使用され得る。この化合物は、原発性腫瘍の
外科的除去ならびに／または放射線治療および従来の化学治療薬物の投与による
処置の前、または後のいずれかに投与される。

【００５２】これらの局面において、本発明のポリペプチドは、一般に、薬学的組成物また
はワクチンの中に存在する。薬学的組成物は、１以上のポリペプチドを含み得、
それらの各々は、１以上の上記の配列（またはそれらの改変体）および生理学的
に受容可能なキャリアを含み得る。ワクチンは、１以上のこのようなポリペプチ
ドおよび非特異免疫応答エンハンサーを含み得る。ここで、この非免疫応答エン
ハンサーは、外因性の抗原に対する免疫応答を誘起し得るかまたは増強し得る。
非免疫応答エンハンサーの例としては、アジュバント、生分解性微粒子（例えば
、ポリ乳酸ガラクチド（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃｇａｌａｃｔｉｄｅ）およびリ
ポソーム（このポリペプチドが組み込まれる）が挙げられる。薬学的組成物およ
びワクチンはまた、肺腫瘍抗原の他のエピトープを含み得、このエピトープは、
上記に記載されるように、融合タンパク質に組み込まれる（すなわち、複数のエ
ピトープを含む単一のポリペプチド）か、または別々のポリペプチド中に存在す
るかのいずれかである。

【００５３】あるいは、薬学的組成物またはワクチンは、１以上の上記のポリペプチドおよ
び／または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、このポリペプチド
がインサイチュで産生されるように含み得る。このような薬学的組成物およびワ
クチンにおいて、このポリヌクレオチドは、当業者に公知である任意の種々の送
達系（核酸発現系、細菌発現系およびウイルス発現系を含む）中に存在し得る。
適切な核酸発現系は、患者における発現に必要なポリヌクレオチド配列（例えば
、適切なプロモーター）を含む。細菌送達系は、その細胞表面上で肺細胞抗原の
エピトープを発現する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇ
ｕｅｒｒｉｎ）の投与を含む。好ましい実施態様において、このポリヌクレオチ
ドは、ウイルス発現系（例えば、ワクシニアまたは他のポックスウイルス、レト
ロウイルス、あるいはアデノウイルス）を使用して導入され得、このウイルス発
現系は、非病原性（欠損）の、複製コンピテントウイルスの使用を含み得る。適
切な系は、例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、ＰＮＡＳ８６：３１７−３
２１、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６
９：８６−１０３、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ８：１７−
２１、１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号
、および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，
７７７，１２７号、ＧＢ２，２００，６５１号；ＥＰ０，３４５，２４２；Ｗ
Ｏ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６
１６−６２７、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：４
３１−４３４、１９９１；Ｋｏｌｌｓら、ＰＮＡＳ９１：２１５−２１９、１
９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、ＰＮＡＳ９０：１１４９８−１１５０２
、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ８８：２８３８−２８
４８、１９９３；ならびにＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２−
１２０７、１９９３に開示される。このような発現系にポリヌクレオチドを組み
込む技術は、当業者に周知である。このポリヌクレオチドはまた、例えば、公開
されたＰＣＴ出願ＷＯ９０／１１０９２、およびＵｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ２５９：１７４５−１７４９、１９９３に記載され、Ｃｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２５９：１６９１−１６９２、１９９３に評論されたように、「裸」で
あり得る。裸のポリヌクレオチドの取り込みは、細胞に効率的に輸送される、生
分解性ビーズ上にこのポリヌクレオチドをコートすることにより増大され得る。

【００５４】投与の経路および頻度、ならびに用量は、個体間により変化し、そして他の疾
患の免疫治療において現在使用されているものに類似し得る。一般に、薬学的組
成物およびワクチンは、注射により（例えば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下
）、経鼻的に（例えば、吸入）または経口的に投与され得る。１〜１０の間の用
量が、３〜２４週間にわたって投与され得る。好ましくは、３ヶ月の間隔で、４
用量が投与され、そして追加投与がその後、定期的になされ得る。代替的プロト
コルが、個々の患者に適切であり得る。適切な用量は、処置される患者における
肺腫瘍細胞に対して免疫応答（細胞性および／または体液性）を惹起するのに有
効である、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの量である。適切な免疫応答は
、基底（すなわち、処置なし）レベルより少なくとも１０〜５０％上である。一
般に、１用量中に存在する（または１用量中のポリヌクレオチド分子によりイン
サイチュで生成される）ポリペプチドの量は、宿主１ｋｇ当たり約１ｐｇ〜約１
００ｍｇ、代表的には約１０ｐｇ〜約１ｍｇ、および好ましくは、約１００ｐｇ
〜約１μｇの範囲である。適切な用量サイズは、患者のサイズにより変化するが
、代表的には、約０．０１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。

【００５５】当業者に公知の任意の適切なキャリアが、本発明の薬学的組成物において使用
され得るが、キャリアの型は、投与の様式に依存して変化する。非経口投与（例
えば、皮下注射）のために、キャリアは、好ましくは、水、生理食塩水、アルコ
ール、脂質、ろうおよび／または緩衝液を含む。経口投与のために、上記のキャ
リアのいずれかまたは固体キャリア（例えば、マンニトール、ラクトース、デン
プン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルクム、セルロー
ス、グルコース、ショ糖、および／または炭酸マグネシウム）が使用され得る。
生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸グリコリド）もまた、本発明の薬学
的組成物のためのキャリアとして使用され得る。適切な生分解性ミクロスフェア
は、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号および同第５，０７５，１０９号
に開示される。

【００５６】任意の種々の免疫応答エンハンサーが、本発明のワクチンにおいて使用され得
る。例えば、アジュバントが含まれ得る。ほとんどのアジュバントは、抗原を迅
速な異化作用から保護するように設計された物質（例えば、水酸化アルミニウム
または鉱油）、および免疫応答の非特異的刺激物（例えば、リピドＡ、Ｂｏｒｄ
ｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓ）を含む。このようなアジュバントは、例えば、フロイント不完
全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）ならびにＭｅｒｃｋＡｄｊｕｖａｎｔ
６５（ＭｅｒｃｋａｎｄＣｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）
として市販されている。本明細書中に開示されるポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドはまた、癌の処置のための養子免疫療法に使用され得る。養子免疫療法は
、能動免疫療法または受動免疫療法のいずれかに大きく分類され得る。能動免疫
療法において、処置は、免疫応答改変剤（ｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ−ｍ
ｏｄｉｆｙｉｎｇａｇｅｎｔ）（例えば、腫瘍ワクチン、細菌性アジュバント
、および／またはサイトカイン）の投与による、腫瘍に対して反応する内因性宿
主免疫系のインビボでの刺激に依存する。

【００５７】受動免疫応答において、処置は、確立された腫瘍免疫反応性を有する生物学的
試薬（例えば、エフェクター細胞または抗体）の送達を含む。この試薬は、抗腫
瘍効果を直接または間接的に媒介し得、そして、必ずしもインタクトな宿主免疫
系に依存しない。エフェクター細胞の例としては、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８
＋細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔヘルパー、γ／δＴリンパ球、腫瘍浸潤リ
ンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、リンホカイン活性化キ
ラー細胞）、Ｂ細胞、または開示される抗原を発現する抗原提示細胞（例えば、
樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。本明細書中に開示されるポリペ
プチドはまた、受動免疫治療のために、抗体または抗イディオタイプ抗体（米国
特許第４，９１８，１６４号のような）を生成するために使用され得る。

【００５８】養子免疫治療のために十分な数のＴ細胞を獲得する有力な方法は、インビトロ
で免疫Ｔ細胞を増殖させることである。単一の抗原特異的Ｔ細胞を、インビボで
抗原認識を保持しながらその数を何十億にまで増殖させる培養条件は、当該分野
で周知である。これらのインビトロ培養条件は、代表的に、しばしばサイトカイ
ン（例えば、ＩＬ−２）の存在下で、抗原による断続刺激および分裂しないフィ
ーダー細胞を利用する。上記のように、本明細書中に記載の免疫反応性ポリペプ
チドは、免疫治療のために十分な数の細胞を生成する目的で、抗原特異的Ｔ細胞
培養物を迅速に増殖させるために使用され得る。特に、抗原提示細胞（例えば、
樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞またはＢ細胞）は、当該分野で周
知の種々の標準的技術を使用して、免疫反応性ポリペプチドでパルスされ得るか
、またはポリヌクレオチド配列が、抗原提示細胞へ導入され得る。例えば、抗原
提示細胞は、ポリヌクレオチド配列でトランスフェクトされ得るか、または形質
導入され得る。ここで、上記配列は、発現を増加するのに適切なプロモーター領
域を含み、そして組換えウィルスまたは他の発現系の一部として発現され得る。
水痘ウィルス、ワクシニアウィルス、およびアデノウィルスを含むいくつかのウ
ィルスのベクターを用いて、抗原提示細胞を形質導入し得る；また、抗原提示細
胞は、遺伝子銃技術、脂質媒介送達、エレクトロポレーション、浸透圧衝撃、お
よび微粒子送達機構を含む、種々の方法によって本明細書中に開示されるポリヌ
クレオチド配列でトランスフェクトされ得る。このことは、当業者によって決定
した場合に効率的かつ許容可能な発現レベルを生じる。治療に有効な培養Ｔ細胞
に関して、培養Ｔ細胞は、インビボで広く増殖および分布し得、そして長期間生
存し得なければならない。培養Ｔ細胞が、ＩＬ−２を補充された抗原での反復刺
激により、インビボで増殖し、そして実質的な数で長期間生存するように誘導さ
れ得ることが、研究により示されている（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒ，Ｍ．ら、「
ＴｈｅｒａｐｙＷｉｔｈＣｕｌｔｕｒｅｄＴＣｅｌｌｓ：Ｐｒｉｎｃｉ
ｐｌｅｓＲｅｖｉｓｉｔｅｄ」、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗ
ｓ、１５７：１７７、１９９７を参照のこと）。

【００５９】本明細書に開示されるポリペプチドはまた、腫瘍反応性Ｔ細胞を生成および／
または単離するために使用され得、このＴ細胞は、次いで、患者に投与され得る
。１つの技術において、抗原特異的Ｔ細胞株は、開示されたポリペプチドの免疫
原性部分に対応する短いペプチドでインビボ免疫により生成され得る。生じた抗
原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬクローンは、患者から単離され、標準的組織培養技術
を使用して増殖され、そして患者に戻され得る。

【００６０】あるいは、ポリペプチドの免疫原性部分に対応するペプチドは、選択的なイン
ビトロ刺激および自己由来のＴ細胞の増殖により腫瘍反応性Ｔ細胞のサブセット
を生成し、抗原特異的Ｔ細胞を提供するために使用され得、続いて、この抗原特
異的Ｔ細胞は、例えば、Ｃｈａｎｇら（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍ
ａｔｏｌ．、２２（３）、２１３、１９９６）により記載されるように、患者に
移入され得る。Ｔ細胞のような免疫系の細胞は、ＣｅｌｌＰｒｏＩｎｃｏｒｐ
ｏｒａｔｅｄの（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）ＣＥＰＲＡＴＥ^TMシステムのような市
販の細胞分離システムを用いて患者の末梢血から単離され得る（米国特許第５，
２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；
ＷＯ９１／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３を参照のこと）。分離された
細胞は、送達ビヒクル（例えば、マイクロスフェア）中に含まれる１つ以上の免
疫反応性ポリペプチドで刺激されて、抗原特異的Ｔ細胞を提供する。次いで、腫
瘍抗原特異的Ｔ細胞の集団は、標準技術を使用して増殖され、そしてこの細胞は
、患者に投与し戻される。

【００６１】他の実施態様において、本明細書中に開示されるポリペプチドに特異的なＴ細
胞および／または抗体レセプターが、クローン化され、増殖され、そして養子免
疫治療に用いるための他のベクターまたはエフェクター細胞に移入され得る。詳
細には、Ｔ細胞は、適切な遺伝子でトランスフェクトされ、腫瘍特異的モノクロ
ーナル抗体由来の可変ドメインを細胞外認識エレメントとして発現し、そしてＴ
細胞レセプターシグナル伝達鎖に連結され、Ｔ細胞活性化、特異的溶解、および
サイトカインの放出を生じ得る。このことは、Ｔ細胞がＭＨＣ独立様式において
その特異性を再指向することを可能にさせる。例えば、Ｅｓｈｈａｒ，Ｚ．，Ｃ
ａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，４５（３−４）：１３１
−６，１９９７およびＨｗｕ，Ｐ．，ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，５５（１５）
：３３６９−７３，１９９５を参照のこと。別の実施態様は、Ｃｏｌｅ，ＤＪ，
ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、５５（４）：７４８−５２，１９９５の場合のよう
に、代替Ｔ細胞（ａｌｔｅｒｎａｔｅＴｃｅｌｌ）への腫瘍抗原特異的αＴ
細胞レセプター鎖および腫瘍抗原特異的βＴ細胞レセプター鎖のトランスフェク
ションを含み得る。

【００６２】さらなる実施態様において、同系すなわち自己由来の樹状細胞は、本明細中に
開示されたポリペプチドの少なくとも免疫原性部分に対応するペプチドでパルス
され得る。生じた抗原特異的樹状細胞は、患者に移入され得るか、またはＴ細胞
を刺激して、次に患者に投与され得る抗原特異的Ｔ細胞を提供するために使用さ
れ得るかのいずれかである。抗原特異的Ｔ細胞を生成するためのペプチドでパル
スされた樹状細胞の使用、およびマウスのモデルにおいて、腫瘍を根絶するため
のこのような抗原特異的Ｔ細胞の続く使用が、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ、１５７：１７７、１９９７により示されてい
る。

【００６３】さらに、開示されるポリヌクレオチドを発現するベクターが、患者から得られ
た幹細胞に導入され得、そして同じ患者へ戻す自己移植のためにインビトロでク
ローン的に増殖される。

【００６４】さらに、開示されるポリヌクレオチドを発現するベクターが、患者から得ら
れた幹細胞に導入され得、そして同じ患者へ戻す自己移植のためにインビトロで
クローン的に増殖される。本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質はまた、
（または代わりに）転移性のヒトの肺腫瘍を検出し得る結合薬剤（例えば、抗体
、またはそのフラグメント）を生成するために使用され得る。本発明の結合薬剤
は、一般的に、当業者に公知の方法（本明細書中に記載の代表的な手順を含む）
を使用して調製され得る。結合薬剤は、本明細書中に記載の代表的アッセイを使
用して、肺癌を有する患者と肺癌を有さない患者とを区別し得る。換言すると、
肺腫瘍タンパク質またはその適切な部分に対して惹起された抗体または他の結合
薬剤は、この疾患に罹患した患者の少なくとも約２０％において、原発性肺癌ま
たは転移性肺癌の存在を示すシグナルを生じ、そして原発性肺癌または転移性肺
癌を有さない個体の少なくとも約９０％において、この疾患が存在しないことを
示すネガティブシグナルを生じる。このような肺腫瘍タンパク質の適切な部分は
、全長タンパク質を使用して肺癌が示される患者の実質的に全て（すなわち、少
なくとも約８０％、および好ましくは、少なくとも約９０％）において、原発性
肺癌または転移性肺癌の存在を示す結合薬剤であって、そして全長タンパク質を
用いて試験された場合にネガティブであるサンプルの実質的に全てにおいて、肺
癌が存在しないことを示す結合薬剤を生じ得る部分である。以下に記載の代表的
なアッセイ（例えば、２抗体（ｔｗｏ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）サンドイッチアッセ
イ）は、一般に、転移性ヒト肺腫瘍を検出する結合薬剤の能力を評価するために
使用され得る。

【００６５】本明細書中に記載されたように調製されたポリペプチドが、原発性ヒト肺腫瘍
または転移性ヒト肺腫瘍を検出し得る抗体を生成する能力は、一般に、このポリ
ペプチドに対する１つ以上の抗体を惹起し（例えば、本明細書中に記載の代表的
方法を使用して）、そしてこのような抗体が、患者においてこのような腫瘍を検
出する能力を決定することにより、評価され得る。この決定は、生成された抗体
に結合するポリペプチドの存在について、原発性肺癌または転移性肺癌を有する
患者またはこれらを有さない患者由来の生物学的サンプルをアッセイすることに
よりなされ得る。このような試験アッセイは、例えば、以下に記載の代表的な手
順を使用して実行され得る。このような手順により、原発性肺腫瘍または転移性
肺腫瘍の少なくとも２０％を検出し得る抗体を生成するポリペプチドは、原発性
肺腫瘍または転移性ヒト肺腫瘍を検出するためのアッセイにおいて有用であると
考えられる。ポリペプチド特異的抗体は、単独で、または感度を改良するために
組合せて使用され得る。

【００６６】原発性ヒト肺腫瘍または転移性ヒト肺腫瘍を検出し得るポリペプチドは、肺癌
を診断するためのマーカー、または患者における疾患の進行をモニターするため
のマーカーとして使用され得る。１つの実施態様において、患者における肺癌は
、この患者から得られた生物学的サンプルを、予め決定したカットオフ値（ｃｕ
ｔ−ｏｆｆｖａｌｕｅ）と比較して、上記の１つ以上のポリペプチドのレベル
について評価することにより診断され得る。本明細書中で使用される場合、適切
な「生物学的サンプル」には、血液、血清、尿、および／または肺分泌物を含む
。

【００６７】上記の１つ以上のポリペプチドのレベルは、このポリペプチドに特異的な任意
の結合薬剤を使用して評価され得る。「結合薬剤」とは、本発明の文脈において
、上記のようなポリペプチドに結合する任意の薬剤（例えば、化合物または細胞
）である。本明細書中で使用される場合、「結合」とは、「複合体」が形成され
るような２つの別々の分子（その各々は、遊離（すなわち溶液中）であり得るか
、あるいは細胞または固体支持体の表面上に存在し得る）間の非共有結合的会合
をいう。このような複合体は、遊離していてもよいし、または支持体材料上に固
定（共有結合または非共有結合のいずれか）されていてもよい。結合する能力は
、一般に、この複合体の形成についての結合定数を決定することにより評価され
得る。結合定数は、その複合体の濃度が成分の濃度の積で除算される場合に得ら
れる値である。一般に、２つの化合物は、複合体形成についての結合定数が約１
０³Ｌ／ｍｏｌを超える場合に、本発明の文脈において、「結合する」と言われ
る。結合定数は、当業者に周知の方法を使用して決定され得る。

【００６８】上記の要件を満足させる任意の物質が、結合薬剤であり得る。例えば、結合薬
剤は、ペプチド成分を有するリボソームまたは有さないリボソーム、ＲＮＡ分子
、あるいはペプチドであり得る。好ましい実施態様において、結合パートナーは
、抗体、またはそのフラグメントである。このような抗体は、ポリクローナルま
たはモノクローナルであり得る。さらに、この抗体は、単鎖抗体、キメラ抗体、
ＣＤＲ移植抗体、またはヒト化抗体であり得る。抗体は、本明細書中に記載の方
法、および当業者に周知の他の方法によって調製され得る。

【００６９】サンプルにおいてポリペプチドマーカーを検出するために結合パートナーを使
用する、当業者に公知の種々のアッセイ形式が存在する。例えば、Ｈａｒｌｏｗ
およびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８
８を参照のこと。好ましい実施態様において、アッセイは、残りのサンプル由来
のポリペプチドに結合してそれを除去するために、固体支持体に固定化された結
合パートナーの使用を含む。次いで、結合ポリペプチドは、レポーター基を含む
第２の結合パートナーを使用して検出され得る。適切な第２の結合パートナーは
、結合パートナー／ポリペプチド複合体に結合する抗体を含む。あるいは、競合
アッセイが、利用され得、このアッセイにおいて、ポリペプチドは、レポーター
基で標識され、そしてサンプルとの結合パートナーのインキュベーション後に、
固定化された結合パートナーに結合することを可能にする。サンプルの成分が、
結合パートナーへの標識されたポリペプチドの結合を阻害する程度は、固定化さ
れた結合パートナーとのそのサンプルの反応性を示す。

【００７０】固体支持体は、抗原が付着され得る、当業者に公知な任意の材料であり得る。
例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレート中の試験ウェルまたはニトロ
セルロース膜もしくは他の適切な膜であり得る。あるいは、この支持体は、ガラ
ス、ファイバーガラス、ラテックスまたはプラスチック材料（例えば、ポリスチ
レンもしくはポリビニルクロリド）のようなビーズあるいはディスクであり得る
。この支持体はまた、例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に開示されるよ
うな、磁気粒子または光ファイバーセンサーであり得る。結合薬剤は、当業者に
公知の種々の技術を使用して固体支持体上に固定化され得、これは、特許および
科学文献において詳細に記載されている。本発明の文脈において、用語「固定化
」は、吸着のような非共有結合的会合および共有結合的付着（これは、抗原と支
持体上の官能基との間の直接的結合であり得るか、または架橋剤による結合であ
り得る）の両方をいう。マイクロタイタープレートにおけるウェルまたは膜に対
する吸着による固定化が、好ましい。このような場合において、吸着は、適切な
緩衝液中で、適切な長さの時間の間、結合薬剤と固体支持体とを接触することに
よって達成され得る。接触時間は、温度とともに変化するが、代表的には約１時
間と約１日との間である。一般に、プラスチックマイクロタイタープレート（例
えば、ポリスチレンまたはポリビニルクロリド）のウェルと約１０ｎｇ〜約１０
μｇの範囲、および好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合薬剤と
を接触させることは、結合薬剤の適切な量を固定化するために十分である。

【００７１】固体支持体に対する結合薬剤の共有結合的付着は、一般的に、この支持体およ
び結合薬剤上の官能基（例えば、ヒドロキシル基またはアミノ基）の両方と反応
する二官能性試薬を、この支持体とまず反応させることによって達成され得る。
例えば、この結合薬剤を、ベンゾキノンを使用するか、または結合パートナーの
アミンおよび活性な水素と支持体のアルデヒド基との縮合によって、適切なポリ
マーコーティングを有する支持体に対して共有結合的に付着し得る（例えば、Ｐ
ｉｅｒｃｅＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣａｔａｌｏｇａｎｄＨ
ａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２〜Ａ１３を参照のこと）。

【００７２】特定の実施態様において、アッセイは、２抗体サンドイッチ（ｔｗｏ−ａｎｔ
ｉｄｏｂｙｓａｎｄｗｉｃｈ）アッセイである。このアッセイを、まず、固体
支持体（一般にマイクロタイタープレートのウェル）上で固定化された抗体を、
サンプルと接触させ、その結果、サンプル内のポリペプチドを固定化された抗体
に結合させることによって実施し得る。次いで、結合していないサンプルを、固
定化されたポリペプチド−抗体複合体から除去し、そしてこのポリペプチド上で
異なる部位に結合する能力を有する第２の抗体（レポーター基を含む）を添加す
る。次いで、固体支持体に結合したままである第２の抗体の量を、特定のレポー
ター基について適切な方法を使用して決定する。

【００７３】より詳細には、一旦この抗体が上記のようにこの支持体上に固定化されると、
この支持体上の残存するタンパク質結合部位は、代表的にはブロックされる。ウ
シ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ２０^TM（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣ
ｏ.、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のような任意の適切なブロック剤が、当業者に
公知である。次いで、この固定化抗体をサンプルとともにインキュベートし、そ
してポリペプチドを抗体に結合させる。このサンプルを、インキュベーションの
前に適切な希釈液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈し得る
。一般に、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、肺癌を有
する個体から入手したサンプル中のポリペプチドの存在を検出するために十分な
時間の長さである。好ましくは、この接触時間は、結合したポリペプチドと結合
していないポリペプチドとの間の平衡で達成される結合の少なくとも約９５％で
ある結合レベルを達成するために十分である。当業者は、平衡に達するために必
要な時間が、一定期間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることによって
容易に決定され得ることを理解する。室温において、約３０分のインキュベーシ
ョン時間が、一般的に十分である。

【００７４】次いで、結合していないサンプルを、この固体支持体を適切な緩衝液（例えば
、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０^TM含有ＰＢＳ）を用いて洗浄することによって除去し
得る。次いで、第２の抗体（これは、レポーター基を含む）をこの固体支持体に
添加し得る。好ましいレポーター基としては、酵素（例えば、西洋ワサビペルオ
キシダーゼ）、基質、補因子、インヒビター、色素、放射性核種、発光基、蛍光
基およびビオチンが挙げられる。レポーター基に対する抗体の結合を、当業者に
公知の標準的方法を使用して達成し得る。

【００７５】次いで、この第２の抗体を、固定化された抗体−ポリペプチド複合体とともに
、結合したポリペプチドを検出するために十分な時間の長さの間、インキュベー
トする。適切な時間の長さを、一般的に、一定期間にわたって起こる結合レベル
をアッセイすることによって決定し得る。次いで、結合していない第２の抗体を
除去し、そして結合した第２の抗体をレポーター基を使用して検出する。レポー
ター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放
射性基に関しては、シンチレーション計数法またはオートラジオグラフ法が、一
般的に適切である。分光法は、色素、発光基および蛍光基を検出するために使用
され得る。ビオチンは、異なるレポーター基（一般に、放射性基または蛍光基ま
たは酵素）に結合されるアビジンを使用して検出され得る。酵素のレポーター基
は、一般的に、基質の添加（一般的に特定の時間の間）、次いで反応生成物の分
光的分析または他の分析によって検出され得る。

【００７６】肺癌が存在するかまたは存在しないかを決定するために、固体支持体に結合さ
れたままであるレポーター基から検出されるシグナルを、一般的に、予め決定さ
れたカットオフ値に対応するシグナルと比較する。１つの好ましい実施態様にお
いて、このカットオフ値は、この固定化された抗体が肺癌を有さない患者由来の
サンプルとともにインキュベートされる場合に得られる平均シグナルである。一
般に、予め決定されたカットオフ値より３標準偏差上であるシグナルを生成する
サンプルは、肺癌について陽性であると考えられる。代替の好ましい実施態様に
おいて、このカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、ＣｌｉｎｉｃａｌＥｐｉｄ
ｅｍｉｏｌｏｇｙ：ＡＢａｓｉｃＳｃｉｅｎｃｅｆｏｒＣｌｉｎｉｃａ
ｌＭｅｄｉｃｉｎｅ、ＬｉｔｔｌｅＢｒｏｗｎａｎｄＣｏ．、１９８５
、１０６〜７頁の方法に従って、レシーバーオペレーター曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅ
ｒＯｐｅｒａｔｏｒＣｕｒｖｅ）を使用して決定される。簡潔に言えば、こ
の実施態様において、このカットオフ値は、診断試験結果について各々可能性の
あるカットオフ値に対応する、真の陽性の割合（すなわち、感度）および偽陽性
の割合（１００％特異性）の対のプロットから決定され得る。上方左手の隅（す
なわち、もっとも大きな領域を囲む値）にもっとも近いこのプロット上のカット
オフ値は、もっとも正確なカットオフ値であり、そしてこの方法によって決定さ
れたカットオフ値よりも高いシグナルを生じるサンプルは、陽性であると考えら
れ得る。あるいは、このカットオフ値は、偽陽性の割合を最小化するためにプロ
ットに沿って左に移動され得、または偽陰性の割合を最小化するために右に移動
され得る。一般に、この方法によって決定されたカットオフ値よりも高いシグナ
ルを生じるサンプルは、肺癌について陽性であると考えられる。

【００７７】関連する実施態様において、このアッセイは、フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈ
ｒｏｕｇｈ）またはストリップ（ｓｔｒｉｐ）試験形式において実行され、ここ
で、この抗体は、膜（例えば、ニトロセルロース）上に固定化される。フロース
ルー試験において、サンプル中のポリペプチドは、サンプルが膜を通るにつれて
、固定化された抗体に結合する。次いで、第２の標識化抗体は、この第２の抗体
を含む溶液が膜を通って流れるにつれて、この抗体−ポリペプチド複合体に結合
する。次いで、結合した第２の抗体の検出を、上記のように実行し得る。ストリ
ップ試験形式において、抗体が結合する膜の一端を、このサンプルを含む溶液中
に浸す。このサンプルは、膜に沿って第２の抗体を含む領域を通って、そして固
定化された抗体の領域まで移動する。固定化された抗体の領域における第２の抗
体の濃度は、肺癌の存在を示す。代表的に、その部位における第２の抗体の濃度
は、可視的に読み取られ得るパターン（例えば、線）を生じる。このようなパタ
ーンが存在しないことは、陰性の結果を示す。一般に、膜上に固定化された抗体
の量は、生物学的サンプルが、上記で議論される形式において、２抗体サンドイ
ッチアッセイにおける陽性シグナルを生じるために十分であるポリペプチドのレ
ベルを含む場合に、可視的に分離できるパターンを生じるように選択される。好
ましくは、膜上に固定化された抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり
、そしてより好ましくは約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試
験は、代表的に、非常に少量の生物学的サンプルを用いて実行され得る。

【００７８】当然のことながら、本発明の抗原または抗体を用いた使用に適切である、他の
多数のアッセイプロトコルが存在する。上記の説明は、例示のみであることを意
図する。

【００７９】別の実施態様において、上記のポリペプチドは、肺癌の進行についてのマーカ
ーとして使用され得る。この実施態様において、肺癌の診断について上記に記載
されるようなアッセイは、経時的に実行され得、そして反応性ポリペプチドのレ
ベルの変化を評価し得る。例えば、このアッセイは、６ケ月〜１年の期間の間２
４〜７２時間毎に実行され得、そしてその後、必要に応じて実行され得る。一般
に、肺癌は、結合薬剤によって検出されるこのポリペプチドのレベルが経時的に
増大する患者において進行している。対照的に、肺癌は、反応性ポリペプチドの
レベルが一定のままであるか、または時間とともに減少するかのいずれかである
場合、進行していない。

【００８０】上記の方法における使用のための抗体は、当業者に公知の任意の種々の技術に
よって調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。１つのこのような
技術において、抗原性ポリペプチドを含む免疫原を、任意の広範な種々の哺乳動
物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヤギ）に最初に注射する。
この工程において、本発明のポリペプチドは、改変することなく、免疫原として
供給され得る。あるいは、特に比較的短いポリペプチドに関して、このポリペプ
チドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリン
ペットヘモシアニン）に連結される場合に、優れた免疫応答が誘導され得る。好
ましくは、１つ以上のブースター免疫化を組み込む予め決定された計画に従って
、この免疫原が動物の宿主内に注射され、そしてこの動物を定期的に採血する。
次いで、このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、例えば、適切な固
体支持体に結合されたポリペプチドを使用してアフィニティークロマトグラフィ
ーによって、このような抗血清から精製され得る。

【００８１】目的の抗原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈ
ｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１〜５
１９、１９７６の技法、ならびにそれに対する改良を使用して調製され得る。簡
潔に言えば、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドと
の反応性）を有する抗体を産生する能力を有する不死化細胞株の調製を包含する
。このような細胞株は、例えば、上記のような免疫化された動物から得られる脾
細胞から産生され得る。ついで、この脾細胞を、例えば、ミエローマ細胞融合パ
ートナーとの融合、好ましくは、免疫化された動物と同系であるパートナーとの
融合によって不死化する。種々の融合技術を使用し得る。例えば、この脾細胞お
よびミエローマ細胞は、数分間、非イオン性界面活性剤と合わせられ、次いで、
ハイブリッド細胞の増殖を支持するがミエローマ細胞の増殖を支持しない選択培
地上に低密度で播種され得る。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、
アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間、通常は約１〜２週間
の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一のコロニーを選択し、そして
このポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性
を有するハイブリドーマが、好ましい。

【００８２】モノクローナル抗体は、増殖するハイブリドーマコロニーの上清から単離され
得る。さらに、種々の技術（例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の
腹膜腔へのハイブリドーマ細胞株の注射）が、収量を増大するために使用され得
る。次いで、モノクローナル抗体は、腹水または血液から採取され得る。夾雑物
は、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、および抽出のような従来技術によっ
て抗体から除去され得る。本発明のポリペプチドは、例えば、アフィニティーク
ロマトグラフィー工程における精製プロセスにおいて使用され得る。

【００８３】本発明のモノクローナル抗体はまた、肺腫瘍を減少させるか、または除去する
ための治療用試薬として使用され得る。この抗体は、これら自身（例えば、転移
を阻害するために）で、または１つ以上の治療剤と結合されて使用され得る。こ
れに関して、適切な薬剤としては、放射性核種、分化のインデューサー、薬物、
毒素、およびそれらの誘導体が挙げられる。好ましい放射性核種としては、⁹⁰Ｙ
、¹²³Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、²¹¹Ａｔ、および²¹²Ｂｉが挙げら
れる。好ましい薬物としては、メトトレキサート、ならびにピリミジンアナログ
およびプリンアナログが挙げられる。好ましい分化のインデューサーとしては、
ホルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。好ましい毒素としては、リシン、
アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびヨウシュヤマゴボウ抗
ウイルスタンパク質が挙げられる。

【００８４】治療剤は、適切なモノクローナル抗体に対して直接的かまたは間接的（例えば
、リンカー基を介して）のいずれかで結合（例えば、共有結合）され得る。薬剤
と抗体との間の直接的な反応は、各々が他方と反応する能力を有する置換基を有
する場合に可能である。例えば、一方における求核基（例えばアミノ基またはス
ルフヒドリル基）は、他方におけるカルボニル含有基（例えば、無水物もしくは
酸ハロゲン化物）または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル
基と反応する能力を有し得る。

【００８５】あるいは、リンカー基を介して治療剤と抗体とを結合させることが所望され得
る。リンカー基は、結合能を妨害することを避けるために、抗体を試薬から離す
ためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体の置換
基の化学的反応性を増大するように作用し、結合効率を増大し得る。化学的反応
性における増大はまた、この増大がなければ可能ではない薬剤、または薬剤の官
能基の使用を容易にし得る。

【００８６】種々の二官能性または多官能性試薬（ホモ−およびヘテロ−官能性の両方（例
えば、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬのカ
タログに記載される試薬））がリンカー基として使用され得ることは、当業者に
明らかである。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基
、または酸化された糖残基を介して行われ得る。このような方法論（例えば、Ｒ
ｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）を記載する、多くの
参考文献が存在する。

【００８７】本発明の免疫結合体の抗体部分を有さない治療剤がより強力である場合、細胞
への内在化の間または細胞への内在化に際して切断され得るリンカー基を使用す
ることが所望され得る。多くの異なる切断され得るリンカー基が、記載されてい
る。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出に関する機構としては、ジスル
フィド結合の還元（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒに対する米国特許第４，４８９，７
１０号）、感光性結合の照射（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらに対する米国特許第４，
６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解（例えば、Ｋｏｈ
ｎらに対する米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介加水分解（例え
ば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触
媒化加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらによる米国特許４，５６９，７８９
）による切断が挙げられる。

【００８８】抗体に１より多い薬剤を結合することが、所望され得る。１つの実施態様にお
いて、薬剤の複数分子が、１つの抗体分子に結合される。別の実施態様において
、１つより多い型の薬剤が、１つの抗体に結合され得る。特定の実施態様に関わ
らず、１つより多い薬剤を有する免疫結合体は、種々の方法において調製され得
る。例えば、１つより多い薬剤は、抗体分子、またはリンカー（これは、使用さ
れ得る付着について複数の部位を提供する）に直接結合され得る。あるいは、キ
ャリアが使用され得る。

【００８９】キャリアは、直接的かまたはリンカー基を介してのいずれかの共有結合を含む
、種々の方法において薬剤を保有し得る。適切なキャリアとしては、アルブミン
のようなタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらに対する米国特許第４，５０７，２３
４号）、ペプチドおよびアミノデキストランのようなポリサッカリド（例えば、
Ｓｈｉｈらに対する米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。キャリア
はまた、非共有結合によってか、またはリポソーム小胞内へのような封入によっ
て薬剤を保有し得る（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，
８７３，０８８号）。放射性核種薬剤に特異的なキャリアとしては、放射性ハロ
ゲン化低分子およびキレート化合物が挙げられる。例えば、米国特許４，７３５
，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する
。放射性核種のキレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するた
めのドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含む化合物を含む、キレート化
合物から形成され得る。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらに対する米国特許第４，６７
３，５６２号は、代表的なキレート化合物及びそれらの合成を開示する。

【００９０】抗体および免疫結合体に対する種々の投与経路が、使用され得る。代表的には
、投与は、静脈内、筋肉内、皮下または切除された腫瘍の床においてである。抗
体／免疫結合体の正確な用量が、使用される抗体、腫瘍上の抗原の密度、および
抗体のクリアランス速度に依存して変化することは明白である。

【００９１】本発明の診断試薬はまた、１つ以上の上記のポリペプチド、または１つ以上の
その一部をコードするヌクレオチド配列を含み得る。例えば、少なくとも２つの
オリゴヌクレオチドプライマーが、生物学的サンプル由来の肺腫瘍特異的ｃＤＮ
Ａを増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおい
て使用され得る。ここで、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、
本発明の肺腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子に特異的である。
次いで、増幅されたｃＤＮＡの存在は、ゲル電気泳動のような当該分野で周知の
技術を使用して検出される。同様に、本発明の肺腫瘍タンパク質をコードするポ
リヌクレオチド分子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、生物学的サンプ
ルにおいて、本発明のポリペプチドの存在を検出するためにハイブリダイゼーシ
ョンアッセイにおいて使用され得る。

【００９２】本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド分子に特異的なオリゴ
ヌクレオチドプライマー／プローブ」は、問題のポリヌクレオチド分子に対して
少なくとも約６０％の、好ましくは少なくとも約７５％の、およびより好ましく
は少なくとも約９０％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を意味する。本
発明の診断方法において有用に使用され得るオリゴヌクレオチドプライマーおよ
び／またはプローブは、好ましくは、少なくとも約１０〜４０ヌクレオチドを有
する。好ましい実施態様において、このオリゴヌクレオチドプライマーは、配列
番号１〜１０９、１１１、１１３、１１５〜１５１、１５３、１５４、１５７、
１５８、１６０、１６２〜１６４、１６７、１６８および１７１から選択される
配列を含むポリヌクレオチド分子の、少なくとも約１０の連続するヌクレオチド
を含む。好ましくは、本発明の診断方法における使用のためのオリゴヌクレオチ
ドプローブは、配列番号１〜１０９、１１１、１１３、１１５〜１５１、１５３
、１５４、１５７、１５８、１６０、１６２〜１６４、１６７、１６８および１
７１に提供される配列を含むポリヌクレオチド分子の、少なくとも約１５の連続
するオリゴヌクレオチドを含む。ＰＣＲに基づくアッセイおよびハイブリダイゼ
ーションアッセイの両方に関する技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕ
ｌｌｉｓら、前出；Ｅｈｒｌｉｃｈ、前出を参照のこと）。従って、プライマー
またはプローブを使用して、血液、精液、肺組織および／または肺腫瘍組織を含
む、生物学的サンプル中の肺腫瘍特異的配列を検出し得る。

【００９３】以下の実施例は、例示のために提供されるものであって、限定のためではない
。

【００９４】（実施例）（実施例１）（肺腫瘍ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列の単離および特徴付け）この実施例は、肺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーからの肺腫瘍特異的ポリペプチド
をコードするｃＤＮＡ分子の単離を例示する。Ａ．肺扁平上皮癌ライブラリーからのｃＤＮＡ配列の単離ヒト肺扁平上皮癌ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、ｃＤＮＡ合成およびプラスミ
ドクローニングキット用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔ
ｅｍ（ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ
、ＭＤ）を用い、製造業者のプロトコールに従って、２人の患者組織のプール由
来のポリＡ⁺ＲＮＡから構築した。詳細には、肺癌腫組織を、ポリトロン（Ｋｉ
ｎｅｍａｔｉｃａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でホモゲナイズし、そして総ＲＮ
Ａを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用
い、製造業者が指示するように抽出した。次いで、ポリＡ⁺ＲＮＡを、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載のよう
に、オリゴｄＴセルロースカラムを用いて精製した。第１鎖ｃＤＮＡは、Ｎｏｔ
Ｉ／Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ１８プライマーを用いて合成した。２本鎖ｃＤＮＡを合成
し、ＢｓｔＸＩ／ＥｃｏＲＩアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉ
ｅｇｏ、ＣＡ）と連結し、そしてＮｏｔＩで消化した。ｃＤＮＡサイズ分画カラ
ム（ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたサイズ分画の後、
ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢｓｔＸＩ／Ｎｏｔ
Ｉ部位中に連結し、そしてエレクトロポーレーションにより、ＥｌｅｃｔｒｏＭ
ａｘＥ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ細胞（ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ）中に形質転換した。

【００９５】同じ手順を用い、正常ヒト肺ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、４つの組織標本の
プールから調製した。このｃＤＮＡライブラリーは、独立コロニーの数、挿入片
を保持するクローンのパーセント、平均挿入片サイズにより、および配列分析に
より特徴付けた。肺扁平上皮癌ライブラリーは、２．７×１０⁶の独立コロニー
を含み、１００％のクローンが挿入片を有し、そして平均挿入片サイズは、２１
００塩基対であった。正常肺ｃＤＮＡライブラリーは、１．４×１０⁶の独立コ
ロニーを含み、９０％のクローンが挿入片を有し、そして平均挿入片サイズは１
８００塩基対であった。両方のライブラリーについて、配列分析は、大部分のク
ローンが完全長のｃＤＮＡ配列を有し、そしてｍＲＮＡから合成されたことを示
した。

【００９６】ｃＤＮＡライブラリーサブトラクションを、Ｈａｒａら（Ｂｌｏｏｄ、８４：
１８９−１９９、１９９４）により記載されるように（いくらか改変して）、上
記の肺扁平上皮癌および正常肺ｃＤＮＡライブラリーを用いて実施した。より詳
細には、肺扁平上皮癌−特異的サブトラクトｃＤＮＡライブラリーを以下のよう
に生成した。正常組織ｃＤＮＡライブラリー（８０μｇ）を、ＢａｍＨＩおよび
ＸｈｏＩで消化し、次いでＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメントを用いたフ
ィルイン反応を行った。フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の
後、ＤＮＡを、１３３μｌのＨ₂Ｏ中に溶解し、熱変性し、そして１３３μｌ（
１３３μｇ）のＰｈｏｔｏｐｒｏｂｅビオチン（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と混合した。製造業者が推奨するよ
うに、得られる混合物を、氷上で２０分間２７０Ｗ太陽灯で照射した。さらなる
Ｐｈｏｔｏｐｒｏｂｅビオチン（６７μｌ）を添加し、そしてビオチン化反応を
繰り返した。ブタノールで５回抽出した後、ＤＮＡをエタノール沈殿し、そして
２３μｌのＨ₂Ｏ中に溶解し、ドライバーＤＮＡを形成した。

【００９７】トレーサーＤＮＡを形成するため、１０μｇの肺扁平上皮癌ｃＤＮＡライブラ
リーを、ＮｏｔＩおよびＳｐｅＩで消化し、フェノールクロロホルム抽出し、そ
してＣｈｒｏｍａｓｐｉｎ−４００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡ
ｌｔｏ、ＣＡ）を通過させた。代表的には、５μｇのｃＤＮＡがサイジンズカラ
ム後に回収された。エタノール沈殿の後、トレーサーＤＮＡを、５μｌＨ₂Ｏ中
に溶解した。トレーサーＤＮＡを、１５μｌのドライバーＤＮＡおよび２０μｌ
の２×ハイブリダイゼーション緩衝液（１．５ＭＮａＣｌ／１０ｍＭＥＤＴ
Ａ／５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５／０．２％ドデシル硫酸ナトリウム）と
混合し、鉱油で重層し、そして完全に熱変性した。直ちにサンプルを、６８℃の
水浴中に移し、そして２０時間インキュベートした（長ハイブリダイゼーション
［ＬＨ］）。次いで反応混合物を、ストレプトアビジン処理に供し、次いでフェ
ノール／クロロホルム抽出した。このプロセスはさらに３回以上繰り返した。サ
ブトラクトＤＮＡを沈殿し、１２μｌＨ₂Ｏ中に溶解し、８μｌドライバーＤＮ
Ａおよび２０μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液と混合し、そして６８℃
で２時間のハイブリダイゼーションに供した（短ハイブリダイゼーション［ＳＨ
］）。ビオチン化２本鎖ＤＮＡの除去の後、サブトラクトｃＤＮＡを、クロラム
フェニコール耐性ｐＢＣＳＫ^-（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃ
Ａ）のＮｏｔＩ／ＳｐｅＩ部位中に連結し、そしてエレクトロポーレーションに
よりＥｌｅｃｔｒｏＭａｘＥ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ細胞中に形質転換し、肺
扁平上皮癌特異的サブトラクトｃＤＮＡライブラリーを生成した（以後本明細書
では「肺サブトラクションＩ」と称する）。

【００９８】第２の肺扁平上皮癌特異的サブトラクトｃＤＮＡライブラリー（「肺サブトラ
クションＩＩ」と称する）を、肺サブトラクションＩからの８つの頻繁に回収さ
れた遺伝子を、ドライバーＤＮＡ中に含めたことを除いて、肺サブトラクション
ライブラリーＩと同様の方法で生成し、そして２４，０００の独立クローンを回
収した。

【００９９】サブトラクトｃＤＮＡライブラリーを分析するために、プラスミドＤＮＡを、
このサブトラクト肺扁平上皮癌特異的ライブラリーからランダムに選択した３２
０の独立クローンから調製した。代表的なｃＤＮＡクローンを、Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ／ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤｉｖｉｓｉｏｎＡｕ
ｔｏｍａｔｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅｒＭｏｄｅｌ３７３Ａおよび／またはＭ
ｏｄｅｌ３７７（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）を用いたＤＮＡ配列決定に
よりさらに特徴付けた。６０の単離されたクローンのｃＤＮＡ配列もを配列番号
１〜６０に提供する。これらの配列を、ＥＭＢＬおよびＧｅｎＢａｎｋデータベ
ース（リリース９６）を用いて遺伝子バンク中の既知配列と比較した。配列番号
２、３、１９、３８および４６に提供される配列に対しては顕著な相同性は見出
されなかった。配列番号１、６〜８、１０〜１３、１５、１７、１８、２０〜２
７、２９、３０、３２、３４〜３７、３９〜４５、４７〜４９、５１、５２、５
４、５５および５７〜５９の配列は、先に同定された発現配列タグ（ＥＳＴ）に
対して特定の相同性を示すことが見出された。配列番号９、２８、３１および３
３の配列は、先に同定された非ヒト遺伝子配列に対して特定の相同性を示すこと
が見出され、そして配列番号４、５、１４、５０、５３、５６および６０の配列
は、先にヒトで同定された遺伝子配列に対し特定の相同性を示すことが見出され
た。

【０１００】上記のサブトラクション手順を、上記の肺扁平上皮癌ｃＤＮＡライブラリーを
トレーサーＤＮＡとして、そして上記の正常肺組織ｃＤＮＡライブラリーおよび
正常肝臓および心臓からのｃＤＮＡライブラリー（上記のように各組織の１つの
サンプルのプールから構築された）、ならびに肺サブトラクションＩおよびＩＩ
中で頻繁に回収された２０の他のｃＤＮＡクローンをドライバーＤＮＡとして（
肺サブトラクションＩＩＩ）用いて繰り返した。正常肝臓および心臓ｃＤＮＡラ
イブラリーは、１．７６×１０⁶の独立コロニーを含み、その１００％のクロー
ンが挿入片を有し、そして平均挿入片サイズは１６００塩基対であった。１０の
さらなるクローンを単離した（配列番号６１−７０）。これらのｃＤＮＡ配列の
上記の遺伝子バンク中の配列との比較は、配列番号６２および６７で提供された
配列に対し有意な相同性は示さなかった。配列番号６１、６３〜６６、６８およ
び６９の配列は、先に単離されたＥＳＴに対し特定の相同性を示すことが見出さ
れ、そして配列番号７０に提供される配列は、先に同定されたラット遺伝子に対
し特定の相同性を示すことが見出された。Ｂ．肺腺癌ライブラリーからのｃＤＮＡ配列の単離ヒト肺腺癌ｃＤＮＡ発現ライブラリーを上記のように構築した。このライブラ
リーは、３．２×１０⁶の独立コロニーを含み、１００％のクローンが挿入片を
有し、そして平均挿入片サイズは１５００塩基対であった。ライブラリーサブト
ラクションを、上記の正常肺および正常肝臓および心臓ｃＤＮＡ発現ライブラリ
ーをドライバーＤＮＡとして用いて上記のように実施した。２６００の独立クロ
ーンを回収した。

【０１０１】１００の独立クローンからの初期ｃＤＮＡ配列分析は、多くのリボソームタン
パク質遺伝子を示した。このサブトラクション中で単離された１５のクローンの
ｃＤＮＡ配列を配列番号７１〜８６に提供する。これらの配列の上記の遺伝子バ
ンク中の配列との比較は、配列番号８４に提供される配列に対して有意な相同性
は示さなかった。配列番号７１、７３、７４、７７、７８および８０〜８２は、
先に単離されたＥＳＴに対して特定の相同性を示すことが見出され、そして配列
番号７２、７５、７６、７９、８３および８５は、先に同定されたヒト遺伝子に
対して特定の相同性を示すことが見出された。

【０１０２】（実施例２）肺腫瘍ポリペプチドの組織特異性の決定遺伝子特異的プライマーを用い、実施例１に記載された７つの代表的肺腫瘍ポ
リペプチドのｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲを用いて種々の正常および腫
瘍組織中で調べた。

【０１０３】簡単に述べれば、総ＲＮＡを、上記のようにＴｒｉｚｏｌ試薬を用い、種々の
正常および腫瘍組織から抽出した。第１鎖合成は、２μｇの総ＲＮＡをＳｕｐｅ
ｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）を用い、４２℃で１時間実施した。次いでｃＤＮＡを、ＰＣＲにより遺伝子特
異的プライマーを用いて増幅した。ＲＴ−ＰＣＲの半定量的性質を確実にするた
めに、βアクチンを、調べた組織の各々に対する内部コントロールとして用いた
。１μｌのｃＤＮＡの１：３０希釈を採用し、βアクチンテンプレートの直線範
囲増幅を可能にし、そして初期コロニー数における差異を反映するに十分高感度
であった。これらの条件を用い、βアクチンレベルを、各組織からの各逆転写反
応について測定した。ＤＮＡ汚染は、ＤＮａｓｅ処理により、および逆転写酵素
を添加することなく調製された第１鎖ｃＤＮＡを用いる場合、ネガティブＰＣＲ
結果を保証することにより最少とした。

【０１０４】ｍＲＮＡ発現レベルを、５つの異なるタイプの腫瘍組織（３人の患者からの肺
扁平上皮癌、肺腺癌、２人の患者からの結腸腫瘍、乳癌および前立腺癌）、およ
び１３の異なる正常組織（４人のドナーからの肺、前立腺、脳、腎臓、肝臓、卵
巣、骨格筋、皮膚、小腸、胃、心筋、網膜および精巣）中で調べた。１０倍量の
ｃＤＮＡを用い、抗原ＬＳＴ−Ｓ１−９０（配列番号３）が、肺扁平上皮癌中お
よび乳腫瘍中で高レベルで発現され、そして調べたその他の組織では低〜検出不
能レベルで発現されることが見出された。

【０１０５】抗原ＬＳＴ−Ｓ２−６８（配列番号１５）は、肺および乳腫瘍に特異的である
ように見えたが、正常腎臓においてもまた発現が検出された。抗原ＬＳＴ−Ｓ１
−１６９（配列番号６）およびＬＳＴ−Ｓ１−１３３（配列番号５）は、肺組織
（正常および腫瘍の両方）で非常に豊富であるように見え、これら２つの遺伝子
の発現は、試験した大部分の正常組織中では減少していた。ＬＳＴ−Ｓ１−１６
９およびＬＳＴ−Ｓ１−１３３の両者もまた、乳および結腸腫瘍で発現された。
抗原ＬＳＴ−Ｓ１−６（配列番号７）およびＬＳＴ−Ｓ２−Ｉ２−５Ｆ（配列番
号４７）は、腫瘍または組織特異的発現は示さず、ＬＳＴ−Ｓ１−２８の発現は
稀であり、そして２〜３の組織で検出可能に過ぎなかった。抗原ＬＳＴ−Ｓ３−
７（配列番号６３）は、肺および乳腫瘍特異的発現を示し、そのメッセージは、
ＰＣＲを３０サイクル実施した場合に正常精巣中で検出されるに過ぎなかった。
サイクル数を３５まで増加した場合、いくつかの正常組織中でより低いレベルの
発現が検出された。抗原ＬＳＴ−Ｓ３−１３（配列番号６６）は、４つの肺腫瘍
のうち３つ、１つの乳腫瘍および両方の結腸腫瘍サンプルで発現されることが見
出された。正常組織におけるその発現は、腫瘍と比較してより低く、そして４つ
の正常肺組織のうちの１つ、および腎臓、卵巣および網膜からの正常組織で検出
されたに過ぎなかった。抗原ＬＳＴ−Ｓ３−４（配列番号６２）およびＬＳＴ−
Ｓ３−１４（配列番号６７）の発現は稀であり、そして任意の組織または腫瘍特
異性を示さなかった。ノザンブロット分析と一致して、抗原ＬＡＴ−Ｓ１−Ａ−
１０Ａ（配列番号７８）に関するＲＴ−ＰＣＲ結果は、その発現が、肺および結
腸腫瘍を含む、肺、結腸、胃および小腸組織で高いことを示唆し、その一方その
発現は、他の組織では低いか検出不能であった。

【０１０６】上記の肺サブトラクションＩ、ＩＩおよびＩＩＩ中で単離された合計２００２
のｃＤＮＡフラグメントを、コロニーＰＣＲ増幅し、そして肺腫瘍、正常肺、お
よび種々のその他の正常組織および腫瘍組織中のそれらのｍＲＮＡ発現レベルを
、ミクロアレイ技術（Ｓｙｎｔｅｎｉ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）を用いて測
定した。簡単に述べれば、ＰＣＲ増幅産物を、各産物がアレイ中の特有の位置を
占めるように、アレイ形式でスライド上にブロットした。ｍＲＮＡを、試験され
る組織サンプルから抽出し、逆転写し、そして蛍光標識されたｃＤＮＡプローブ
を生成した。ミクロアレイを、標識ｃＤＮＡプローブでプローブし、スライドを
走査し、そして蛍光強度を測定した。この強度は、ハイブリダイゼーション強度
と相関する。１７の非縮重ｃＤＮＡクローンは、肺扁平上皮腫瘍で過剰発現を示
し、試験された正常組織（肺、皮膚、リンパ節、結腸、肝臓、膵臓、乳、心臓、
骨髄、大腸、腎臓、胃、脳、小腸、膀胱および唾液腺）における発現は、検出不
能であるか、または肺扁平上皮腫瘍に比較して１０倍より少なかった。クローン
Ｌ５１３Ｓの決定された部分ｃＤＮＡ配列を配列番号８７および８８に提供し；
Ｌ５１４Ｓのそれを配列番号８９および９０に提供し；Ｌ５１６Ｓのそれを配列
番号９１および９２に；Ｌ５１７Ｓのそれを配列番号９３に；Ｌ５１９Ｓのそれ
を配列番号９４に；Ｌ５２０Ｓのそれを配列番号９５および９６に；Ｌ５２１Ｓ
のそれを配列番号９７および９８に；Ｌ５２２Ｓのそれを配列番号９９に；Ｌ５
２３Ｓのそれを配列番号１００に；Ｌ５２４Ｓのそれを配列番号１０１に；Ｌ５
２５Ｓのそれを配列番号１０２に；Ｌ５２６Ｓのそれを配列番号１０３に；Ｌ５
２７Ｓのそれを配列番号１０４に；Ｌ５２８Ｓのそれを配列番号１０５に；Ｌ５
２９Ｓのそれを配列番号１０６に；ならびに、Ｌ５３０Ｓのそれを配列番号１０
７および１０８に提供する。さらに、Ｌ５０３ＳおよびＬ５１４Ｓ（改変体１お
よび２）の完全長ｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号１５１、１５３および１５
４に提供し、対応する推定アミノ酸配列は、配列番号１５２、１５５および１５
６に提供される。多形性に起因して、クローンＬ５３１Ｓは２つの形態を有する
ようである。第１番目に決定されたＬ５３１Ｓの完全長ｃＤＮＡ配列を配列番号
１０９に提供し、対応する推定アミノ酸配列は配列番号１１０に提供される。第
２番目に決定されたＬ５３１Ｓの完全長ｃＤＮＡ配列は配列番号１１１に提供さ
れ、対応する推定アミノ酸配列は配列番号１１２に提供される。配列番号１１１
の配列は、それが２７ｂｐの挿入片を含むことを除いて、配列番号１０９のそれ
と同じである。同様に、Ｌ５１４Ｓもまた２つのオルタナティブスプライス形態
を有し；第１番目の改変体ｃＤＮＡは配列番号１５３として列挙され、対応する
アミノ酸配列は配列番号１５５である。Ｌ５１４Ｓ完全長ｃＤＮＡの第２番目の
改変体形態は、配列番号１５４として言及され、その対応するアミノ酸配列は配
列番号１５６である。

【０１０７】Ｌ５２４Ｓ（配列番号１０１）についての全長クローニングは、それぞれ対応
する推定アミノ酸配列（配列番号１６５および１６６）を有する２つの改変体（
配列番号１６３および１６４）を生じた。両方の改変体は、副甲状腺ホルモン関
連ペプチドをコードすることが示された。

【０１０８】上記の、Ｌ５１４ＳおよびＬ５３１Ｓ（それぞれ、配列番号８７および８８、
８９および９０、ならびに１０９）の配列とジーンバンク中の配列との比較は、
公知の配列に対する有意な相同性を示さなかった。Ｌ５１３Ｓ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ
５１７Ｓ、Ｌ５１９Ｓ、Ｌ５２０ＳおよびＬ５３０Ｓの配列（それぞれ、配列番
号８７および８８、９１および９２、９３，９４、９５および９６、１０７およ
び１０８）は、以前に同定されたＥＳＴに対して幾分の相同性を示すことが見出
された。Ｌ５２１Ｓ、Ｌ５２２Ｓ、Ｌ５２３Ｓ、Ｌ５２４Ｓ、Ｌ５２５Ｓ、Ｌ５
２６Ｓ、Ｌ５２７Ｓ、Ｌ５２８ＳおよびＬ５２９Ｓ（それぞれ、配列番号９７お
よび９８、９９、９９、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５および１０６
）は、公知の遺伝子を表すことが見出された。Ｌ５２０Ｓについて決定された全
長ｃＤＮＡ配列を配列番号１１３に提供し、対応する推定アミノ酸配列を配列番
号１１４に提供する。引き続いてのマイクロアレイ分析は、Ｌ５２０Ｓが、肺扁
平上皮腫瘍に加えて乳房腫瘍において過剰発現されることを示した。

【０１０９】さらなる分析によって、Ｌ５２９Ｓ（配列番号１０６および１１５）、Ｌ５２
５Ｓ（配列番号１０２および１２０）、およびＬ５２７Ｓ（配列番号１０４）が
、細胞骨格成分であり、そして潜在的に扁平上皮細胞特異的タンパク質であるこ
とが実証された。Ｌ５２９Ｓは、コネキシン２６（ギャップ結合タンパク質）で
ある。Ｌ５２９Ｓは、肺扁平上皮腫瘍９６８８Ｔにおいて高度に発現され、そし
て２つの他のものにおいては中程度に過剰発現される。しかし、コネキシン２６
のより低いレベルの発現もまた、正常な皮膚、結腸、肝臓、および胃において検
出可能である。いくつかの乳房腫瘍におけるコネキシン２６の過剰発現が報告さ
れており、そしてＬ５２９Ｓの変異形態は、肺腫瘍における過剰発現を生じ得る
。Ｌ５２５Ｓは、プラコフィリン１（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ１）（皮膚の斑保
有接着結合において見出されるデスモソームタンパク質）である。Ｌ５２５Ｓ
ｍＲＮＡについての発現レベルは、試験された４つの肺扁平上皮腫瘍のうちの３
つおよび正常な皮膚において高度に上昇される。Ｌ５２７Ｓは、ケラチン６イソ
型、ＩＩ型５８ｋｄケラチン、およびサイトケラチン１３として同定され、そし
て扁平上皮腫瘍における過剰発現、ならびに正常な皮膚組織、乳房組織および結
腸組織における低い発現を示す。特に、ケラチンおよびケラチン関連遺伝子は、
ＣＹＦＲＡ２．１を含む肺癌についての潜在的なマーカーとして広く実証されて
いる（Ｐａｓｔｏｒ，Ａ．ら、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．、１０：６０３〜６
０９、１９９７）。Ｌ５１３Ｓ（配列番号８７および８８）は、試験されたいく
つかの腫瘍組織における中程度の過剰発現を示し、そして尋常性天疱瘡抗原とし
て最初に単離されたタンパク質をコードする。

【０１１０】Ｌ５２０Ｓ（配列番号９５および９６）およびＬ５２１Ｓ（配列番号９７およ
び９８）は肺扁平上皮腫瘍において高度に発現され、そしてＬ５２０Ｓは正常な
唾液腺においてアップレギュレートされ、そしてＬ５２１Ｓは正常な皮膚におい
て過剰発現される。両方とも、小さなプロリンリッチタンパク質のファミリーに
属し、そして十分に分化された扁平上皮細胞についてのマーカーを表す。Ｌ５２
１Ｓは、肺扁平上皮腫瘍についての特定のマーカーとして記載されている（Ｈｕ
，Ｒ．ら、ＬｕｎｇＣａｎｃｅｒ、２０：２５〜３０、１９９８）。Ｌ５１５
Ｓ（配列番号１６２）は、ＩＧＦ−β２をコードし、そしてＬ５１６Ｓはアルド
ースレダクターゼホモログであり、そして両方とも、肺扁平上皮腫瘍および正常
な結腸において中程度に発現される。特に、Ｌ５１６Ｓ（配列番号９１および９
２）は、転移性腫瘍においてアップレギュレートされるが、原発性肺腺癌におい
てはアップレギュレートされず、転移におけるその潜在的な役割の指標および潜
在的な予後マーカーである。Ｌ５２２Ｓ（配列番号９９）は、肺扁平上皮腫瘍に
おいて中程度に過剰発現され、正常な組織においては最小の発現である。Ｌ５２
２Ｓは、クラスＩＶアルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ７に属することが示され
、そしてその発現プロフィールは、それが扁平上皮細胞特異的抗原であることを
示唆する。Ｌ５２３Ｓ（配列番号１００）は、肺扁平上皮腫瘍、ヒト膵臓癌細胞
株、および膵臓癌組織において中程度に過剰発現され、このことは、この遺伝子
が、膵臓細胞癌（と肺扁平上皮細胞癌との間に共有される抗原であり得ることを
示唆する。

【０１１１】Ｌ５２４Ｓ（配列番号１０１）は、試験される扁平上皮腫瘍の大部分において
過剰発現され、そして白血病、前立腺癌および乳癌のような悪性腫瘍と関連する
体液性高カルシウム血症（ｈｕｍｏｒａｌｈｙｐｅｒｃａｌｃａｅｍｉａ）を
引き起こすことが最も知られている副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ
）と相同である。ＰＴＨｒＰは、肺の扁平上皮癌と最も一般に関連し、そして肺
腺腫とまれに関連するともまた考えられている（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｌ．Ａ．ら
、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１７８：３９８〜４０１、１９９６）。Ｌ５２８Ｓ（配
列番号１０５）は、２つの肺扁平上皮腫瘍において高度に過剰発現され、２つの
他の扁平上皮腫瘍、１つの肺腺腫およびいくつかの正常な組織（皮膚、リンパ節
、心臓、胃および肺を含む）において中程度に発現される。Ｌ５２８Ｓは、メラ
ノサイト特異的遺伝子Ｐｍｅｌ１７（これは、低い転移能の黒色腫細胞株におい
て優先的に発現されることが報告されている）の前駆体に類似しているＮＭＢ遺
伝子をコードする。このことは、Ｌ５２８Ｓが、黒色腫および肺扁平上皮（ａｑ
ｕａｍｏｕｓ）細胞癌の両方において共有される抗原であり得ることを示唆する
。Ｌ５２６Ｓ（配列番号１０３）は、試験されるすべての肺扁平上皮細胞腫瘍組
織において過剰発現され、そして変異が毛細血管拡張性運動失調（他の症状の中
でもとりわけ、癌への傾向を生じるヒトにおける遺伝子障害）を生じる遺伝子（
ＡＴＭ）との相同性を共有することが示されている。ＡＴＭは、ｐ５３分子の直
接的な結合およびリン酸化を介してｐ５３媒介細胞周期チェックポイントを活性
化するタンパク質をコードする。肺癌の約４０％は、ｐ５３変異と関連し、そし
てＡＴＭの過剰発現が、ｐ５３機能の欠失の補償の結果であると推測されるが、
過剰発現が肺扁平上皮細胞癌の結果の原因であるか否かは知られていない。さら
に、Ｌ５２６Ｓ（ＡＴＭ）の発現はまた、転移性のものにおいては検出されるが
、肺腺癌においては検出されず、このことは、転移における役割を示唆する。

【０１１２】（実施例３ＰＣＲに基づく差し引きによる肺腫瘍ポリペプチドの単離および
特徴付け）肺、ＰＢＭＣ、脳、心臓、腎臓、肝臓、膵臓および皮膚を含む、８つの正常な
ヒト組織ｃＤＮＡから差し引き（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）した２つのヒト肺扁平
上皮腫瘍のプール由来のｃＤＮＡを含む、ｃＤＮＡサブトラクションライブラリ
ー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）由来の８５７クローンを誘
導し、そして第１回のＰＣＲ増幅に供した。このライブラリーを、製造業者のプ
ロトコルに従って、第２回のＰＣＲ増幅に供した。得られたｃＤＮＡフラグメン
トを、ベクターＰ７−Ａｄｖベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ
，ＣＡ）にサブクローニングし、そしてＤＨ５α Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｇｉｂｃｏ、
ＢＲＬ）に形質転換した。ＤＮＡを、個々のクローンから単離し、そしてＰｅｒ
ｋｉｎＥｌｍｅｒ／ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤｉｖｉｓｉｏ
ｎＡｕｔｏｍａｔｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅｒＭｏｄｅｌ３７３Ａを用いて
配列決定した。

【０１１３】１６２の陽性クローンを配列決定した。上記のとおり、ＥＭＢＬおよびＧｅｎ
Ｂａｎｋデータベースを使用する、ジーンバンク中の配列とこれらのクローンの
ＤＮＡ配列との比較は、これらのクローンのうちの１３（本明細書中以後、コン
ティグ１３、１６、１７、１９、２２、２４、２９、４７、４９、５６〜５９と
呼ぶ）に対して有意な相同性を示さなかった。これらのクローンについて決定さ
れたｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号１２５、１２７〜１２９、１３１〜１３
３、１４２、１４４、１４８〜１５０および１５７で提供する。コンティグ１、
３〜５、７〜１０、１２、１１、１５、２０、３１、３３、３８、３９、４１、
４３、４４、４５、４８、５０、５３、５４（それぞれ、配列番号１１５〜１２
４、１２６、１３０、１３４〜１４１、１４３、１４５〜１４７）は、以前に同
定されたＤＮＡ配列に対して幾分の程度の相同性を示すことが見出された。コン
ティグ５７（配列番号１４９）は、米国特許出願番号第０９／１２３，９１２号
（１９９８年７月２７日出願）に開示されるクローンＬ５１９Ｓ（配列番号９４
）を表すことが見出された。発明者の知る限り、これらの配列のいずれも、肺腫
瘍において示差的に過剰発現されることは以前に示されていない。

【０１１４】肺腫瘍組織、正常な肺組織（ｎ＝４）、休止ＰＢＭＣ、唾液腺、心臓、胃、リ
ンパ節、骨格筋、軟口蓋、小腸、大腸、気管支、膀胱、扁桃、腎臓、食道、骨髄
、結腸、副腎、膵臓、および皮膚（すべて、ヒト由来）における代表的なクロー
ンについてのｍＲＮＡ発現レベルを、上記のようにＲＴ−ＰＣＲによって決定し
た。上記のようなマイクロアレイ技術を使用する発現レベルを、他に示さない限
り各組織型の１つのサンプルにおいて試験した。

【０１１５】コンティグ３（配列番号１１６）は、試験されたすべての頭部および頸部の扁
平上皮細胞腫瘍において高度に発現され（１７／１７）、そして肺扁平上皮腫瘍
の大部分（８／１２）において発現される（７／１２において高度な発現、２／
１２において中程度、２／１２において低い程度）ことが見出されたが、２／４
の正常な肺組織については陰性発現、そして残りの２つのサンプルにおいては低
い発現を示す。コンティグ３は、皮膚および軟口蓋において中程度の発現、そし
て休止ＰＢＭＣ、大腸、唾液腺、扁桃、膵臓、食道、および結腸において減少し
た発現レベルを示した。コンティグ１１（配列番号１２４）は、試験されたすべ
ての頭部および頸部扁平上皮細胞腫瘍（１７／１７）において発現され；１４／
１７において高度に発現され、そして３／１７において中程度に発現されること
が見出された。さらに、肺扁平上皮腫瘍における発現は、３／１２において高度
の発現、および４／１２において中程度の発現を示した。コンティグ１１は、３
／４の正常な肺サンプルについて陰性であったが、残りのサンプルは、低い程度
の発現のみを有した。コンティグ１１は、唾液腺、軟口蓋、膀胱、扁桃、皮膚、
食道、および大腸に対して、低い程度〜中程度の反応性を示した。コンティグ１
３（配列番号１２５）は、試験されたすべての頭部および頸部扁平上皮細胞腫瘍
（１７／１７）において発現され；１２／１７において高度に発現され、そして
５／１７において中程度に発現されることが見出された。コンティグ１３は、７
／１２の肺扁平上皮腫瘍において発現され、４／１２において高度な発現、３つ
のサンプルにおいて中程度の発現であった。正常な肺サンプルの分析は、２／４
について陰性発現を示し、残りの２つのサンプルにおいて低い程度〜中程度の発
現を示した。コンティグ１３は、休止ＰＢＭＣ、唾液腺、膀胱、膵臓、扁桃、皮
膚、食道、および大腸に対して低い程度〜中程度の反応性、ならびに軟口蓋にお
いて高度の発現を示した。コンティグ１６（配列番号１２７）は、いくつかの頭
部および頸部扁平上皮細胞腫瘍（６／１７）および１つの肺扁平上皮腫瘍におい
て中程度に発現されることが見出されたが；試験されたいかなる正常な肺サンプ
ルにおいても発現を示さなかった。コンティグ１６は、休止ＰＢＭＣ、大腸、皮
膚、唾液腺、および軟口蓋に対して低い程度の反応性を示した。コンティグ１７
（配列番号１２８）は、試験されたすべての頭部および頸部扁平上皮細胞腫瘍（
１７／１７）において発現され；５／１７において高度に発現され、そして１２
／１７において中程度に発現されることが示された。肺扁平上皮腫瘍における発
現レベルは、高度の発現を有する１つの腫瘍サンプル、および中程度のレベルを
有する３／１２を示した。コンティグ１７は、２／４の正常な肺サンプルについ
て陰性であり、残りのサンプルは、低い程度の発現のみを有した。さらに、低い
レベルの発現は、食道および軟口蓋において見出された。コンティグ１９（配列
番号１２９）は、試験されたほとんどの頭部および頸部扁平上皮細胞腫瘍におい
て発現され（１１／１７）；２つのサンプルは高いレベルを有し、６／１７は中
程度の発現を示し、そして低い発現が３／１７において見られることが見出され
た。肺扁平上皮腫瘍における試験は、３／１２サンプルにおいて中程度の発現の
みを示した。正常な肺サンプルの２／４における発現レベルは、陰性であり、他
の２つのサンプルは低い発現のみを有した。コンティグ１９は、食道、休止ＰＢ
ＭＣ、唾液腺、膀胱、軟口蓋、および膵臓において低い発現レベルを示した。

【０１１６】コンティグ２２（配列番号１３１）は、試験された頭部および頸部の扁平上皮
細胞腫瘍のほとんど（１３／１７）において発現され、これらのサンプルのうち
の４つにおいては高度の発現、６／１７においては中程度の発現、そして３／１
７においては低い発現であることが示された。肺扁平上皮腫瘍における発現レベ
ルは、試験された組織の３／１２について中程度〜高度であり、２つの正常な肺
サンプルにおいて陰性発現であり、そして２つの他のサンプルにおいて低い発現
であることが見出された（ｎ＝４）。コンティグ２２は、皮膚、唾液腺、および
軟口蓋において低い発現を示した。同様に、コンティグ２４（配列番号１３２）
は、試験された頭部および頸部の扁平上皮細胞腫瘍のほとんど（１３／１７）に
おいて発現され、これらのサンプルのうちの３つにおいては高度の発現、６／１
７においては中程度の発現、そして４／１７においては低い発現であることが見
出された。肺扁平上皮腫瘍における発現レベルは、試験された組織の３／１２に
ついて中程度〜高度であり、３つの正常な肺サンプルにおいて陰性発現であり、
そして１つのサンプルにおいて低い発現であることが見出された（ｎ＝４）。コ
ンティグ２４は、皮膚、唾液腺、および軟口蓋において低い発現を示した。コン
ティグ２９（配列番号１３３）は、試験された頭部および頸部扁平上皮細胞腫瘍
のほぼすべて（１６／１７）において発現され；４／１７において高度に発現さ
れ、１１／１７において中程度に発現され、１つのサンプルにおいて低い発現で
あった。また、コンティグ２９は、３／１２の肺扁平上皮腫瘍において中程度に
発現されたが、２／４の正常な肺サンプルについては陰性であった。コンティグ
２９は、大腸、皮膚、唾液腺、膵臓、扁桃、心臓および軟口蓋において低い〜中
程度の発現を示した。コンティグ４７（配列番号１４２）は、試験された頭部お
よび頸部扁平上皮細胞腫瘍のほとんど（１２／１７）において発現され；１０／
１７において中程度の発現、２つのサンプルにおいて低い発現であった。肺扁平
上皮腫瘍において、コンティグ４７は、１つのサンプルにおいて高度に発現され
、そして２つの他のサンプルにおいて中程度に発現された（ｎ＝１３）。コンテ
ィグ４７は、２／４の正常な肺サンプルについて陰性であったが、残りの２つの
サンプルは中程度の発現を有した。また、コンティグ４７は、大腸および膵臓に
おいて中程度の発現、そして皮膚、唾液腺、軟口蓋、胃、膀胱、休止ＰＢＭＣお
よび扁桃において低い発現を示した。

【０１１７】コンティグ４８（配列番号１４３）は、試験された頭部および頸部扁平上皮細
胞腫瘍のすべて（１７／１７）において発現され；８／１７において高度に発現
され、そして７／１７において中程度に発現され、２つのサンプルにおいて低い
発現であった。肺扁平上皮腫瘍における発現レベルは、３つのサンプルにおいて
高度〜中程度であった（ｎ＝１３）。コンティグ４８は、４つの正常な肺サンプ
ルの中の１つについて陰性であったが、残りのサンプルは低い程度または中程度
の発現を示した。コンティグ４８は、軟口蓋、大腸、膵臓および膀胱において中
程度の発現、そして食道、唾液腺、休止ＰＢＭＣおよび心臓において低い発現を
示した。コンティグ４９（配列番号１４４）は、試験された頭部および頸部扁平
上皮腫瘍の６／１７において、低い〜中程度のレベルで発現された。肺扁平上皮
腫瘍における発現レベルは、３つのサンプルにおいて中程度であった（ｎ＝１３
）。コンティグ４９は、２／４の正常な肺サンプルについて陰性であったが、残
りのサンプルは低い発現を示した。皮膚、唾液腺、大腸、膵臓、膀胱および休止
ＰＢＭＣにおいて中程度の発現レベル、ならびに軟口蓋、リンパ節および扁桃に
おいて低い発現が示された。コンティグ５６（配列番号１４８）は、試験された
頭部および頸部扁平上皮腫瘍の３／１７、および肺扁平上皮腫瘍において低い〜
中程度のレベルで発現され、１３のサンプルのうちの３つにおいて低い〜中程度
のレベルを示した。特に、１つの腺癌肺腫瘍サンプルにおいて、低い発現レベル
が検出された（ｎ＝２）。コンティグ５６は、３／４の正常な肺サンプルについ
て陰性であり、そして大腸においてのみ中程度の発現レベル、そして唾液腺、軟
口蓋、膵臓、膀胱および休止ＰＢＭＣにおいて低い発現を示した。コンティグ５
８（Ｌ７６９Ｐとしてもまた知られる）（配列番号１５０）は、試験された頭部
および頸部扁平上皮細胞腫瘍の１１／１７において中程度のレベルで発現され、
１つのさらなるサンプルにおいて低い発現であった。肺扁平上皮腫瘍における発
現は、１３のサンプルのうちの３つにおいて低い〜中程度のレベルを示した。コ
ンティグ５８は、３／４の正常な肺サンプルについて陰性であり、１つのサンプ
ルは低い発現を有した。皮膚、大腸および休止ＰＢＭＣにおける中程度の発現レ
ベル、ならびに唾液腺、軟口蓋、膵臓および膀胱における低い発現が実証された
。コンティグ５９（配列番号１５７）は、いくつかの頭部、頸部、および肺扁平
上皮腫瘍において発現された。コンティグ５９の低いレベルの発現もまた、唾液
腺および大腸において検出された。

【０１１８】さらに、コンティグ２２（Ｌ７６３Ｐと呼ばれる）についての全長ｃＤＮＡ配
列を、配列番号１５８に提供し、対応する推定アミノ酸配列を配列番号１５９に
提供する。また、コンティグ１７、１９および２４（Ｌ７６２Ｐという）を組み
込む全長ｃＤＮＡ配列を配列番号１６０に提供し、対応する推定アミノ酸配列を
配列番号１６１に提供する．Ｌ７６２Ｐのさらなる分析によって、Ｌ７６２Ｐが
Ｉ型膜タンパク質であると決定され、そして２つのさらなる改変体を配列決定し
た。改変体１（配列番号１６７および配列番号１６９（対応するアミノ酸配列）
）は、配列番号１６０の選択的スプライシング形態であり、５０３ヌクレオチド
の欠失、ならびに発現されるタンパク質の短いセグメントの欠失を生じる。改変
体２（配列番号１６８および配列番号１７０（対応するアミノ酸配列））は、配
列番号１６０と比較して３’コード領域に２つのヌクレオチド欠失を有し、発現
されるタンパク質の分泌形態を生じる。

【０１１９】コンティグ５６（配列番号１４８）（Ｌ７７３Ｐと呼ぶ）についての全長ｃＤ
ＮＡ配列を、配列番号１７１に、推定アミノ酸配列を配列番号１７２に提供する
。Ｌ７７３Ｐの引き続いてのノーザンブロット分析によって、この転写物が、扁
平上皮腫瘍において示差的に過剰発現され、そして原発性肺腫瘍組織において約
１．６Ｋｂ、そして原発性頭部および頸部腫瘍組織において約１．３Ｋｂで検出
されることが実証される。

【０１２０】引き続いてのマイクロアレイ分析によって、コンティグ５８（Ｌ７６９Ｓとも
呼ぶ）（配列番号１５０）が、肺扁平上皮腫瘍に加えて乳房腫瘍において過剰発
現されることが示された。

【０１２１】（実施例４ポリペプチドの合成）ポリペプチドは、ＨＰＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−
テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ
ｕｒｏｎｉｕｍｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ））活性化とともに
ＦＭＯＣ化学を使用する、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓＤｉｖｉｓｉｏｎ４３０Ａペプチド合成機で合成され得る。
Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ配列をペプチドのアミノ末端に結合し、ペプチドの結合
体化、固定化表面へのペプチドの結合、またはペプチドの標識化の方法を提供し
得る。固体支持体からのペプチドの切断を、以下の切断混合物を使用して行い得
る：トリフルオロ酢酸：エタンジチオール：チオアニソール：水：フェノール（
４０：１：２：２：３）。２時間の切断後に、ペプチドを、冷メチル−ｔ−ブチ
ル−エーテル中に沈降し得る。次いで、ペプチドペレットを、０．１％のトリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水中に溶解し、そしてＣ１８逆相ＨＰＬＣによる精
製前に凍結乾燥し得る。水（０．１％ＴＦＡを含む）中での０％から６０％のア
セトニトリル（０．１％ＴＦＡを含む）の勾配を使用して、ペプチドを溶出し得
る。純粋な画分の凍結乾燥後に、このペプチドを、電気スプレー（ｅｌｅｃｔｒ
ｏｓｐｒａｙ）または他の型の質量分析法を用いて、そしてアミノ酸分析によっ
て特徴付けし得る。

【０１２２】前述から、本発明の特定の実施態様が例示の目的のために記載されているが、
種々の改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが
理解される。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ０８５ 39/39 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８６ 48/00 16/18 ４Ｃ０８７Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｈ０４５Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 16/18 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｎ 1/21 33/574 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｑ 1/68 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/574 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/02 37/04 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号０９／１２３，９１２ (32)優先日平成10年７月27日(1998．7．27) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０９／１２３，９３３ (32)優先日平成10年７月27日(1998．7．27) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA31 BA41 CA01 CA07 DA02 DA06 DA12 FA06 HA12 HA15 4B063 QA19 QQ02 QQ53 QQ79 QQ96 QR32 QR48 QR55 QR72 QR82 QS25 QS33 QS34 QX02 4B064 AG01 AG27 CA02 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 DA14 4B065 AA26X AA72X AA90X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA45 CA46 4C084 AA01 AA07 AA13 BA41 ZB092 ZB262 4C085 AA03 BB01 EE06 FF24 GG02 GG03 GG04 GG05 4C086 AA01 AA02 MA01 MA04 ZB09 ZB26 4C087 AA01 AA02 AA03 BB37 BB64 NA10 ZB09 ZB26 4H045 AA10 AA30 BA10 CA41 EA28 EA51 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】単離されたポリヌクレオチド分子であって、以下：（ａ）配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２
、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３
、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１
、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４
、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６７、１６８
および１７１に提供される配列；（ｂ）配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２
、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３
、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１
、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４
、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６７、１６８
および１７１に提供される配列の相補体；ならびに（ｃ）中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）または（ｂ）の配列にハ
イブリダイズする配列、からなる群から選択される、ヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオ
チド分子。
【請求項２】肺腫瘍タンパク質またはその改変体の免疫原性部分を含む単
離されたポリペプチドであって、該タンパク質が請求項１に記載のポリヌクレオ
チド分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項３】請求項２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４】請求項１または３に記載の単離されたポリヌクレオチド分子
を含む、発現ベクター。
【請求項５】請求項４に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞
。
【請求項６】前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母および哺乳動物細胞株
からなる群から選択される、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】請求項２に記載のポリペプチドおよび生理的に受容可能なキ
ャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項８】請求項２に記載のポリペプチドおよび非特異的免疫応答エン
ハンサーを含む、ワクチン。
【請求項９】前記非特異的免疫応答エンハンサーがアジュバントである、
請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】請求項１または３に記載の単離されたポリヌクレオチド分
子および非特異的免疫応答エンハンサーを含む、ワクチン。
【請求項１１】前記非特異的免疫応答エンハンサーがアジュバントである
、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】ポリペプチドおよび生理的に受容可能なキャリアを含む肺
癌の処置のための薬学的組成物であって、該ポリペプチドが、肺タンパク質また
はその改変体の免疫原性部分を含み、ここで該タンパク質が、以下：（ａ）配列番号４、５、９、１４、２８、３１、３３、５０、５３、５６、６
０、７０、７２、７５、７６、７９、８３、８５、９７〜１０６、１１５〜１２
４、１２６、１３０、１３４〜１４１、１４３、１４５〜１４７および１６２〜
１６４に示される配列；（ｂ）配列番号４、５、９、１４、２８、３１、３３、５０、５３、５６、６
０、７０、７２、７５、７６、７９、８３、８５、９７〜１０６、１１５〜１２
４、１２６、１３０、１３４〜１４１、１４３、１４５〜１４７および１６２〜
１６４の配列に相補的な配列；ならびに（ｃ）中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）または（ｂ）の配列にハ
イブリダイズする配列、からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド分子によりコードされる
アミノ酸配列を包含する、薬学的組成物。
【請求項１３】ポリペプチドおよび非特異的免疫応答エンハンサー含む肺
癌の処置のためのワクチンであって、該ポリペプチドが、肺タンパク質またはそ
の改変体の免疫原性部分を含み、ここで該タンパク質が、以下：（ａ）配列番号４、５、９、１４、２８、３１、３３、５０、５３、５６、６
０、７０、７２、７５、７６、７９、８３、８５、９７〜１０６、１１５〜１２
４、１２６、１３０、１３４〜１４１、１４３、１４５〜１４７および１６２〜
１６４に示される配列；（ｂ）配列番号４、５、９、１４、２８、３１、３３、５０、５３、５６、６
０、７０、７２、７５、７６、７９、８３、８５、９７〜１０６、１１５〜１２
４、１２６、１３０、１３４〜１４１、１４３、１４５〜１４７および１６２〜
１６４の配列に相補的な配列；ならびに（ｃ）中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）または（ｂ）の配列にハ
イブリダイズする配列、からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド分子によりコードされる
アミノ酸配列を包含する、ワクチン。
【請求項１４】ＤＮＡ分子および非特異的免疫応答エンハンサーを含む肺
癌の処置のためのワクチンであって、前記ポリヌクレオチド分子が、以下：（ａ）配列番号４、５、９、１４、２８、３１、３３、５０、５３、５６、６
０、７０、７２、７５、７６、７９、８３、８５、９７〜１０６、１１５〜１２
４、１２６、１３０、１３４〜１４１、１４３、１４５〜１４７および１６２〜
１６４に示される配列；（ｂ）配列番号４、５、９、１４、２８、３１、３３、５０、５３、５６、６
０、７０、７２、７５、７６、７９、８３、８５、９７〜１０６、１１５〜１２
４、１２６、１３０、１３４〜１４１、１４３、１４５〜１４７および１６２〜
１６４の配列に相補的な配列；ならびに（ｃ）中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）または（ｂ）の配列にハ
イブリダイズする配列、からなる群から選択される配列を含む、ワクチン。
【請求項１５】患者における肺癌の発達を阻害するための方法であって、
請求項７または１２に記載の薬学的組成物の有効量を該患者に投与する工程を包
含する、方法。
【請求項１６】患者における肺癌の発達を阻害するための方法であって、
請求項８、１０、１３または１４のいずれか１項に記載のワクチンの有効量を該
患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１７】少なくとも１つの請求項２に記載のポリペプチドを含む、
融合タンパク質。
【請求項１８】請求項２に記載のポリペプチドおよび公知の肺腫瘍抗原を
含む、融合タンパク質。
【請求項１９】請求項１７〜１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質
および生理的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項２０】請求項１７〜１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質
および非特異的免疫応答エンハンサーを含む、ワクチン。
【請求項２１】前記非特異的免疫応答エンハンサーがアジュバントである
、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２２】患者における肺癌の発達を阻害するための方法であって、
請求項１９に記載の薬学的組成物の有効量を該患者に投与する工程を包含する、
方法。
【請求項２３】患者における肺癌の発達を阻害するための方法であって、
請求項２０に記載のワクチンの有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法
。
【請求項２４】患者における肺癌を検出するための方法であって、以下：（ａ）該患者から得られた生物学的サンプルを、ポリペプチドに結合し得る結
合剤と接触させる工程であって、該ポリペプチドが肺タンパク質またはその改変
体の免疫原性部分を含み、ここで該タンパク質が、配列番号１〜１０９、１１１
、１１３、１１５〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６２
〜１６４、１６７、１６８および１７１に示されるヌクレオチド配列、該ヌクレ
オチド配列の相補体、ならびに中程度にストリンジェントな条件下で、配列番号
１〜１０９、１１１、１１３、１１５〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５
８、１６０、１６２〜１６４、１６７、１６８および１７１の配列にハイブリダ
イズする配列からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド分子により
コードされるアミノ酸配列を含む、工程；ならびに（ｂ）該結合剤に結合するタンパク質またはポリペプチドを該サンプルにおい
て検出することによって、該患者の肺癌を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項２５】前記結合剤がモノクローナル抗体である、請求項２４に記
載の方法。
【請求項２６】前記結合剤がポリクローナル抗体である、請求項２５に記
載の方法。
【請求項２７】患者における肺癌の進行をモニターするための方法であっ
て、以下：（ａ）該患者から得られた生物学的サンプルをポリペプチドに結合し得る結合
剤に接触させる工程であって、該ポリペプチドが肺タンパク質またはその改変体
の免疫原性部分を含み、ここで該タンパク質が、配列番号１〜１０９、１１１、
１１３、１１５〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６２〜
１６４、１６７、１６８および１７１に示されるヌクレオチド配列、該ヌクレオ
チド配列の相補体、ならびに中程度にストリンジェントな条件下で、配列番号１
〜１０９、１１１、１１３、１１５〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８
、１６０、１６２〜１６４、１６７、１６８および１７１のヌクレオチド配列に
ハイブリダイズする配列からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド
分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、工程；（ｂ）該サンプルにおいて、該結合剤に結合するタンパク質またはポリペプチ
ドの量を決定する工程；（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程；ならびに（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）において検出されるポリペプチドの量を比較し
て、該患者における肺癌の進行をモニターする工程、を包含する、方法。
【請求項２８】肺タンパク質またはその改変体の免疫原性部分を含むポリ
ペプチドに結合するモノクローナル抗体であって、ここで該タンパク質が、以下
：配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２、３４
〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３、７４
、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１、１１
３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４、１４
８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６７、１６８および
１７１に示されるヌクレオチド配列；該ヌクレオチド配列の相補体；ならびに中
程度にストリンジェントな条件下で、配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１
５〜２７、２９、３０、３２、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５
９、６１〜６９、７１、７３、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９
６、１０７〜１０９、１１１、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３
１〜１３３、１４２、１４４、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５
８、１６０、１６７、１６８または１７１のヌクレオチド配列にハイブリダイズ
する配列からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド分子によりコー
ドされるアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体。
【請求項２９】患者における肺癌の発達を阻害するための方法であって、
請求項２８に記載のモノクローナル抗体の治療的有効量を該患者に投与する抗体
を包含する、方法。
【請求項３０】前記モノクローナル抗体が治療剤と結合体化されている、
請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】患者における肺癌を検出するための方法であって、以下：（ａ）該患者から生物学的サンプルを得る工程；（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応において、該サンプルと少なくとも２つのオリゴ
ヌクレオチドプライマーとを接触させる工程であって、ここで該オリゴヌクレオ
チドの少なくとも１つが肺タンパク質またはその改変体の免疫原性部分を含むポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド分子に特異的であり、該タンパク質は
、配列番号１〜１０９、１１１、１１３、１１５〜１５１、１５３、１５４、１
５７、１５８、１６０、１６２〜１６４、１６７、１６８および１７１に示され
るヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の相補体、ならびに中程度にストリン
ジェントな条件下で、配列番号１〜１０９、１１１、１１３、１１５〜１５１、
１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６２〜１６４、１６７、１６８ま
たは１７１の配列にハイブリダイズする配列からなる群から選択される配列を含
むポリヌクレオチド分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、工程；ならび
に（ｃ）サンプルにおいて、該オリゴヌクレオチドプライマーの存在下で増幅す
るポリヌクレオチド配列を検出し、それによって肺癌を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項３２】請求項３１に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチ
ドプライマーの少なくとも１つが、配列番号１〜１０９、１１１、１１３、１１
５〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６２〜１６４、１６
７、１６８および１７１から選択される配列を含むポリヌクレオチド分子の少な
くとも約１０個の連続するヌクレオチドを含む、方法。
【請求項３３】診断キットであって、以下：（ａ）請求項２８に記載の１以上のモノクローナル抗体；および（ｂ）検出試薬、を含む、キット。
【請求項３４】診断キットであって、以下：（ａ）配列番号４、５、９、１４、２８、３１、３３、５０、５３、５６、６
０、７０、７２、７５、７６、７９、８３、８５、９７〜１０６、１１５〜１２
４、１２６、１３０、１３４〜１４１、１４３、１４５〜１４７および１６２〜
１６４、該配列の相補体、ならびに中程度にストリンジェントな条件下で、配列
番号４、５、９、１４、２８、３１、３３、５０、５３、５６、６０、７０、７
２、７５、７６、７９、８３、８５、９７〜１０６、１１５〜１２４、１２６、
１３０、１３４〜１４１、１４３、１４５〜１４７または１６２〜１６４の配列
にハイブリダイズする配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポ
リヌクレオチド分子によりコードされるポリペプチドに結合する１以上のモノク
ローナル抗体；ならびに（ｂ）検出試薬、を含む、キット。
【請求項３５】前記モノクローナル抗体が固体支持体上に固定されている
、請求項３３または３４に記載のキット。
【請求項３６】前記固体支持体がニトロセルロース、ラテックスまたはプ
ラスチック材料を含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】前記検出キットが結合剤に結合体化されたレポーター基を
含む、請求項３３または３４に記載のキット。
【請求項３８】前記結合剤が抗イムノグロブリン、プロテインＧ、プロテ
インＡ、およびレクチンからなる群から選択される、請求項３７に記載のキット
。
【請求項３９】前記レポーター基が放射性同位体、蛍光基、発光基、酵素
、ビオチンおよび色素粒子からなる群から選択される、請求項３７に記載のキッ
ト。
【請求項４０】少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む診
断キットであって、該オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つが、肺タ
ンパク質またはその改変体の免疫原性部分を含むポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド分子に特異的であり、該タンパク質は、配列番号１〜１０９、１１
１、１１３、１１５〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６
２〜１６４、１６７、１６８および１７１に示されるヌクレオチド配列、該ヌク
レオチド配列の相補体、ならびに中程度にストリンジェントな条件下で、配列番
号１〜１０９、１１１、１１３、１１５〜１５１、１５３、１５４、１５７、１
５８、１６０、１６２〜１６４、１６７、１６８または１７１にハイブリダイズ
する配列からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド分子によりコー
ドされるアミノ酸配列を含む、キット。
【請求項４１】請求項４０に記載の診断キットであって、ここで少なくと
も１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号１〜１０９、１１１、１１
３、１１５〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６２〜１６
４、１６７、１６８および１７１から選択される配列を含むポリヌクレオチド分
子の少なくとも約１０個の連続するヌクレオチドを含む、キット。
【請求項４２】患者における肺癌を検出するための方法であって、（ａ）該患者から生物学的サンプルを得る工程（ｂ）該生物学的サンプルと、肺タンパク質またはその改変体の免疫原性部分
を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子に特異的なオリゴヌクレ
オチドプローブとを接触させる工程であって、該タンパク質が、配列番号１〜１
０９、１１１、１１３、１１５〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１
６０、１６２〜１６４、１６７、１６８および１７１に示されるヌクレオチド配
列、該ヌクレオチド配列の相補体、ならびに中程度にストリンジェントな条件下
で、配列番号１〜１０９、１１１、１１３、１１５〜１５１、１５３、１５４、
１５７、１５８、１６０、１６２〜１６４、１６７、１６８または１７１の配列
にハイブリダイズする配列からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチ
ド分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、工程；ならびに（ｃ）該サンプル中において、該オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイ
ズするポリヌクレオチド配列を検出し、それによって患者における肺癌を検出す
る工程、を包含する、方法。
【請求項４３】請求項４２に記載の方法であって、ここで前記オリゴヌク
レオチドプローブが、配列番号１〜１０９、１１１、１１３、１１５〜１５１、
１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６２〜１６４、１６７、１６８お
よび１７１からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド分子の少なく
とも約１５個の連続するヌクレオチドを含む、方法
【請求項４４】肺タンパク質またはその改変体の免疫原性部分を含むポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド分子に特異的なオリゴヌクレオチドプロ
ーブを含む診断キットであって、該タンパク質は、以下：配列番号１〜１０９、
１１１、１１３、１１５〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、
１６２〜１６４、１６７、１６８および１７１に示されるヌクレオチド配列；該
ヌクレオチド配列の相補体；ならびに中程度にストリンジェントな条件下で、配
列番号１〜１０９、１１１、１１３、１１５〜１５１、１５３、１５４、１５７
、１５８、１６０、１６２〜１６４、１６７、１６８または１７１の配列にハイ
ブリダイズする配列、からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド分
子によりコードされるアミノ酸配列を含む、キット。
【請求項４５】請求項４４に記載の診断キットであって、ここで前記オリ
ゴヌクレオチドプローブが、配列番号１〜１０９、１１１、１１３、１１５〜１
５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６２〜１６４、１６７、１
６８および１７１からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド分子の
少なくとも約１５個の連続するヌクレオチドを含む、キット。
【請求項４６】患者における肺癌を処置するための方法であって、以下：（ａ）該患者から末梢血細胞を得る工程（ｂ）請求項２に記載の少なくとも１つのポリペプチドの存在下で該細胞をイ
ンキュベートし、その結果Ｔ細胞が増殖する、工程；ならびに（ｃ）該患者に該増殖したＴ細胞を投与する工程、を包含する、方法。
【請求項４７】患者における肺癌を処置するための方法であって、以下：（ａ）該患者から末梢血細胞を得る工程（ｂ）請求項１に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドの存在下で該細胞
をインキュベートし、その結果Ｔ細胞が増殖する、工程；ならびに（ｃ）該患者に該増殖したＴ細胞を投与する工程、を包含する、方法。
【請求項４８】前記Ｔ細胞をインキュベートする前記工程が１回以上繰り
返される、請求項４６および４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】前記工程（ａ）が前記末梢血細胞からＴ細胞を分離するこ
とをさらに包含し、そして前記工程（ｂ）においてインキュベートされる前記細
胞がＴ細胞である、請求項４６および４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】前記工程（ａ）が、前記末梢血細胞からＣＤ４＋細胞また
はＣＤ８＋細胞を分離することをさらに包含し、そして前記工程（ｂ）において
増殖した前記細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項４６ま
たは４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】前記工程（ｂ）が、前記ポリペプチドの存在下で、増殖し
た１以上のＴ細胞をクローニングする工程をさらに包含する、請求項４６または
４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】薬学的に受容可能なキャリアとの組合せで、請求項２のポ
リペプチドの存在下で増殖したＴ細胞を含む、患者における肺癌の処置のための
組成物。
【請求項５３】薬学的に受容可能なキャリアとの組合せで、請求項１のポ
リヌクレオチドの存在下で増殖したＴ細胞を含む、患者における肺癌の処置のた
めの組成物。
【請求項５４】患者における肺癌の処置を処置するための方法であって、
以下の工程：（ａ）請求項２に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドの存在下で、抗原
提示細胞をインキュベートする工程；（ｂ）該インキュベートされた抗原提示細胞を該患者に投与する工程、を包含する、方法。
【請求項５５】患者における肺癌の処置を処置するための方法であって、
以下の工程：（ａ）請求項１に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドの存在下で、抗原
提示細胞をインキュベートする工程；（ｂ）該インキュベートされた抗原提示細胞を該患者に投与する工程、を包含する、方法。
【請求項５６】前記抗原提示細胞が樹状細胞およびマクロファージ細胞か
らなる群から選択される、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】薬学的に受容可能なキャリアとの組合せで、請求項２のポ
リペプチドの存在下でインキュベートされた抗原提示細胞を含む、患者における
肺癌の処置のための組成物。
【請求項５８】薬学的に受容可能なキャリアとの組合せで、請求項１のポ
リペプチドの存在下でインキュベートされた抗原提示細胞を含む、患者における
肺癌の処置のための組成物。