JP2003502028A

JP2003502028A - 乳癌の治療、診断およびモニタリングのための組成物および方法

Info

Publication number: JP2003502028A
Application number: JP2001500662A
Authority: JP
Inventors: ギャリーリチャードファンガー，; ロナルドシー．ヘンドリクソン，; レイモンドエル．ホウトン，; スティーブンジー．リード，
Original assignee: コリクサコーポレイション
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 2000-05-26
Publication date: 2003-01-21
Also published as: WO2000073338A8; WO2000073338A9; WO2000073338A1; AU5449600A; EP1185557A1; CA2375049A1

Abstract

(57)【要約】乳癌の治療、診断およびモニタリングのための組成物および方法が開示される。組成物は、１以上のママグロビンエピトープ、またはそれに対する抗体もしくはＴ細胞を含み得、そして例えば、乳癌の予防および処置のために用いられ得る。サンプル中のママグロビンエピトープまたはそれに対する抗体もしくはＴ細胞の存在を検出することに基づく診断方法もまた提供される。患者の血液またはその画分中のママグロビンをコードするＲＮＡを検出するための方法もまた提供される。これらの方法を用いて、乳癌の進行を検出および／またはモニタリングし得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は一般的に、癌（例えば、乳癌）の治療、診断およびモニタリングに関
する。本発明はさらに詳細には、ママグロビン（ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ）の特
異的エピトープに、このようなエピトープを認識する抗体および免疫細胞に、そ
して患者の血清中のママグロビンを検出するための方法に関する。このようなペ
プチド、抗体および細胞は、乳癌の予防および処置のため、ならびに乳癌の診断
およびモニタリングのための、ワクチンおよび薬学的組成物において用いられ得
る。

【０００２】（発明の背景）乳癌は、合衆国および世界中の女性にとって重要な健康問題である。この疾患
の検出および処置は進歩してきているが、乳癌は、女性における癌関連死の２番
目に主な原因のままであり、米国において毎年１８０，０００人を超える女性に
罹患している。北アメリカの女性については、生涯で乳癌になる確率は現在、８
分の１である。

【０００３】乳癌の予防または処置のために、ワクチンも他の普遍的に好首尾の方法も現在
利用可能でない。この疾患の管理は現在、早期診断（慣用的な乳房スクリーニン
グ手順を通して）および攻撃的処置（これは、１以上の種々の処置（例えば、手
術、放射線治療、化学治療およびホルモン治療）を含み得る）の組み合わせに頼
る。特定の乳癌についての処置経過はしばしば、特異的腫瘍マーカーの分析を含
む、種々の予後パラメーターに基づいて選択される。例えば、Ｐｏｒｔｅｒ−Ｊ
ｏｒｄａｎおよびＬｉｐｐｍａｎ，ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒ８：７３−１
００，１９９４を参照のこと。しかし、確立されたマーカーの使用はしばしば、
解釈することが困難である結果をもたらし、そして乳癌患者において観察される
高い死亡率は、この疾患の処置、診断および予防において改善が必要であること
を示す。

【０００４】治療方法および診断方法におけるかなりの研究にもかかわらず、当該分野には
、乳癌を検出および処置するための方法を改善する必要がある。本発明は、これ
らの必要性を満たし、そしてさらに、他の関連する利点を提供する。

【０００５】（発明の要旨）手短に述べると、本発明は、乳癌の診断、治療およびモニタリングのための組
成物および方法を提供する。１つの局面では、本発明は、ヒトママグロビンのエ
ピトープの少なくとも７個、好ましくは少なくとも９個、そしてより好ましくは
少なくとも１５個連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドを提供し、ここで、
このエピトープは、ＩＤＥＬＫＥＣＦＬＮＱＴＤＥＴＬＳＮＶＥ（Ｐｒｏ２；配
列番号１）；ＴＴＮＡＩＤＥＬＫＥＣＦＬＮＱ（Ｐｒｏ２−３；配列番号２）；
ＳＱＨＣＹＡＧＳＧＣＰＬＬＥＮＶＩＳＫＴＩ（Ｐｒｏ５：配列番号３）；ＥＹ
ＫＥＬＬＱＥＦＩＤＤＮＡＴＴＮＡＩＤ（ペプチド５Ａ：配列番号４）およびＫ
ＬＬＭＶＬＭＬＡ（ｍｇｂ１；配列番号５）からなる群より選択され、その結果
、このポリペプチドは、ヒトママグロビン内に存在する３０個以下連続したアミ
ノ酸残基を含む。

【０００６】他の局面では、本発明は、上記の通りのポリペプチドおよび生理学的に受容可
能なキャリアを含む、薬学的組成物を提供する。

【０００７】本発明の関連した局面では、ワクチンが提供される。このようなワクチンは、
上記のポリペプチドおよび免疫刺激物質を含む。

【０００８】さらなる局面では、本発明は、上記の通りのママグロビンエピトープに結合す
る抗体（例えば、モノクローナル抗体）またはその抗原結合フラグメントを、な
らびにこのような抗体を含む診断キットを提供する。

【０００９】グリコシル化ママグロビンに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原
結合フラグメント、およびこのような抗体を含む診断キットもまた提供される。

【００１０】本発明はさらに、以下を含む薬学的組成物を提供する：（ａ）上記の通りのエ
ピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；および（ｂ
）生理学的に受容可能なキャリア。

【００１１】さらなる局面では、本発明は、上記に記載した通りの薬学的組成物またはワク
チンを患者に投与する工程を包含する、患者における乳癌の発達を阻害するため
の方法を提供する。

【００１２】さらなる局面では、本発明は、患者における乳癌の存在または非存在を決定す
るための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から得
た生物学的サンプルを、上記の通りのエピトープに特異的に結合する抗体または
その抗原結合フラグメントと接触させる工程；（ｂ）サンプル中の、抗体または
そのフラグメントに結合するポリペプチドの量を検出する工程；および（ｃ）ポ
リペプチドの量を所定のカットオフ値に対して比較する工程。好ましい実施形態
では、この抗体は、モノクローナル抗体である。工程（ｂ）は、例えば、２抗体
サンドイッチアッセイを含み得る。

【００１３】本発明はまた、他の局面では、患者における乳癌の進行のモニタリングのため
の方法を提供する。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）第１の時
点で患者から得られた生物学的サンプルを、上記の通りのエピトープに特異的に
結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；（ｂ）該サン
プル中の、この抗体またはそのフラグメントに結合するポリペプチドの量を検出
する工程；（ｃ）その後の時点で該患者から得られた生物学的サンプルを用いて
工程（ａ）および工程（ｂ）を繰り返す工程：ならびに（ｄ）工程（ｃ）におい
て検出されたポリペプチドの量を、工程（ｂ）において検出された量に対して比
較する工程。

【００１４】さらなる局面では、本発明は、生物学的サンプルから腫瘍細胞を除去するため
の方法を提供し、この方法は、生物学的サンプルを、ＥＹＫＥＬＬＱＥＦＩＤＤ
ＮＡＴＴＮＡＩＤ（ペプチド５Ａ；配列番号４）およびＫＬＬＭＶＬＭＬＡ（ｍ
ｇｂ１；配列番号５）からなる群より選択されるママグロビンエピトープと特異
的に反応するＴ細胞と接触させる工程を包含し、この接触させる工程は、該サン
プルからのママグロビンまたはそのペプチドエピトープを発現する細胞の除去を
可能にするに充分な条件下および時間にわたって行われる。生物学的サンプルと
しては例えば、血液およびその画分が挙げられる。

【００１５】他の局面では、上記の通りに処理された生物学的サンプルを患者に投与する工
程を包含する、患者における乳癌の発達を阻害するための方法がさらに提供され
る。

【００１６】本発明はまた、さらなる局面において、ママグロビンに特異的なＴ細胞を刺激
および／または増加（ｅｘｐａｎｄ）させるための方法を提供し、この方法は、
Ｔ細胞を、配列ＥＹＫＥＬＬＱＥＦＩＤＤＮＡＴＴＮＡＩＤ（ペプチド５Ａ；配
列番号４）またはＫＬＬＭＶＬＭＬＡ（ｍｇｂ１；配列番号５）を含むペプチド
と接触させる工程を包含し、ここで、このペプチドは、ヒトママグロビンの少な
くとも７個、好ましくは少なくとも９個、そしてより好ましくは少なくとも１５
個連続したアミノ酸残基を含み、ここでこのペプチドは、ヒトママグロビンの３
０個以下連続したアミノ酸残基を含み、そして接触は、Ｔ細胞の刺激および／ま
たは増加を可能にするに充分な条件下でおよび時間にわたって行われる。

【００１７】関連した局面では、上記の通りに調製されたＴ細胞を含む、単離されたＴ細胞
集団が提供される。

【００１８】さらなる局面では、有効量の上記の通りのＴ細胞集団を患者に投与する工程を
包含する、患者における乳癌の発達を阻害するための方法が提供される。

【００１９】さらなる局面では、患者における乳癌の発達を阻害するための方法が提供され
、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から単離されたＣＤ４⁺およ
び／またはＣＤ８⁺のＴ細胞を、ヒトママグロビンの少なくとも７個、好ましく
は少なくとも９個、そしてより好ましくは少なくとも１５個連続したアミノ酸残
基を含むペプチドと共にインキュベートし、その結果、Ｔ細胞が増殖する工程で
あって、ここで、このペプチドは、ヒトママグロビンの３０個以下連続したアミ
ノ酸残基を含み、そしてこのペプチドは、配列ＥＹＫＥＬＬＱＥＦＩＤＤＮＡＴ
ＴＮＡＩＤ（ペプチド５Ａ；配列番号４）またはＫＬＬＭＶＬＭＬＡ（ｍｇｂ１
；配列番号５）を含む、工程；および（ｂ）有効量の増殖したＴ細胞を患者に投
与する工程。

【００２０】さらに、患者における乳癌の発達を阻害するための方法が提供され、この方法
は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から単離されたＣＤ４⁺および／または
ＣＤ８⁺のＴ細胞を、ヒトママグロビンの少なくとも７個、好ましくは少なくと
も９個、そしてより好ましくは少なくとも１５個連続したアミノ酸残基を含むペ
プチドと共にインキュベートし、その結果、Ｔ細胞が増殖する工程であって、こ
こで、このペプチドは、ヒトママグロビンの３０個以下連続したアミノ酸残基を
含み、そしてこのペプチドは、配列ＥＹＫＥＬＬＱＥＦＩＤＤＮＡＴＴＮＡＩＤ
（ペプチド５Ａ；配列番号４）またはＫＬＬＭＶＬＭＬＡ（ｍｇｂ１；配列番号
５）を含む、工程；（ｂ）少なくとも１つの増殖した細胞をクローニングする工
程；および（ｃ）患者に有効量のクローニングされたＴ細胞を投与する工程。

【００２１】なおさらに、患者から得られた全血またはその画分のサンプル中のママグロビ
ンｍＲＮＡのレベルを検出することにより、乳癌の存在または非存在が患者にお
いて決定され得る方法が提供され、ここで上皮細胞は、このサンプルから除去さ
れている。例えば、このような検出は、以下の工程によって達成され得る：（ａ
）患者から得られた生物学的サンプルを、ママグロビンをコードするポリヌクレ
オチドまたはその相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる
工程；（ｂ）このサンプルにおいて、このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ
するポリヌクレオチドの量を検出する工程；および（ｃ）オリゴヌクレオチドに
ハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を、所定のカットオフ値に対して比較
し、それにより、この患者における乳癌の存在または非存在を決定する工程。

【００２２】他の局面では、乳癌の進行は、患者から得られた全血またはその画分のサンプ
ル中のママグロビンｍＲＮＡのレベルを検出することによって患者においてモニ
タリングされ得、ここで上皮細胞は、２つの異なる時点でこのサンプルから除去
されている。例えば、このようなモニタリングは、以下の工程によって達成され
得る：（ａ）患者から得られたサンプルを、ママグロビンポリヌクレオチドにハ
イブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）このサンプル中
の、このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を検出
する工程；（ｃ）その後の時点でこの患者から得られたサンプルを用いて工程（
ａ）および工程（ｂ）を繰り返す工程：ならびに（ｄ）工程（ｃ）において検出
されたポリヌクレオチドの量を、工程（ｂ）において検出された量に対して比較
し、それにより、この患者におけるこの癌の進行をモニタリングする工程。

【００２３】本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照
すれば明らかになる。本明細書中に開示された全ての参考文献は、あたかも各々
が個々に援用されたかのように、その全体が本明細書中に参考として援用される
。

【００２４】（発明の詳細な説明）上述のように、本発明は、一般に、癌（例えば、乳癌）の治療、診断およびモ
ニタリングのための組成物および方法に関する。本明細書中に記載の組成物は、
ママグロビンのポリヌクレオチド、ポリペプチド、エピトープまたはこのような
エピトープを特異的に認識する抗体を含み得る。本発明は、ヒトママグロビンの
ある特定のエピトープおよびこのようなエピトープを結合する抗体の発見に一部
基づく。本発明はさらに、グリコシル化感受性様式でママグロビンを結合する抗
体の発見に一部基づく。本明細書中に記載の他の方法は、患者の血液またはその
画分におけるママグロビン核酸を検出するための技術を使用する。本発明の状況
下での、これらの発見は、診断目的に適切な抗体の生成、乳癌の改善された治療
法、ならびに乳癌の高感度の診断を可能にする血中のママグロビンＲＮＡの検出
に基づき得る診断方法を可能にする。

【００２５】（ママグロビンポリヌクレオチド）本明細書中に提供される診断方法は、一般に、患者から得られたサンプル中の
ママグロビン核酸のレベルを検出するためのプローブまたはプライマーとして、
ママグロビンポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）を使用する。マ
マグロビンオリゴヌクレオチドは、ママグロビンタンパク質の一部をコードし得
る（例えば、１５個連続するヌクレオチド、３０個連続するヌクレオチド、およ
び４５個連続するヌクレオチド）。任意のこのような配列に相補的なポリヌクレ
オチドはまた、本発明によって含まれる。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コード
またはアンチセンス）または二本鎖であり得、そしてＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤ
ＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子は、ＨｎＲＮＡ分
子（イントロンを含み、そして１対１の様式でＤＮＡ分子に対応する）およびｍ
ＲＮＡ（イントロンを含まない）を含む。さらなるコード配列または非コード配
列は、必要ではないが、本発明のポリヌクレオチド中に存在し得、そしてポリヌ
クレオチドは、必要ではないが、他の分子および／または支持材料に連結され得
る。

【００２６】ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、内因性ママグロビンの一部
）を含み得るか、またはこのような配列の改変体を含み得る。ポリヌクレオチド
改変体は、アッセイ条件下でママグロビンポリヌクレオチドにハイブリダイズす
るこのポリヌクレオチドの能力を実質的に減少させないように、１以上の置換、
付加、欠失および／または挿入を含み得る。好ましくは、このようなポリペプチ
ド改変体は、ネイティブママグロビンをコードする天然に存在するＤＮＡ配列（
または相補性配列）に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得
る。適切な中程度にストリンジェントな条件は、以下を含む：５×ＳＳＣ、０．
５％ＳＤＳ、１．０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予備洗浄；５０
℃〜６５℃、５×ＳＳＣでの、一晩のハイブリダイゼーション；続いて各々０．
１％ＳＤＳ含有の２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣおよび０．２×ＳＳＣを用いた２
０分間、６５℃での２回の洗浄。

【００２７】ポリヌクレオチドは、任意の種々の技術を用いて調製され得る。例えば、ポリ
ヌクレオチドは、ママグロビンを発現する細胞（例えば、乳房腫瘤細胞）から調
製されるｃＤＮＡから増幅され得る。このようなポリヌクレオチドは、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅され得る。このアプローチについて、配列
特異的プライマーが、既知のママグロビン配列に基づいて設計され得、そして購
入され得るか、または合成され得る。

【００２８】コード配列または相補的配列の一部は、遺伝子発現を検出するためのプローブ
またはプライマーとして設計され得る。プローブは、種々のレポーター基（たと
えば、放射性核種および酵素）によって標識され得、そして好ましくは、少なく
とも１０ヌクレオチド長、より好ましくは、少なくとも２０ヌクレオチド長、そ
してなおより好ましくは、少なくとも３０ヌクレオチド長である。プライマーは
、好ましくは、２２〜３０ヌクレオチド長である。

【００２９】任意のポリヌクレオチドをさらに改変して、インビボでの安定性を増加させ得
る。可能な改変としては、５’末端および／または３’末端での隣接配列の付加
；骨格中のリン酸ジエステル結合に代わるホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メ
チルの使用；および／または非古典的塩基（例えば、イノシン、キューオシンお
よびワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）、ならびにアセチル−、メチル−、
チオ−および他の改変形態のアデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウ
リジン）の含有が挙げられるが、これらに限定されない。

【００３０】本明細書中に記載されるようなヌクレオチド配列は、確立された組換えＤＮＡ
技術を用いて種々の他のヌクレオチド配列に連結され得る。例えば、ポリヌクレ
オチドは、種々のクローニングベクター（プラスミド、ファージミド、λファー
ジ誘導体、およびコスミドを含む）のいずれかにクローニングされ得る。特定の
目的のベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター
および配列決定ベクターが挙げられる。一般に、ベクターは、少なくとも１つの
生物において機能的な複製起点、都合の良い制限エンドヌクレアーゼ部位、およ
び１つ以上の選択マーカーを含む。他のエレメントは、所望される用途に依存し
て、そして当業者に明らかである。

【００３１】（ママグロビンエピトープおよびポリペプチド）本発明の状況下で、ポリペプチドは、少なくとも１つのママグロビンエピトー
プまたはその改変体を含む。「エピトープ」は、本明細書中に記載されるような
、抗ママグロビン抗血清内の１以上の抗体が特異的に結合するか、または１以上
のママグロビン特異的Ｔ細胞と特異的に反応する、ママグロビンの一部である。
エピトープは、必要ではないが、グリコシル化感受性様式で、抗体によって特異
的に結合され得る（すなわち、抗体は、グリコシル化されたエピトープ、脱グリ
コシル化されたエピトープまたは両方に結合し得る）。ママグロビンエピトープ
を含むポリペプチドは、一般に、ヒトママグロビンの少なくとも７連続するアミ
ノ酸残基、および好ましくは、ヒトママグロビンの９〜３０個連続するアミノ酸
残基を含む。エピトープのサイズは、そのエピトープがＣＤ４⁺Ｔ細胞、ＣＤ８⁺ Ｔ細胞または抗体によって認識されるか否かに依存して変化し得ることに留意す
る。しかし、一般に、９アミノ酸配列が、ＴＣＬ認識に十分である。本明細書中
に記載のようなポリペプチドは、任意の長さのポリペプチドであり得る。ネイテ
ィブタンパク質および／または異種配列由来のさらなる配列が存在し得、そして
このような配列は、（必要ではないが）免疫原性特性または抗原性特性をさらに
有し得る。

【００３２】特定の好ましいエピトープは、以下の配列のうちの１つを含むか、またはこの
ような配列の少なくとも７個連続したアミノ酸残基、好ましくは少なくとも９個
連続したアミノ酸残基、そしてより好ましくは少なくとも１５個連続したアミノ
酸残基を含む、その部分を含む：

【００３３】

【化１】他の好ましいエピトープは、ママグロビンのグリコシル化部位を含む。このよう
なエピトープは、グリコシル化ママグロビンに特異的に結合する抗体の生成に特
に有用である。このような２つの部位は、Ｎ結合型グリコシル化部位アスパラギ
ン（Ａｓｐ）−５３（ＱＥＦＩＤＤＮＡＴＴＮＡＩ）（配列番号６）およびＡｓ
ｐ−６８（ＬＫＥＣＦＬＮＱＴＤＥＴＬ）（配列番号７）である。他のこのよう
な部位は、例えば、異なるグリコシル化の組み合わせに対する抗体を含む抗体ラ
イブラリーを使用して、容易に同定され得る。乳癌細胞由来のネイティブママグ
ロビンに対するこのような抗体の結合は、従来のＥＬＩＳＡおよびブロッティン
グ技術を使用してアッセイされ得る。確立された生化学的技術もまた、他のママ
グロビングリコシル化部位を同定するために使用され得る。

【００３４】上記のように、ポリペプチドは、種々のネイティブママグロビンエピトープの
改変体を含み得る。本明細書において用いるような「改変体」は、ネイティブエ
ピトープに特異的な抗体によって結合されるその改変体の能力が実質的に減少さ
れないように、そのネイティブエピトープとは、１以上の置換、欠失、付加およ
び／または挿入で異なる。換言すれば、改変体がエピトープ特異的な抗血清また
は単離された抗体と反応する能力は、そのネイティブタンパク質に対して増強さ
れてもよく、もしくは変化しなくてもよく、またはネイティブタンパク質に対し
て５０％未満まで、そして好ましくは２０％未満まで減少されてもよい。このよ
うな改変体は、一般に、本明細書において記載されるように、上記で提供される
ようなエピトープを改変し、そして上記のようにこの改変エピトープとエピトー
プ特異的な抗体または抗血清との反応性を評価することによって同定され得る。
好ましい改変体としては、そのエピトープ中の２０％未満の残基で置換が作製さ
れているエピトープが挙げられる。

【００３５】好ましくは、改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」は、ペプチド化学
の当業者にポリペプチドの二次構造および疎水性親水性特性が実質的に不変であ
ることが予測されるような、アミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸により
置換されている置換である。アミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解
度、疎水性、親水性および／または両親媒性特性の類似性に基づいて生成され得
る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン
酸が挙げられ；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げ
られ；そして類似の親水性価を有する非荷電極性ヘッド基を有するアミノ酸とし
ては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパ
ラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよ
びチロシンが挙げられる。保存的変化を示し得るアミノ酸の他の群としては、以
下が挙げられる：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａ
ｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ
、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；
および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。改変体はまた、またはあるいは
、非保存的変化を含み得る。改変体はまた、（またはあるいは）例えば、アミノ
酸の欠失または付加により改変され得、この欠失または付加は、そのポリペプチ
ドの免疫原性、二次構造および疎水性親水性特性に最小限の影響しか有さない。

【００３６】上記のように、ポリペプチドは、そのタンパク質のＮ末端にシグナル（または
リーダー）配列を含み得、この配列は、そのタンパク質の移動を翻訳同時的にま
たは翻訳後に指向する。このポリペプチドはまた、このポリペプチドの合成、精
製、または同定の容易さのために（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）、または固体支持体
へのポリペプチドの結合を増強するために、リンカーまたは他の配列に結合体化
され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合体化され得
る。

【００３７】ポリペプチドは、任意の周知の技術を用いて調製され得る。組換えポリペプチ
ドは、当業者に公知の任意の種々の発現ベクターを用いて、ママグロビンＤＮＡ
配列から容易に調製され得る。発現は、組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ
分子を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた任意の適切な
宿主細胞において達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物細胞、酵母
細胞および高等真核生物細胞が挙げられる。好ましくは、使用される宿主細胞は
、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、またはＣＯＳもしくはＣＨＯのような哺乳動物細胞株で
ある。培養培地中に組換えタンパク質またはポリペプチドを分泌する適切な宿主
／ベクター系由来の上清は、まず、市販のフィルターを用いて濃縮され得る。濃
縮後、濃縮物を適切な精製マトリックス（例えば、アフィニティーマトリックス
またはイオン交換樹脂）に適用し得る。最終的に、１回以上の逆相ＨＰＬＣ工程
を用いて、組換えポリペプチドをさらに精製し得る。

【００３８】約１００アミノ酸より少ない、そして一般に約５０アミノ酸より少ないアミノ
酸を有するポリペプチドはまた、当業者に周知の技術を用いる合成手段により生
成され得る。例えば、このようなポリペプチドは、任意の市販の固相技術（例え
ば、メリフィールド固相合成方法）（ここでは、アミノ酸が、伸長しているアミ
ノ酸鎖に連続的に付加される）を用いて合成され得る。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９〜２１４６、１９６３を参照のこ
と。ポリペプチドの自動合成のための装置は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔ
ｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）のような供給業者から市販
されており、そして製造業者の指示に従って操作され得る。

【００３９】関連する局面において、本明細書中に提供されるようなポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを提供される。一般に、本明細書中に記載されるようなポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離されている。「単離された」ポリペ
プチドおよびポリヌクレオチドは、その元々の環境から取り出されたものである
。例えば、天然に存在するタンパク質は、その天然の系において共に存在する材
料のいくらかまたは全てから分離されている場合に、単離されている。好ましく
は、このようなポリペプチドは、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは、少
なくとも約９５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。
ポリヌクレオチドは、例えば、その天然の環境の一部でないベクターにクローニ
ングされている場合に、単離されているとみなされる。

【００４０】（抗体およびそのフラグメント）本発明はさらに、ママグロビンエピトープに特異的に結合する薬剤（例えば、
抗体およびその抗原結合フラグメント）を提供する。本明細書中で使用される場
合、抗体またはその抗原結合フラグメントは、それが、ママグロビンエピトープ
と検出可能なレベルで反応するが（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて）、類似の条件
下で無関係なタンパク質と検出可能に反応しない場合に、ママグロビンエピトー
プに「特異的に結合する」と言われる。好ましい抗体は、ママグロビンのエピト
ープに検出可能に結合するが、このエピトープと重複しない（または、５アミノ
酸残基未満で重複する）ママグロビンの他の部分に検出可能に結合しない。本明
細書中で使用される場合、「結合」とは、複合体が形成されるような、２つの別
々の分子間の非共有結合をいう。結合する能力は、例えば、この複合体の形成に
ついての結合定数を決定することにより評価され得る。結合定数は、その複合体
の濃度が構成成分の濃度の積で除算される場合に得られる値である。一般に、２
つの化合物は、複合体形成についての結合定数が約１０³Ｌ／ｍｏｌを超える場
合に、本発明の文脈において、「結合する」と言われる。結合定数は、当業者に
周知の方法を使用して決定され得る。

【００４１】結合因子は、さらに、本明細書に記載の代表的なアッセイを使用して、癌（例
えば、乳癌）を有する患者と有さない患者との間を区別し得る。つまり、ママグ
ロビンエピトープに結合する抗体または他の結合因子、あるいはそれらの適切な
部分は、癌に冒されている患者の少なくとも約２０％において、その疾患の存在
を示すシグナルを生成し、ならびに癌を有さない個体の少なくとも約９０％にお
いて、その疾患の非存在を示す陰性シグナルを生成する。結合因子がこの要件を
満足するか否かを決定するために、癌を有する患者および有さない患者（標準的
な臨床試験を使用して決定されるような）由来の生物学的サンプル（例えば、血
液、血清、尿および／または腫瘍生検）を、本明細書中に記載されるように、結
合因子に結合するポリペプチドの存在についてアッセイし得る。疾患を有するま
たは有さない統計的に有意な数のサンプルをアッセイするべきことは明らかであ
る。各結合因子は、上記の基準を満足すべきであるが；当業者は、結合因子を組
み合わせて使用して感度を改善し得ることを認識する。

【００４２】上記の要件を満足させる任意の物質は、結合因子であり得る。例えば、結合因
子は、ペプチド成分を有するリボソームまたは有さないリボソーム、ＲＮＡ分子
、あるいはペプチドであり得る。好ましい実施形態において、結合因子は、抗体
またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、当業者に公知の任意の種々の
技術によって調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。一般に、抗
体は、組換え抗体の産生を可能にするための、細胞培養技術（本明細書中に記載
されるようなモノクローナル抗体の生成を含む）によって、または抗体遺伝子の
適切な細菌宿主または哺乳動物細胞宿主へのトランスフェクションを介して産生
され得る。１つの技術において、このポリペプチドを含む免疫原を、任意の広範
な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヤギ）に最
初に注射し得る。この工程において、本発明のポリペプチドは、改変することな
く、免疫原として供給され得る。あるいは、特に比較的短いポリペプチドに関し
て、このポリペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまた
はキーホールリンペットヘモシアニン）に連結される場合に、優れた免疫応答が
誘導され得る。好ましくは、１つ以上のブースター免疫化を組み込む所定の計画
に従って、この免疫原が動物の宿主内に注射され、そしてこの動物を定期的に採
血する。次いで、このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、例えば、
適切な固体支持体に結合されたポリペプチドを使用するアフィニティークロマト
グラフィーによって、このような抗血清から精製される。

【００４３】目的の抗原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈ
ｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１〜５
１９、１９７６ならびにそれに対する改良の技術を使用して調製され得る。簡潔
に言えば、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの
反応性）を有する抗体を産生する能力を有する不死細胞株の調製を包含する。こ
のような細胞株は、例えば、上記のような免疫化された動物から得られる脾細胞
から産生され得る。ついで、この脾細胞を、例えば、ミエローマ細胞融合パート
ナーとの融合、好ましくは、免疫化された動物と同系であるパートナーとの融合
によって不死化する。種々の融合技術を使用し得る。例えば、この脾細胞および
ミエローマ細胞は、数分間、非イオン性界面活性剤と合わせられ、次いで、ハイ
ブリッド細胞の増殖を支持するがミエローマ細胞の増殖を支持しない選択培地上
に低密度で播種され得る。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間、通常は約１〜２週間の後
、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一のコロニーを選択し、そしてこの
ポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性を有
するハイブリドーマが、好ましい。

【００４４】モノクローナル抗体は、増殖するハイブリドーマコロニーの上清から単離され
得る。さらに、種々の技術（例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の
腹膜腔へのハイブリドーマ細胞株の注射）が、収量を増大するために使用され得
る。次いで、モノクローナル抗体は、腹水または血液から採取され得る。夾雑物
は、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、および抽出のような従来技術によっ
て抗体から除去され得る。本発明のポリペプチドは、例えば、アフィニティーク
ロマトグラフィー工程における精製プロセスにおいて使用され得る。

【００４５】特定の好ましいモノクローナル抗体は、上記のエピトープ配列（Ｐｒｏ２、Ｐ
ｒｏ２〜３、Ｐｒｏ５、ペプチド５Ａまたはｍｇｂ１）に特異的に結合する。こ
のような抗体としては、本明細書中で２９Ｃ１１、６Ａ１、２Ｄ３および１６Ｄ
８と称されるウサギ抗体、および１９７−１Ｈ１１と称されるマウス抗体が挙げ
られる。他の好ましい抗体は、他の配列（例えば、立体配置的に依存した配列）
に結合する。このような抗体としては、本明細書中で、３１−１Ｈ７、３２−Ｇ
１１、３０４−１Ａ５および９８−１Ｆ４と称される抗体が挙げられる。他の好
ましい抗体は、グリコシル化に依存する親和性でママグロビンのグリコシル化部
位に結合する。例えば、特定の抗体がグリコシル化ママグロビンに特異的に結合
する（すなわち、最適な結合のための特定のグリコシル化部位のグリコシル化を
必要とする）。本明細書中で使用されるように、脱グリコシル化ママグロビン（
周知技術を使用して、酵素学的に脱グリコシル化されたママグロビンであって、
その結果、実質的にすべてのグリコシル化が除去される）に結合する親和性より
も、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍より高い親和性で、グリコシル
化ママグロビンに結合する場合、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、グ
リコシル化ママグロビンに特異的に結合する。オリゴサッカリドユニットが、ア
スパラギン（Ｎ−結合）またはセリンおよびスレオニン残基（Ｏ−結合）を介し
てタンパク質に付着された場合、グリコシル化が生じる。正常な細胞に比較して
、タンパク質のグリコシル化は、しばしば腫瘍細胞において改変される。タンパ
ク質のグリコシル化におけるこの差異は、診断（例えば、乳癌の診断）目的のた
めに腫瘍特異的抗体を提供するために開発され得る。これは、ひどくグリコシル
化されたタンパク質（例えば、ママグロビン）について特にあてはまる。ママグ
ロビンの推定分子量は、９．２ｋＤａであるが、乳癌細胞において発現されたこ
のタンパク質の成熟形態は、約１８〜２５ｋＤａの分子量であった。本発明の内
容において、ママグロビンのさらなる分子量は、オリゴサッカリドの付着に起因
することが見出された。従って、ママグロビンの分子量のおよそ１／２以上が、
グリコシル化による。

【００４６】特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントの使用が好ましい。こ
のようなフラグメントは、標準方法を使用して調製されたＦａｂフラグメントを
含む。簡単には、免疫グロブリンは、ＰｒｏｔｅｉｎＡビーズカラム（Ｈａｒ
ｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ
ａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，
１９８８）のアフィニティークロマトグラフィーによってウサギ抗血清から精製
され得、そしてパパインによって消化され、ＦａｂおよびＦｃフラグメントを生
じる。ＦａｂおよびＦｃフラグメントは、プロテインＡビーズカラムのアフィニ
ティークロマトグラフィーによって分別され得る。

【００４７】本発明のモノクローナル抗体は、１つ以上の治療剤と結合されて使用され得る
。これに関して、適切な薬剤としては、放射性核種、分化のインデューサー、薬
物、毒素、およびそれらの誘導体が挙げられる。好ましい放射性核種としては、 ⁹⁰ Ｙ、¹²³Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、²¹¹Ａｔ、および²¹²Ｂｉが挙
げられる。好ましい薬物としては、メトトレキサート、ならびにピリミジンアナ
ログおよびプリンアナログが挙げられる。好ましい分化のインデューサーとして
は、ホルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。好ましい毒素としては、リシ
ン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびヨウシュヤマゴボ
ウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。

【００４８】治療剤は、適切なモノクローナル抗体に対して直接的または間接的（例えば、
リンカー基を介して）のいずれかで結合（例えば、共有結合）され得る。薬剤と
抗体との間の直接的な反応は、各々が他方と反応する能力を有する置換基を有す
る場合に可能である。例えば、一方における求核基（アミノ基またはスルフヒド
リル基）は、他方におけるカルボニル含有基（例えば、無水物もしくはハロゲン
酸）または良好な脱離基（例えば、ハロゲン）を含むアルキル基と反応する能力
を有し得る。

【００４９】あるいは、リンカー基を介して治療剤と抗体とを結合させることが所望され得
る。リンカー基は、結合能を妨害することを避けるために、抗体を試薬から離す
ためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体の置換
基の化学的反応性を増大させるように作用し、結合効率を増大し得る。化学的反
応性における増大はまた、薬剤、または薬剤の官能基の使用を容易にし得、そう
でなければ、可能でない。

【００５０】種々の二官能性または多官能性試薬（ホモ−およびヘテロ−官能性の両方（例
えば、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬのカ
タログに記載される試薬））がリンカー基として使用され得ることは、当業者に
明らかである。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基
、または酸化された炭水化物残基によって影響され得る。このような方法論（例
えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）を記載する
、多くの参考文献が存在する。

【００５１】本発明の免疫結合体の抗体部分を有さない治療剤がより強力である場合、細胞
への内在化の間または細胞への内在化に際して切断され得るリンカー基を使用す
ることが所望され得る。多くの異なる切断され得るリンカー基が、記載されてい
る。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出に関する機構としては、ジスル
フィド結合の還元（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒに対する米国特許第４，４８９，７
１０号）、感光性結合の照射（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらに対する米国特許第４，
６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解（例えば、Ｋｏｈ
ｎらに対する米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介加水分解（例え
ば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触
媒化加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらによる米国特許４，５６９，７８９
）による切断が挙げられる。

【００５２】抗体に１つ以上の薬剤を結合することが、所望される。１つの実施形態におい
て、薬剤の複数分子が、１つの抗体分子に結合される。別の実施形態において、
１つ以上の型の薬剤が、１つの抗体に結合され得る。特定の実施形態に関わらず
、１つ以上の薬剤を有する免疫結合体は、種々の方法において調製され得る。例
えば、１つ以上の薬剤は、抗体分子、またはリンカー（これは、使用され得る付
着について複数の部位を提供する）に直接結合され得る。あるいは、キャリアが
使用され得る。

【００５３】キャリアは、直接的かまたはリンカー基を介してのいずれかの共有結合を含む
、種々の方法において薬剤を保有し得る。適切なキャリアとしては、アルブミン
のようなタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらに対する米国特許第４，５０７，２３
４号）、ペプチドおよびアミノデキストランのようなポリサッカリド（例えば、
Ｓｈｉｈらに対する米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。キャリア
はまた、非共有結合によってか、またはリポソーム小胞内へのような封入によっ
て薬剤を保有し得る（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，
８７３，０８８号）。放射性核種薬剤に特異的なキャリアとしては、放射性ハロ
ゲン化低分子およびキレート化合物が挙げられる。例えば、米国特許４，７３５
，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する
。放射性核種のキレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するた
めのドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含む化合物を含む、キレート化
合物から形成され得る。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらに対する米国特許第４，６７
３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示する。

【００５４】抗体および免疫結合体についての種々の投与経路が、使用され得る。代表的に
は、投与は、静脈内、筋肉内、皮下または切除された腫瘍の床においてである。
抗体／免疫結合体の正確な用量が、使用される抗体、腫瘍上の抗原の密度、およ
び抗体のクリアランス速度に依存して変化することは明白である。

【００５５】（Ｔ細胞）免疫治療組成物はまた、あるいは、ママグロビンを特異的に認識するＴ細胞を
含み得る。このような細胞は、一般的に標準的手順を使用して、インビトロまた
はエキソビボで調製され得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離システム（例
えば、ＩＳＯＬＥＸ^TMシステム（ＮｅｘｅｌｌＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩ
ｎｃ．，（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡから入手可能、米国特許第５，２４０，８５６号
；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；ＷＯ９１／１６１
１６およびＷＯ９２／０７２４３もまた参照のこと））を使用して、患者の骨髄
、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分中から単離され得る。あるいは、Ｔ細
胞は、関連または無関連のヒト、非ヒト哺乳動物、細胞株または培養物から誘導
され得る。簡単には、患者、関連するドナーまたは関連しないドナーから、慣用
的技術（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心
分離）によって、単離され得るＴ細胞は、ママグロビンポリペプチドと共にイン
キュベートされる。例えば、Ｔ細胞は、ママグロビンポリペプチド（例えば、５
〜２５μｇ／ｍｌ）または匹敵する量のママグロビンポリペプチドを合成する細
胞とともに、３７℃で２〜９日間（代表的には４日間）、インビトロでインキュ
ベートされ得る。Ｔ細胞サンプルの別のアリコートを、コントロールとして役立
つように、ママグロビンタンパク質の非存在下でインキュベーションすることが
、所望され得る。

【００５６】Ｔ細胞は、ママグロビンポリペプチド、ママグロビンポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドおよび／またはそのようなポリペプチドを発現する抗原提示
細胞（ＡＰＣ）を用いて刺激され得る。このような刺激は、このポリペプチドに
特異的であるＴ細胞の生成を可能にする条件下および十分な時間で行われる。好
ましくは、ママグロビンポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、送達ビヒクル
（例えば、ミクロスフェア）中に存在して、特異的Ｔ細胞の生成を容易にする。

【００５７】Ｔ細胞は、このＴ細胞が特異的に増殖、サイトカインを分泌、またはこのポリ
ペプチドで被覆された標的細胞またはこのようなポリペプチドをコードする遺伝
子を発現する標的細胞を殺傷する場合に、ママグロビンポリペプチドに特異的で
あるとみなされる。Ｔ細胞特異性は、任意の種々の標準的技術を使用して評価さ
れ得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいて、ネガティブ
コントロールと比較して、溶解および／または増殖において２倍を超える増加の
刺激指数は、Ｔ細胞特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎら
、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５４：１０６５−１０７０，１９９４に記載されるよ
うに、実行され得る。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によ
って達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成の速度の増加を測定する
ことによって検出され得る（例えば、トリチウム化チミジンでＴ細胞の培養物を
パルス標識し、ＤＮＡに取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定すること
によって）。Ｔ細胞増殖を検出する他の方法は、インターロイキン２（ＩＬ−２
）、Ｃａ²⁺流動、または色素の取り込み(例えば、３−（４，５−ジメチルチア
ゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウム)の増加を測定する
ことである。あるいは、リンフォカイン（例えば、インターフェロンγ）の合成
が測定され得るか、またはママグロビンポリペプチドに応答し得る相対的な数の
Ｔ細胞が定量され得る。３〜７日間のママグロビンポリペプチド（１００ｎｇ／
ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、２００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）と
の接触は、Ｔ細胞の増殖において少なくとも２倍の増加を生じる。２〜３時間の
上記のような接触は、標準的なサイトカインアッセイを使用して測定されるよう
に、Ｔ細胞の活性化を生じ、ここで、サイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＦ
Ｎ−γ）放出のレベルの２倍の増加が、Ｔ細胞の活性化を示す（Ｃｏｌｉｇａｎ
ら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１
巻、ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎｅ１９９８）を参照
のこと）。ママグロビン特異的Ｔ細胞を、標準的な技術を使用して増加させ得る
。好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、患者または関連するドナーもしくは無
関連のドナーから誘導され、そして刺激および増加後にその患者に投与される。

【００５８】ママグロビンポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣを発現するポリペ
プチドに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４⁺および／またはＣＤ８⁺であり
得る。ＣＤ４⁺またはＣＤ８⁺Ｔ細胞の特異的な活性は、種々の方法で検出され得
る。特異的なＴ細胞活性化を検出する方法としては、Ｔ細胞の増殖の検出、サイ
トカイン（例えば、リンフォカイン）の産生の検出、または細胞溶解活性の産生
（すなわち、ママグロビンに特異的な細胞毒性Ｔ細胞の産生）の検出が挙げられ
る。ＣＤ４⁺Ｔ細胞について、特定のＴ細胞活性化を検出するための好ましい方
法は、Ｔ細胞の増殖の検出である。ＣＤ８⁺細胞について、特定のＴ細胞活性化
を検出するための好ましい方法は、細胞溶解活性の産生の検出である。

【００５９】治療目的で、ママグロビンポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応
答して増殖するＣＤ４⁺Ｔ細胞またはＣＤ８⁺Ｔ細胞を、インビトロまたはインビ
ボのいずれかで大量に増加させ得る。このようなＴ細胞のインビトロでの増殖は
、種々の方法において達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子（例え
ば、インターロイキン−２）の添加を伴うか、または伴わずに、ママグロビンポ
リペプチド（例えば、このようなポリペプチドの免疫原性部分に対応する短いペ
プチド）、および／またはママグロビンポリペプチドを合成する刺激細胞に再曝
露され得る。ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答が産生される場合、刺激細胞の添加は好ましい
。Ｔ細胞は、ママグロビンポリペプチドとの断続的な再刺激に応答する特異性を
保持してインビトロで多数まで増殖し得る。簡単には、インビトロの刺激につい
て、リンパ球は、ヒト血清、ママグロビンタンパク質またはペプチドおよびサイ
トカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＩＬ−７）を含む媒体を有する
血管に配置され得る。細胞は、７〜１４日間インキュベートされ得、次いで、細
胞に存在する自己抗原提示細胞、ママグロビンタンパク質またはペプチドおよび
サイトカインを使用して類似の様式で再刺激され得る。抗原特異的Ｔ細胞はまた
、抗原またはマイトジェンまたは非特的の刺激因子（例えば、α−ＣＤ３または
ＰＨＡ）のいずれかを使用してインビトロで増殖し得る。

【００６０】あるいは、ママグロビンポリペプチドの存在下で増殖する１以上のＴ細胞は、
クローニングによって数が増加し得る。細胞をクローニングするための方法は、
当該分野で周知であり、そして限界希釈を意味しない。応答者Ｔ細胞は、密度勾
配遠心分離およびヒツジ赤血球ロゼット形成によって、感作された親の末梢血よ
り精製され得、そして、照射された自己フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）細胞の存在下
で正常抗原を用いて刺激することによって培養物中に確立される。ＣＤ４⁺細胞
株を産生するために、ママグロビンポリペプチドは、抗原性刺激として使用され
、そして自己末梢血リンパ球（ＰＢＬ）由来のＡＰＣまたはエプスタイン−バー
ウイルスでの感染によって不死化されたリンパ芽球腫細胞株（ＬＣＬ）を、抗原
提示細胞として使用した。ＣＤ８⁺Ｔ細胞株を産生するために、ママグロビンポ
リペプチドを産生する発現ベクターを用いてトランスフェクトされた自己抗原提
示細胞は、刺激細胞として使用され得る。確立されたＴ細胞株は、９６ウェルの
平らな底のプレートにウェルあたり０．５細胞の頻度で、１×１０⁶の照射され
たＰＢＬまたはＬＣＬ細胞および組換えインターロイキン２（ｒＩＬ−２）（５
０Ｕ／ｍｌ）で刺激されたＴ細胞をプレートすることによって抗原刺激後にクロ
ーン化され得る。確立されたクローンの増殖を有するウェルは、初めのプレート
後、約２〜３週間で同定され得、そして自己抗原提示細胞の存在化で適切な抗原
を用いて再刺激される。引き続いて、抗原刺激の後、２〜３日間の低用量のｒＩ
Ｌ−２（１０Ｕ／ｍｌ）の添加によって増殖した。Ｔ細胞クローンは、およそ２
週間おきの抗原およびｒＩＬ２を用いる周期性の再刺激によって２４ウェルプレ
ート内で維持され得る。クローンおよび／または増殖した細胞は、例えばＣｈａ
ｎｇら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２２：２１３，１９
９６に記載されたように患者に再び投与され得る。

【００６１】特定の実施形態において、同種のＴ細胞は、インビボおよび／またはインビト
ロでプライムされ得る（すなわち、ママグロビンに感作される）。このようなプ
ライミングは、Ｔ細胞のプライミングを可能にするのに十分な条件および時間、
ママグロビンポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドまたはこのようなポリペプチドを産生する細胞とＴ細胞との接触によって達
成され得る。一般的に、例えば、ママグロビンポリペプチドと接触が、本明細書
中に記載される標準増殖アッセイ、クロム放出アッセイおよび／またはサイトカ
イン放出アッセイによって測定されるようなＴ細胞の増殖および／または活性化
を生じた場合、Ｔ細胞はプライムされたと考えられる。ネガティブコントロール
と比較したサイトカインレベルの増殖または溶解における刺激指標の２倍以上の
増加、および３倍以上の増加は、Ｔ細胞特異性を示す。インビトロでプライムさ
れた細胞は、例えば、骨髄移植においてか、またはドナーのリンパ球感染注入と
して使用され得る。

【００６２】（薬学的組成物およびワクチン）特定の局面では、本明細書中に開示されるようなポリペプチド、ポリヌクレオ
チド、Ｔ細胞および／または結合因子を、薬学的組成物または免疫原性組成物（
すなわち、ワクチン）中に組み込み得る。あるいは、薬学的組成物は、ママグロ
ビンポリペプチドでトランスフェクトされた抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）
を含み、その結果、抗原提示細胞はママグロビンポリペプチドを発現する。薬学
的組成物生物は、１つ以上のこのような化合物または細胞および生理的に受容可
能なキャリアを含む。ワクチンは、１つ以上のこのような化合物または免疫賦活
薬を含み得る。免疫賦活薬は、外因性の抗原に対する（抗体および／または細胞
媒介性の）免疫応答を増強または強化する任意の物質であり得る。免疫賦活薬の
例としては、アジュバント、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラク
チド（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃｇａｌａｃｔｉｄｅ）およびリポソーム（この中
に、化合物を取り込む；例えば、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、米国特許第４，２３５，
８７７号を参照のこと）が挙げられる。ワクチン調製物は、一般的に、例えば、
Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編、「ＶａｃｃｉｎｅＤｅ
ｓｉｇｎ（ｔｈｅｓｕｂｕｎｉｔａｎｄａｄｊｕｖａｎｔａｐｐｒｏａ
ｃｈ）」、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ（ＮＹ、１９９５）に記載される。本発明
の範囲内にある薬学的組成物およびワクチンはまた、生物学的に活性または不活
性であり得る他の化合物を含み得る。例えば、他の腫瘍抗原の１つ以上の免疫原
性部分は、組成物またはワクチンにおいて、融合ポリペプチドに組み込まれてか
または個々の化合物としてのいずれかで存在し得る。

【００６３】薬学的組成物またはワクチンは、上記のような１つ以上のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを含み得、その結果、そのポリペプチドはインサイチュで生成され
る。上記のように、ＤＮＡは、当業者に公知の種々の任意の送達系（核酸発現系
、細菌性発現系、およびウイルス性発現系ならびに哺乳動物発現系を含む）にお
いて存在し得る。多数の遺伝子送達技術（例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｃｒｉｔ．
Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．ＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ１５：１
４３−１９８、およびその中で援用される参考文献）が当該分野で周知である。
適切な核酸発現系は、患者における発現のために必要なＤＮＡ配列を含む（例え
ば、適切なプロモーターおよび終結シグナル）。細菌性送達系は、細胞表面上で
ポリペプチドの免疫原性部分を発現するか、または分泌（エピトープ）する細菌
（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を含
む。好ましい実施形態では、ウイルス性発現系（例えば、ワクシニアもしくは他
のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を使用してＤＮ
Ａを導入し得る。このウイルス発現系は、非病原性（欠損性）の複製コンピテン
トなウイルスの使用を含み得る。適切な系は、例えば、以下において開示される
：Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、ＰＮＡＳＵ．Ｓ．Ａ．８６：３１７−３２１、
１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８
６−１０３、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ８：１７−２１、
１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号、およ
び同第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７
，１２７号；ＧＢ２，２００，６５１；ＥＰ０，３４５，２４２；ＷＯ９
１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６１６−
６２７、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：４３１−
４３４、１９９１；Ｋｏｌｌｓら、ＰＮＡＳ９１：２１５−２１９、１９９４
；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、ＰＮＡＳＵ．Ｓ．Ａ．９０：１１４９８−１１
５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ８８：２８３８
−２８４８、１９９３；およびＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０
２−１２０７、１９９３。このような発現系にＤＮＡを組み込む技術は、当業者
に周知である。ＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９
：１７４５−１７４９、１９９３において記載され、そしてＣｏｈｅｎ、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２５９：１６９１−１６９２、１９９３によって概説されるように、
「裸」であり得る。裸のＤＮＡの取り込みは、生分解性ビーズ（これは、細胞に
効率的に輸送される）上にＤＮＡをコーティングすることによって増加され得る
。ワクチンが、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド成分の両方を含み得ること
は明らかである。このようなワクチンは、増強された免疫応答を提供し得る。

【００６４】ワクチンは、本明細書中で提供されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
薬学的に受容可能な塩を含み得ることが明らかである。このような塩は、薬学的
に受容可能な非毒性の塩基（有機塩基（例えば、１級、２級および３級のアミン
ならびに塩基性アミノ酸の塩）、および無機塩基（例えば、ナトリウム塩、カリ
ウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩）を
含む）から調製され得る。

【００６５】当業者に公知の任意の適切なキャリアが、本発明の薬学的組成物において使用
され得るが、キャリアの型は、投与の様式に依存して変化する。本発明の組成物
は、任意の適切な投与の様式（例えば、局所的投与、経口投与、経鼻投与、静脈
内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋内投与を含む）について
処方され得る。非経口投与（例えば、皮下注射）については、キャリアは、好ま
しくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ろう、または緩衝液を含む。経口
投与については、任意の上記のキャリアまたは固体キャリア（例えば、マンニト
ール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリ
ン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウム）
を使用し得る。生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリラクテートポリグリコレ
ート）もまた、本発明の薬学的組成物のためのキャリアとして使用され得る。適
切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同
第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８
号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，
３４４号；および同第５，９４２，２５２号に開示される。

【００６６】このような組成物はまた、以下を含み得る：緩衝液（中性の緩衝化生理食塩水
またはリン酸緩衝化生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース
、スクロース、またはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチ
ド、またはアミノ酸（例えば、グリシン）、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤（例
えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニ
ウム）、処方物を患者の血液に対して等張性、低浸透性またはわずかに高浸透性
にする溶質、懸濁剤、濃化剤、および／または保存剤。あるいは、本発明の組成
物は、凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｅ）として処方され得る。化合物は
また、周知技術を使用して、リポソーム内にカプセル化され得る。

【００６７】任意の種々の免疫刺激薬が、本発明のワクチンにおいて使用され得る。例えば
、アジュバントが含められ得る。大半のアジュバントは、迅速な異化作用から抗
原を保護するために設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）
、および免疫応答の刺激物質（例えば、リピドＡ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａｐｅ
ｒｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ
由来のタンパク質）を含む。適切なアジュバントは、例えば、フロイントの不完
全アジュバントおよび完全アジュバント（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）、ＭｅｒｃｋＡｄｊｕｖａｎｔ６５（Ｍｅｒｃ
ｋａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）；ＡＳ−２（Ｓ
ｍｉｔｈＫｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）；水
酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムのようなアルミ
ニウム塩；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；
アシル化糖；カチオン性またはアニオン性の誘導体化多糖類；ポリホスファゼン
（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリ
ルリピドＡおよびクイルＡ（ｑｕｉｌＡ）として市販されている。ＧＭ−ＣＳ
Ｆまたはインターロイキン−２、インターロイキン−７、もしくはインターロイ
キン−１２のようなサイトカインもまた、アジュバントとして使用され得る。

【００６８】本明細書中に提供されるワクチンでは、アジュバント組成物は、好ましくは、
優勢にＴｈ１型の免疫応答を誘導するように設計され得る。高レベルのＴｈ１型
サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与され
た抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導に有利な傾向がある。対照的に、高レ
ベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−
１０およびＴＮＦ−β）は、体液性免疫応答の誘導に有利な傾向がある。本明細
書中に提供されるようなワクチンの適用後、患者は、Ｔｈ１型応答およびＴｈ２
型応答を含む免疫応答を支持する。応答が優勢にＴｈ１型である好ましい実施形
態では、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより
も高い程度に増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを使
用して容易に評価され得る。サイトカインのファミリーの概説については、Ｍｏ
ｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４
５−１７３、１９８９を参照のこと。

【００６９】優勢にＴｈ１型応答を誘発する際の使用のために好ましいアジュバントとして
は、例えば、モノホスホリルリピドＡ（好ましくは、３−デ−Ｏ−アシル化モノ
ホスホルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩との組み合わせが挙げられ
る。ＭＰＬアジュバントは、ＣｏｒｉｘａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔ
ｔｌｅ、ＷＡ；米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；
同第４，８６６，０３４号；および同第４，９１２，０９４号を参照のこと）か
ら入手可能である。ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチド（ここで、ＣｐＧジヌ
クレオチドはメチル化されていない）もまた、優勢にＴｈ１応答を誘導する。こ
のようなオリゴヌクレオチドは周知であり、そして例えば、ＷＯ９６／０２５
５５およびＷＯ９９／３３４８８に記載されている。免疫刺激ＤＮＡ配列もまた
、例えば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７３：３５２、１９９６により記載
される。別の好ましいアジュバントはサポニン、好ましくは、ＱＳ２１（Ａｑｕ
ｉｌａＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＩｎｃ．、Ｆｒａｍｉｎｇｈ
ａｍ、ＭＡ）であり、これは単独または他のアジュバントと組み合わせて使用さ
れ得る。例えば、増強される系としては、モノホスホルリピドＡとサポニン誘導
体の組み合わせ（例えば、ＷＯ９４／００１５３に記載のようなＱＳ２１と３
Ｄ−ＭＰＬの組み合わせ）、またはＷＯ９６／３３７３９に記載のような、反
応原性の低い組成物（ここでは、ＱＳ２１は、コレステロールでクエンチされる
）が挙げられる。他の好ましい処方物は、水中油エマルジョンおよびトコフェロ
ールが挙げられる。水中油エマルジョン中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコ
フェロールを含有する特定の強力なアジュバント処方物が、ＷＯ９５／１７２
１０中に記載される。

【００７０】他の好ましいアジュバントには、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ７２０（Ｓｅ
ｐｐｉｃ、Ｆｒａｎｃｅ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕ
ｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒ
ｏｎ）、ＳＢＡＳシリーズのアジュバント例えば、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅＢｅ
ｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能なＳＢＡＳ−２
またはＳＢＡＳ−４）、Ｄｅｔｏｘ（ＣｏｒｉｘａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；
Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、ＲＣ−５２９（ＣｏｒｉｘａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ；Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）およびアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェ
ート（ＡＧＰ）が挙げられる。

【００７１】本明細書中で提供される任意のワクチンは、抗原、免疫刺激薬およびお適切な
キャリアまたは賦形剤の組み合わせを生じる周知の方法を使用して調製され得る
。本明細書において記載される組成物は、徐放性処方物（すなわち、投与後、化
合物の緩徐な放出をもたらすカプセル、スポンジ、またはゲル（例えば、多糖類
からなる）のような処方物）の一部として投与され得る。このような処方物は一
般に、周知の技術を用いて調製され得（例えば、Ｃｏｏｍｂｅｓら、Ｖａｃｃｉ
ｎｅ１４：１４２９〜１４３８、１９９６を参照のこと）、そして例えば、経
口、直腸または皮下移植によってか、あるいは所望の標的部位への移植によって
投与され得る。徐放性処方物は、キャリアマトリックスに分散され、そして／ま
たは速度制御膜に囲まれる貯蔵所内に含まれる、ポリペプチド、ポリヌクレオチ
ドまたは抗体を含み得る。

【００７２】このような処方物内での使用のためのキャリアは、生体適合性であり、そして
また生分解性であり得る；好ましくは、この処方物は比較的一定レベルの活性成
分の放出を提供する。このようなキャリアには、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコ
リド）、ならびにポリアクリレート、ラテックス、スターチ、セルロースおよび
デキストランの微粒子が挙げられる。他の徐放性キャリアには、超分子バイオベ
クターが挙げられ、これは、非液体親水性コア（例えば、架橋ポリサッカリドま
たはオリゴサッカリド）、および必要に応じて、リン脂質のような両親媒性化合
物を含む外層を含む（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号、およびＰＣＴ
出願ＷＯ９４／２００７８、ＷＯ／９４／２３７０１およびＷＯ９６／０６６
３８を参照のこと）。適切な処方物内に含まれる活性化化合物の量は、移植の部
位、放出の速度および予測持続時間、ならびに処置または予防される状態の特徴
に依存する。

【００７３】任意の種々の送達ビヒクルが、腫瘍細胞を標的化する抗原特異的な免疫応答の
産生を容易にするために、薬学的組成物およびワクチンにおいて使用され得る。
送達ビヒクルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ
、Ｂ細胞、単球、および効率的なＡＰＣとなるように操作され得る他の細胞）を
含む。このような細胞は、抗原を提示する能力を増加させるために、Ｔ細胞応答
の活性化および／または維持を改善するために、抗腫瘍効果自体を有するように
、および／または受け手（すなわち、整合したＨＬＡハプロタイプ）と免疫学的
に適合性であるように、遺伝的に改変され得るが、必要ではない。ＡＰＣは、一
般的に、任意の種々の生物学的液体および器官（腫瘍組織および腫瘍周囲組織を
含む）から単離され得、そして自系、同種異系、同系または異種の細胞であり得
る。

【００７４】本発明の特定の好ましい実施形態は、抗原提示細胞として、樹状細胞またはそ
の前駆細胞を使用する。樹状細胞は、高度に強力なＡＰＣであり（Ｂａｎｃｈｅ
ｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ３９２：２４５−２５１、１
９９８）、そして予防的または治療的な抗腫瘍免疫性を誘発するための生理学的
アジュバンドとして有効であることが示されてきた（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎおよび
Ｌｅｖｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５０：５０７−５２９、１９９９を参照の
こと）。一般に、樹状細胞は、それらの代表的な形状（インサイチュでは星状、
インビトロでは目に見える顕著な細胞質突起（樹枝状結晶）を有する）、高い効
率で抗原を取り込み、処理し、そして提示するそれらの能力、および未処置の（
ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞応答を活性化するそれらの能力に基づいて同定され得る。も
ちろん樹状細胞は、インビボまたはエキソビボで樹状細胞上に通常見出されない
特定の細胞表面レセプターまたはリガンドを発現するように操作され得、このよ
うな改変樹状細胞は本発明によって意図される。樹状細胞の代替として、分泌小
胞抗原装荷樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄｖｅｓｉｃｌｅｓａｎｔｉｇｅｎ−
ｌｏａｄｅｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ）（エキソソーム（ｅｘｏｓｏ
ｍｅ）と呼ばれる）がワクチン内で使用され得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔ
ｕｒｅＭｅｄ．４：５９４−６００，１９９８を参照のこと）。

【００７５】樹状細胞および前駆体は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周囲の組織浸潤
細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または任意の他の適切な組織もしくは液
体から獲得され得る。例えば、樹状細胞は、末梢血から回収された単球の培養物
に対して、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαのよう
なサイトカインの組み合わせを添加することによって、エキソビボで分化され得
る。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から回収されたＣＤ３４陽性細胞は、
ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガ
ンドおよび／または樹状細胞の成熟および増殖を誘導する他の化合物の組み合わ
せを、培養培地に添加することによって、樹状細胞に分化され得る。

【００７６】樹状細胞は、「未熟」細胞および「成熟」細胞として都合良く分類され、この
ことは、２つの充分に特徴付けられた表現型の間を区別する単純な方法を与える
。しかしこの学名は、あらゆる可能な分化の中間段階を排除するように解釈され
るべきではない。未熟な樹状細胞は、抗原の取り込みおよび処理の高い能力を有
するＡＰＣとして特徴付けられ、この能力は、Ｆｃγレセプターおよびマンノー
スレセプターの高度な発現と相関する。成熟表現型は、代表的に、クラスＩおよ
びクラスＩＩＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに
同時刺激性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）の
ようなＴ細胞活性化の原因である細胞表面分子の高度な発現ではなく、これらの
マーカーのより低い発現によって特徴付けられる。

【００７７】ＡＰＣは、一般に、胸部腫瘍タンパク質（またはその部分もしくは他の改変体
）をコードするポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトされ得、その結果、
胸部腫瘍ポリペプチドまたはその免疫原性部分が細胞表面上に発現される。この
ようなトランスフェクションはエキソビボで生じ得、次いでこのようなトランス
フェクトされた細胞を含む組成物またはワクチンは、本明細書中に記載されるよ
うに、治療目的のために使用され得る。あるいは、細胞を提示する樹状または他
の抗原を標的とする遺伝子送達ビヒクルが、患者に投与され得、インビボで起こ
るトランスフェクションを生じる。樹状細胞のインビボおよびエキソビボでのト
ランスフェクションは、例えば、ＷＯ９７／２７４４４７に記載される方法、ま
たはＭａｈｖｉら、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙａｎｄｃｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ
７５：４５６−４６０、１９９７によって記載される遺伝子銃アプローチのよ
うな当該分野で公知の任意の方法を使用して一般に実施され得る。樹状細胞の抗
原装荷は、樹状細胞または前駆細胞を、胸部腫瘍ポリペプチド、ＤＮＡ（裸のも
しくはプラスミドベクター中の）またはＲＮＡ；あるいは抗原発現性組換え細菌
またはウイルス（例えば、牛痘、鶏痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスの
ベクター）とインキュベートすることによって達成され得る。装荷の前に、ポリ
ペプチドは、Ｔ細胞補助（例えば、キャリア分子）を提供する免疫学的パートナ
ーに共有結合され得る。あるいは、樹状細胞は、単独でかまたはポリペプチドの
存在下で、結合していない免疫学的パートナーでパルス（ｐｕｌｓｅ）され得る
。

【００７８】ワクチンおよび薬学的組成物は、密閉アンプルまたはバイアルのような単位用
量または多用量容器内に提供され得る。このような容器は、好ましくは、使用す
るまで処方物の無菌状態を損なわないために、密閉される。一般に、処方物は、
油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンとして保存され得
る。あるいは、ワクチンまたは薬学的組成物は、使用直前の滅菌液体キャリアの
添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存され得る。

【００７９】（癌治療）本発明のさらなる局面において、本明細書中に記載される組成物は、癌（例え
ば、乳癌）の免疫療法のために使用され得る。このような方法では、代表的に、
薬学的組成物およびワクチンが患者に投与される。本明細書中で使用される場合
、「患者」は、任意の温血動物、好ましくはヒトをいう。患者は、癌に冒されて
いても冒されていなくともよい。従って、上記の薬学的組成物およびワクチンは
、癌の発症を妨げるためか、または癌に冒された患者を処置するために使用され
得る。癌は、当該分野で一般に認められている判定基準（悪性腫瘍の存在を含む
）を使用して診断され得る。薬学的組成物およびワクチンは、原発性腫瘍の外科
的除去ならびに／または放射線療法および従来の化学療法薬物の投与のような処
置の前後のいずれかに投与され得る。

【００８０】特定の実施形態では、免疫療法は能動免疫療法であり得る。能動免疫療法にお
いて、処置は、免疫応答改変因子（例えば、腫瘍ワクチン、細菌性アジュバント
、および／またはサイトカイン）の投与による、腫瘍に対して反応する内因性宿
主免疫系のインビボ刺激に依存する。

【００８１】他の実施形態では、免疫療法は受動免疫療法であり得る。受動免疫療法におい
て、処置は、確立された腫瘍免疫反応性を有する因子（例えば、エフェクター細
胞または抗体）の送達を包含する。この因子は、抗腫瘍効果を直接または間接的
に媒介し得、そして、必ずしもインタクトな宿主免疫系に依存するとは限らない
。エフェクター細胞の例としては、以下が挙げられる：Ｔリンパ球（例えば、Ｃ
Ｄ８^-細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４^- Ｔヘルパー腫瘍浸潤リンパ球）、キ
ラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞
）、Ｂ細胞、および本明細書中に提供されるポリペプチドを発現する抗原提示細
胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）。本明細書中に列挙されるポリペ
プチドに対して特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、養子免疫療
法のために、クローン化され、発現され、そして他のベクターまたはエフェクタ
ー細胞中に移入され得る。本明細書中に提供されるポリペプチドはまた、受動免
疫療法のために、抗体または抗イディオタイプ抗体（上記および米国特許第４，
９１８，１６４号に記載のような）を生成するために使用され得る。

【００８２】エフェクター細胞は、本明細書中に記載されるように、一般的にインビトロで
の増殖によって養子免疫療法のために十分な量で獲得され得る。単一抗原特異的
エフェクター細胞を、インビボでの抗原認識を保持しながらその数を何十億にま
で増殖させるための培養条件は、当該分野で周知である。このようなインビトロ
培養条件は、代表的に、しばしばサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および非分
裂性フィーダー細胞の存在下における、抗原での断続刺激を利用する。上記のよ
うに、本明細書中に提供される免疫反応性ポリペプチドは、免疫療法のために十
分な数の細胞を生成するために、抗原特異的Ｔ細胞培養物を迅速に増殖させるよ
うに使用され得る。特に、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージま
たはＢ細胞）は、当該分野で周知の種々の標準的技術を使用して、免疫反応性ポ
リペプチドを適用（ｐｕｌｓｅ）され得るか、または１つ以上のポリヌクレオチ
ドでトランスフェクトされ得る。例えば、抗原提示細胞は、組換えウイルスまた
は他の発現系において発現を増加させるために適切なプロモーターを有するポリ
ヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。治療における使用のための培養エフ
ェクター細胞は、インビボで広く増殖および分布し得、そして長期間生存し得な
ければならない。培養エフェクター細胞が、ＩＬ−２を補充された抗原での反復
刺激により、インビボで増殖しそして実質的な数で長期間生存するように誘導さ
れ得ることが、研究により示されている（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ、１５７：１７７、１９９７を参照のこと
）。

【００８３】本明細書中に開示されたポリぺプチドはまた、腫瘍反応性のＴ細胞を生成およ
び／または単離するために用いられ得、このＴ細胞は、次いで、患者に投与され
得る。１つのこのような技術において、抗原特異的なＴ細胞株は、開示されたポ
リぺプチドの免疫原性部分に対応する短いペプチドを用いて、インビボで免疫化
することによって生成され得る。得られた抗原特異性ＣＤ８^- ＣＴＬクローン
が患者から単離され得、標準的な組織培養技術を使用して増加され得、そして患
者に戻され得る。

【００８４】別の実施形態において、同系または自己樹状細胞は、本明細書に開示されたポ
リぺプチドの少なくとも免疫原性部分に対応するペプチドでパルスされ得る。得
られた抗原特異的な樹状細胞は、患者に移入され得るか、またはＴ細胞を刺激し
て順に患者に投与され得る抗原特異的なＴ細胞を提供するために用いられ得るか
のいずれかである。抗原特異的なＴ細胞を生成するためのペプチドパルスされた
樹状細胞の使用、ならびにマウスモデルにおいて腫瘍を根絶するためのこのよう
な抗原特異的なＴ細胞の続く使用が、Ｃｈｅｅｖｅｒら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，１５７：１７７，１９９７）により示される。

【００８５】あるいは、本明細書中に示されるポリペプチドを発現するベクターは、患者か
ら採取され、そしてその同じ患者に移植し戻すためにエキソビボでクローン増殖
された抗原提示細胞に導入され得る。形質転換細胞は、当該分野で公知の任意の
手段を使用して、好ましくは、静脈内投与、腔内投与、腹腔内投与または腫瘍内
投与により、滅菌形態でその患者に再導入され得る。

【００８６】投与の経路および頻度ならびに投薬量は、個体間で変化し、そして標準的技術
を使用して容易に確立され得る。一般に、薬学的組成物およびワクチンは、注射
により（例えば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下）、鼻腔的に（例えば、吸入
）、経口的に投与され得る。好ましくは、１〜１０の間の用量が、５２週間にわ
たり投与され得る。好ましくは、１ヶ月の間隔で、６用量が投与され、そしてそ
の後、追加免疫が定期的に与えられ得る。代替的プロトコルが、個々の患者に適
切であり得る。適切な用量は、上記されるように投与される場合に、抗腫瘍免疫
応答を促進し得、そして基底（すなわち、未処理）レベルより少なくとも１０〜
５０％上である化合物の量である。このような応答は、患者において抗腫瘍抗体
を測定することによってか、またはインビトロで患者の腫瘍細胞を殺傷し得る細
胞傷害性エフェクター細胞のワクチン依存的産生によってモニターされ得る。こ
のようなワクチンは、ワクチン接種されていない患者と比較して、ワクチン接種
された患者において改善された臨床結果（例えば、より頻繁な寛解、完全もしく
は部分的、またはより長い、疾患のない生存）に導く免疫応答を引き起こし得る
べきである。一般に、１つ以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチ
ンについて、１用量中に存在する各ポリペプチドの量は、宿主１ｋｇあたり約１
００μｇ〜５ｍｇの範囲である。適切な用量サイズは、患者のサイズによって変
化するが、代表的には、約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。

【００８７】一般的に、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的および／または予防的
利点を提供するに十分な量の活性化合物を提供する。このような応答は、処置さ
れていない患者と比較して、処置された患者において改善された臨床結果（例え
ば、より頻繁な寛解、完全もしくは部分的、またはより長い、疾患のない生存）
を確立することによって、モニターされ得る。ママグロビンに対する既存の免疫
応答の増加は、一般的に、改善された臨床結果と相関する。このような免疫応答
は、標準的な増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイまたはサイトカインアッセイを
使用して評価され得る。これらのアッセイは、処置の前後の患者から得られたサ
ンプルを用いて実施され得る。

【００８８】（癌を検出する方法）一般的に、癌は、患者から得られた生物学的サンプルにおける１つ以上のママ
グロビンエピトープまたはこれに対する抗体の存在に基づいて、患者において検
出され得る。換言すれば、このようなエピトープは、乳癌のような癌の存在また
は非存在を示すためのマーカーとして使用され得る。一般的に、このようなエピ
トープまたは抗体は、正常組織においてよりも腫瘍組織において少なくとも３倍
高いレベルで存在すべきである。

【００８９】サンプル中のポリペプチドマーカーを検出するために結合剤を使用することに
関して、当業者に公知の種々のアッセイ様式が存在する。例えば、Ｈａｒｌｏｗ
およびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８
８を参照のこと。一般的に、患者における癌の存在または非存在は、（ａ）患者
から得られた生物学的サンプルを結合剤と接触させること；（ｂ）この結合剤に
結合するポリペプチドのレベルを、サンプル中において検出すること；および（
ｃ）このポリペプチドのレベルを、所定のカットオフ値（ｃｕｔ−ｏｆｆｖａ
ｌｕｅ）と比較すること、によって決定され得る。

【００９０】好ましい実施形態では、このアッセイは、サンプルの残渣（ｒｅｍａｉｎｄｅ
ｒ）由来のポリペプチドに結合し、そしてそれを取り出すための固体支持体に固
定された結合剤の使用を含む。次いで、レポーター基（ｒｅｐｏｒｔｅｒｇｒ
ｏｕｐ）を含み、そして結合剤／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試
薬を使用して、結合したポリペプチドを検出し得る。このような検出試薬は、例
えば、ポリペプチドもしくは抗体に特異的に結合する結合剤、またはこの結合剤
に特異的に結合する他の因子（例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロ
テインＡ、またはレクチン）を含み得る。あるいは、競合的アッセイが使用され
得る。ここでは、ポリペプチドをレポーター基で標識し、そして結合剤とサンプ
ルとのインキュベーションの後に、固定された結合剤に結合させる。サンプルの
成分が、結合剤への標識化ポリペプチドの結合を阻害する程度は、固定された結
合剤とのサンプルの反応性の指標である。

【００９１】この固体支持体は、結合剤が結合され得ることが当業者に公知である、任意の
材料であり得る。例えば、この固体支持体は、マイクロタイタープレート中の試
験ウェルであっても、ニトロセルロース膜であっても、または他の適切な膜であ
ってもよい。あるいは、この支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス
）、ガラス繊維、ラテックスであっても、あるいはプラスチック材料（例えば、
ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）であってもよい。この支持体はまた、磁性
粒子であっても、光ファイバー検出器（例えば、米国特許第５，３５９，６８１
号に記載されるもの）であってもよい。この結合剤は、当業者に公知の種々の技
術を使用して、この固体支持体上に固定され得、このような技術は、特許および
科学文献に十分記載されている。本発明の文脈において、用語「固定」とは、非
共有結合（例えば、吸着）および共有結合（この薬剤とこの支持体上の官能基と
の間の直接の結合であっても、架橋剤による結合であってもよい）の両方をいう
。マイクロタイタープレート中のウェルまたは膜への吸着による固定が、好まし
い。このような場合、吸着は、適切な緩衝液中にあるこの結合剤を固体支持体と
適切な時間接触させる工程によって達成され得る。この接触時間は、温度によっ
て変化するが、代表的には、約１時間と約１日との間である。一般的には、プラ
スチックのマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビ
ニル）のウェルを、約１０ｎｇ〜約１０μｇの範囲の量の結合剤、好ましくは約
１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合剤と接触させる工程が、十分な量の結合
剤を固定するに十分である。

【００９２】固体支持体への結合剤の共有結合は、一般的には、まず、この支持体を二官能
性試薬と反応させる工程によって達成され得、ここで、この二官能性試薬は、こ
の支持体およびこの結合剤上の官能基（例えば、ヒドロキシル基またはアミノ基
）の両方と反応する。例えば、この結合剤は、ベンゾキノンを使用してか、また
はこの支持体上のアルデヒド基をこの結合パートナー上のアミンおよび活性水素
と縮合させることによって、適切なポリマーコーティングを有する支持体に共有
結合され得る（例えば、ＰｉｅｒｃｅＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣ
ａｔａｌｏｇａｎｄＨａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２〜Ａ１３を参照の
こと）。

【００９３】特定の実施形態において、このアッセイは、二抗体サンドイッチアッセイであ
る。このアッセイは、固体支持体（一般的には、マイクロタイタープレートのウ
ェル）上に固定されている抗体を、まずそのサンプルと接触させて、その結果、
このサンプル内のポリペプチドがこの固定された抗体に結合するのを可能にする
ことによって、実施され得る。次いで、未結合サンプルが、この固定されたポリ
ペプチド−抗体複合体から除去され、そしてレセプター基を含む検出試薬（好ま
しくは、このポリペプチド上の異なる部位に結合し得る２次抗体）が添加される
。次いで、この固体支持体に結合したままである検出試薬の量が、この特定のレ
ポーター基に適切な方法を使用して、決定される。

【００９４】より詳細には、上記のように、一旦この抗体が支持体上に固定されると、この
支持体上の残りのタンパク質結合部位は、代表的にはブロックされる。当業者に
公知の任意の適切なブロック試薬（例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅ
ｎ２０^TM（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ
））が使用され得る。次いで、この固定された抗体は、そのサンプルとともにイ
ンキュベートされ、そしてポリペプチドがこの抗体に結合するのを可能にする。
このサンプルは、適切な希釈剤（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））
で希釈された後にインキュベートされ得る。一般的には、適切な接触時間（すな
わち、インキュベーション時間）は、乳癌を有する個体から得られたサンプル中
のポリペプチドの存在を検出するに十分な時間である。好ましくは、この接触時
間は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡な状態で達成される
レベルの少なくとも約９５％である結合レベルを達成するに十分である。当業者
は、平衡を達成するために必要な時間が、一定時間にわたって生じる結合のレベ
ルをアッセイすることによって容易に決定され得ることを認識する。室温では、
約３０分というインキュベーション時間が、一般的に十分である。

【００９５】次いで、非結合サンプルは、適切な緩衝液（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０^TM）含有ＰＢＳ）を用いてこの固体支持体を洗浄することによって除去され
得る。次に、レポーター基を含む２次抗体が、この固体支持体に添加され得る。
好ましいレポーター基としては、上記の基が挙げられる。

【００９６】次いで、検出試薬が、結合されたポリペプチドを検出するのに十分な時間の間
、固定化抗体−ポリペプチド複合体と共にインキュベートされる。適切な時間量
は、一般的に、一定時間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることによ
り決定され得る。次いで、非結合検出試薬が除去され、そして結合された検出試
薬が、レポーター基を使用して検出される。レポーター基を検出するために使用
される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射活性基については、シンチ
レーション計数またはオートラジオグラフィー方法が、一般に適切である。分光
学的方法が、色素、発光基および蛍光基を検出するために使用され得る。ビオチ
ンは、異なるレポーター基（通常、放射活性基または蛍光基、あるいは酵素）に
カップリングされたアビジンを使用して検出され得る。酵素レポーター基は、一
般に、基質の添加（一般に、特定の時間の間）、続いてその反応産物の分光学的
分析または他の分析により、検出され得る。

【００９７】癌（例えば、乳癌）の存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合
したままであるレポーター基から検出されるシグナルが、一般的には、所定のカ
ットオフ値に対応するシグナルと比較される。１つの好ましい実施形態において
、癌の検出のためのカットオフ値は、癌を有していない患者由来のサンプルとと
もに固定化抗体をインキュベートした場合に得られる、平均シグナルの平均値で
ある。一般的に、所定のカットオフ値よりも標準偏差３つ分高いシグナルを発生
するサンプルは、癌について陽性であるとみなされる。別の好ましい実施形態に
おいて、このカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、ＣｌｉｎｉｃａｌＥｐｉｄ
ｅｍｉｏｌｏｇｙ：ＡＢａｓｉｃＳｃｉｅｎｃｅｆｏｒＣｌｉｎｉｃａ
ｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＬｉｔｔｌｅＢｒｏｗｎａｎｄＣｏ．，１９８５
、１０６〜１０７頁の方法に従って、ＲｅｃｅｉｖｅｒＯｐｅｒａｔｏｒＣ
ｕｒｖｅを使用して決定される。手短に言うと、この実施形態において、このカ
ットオフ値は、診断試験の結果についての各可能なカットオフ値に対応する、真
の陽性割合（すなわち、感受性）および偽陽性の割合（１００％−特異性）の対
のプロットから決定され得る。左側上方の隅に最も近いプロットに対するカット
オフ値（すなわち、最も大きい領域を囲む値）が、最も正確なカットオフ値であ
り、そしてこの方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生成す
るサンプルは、陽性であるとみなされ得る。あるいは、このカットオフ値は、プ
ロットに沿って左にシフトされて、偽陽性の割合を最小化し得るし、または右に
シフトされて偽陰性の割合を最小化し得る。一般的に、この方法によって決定さ
れたカットオフ値より高いシグナルを生成するサンプルは、癌について陽性であ
るとみなされる。

【００９８】特定の実施形態について（例えば、サンドイッチアッセイ）、抗原の定量測定
が得られ得る。このような実施形態において、標準曲線が作製され得る。次いで
、特定のサンプルにおける抗原レベルについて得られたシグナルは、標準曲線と
比較され、定量を可能にし得る。このようなアッセイにおけるカットオフ値は、
乳癌の存在を示すママグロビンの量であり得る。

【００９９】関連する実施形態において、このアッセイは、貫流型（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕ
ｇｈ）試験形式または小片型（ｓｔｒｉｐ）試験形式で実行され、ここで、結合
剤は、膜（例えば、ニトロセルロース）上に固定化される。貫流型試験において
、サンプル中のポリペプチドは、そのサンプルが膜を通過するときに、固定化結
合剤に結合する。次いで、第２の標識結合剤が、その第２の結合剤を含む溶液が
膜を貫流するときに、結合剤−ポリペプチド複合体に結合する。次いで、結合し
た第２の結合剤の検出が、上記のように実施され得る。小片試験形式において、
結合剤が結合される膜の一端が、そのサンプルを含む溶液中に浸される。そのサ
ンプルは、第２の結合剤を含む領域を通って、固定化結合剤の領域まで膜に沿っ
て移動する。固定化抗体の領域での第２の結合剤の濃縮は、癌の存在を示す。代
表的に、その部位での第２の結合剤の濃縮は、視覚的に読取られ得るパターン（
例えば、線）を生じる。このようなパターンがないことは、陰性の結果を示す。
一般的に、膜上に固定化される結合剤の量は、その生物学的サンプルが、上記で
考察した形式で、二抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生成する
のに十分であるレベルのポリペプチドを含む場合に、視覚的に識別可能なパター
ンを生成するよう選択される。このようなアッセイにおける使用のための好まし
い結合剤は、抗体およびその抗原結合フラグメントである。好ましくは、膜上に
固定化された抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇ、そしてより好ましくは約５０
ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試験は、代表的に、非常に少量の
生物学的サンプルを用いて実施され得る。

【０１００】もちろん、本発明のエピトープおよび結合剤を用いる使用に適切な、多くの他
のアッセイプロトコールが存在する。上記の記載は、例示であることのみ意図さ
れる。例えば、上記のプロトコルが、生物学的サンプル中でこのようなポリペプ
チドに結合する抗体を検出するために本明細書中に記載されるポリペプチドを使
用するように容易に改変され得ることが、当業者には明らかである。このような
ママグロビンエピトープ特異的抗体の検出は、癌の存在と相関し得る。他の好ま
しいアッセイプロトコルとしては、レーザースキャニングサイトメトリー（細胞
を標識抗体で染色する、顕微鏡技術）および免疫組織化学的検出が挙げられる。
このような技術は、一般的に、当該分野で公知の技術に従って実行され得る。本
明細書中に提供されたような抗体をさらに使用して細胞同定およびインビトロで
の分類を容易にし得る。このことによってママグロビン（または異なるママグロ
ビンレベル）を発現する細胞の選択が可能になる。好ましくは、このような方法
で使用するための抗体は、検出可能なマーカーに連結される。適切なマーカーは
当該分野で周知であり、そしてそれらとしては、放射性核種、発光基、蛍光基、
酵素、色素、定常イムノグロブリンドメインおよびビオチンが挙げられる。１つ
の好ましい実施形態において、例えば、フルオレセインのような蛍光マーカーに
連結された抗体が細胞と接触され、次いで、これは、蛍光活性化セルソーティン
グ（ＦＡＣＳ）によって分析される。

【０１０１】別の実施形態において、上記ポリペプチドは、癌の進行のためのマーカーとし
て使用され得る。この実施形態において、癌の診断のための上記のようなアッセ
イが、経時的に実施され得、そして反応性ポリペプチドのレベルの変化が評価さ
れ得る。例えば、このアッセイは、６ヶ月〜１年の期間に２４〜７２時間ごとに
実施され得、その後も必要ならば実施され得る。一般的に、癌は、結合剤によっ
て検出されるポリペプチドのレベルが経時的に増加する患者において進行してい
る。対照的には、この癌は、反応性ポリペプチドのレベルが一定のままであるか
または時間とともに減少するかのいずれかである場合には、進行していない。

【０１０２】特定のインビボ診断アッセイは、腫瘍に対して直接実施され得る。１つのこの
ようなアッセイは、腫瘍細胞を結合剤と接触させる工程を包含する。次いで、結
合された結合剤が、レポーター基を介して直接的または間接的に検出され得る。
このような結合剤はまた、組織学的適用において使用され得る。

【０１０３】感度を改善するために、本明細書中に記載のアッセイは、他の腫瘍関連抗原を
検出するためのアッセイと組み合わされ得る。異なるタンパク質に特異的な結合
剤は、シグナルアッセイにおいて組み合わされ得ることが明らかである。腫瘍タ
ンパク質マーカーの選択は、最適な感度を生じる組み合わせを決定するための慣
用的な試験に基づき得る。

【０１０４】本発明の代替的な実施形態によって、癌は、患者から得られる生物学的サンプ
ルにおけるママグロビンポリヌクレオチドの存在に基づいて患者において検出さ
れ得る。換言すれば、このようなポリヌクレオチドを、マーカーとして使用し、
癌（例えば、乳癌）の存在または非存在を示し得る。特に、ポリヌクレオチドプ
ライマーおよびポリヌクレオチドプローブを使用し、ママグロビンをコードする
ｍＲＮＡのレベルを検出し得る。このｍＲＮＡは、乳癌の存在または非存在を示
す。一般的には、正常組織より少なくとも２倍高い、好ましくは３倍高いレベル
のママグロビンポリヌクレオチドの存在は、乳癌を示す。

【０１０５】本明細書中で提供されたアッセイのために用いられ得る種々の体液および腫瘍
サンプルを含む、種々の生物学的サンプルが存在する。好ましいサンプルは、血
液およびその画分（例えば、末梢血、血清または血漿）である。一般的には、Ｒ
ＮＡは、血液またはその画分から任意の標準的な技術を用いて単離され得る。

【０１０６】ＰＣＲ分析またはハイブリダイゼーション分析の前に、サンプルを、任意の標
準的な技術によって処置し、上皮細胞を除去する。本発明の文脈において、この
ような処置がアッセイの感度を約１０倍まで改善することを見出した。上皮細胞
を取り除く１つの方法は、Ｄｙｎａｌの上皮細胞富化ビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓ
ｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を使用する。この方法は、製造業社の説明書に従って使用
され得る。分析のための好ましいサンプルは、上皮細胞を除去した患者の全血サ
ンプルである。

【０１０７】特定の実施形態において、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーが
、生物学的サンプル由来のママグロビンｃＤＮＡの一部を増幅するために、ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて使用され得、このオリゴ
ヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つは、ママグロビンをコードする
ポリヌクレオチドに特異的である（すなわち、ハイブリダイズする）。次いで、
この増幅されたｃＤＮＡは、当該分野で周知の技術（例えば、ゲル電気泳動およ
びオートラジオグラフィー）を使用して、分離および検出される。同様に、ママ
グロビンポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプ
ローブが、生物学的サンプル中のママグロビンの発現を検出するために、ハイブ
リダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。

【０１０８】アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌク
レオチドプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さ、好
ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さのママグロビンポリヌクレオチドの
一部に対して、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％そしてより
好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有する、オリゴヌクレオチド配列を含
むべきである。本明細書中に記載される診断方法において有用に使用され得るオ
リゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、好ましくは少なくとも
１０〜４０ヌクレオチドの長さである。ＰＣＲに基づくアッセイおよびハイブリ
ダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野で周知である（例え
ば、Ｍｕｌｌｉｓら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ．Ｑｕ
ａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３、１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲＴｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ、ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９を参照のこと
）。

【０１０９】１つの好ましいアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを使用し、ＲＴ−ＰＣＲにおいては
、ＰＣＲが、逆転写と組み合わせて適用される。代表的には、ＲＮＡが、生検組
織のような生物学的サンプルから抽出され、そしてｃＤＮＡ分子を生成するよう
に逆転写される。少なくとも１つの特異的プライマーを使用するＰＣＲ増幅は、
例えば、ゲル電気泳動を使用して分離および可視化され得る、ｃＤＮＡ分子を生
じる。増幅は、試験患者および癌に罹患していない個体から採取された、生物学
的サンプルに対して実施され得る。この増幅反応は、２桁の大きさに及ぶｃＤＮ
Ａのいくつかの希釈物に対して実施され得る。非癌性サンプルの同じ希釈物と比
較して、試験患者サンプルのいくつかの希釈物における２倍以上の発現の増加は
、代表的に陽性とみなされる。

【０１１０】このようなアッセイで使用され得るなお別の増幅技術は、リアルタイムＰＣＲ
である（Ｇｉｂｓｏｎｅｔａｌ．，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ６
：９９５−１００１，１９９６；Ｈｅｉｄｅｔａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ６：９８６−９９４，１９９６を参照のこと）。リアル
タイムＰＣＲは、増幅の間のＰＣＲ産物の蓄積のレベルを評価する技術である。
この技術は、複数のサンプルにおけるｍＲＮＡレベルの定量的評価を可能にする
。簡単には、ｍＲＮＡは、標準的な技術を用いて目的の細胞から最初に抽出され
る。リアルタイムＰＣＲは、例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅ
ｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）７７００Ｐｒｉ
ｓｍ装置を使用して、行われ得る。一致するプライマーおよび蛍光プローブは、
例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（
ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）により提供されるプライマー発現プログラムを
用いてママグロビンについて設計され得る。プライマーおよびプローブの最適濃
度は、当業者により、最初に、決定され得、そしてコントロール（例えば、β−
アクチン）プライマーおよびプローブは、例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／
ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）から商
業的に入手され得る。サンプルにおけるママグロビンＲＮＡの量を定量するため
に、検量線が、ママグロビン遺伝子を含むプラスミドを用いて並行して作成され
る。目的の遺伝子の１０〜１０⁶のコピーの範囲の標準希釈は、一般に十分であ
る。さらに、検量線は、コントロール配列について作成される。これは、比較目
的のために、組織サンプルの初期のＲＮＡ量の、コントロールの量に対する標準
化を可能にする。

【０１１１】特定のインビボ診断アッセイは、腫瘍に対して直接実施され得る。１つのこの
ようなアッセイは、腫瘍細胞を結合剤と接触させる工程を包含する。次いで、結
合された結合剤が、レポーター基を介して直接的または間接的に検出され得る。

【０１１２】上記のように、感度を改善するために、複数の乳房腫瘤タンパク質マーカーが
、所定のサンプルにおいてアッセイされ得る。例えば、本明細書中に記載される
ようなポリヌクレオチドプローブまたはプライマーは、異なるマーカーを検出す
るように設計されたプローブおよびプライマーと同時に使用され得る。乳房腫瘤
マーカーの選択は、最適な感度を生じる組み合わせを決定するための慣用的実験
に基づき得る。

【０１１３】（診断キット）本発明は、上記の診断方法のうちのいずれかにおける使用のためのキットをさ
らに提供する。このようなキットは、代表的には、診断アッセイを実施するため
に必要な２つ以上の成分を含む。成分は、化合物、試薬、容器および／または装
置であり得る。例えば、キット中の１つの容器が、ママグロビンエピトープに特
異的に結合する、モノクローナル抗体またはそのフラグメントを含み得る。この
ような抗体またはフラグメントは、上記のように、支持体材料に結合して提供さ
れ得る。１つ以上のさらなる容器が、このアッセイにおいて使用される要素（例
えば、試薬または緩衝液）を含み得る。このようなキットはまた、またはあるい
は、抗体結合の直接検出または間接検出に適切な、レポーター基を含む上記のよ
うな検出試薬を含み得る。

【０１１４】好ましいキットは、サンドイッチアッセイで使用するために設計されたキット
である。このようなキットは、このようなアッセイに使用するために２以上の成
分を含む。例えば、このようなキットは、検量線の作成に使用する組換えママグ
ロビンに基づく標準を含み得る。このようなキットは、アッセイ内で使用するた
ための１つまたは両方の抗体（すなわち、捕捉抗体および／またはシグナル抗体
）を、ママグロビン結合の検出に使用するさらなる試薬を伴って、または伴わず
に含み得る。

【０１１５】キットは、上記のような少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブまたは
プライマーを含み得る生物学的サンプル中で、ママグロビンをコードするｍＲＮ
Ａのレベルを検出するように設計した。このようなオリゴヌクレオチドは、例え
ば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。この
ようなキット中に存在し得るさらなる成分としては、ママグロビンポリヌクレオ
チドの検出を容易にするための、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または診断
試薬もしくは診断容器が挙げられる。

【０１１６】以下の実施例は、例示として提供され、限定としては提供されない。

【０１１７】（実施例）（実施例１）（ママグロビンエピトープの同定および抗体の調製）本実施例は、抗ママグロビン抗体およびエピトープマッピングの調製を例示す
る。

【０１１８】ウサギおよびマウスを、全長ヒトママグロビンタンパク質で免疫化した。マウ
スモノクローナル抗体を、標準的なハイブリドーマ技術で単離した。ウサギのモ
ノクローナル抗体を、選択細胞質抗体法（ＳＬＡＭ）技術を用いて単離した。こ
れらの抗体に加えて、ママグロビンのＣ末端に対して指向される精製されたポリ
クローナル抗体もまた展開され、続いてＣ末端ペプチドでウサギを免疫化した。

【０１１９】図１Ａは、ママグロビンに対して展開されたモノクローナル抗体を例示する。
ウサギのモノクローナル抗体に対して、Ｉｇ可変領域を配列決定した。各ウサギ
の抗ママグロビンモノクローナル抗体の可変領域の配列を、図１Ｂ〜１Ｃに示す
。

【０１２０】各モノクローナル抗体のエピトープ結合領域を良好に規定するために、ママグ
ロビンタンパク質配列全体にわたる一連のペプチドを生成した。ママグロビンの
アミノ酸配列を図２に示し、そして対応するペプチドを示す。ペプチドに加えて
、ママグロビンの短い組換え形態を、プロテアーゼで切断することによって生成
した。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、２００ｎｇ／
ウェルのペプチドまたは組換え抗原のいずれかででコーティングした。４℃で一
晩かけてコーティングした。次いで、プレートを吸引し、そして１％（ｗ／ｖ）
ＢＳＡを含むリン酸緩衝液生理食塩水を用いて２時間室温で保護し、次いで０．
１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄した。ＰＢＳＴ中の異な
る希釈度（１０００〜７．８ｎｇ／ｍｇ）の精製したウサギの抗体を、このウェ
ルに添加し、そして室温で３０分間インキュベートした。このウェルをＰＢＳＴ
で６回洗浄し、次いでさらに３０分間かけて１／２０００希釈度で結合させたタ
ンパク質Ａ−ＨＲＰでインキュベートした。プレートをＰＢＳＴ中で６回洗浄し
、次いでさらに１５分間、テトラメチルベンジジン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂ
ｅｎｚｉｄｉｎｅ）（ＴＭＳ）基質でインキュベートした。この反応を１Ｎの硫
酸を添加することによって停止させ、そしてプレートをＥＬＩＳＡプレートリー
ダーを使用して４５０ｎｍで読み取った。

【０１２１】マウスのモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡを、アッセイにおいてニート
な状態で実施した組織培養物由来の上清で行った。

【０１２２】このデータの要約を図３Ａに示す。影を付けた細胞は、抗体に対して陽性であ
ると考えられる。３種の異なるエピトープの反応性を、図３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄ
に示す、ここで２Ｄ３は、ｐｒｏ５およびＮ末端組換え体と反応し、そして２９
Ｃ１１は、ｐｒｏ２と弱く反応する。抗ママグロビン抗体のエピトープ結合部位
を、図１Ａに要約する。

【０１２３】エピトープのマッピングに続き、抗体を、ママグロビンを発現する細胞株（Ｍ
Ｂ４１５乳癌細胞）でのＦＡＣＳ分析で試験した。抗体結合の特異性について確
認するために、ママグロビンを発現しないＭＣＦ−７細胞をまた、同一の条件下
でＦＡＣＳ分析によって試験した。細胞を、２０分間４％のホルムアルデヒドで
固定し、その後２回洗浄した。次いで、細胞を、１０分間０〜０．１％のサポニ
ンを含有するＰＢＳで透過化処理した。０．５μｇの抗ママグロビンモノクロー
ナル抗体を添加し、そして細胞を室温で３０分間インキュベートし、その後２回
洗浄し、そしてＦＩＴＣで標識したヤギの抗ウサギまたはマウス第二抗体で２０
分間インキュベートした。２回洗浄した後、細胞を、Ｅｘｃｅｌｉｂｕｒ蛍光活
性化細胞選別機で分析した。この結果を、図４Ａに例示する。

【０１２４】ウエスタンブロット分析をまた、抗ママグロビンモノクローナル特異性を特徴
づけするために使用した（図５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、１）ＭＤＭ−ＭＢ−４
１５細胞が増殖する培地上、２）ＭＤＡ−ＭＢ−４１５細胞溶解物上、および３
）細菌的に発現した組換えママグロビン上で実施した。タンパク質をニトロセル
ロースに移し、次いで抗ママグロビンモノクローナル抗体に対して、１μｇ／ｍ
ｌの抗体濃度でウエスタンブロットした。タンパク質を、ヤギの抗マウスモノク
ローナル抗体またはタンパク質Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのいずれかに結合される
ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使用して検出した。精製した抗ママグロビ
ンポリクローナル抗体は、細菌で発現された組換えママグロビンならびにＭＤＡ
−ＭＤ−４１５乳癌細胞で発現および分泌されたママグロビンを認識した。マウ
スおよびウサギの全てのモノクローナル抗体は、組換え細菌で発現されたママグ
ロビンを認識した。１９７１Ｈ１１を除いて、全てのマウスのモノクローナル抗
体は、細胞培地中に分泌されるママグロビン、または細胞質内で発現されるママ
グロビンを認識した。ウサギのママグロビン抗体１４Ａ１２、６Ｂ１２および２
Ｄ３は、細菌で発現されたママグロビン、ならびに細胞質で発現されたママグロ
ビンおよび培地中に分泌されるママグロビンを認識した。培地中に分泌されたマ
マグロビンを認識し得ないが、ウサギのモノクローナル抗体６Ａ１は、細菌で発
現されたママグロビンおよびＭＢ４１５細胞の細胞質で発現されたママグロビン
を認識し得た。モノクローナル抗体１９７−１Ｈ１１および６Ａ１がママグロビ
ンの特異的形態に関連して無力であることは、グリコシル化のような差動的翻訳
後改変に影響を与えており、そして／または抗体とママグロビンの親和性に関係
しているようである。

【０１２５】どの組織がママグロビンを発現しているかを決定するために、免疫組織化学（
ＩＨＣ）分析を、組織分泌の多様な範囲で実施した。組織サンプルを、２４時間
かけてホルマリン溶液中で固定し、そしてパラフィン中で包理し、その後に１０
ミクロンの断片中にスライスさせた。組織断片を透過化処理し、そして１時間か
けて抗ママグロビン抗体でインキュベートした。ＨＲＰ標識した抗マウスまたは
抗ウサギ抗体を使用して、ママグロビン免疫反応性を視覚化した。図６は、ママ
グロビンタンパク質の組織特異的分布を要約した。ママグロビンは、乳房の組織
中で高く発現したが、試験した他の以下の組織では見出されなかった：副腎、頚
部、結腸、十二指腸、胆嚢、回腸、腎臓、卵巣、膵臓、耳下腺、腺、前立腺、骨
格筋、脾臓、および精巣。

【０１２６】（実施例２）（ママグロビンのためのサンドイッチ免疫アッセイ）本実施例は、血清中でママグロビンを検出するために、本明細書中に提供され
る抗体の使用を例示する。

【０１２７】ママグロビンのＣ末端１６アミノ酸ペプチドに関する、モノクローナル抗体お
よびウサギポリクローナル抗体９６７を、ＭＢ４１５細胞の溶解物（ＭＢ４１５
細胞の細胞上清）中、およびまた乳癌患者の血清中のママグロビンを検出する能
力について、サンドイッチＥＬＩＳＡで評価した。抗体を、異なるエピトープを
検出するための能力に基づいて組合せた。以下に、試験したサンドイッチのいく
つかの組合せを記載する。全てのアッセイにおいて、検量線を、組換えママグロ
ビンを雄性の血清をスパイクすることによって構築した。

【０１２８】（マウス／ウサギ抗体サンドイッチ）アッセイを、サンドイッチの一部としてヤギの抗マウスＩｇＧの固相を使用す
る、マウスモノクローナル抗体を捕捉するように設計した。９６ウェルプレート
（ＣｏｓｔａｒＣｏｒｎｉｎｇ）を、２００ｎｇ／ウェルのヤギの抗マウスＩ
ｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ抗体、Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍｅ）で一晩４℃でコーティ
ングした。プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液生理食
塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳＴ）中で洗浄し、次いでリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）中の１％ＢＳＡで２時間かけて保護した。次いで、マウスのモノクローナル
上清を、ＰＢＳとプレートの１：１０希釈液（５０μｌ）に添加し、そして室温
で４時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）
中で６回洗浄し、正常な１％のマウス血清および正常な１％ヒト血清で１時間か
けて保護し、次いでさらに洗浄した。サンプルおよび標準をこのウェルに適用し
、このプレートを室温で１時間かけてインキュベートした。次いで、このプレー
トを、０．０５％のＴｗｅｅｎを含むＰＢＳ中で６回洗浄した。ビオチン化した
３１Ａ５または２Ｄ３を、ＰＢＳおよび正常な１％のマウス血清中で１μｇ／ｍ
ｌの結合体として使用した。これらを、室温で１時間かけてインキュベートし、
次いでＰＢＳＴ中で６回洗浄した。ストレプトアビジンＨＲＰと正常な１％のマ
ウス血清を含むＰＢＳの１：１０００希釈液（５０μｌ）を添加し、そしてこの
プレートを室温で３０分間インキュベートした。この時、プレートをさらに６回
洗浄した。次いで、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）基質（Ｋｉｒｋｅｇａａ
ｒｄおよびＰｅｒｒｙ）を、このウェルに添加し、そしてさらに１５分間インキ
ュベートした。この反応を１ＮのＨ₂ＳＯ₄（１００μｌ）で停止させ、そして発
生するシグナルを、４５０ｎｍで読み取った。このアッセイにおけるｐｇママグ
ロビンに関連する検量線を、正常な雄性血清にスパイクした組換えママグロビン
を使用して構築し、そしてこの試験で実施したサンプルを、この検量線を使用し
て定量した。

【０１２９】（ウサギ／ウサギ抗体サンドイッチ）２種のアッセイを実施した。第１は、固相としてアフィニティー精製したウサ
ギ抗９６７ペプチド（Ｃ末端１６アミノ酸ペプチド）およびシグナル抗体として
ビオチン化した２Ｄ３ウサギモノクローナルを利用した。第２は、固相抗体とし
て２Ｄ３およびシグナル抗体としてビオチン化した３１Ａ５を使用した。第１の
アッセイにおいて、このアフィニティー精製したポリクローナル抗体を、ｐＨ９
．５の炭酸／重炭酸緩衝液（５０ｍＭ）中で９６ウェルプレート（２００ｎｇ／
ウェル）において、４℃で一晩かけてコーティングした。プレートを、ＰＢＳＴ
で洗浄し、次いで室温で２時間かけて１％のＢＳＡ（ＰＢＳ中）で保護した。次
いで、血清（５０μｌ）をプレートに添加し、室温で１時間かけてインキュベー
トした。次いで、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液生
理食塩水で６回洗浄した。次いで、正常の１％ウサギ血清を含むＰＢＳ中のビオ
チン化した２Ｄ３モノクローナル抗体（２μｇ／ｍｌ）を、添加して、そしてプ
レートを、室温で１時間かけてさらにインキュベートした。さらに６回洗浄した
後、ストレプトアビジンＨＲＰと正常な１％のマウス血清を含むＰＢＳの１：１
００００希釈液（５０μｌ）を添加し、そしてこのプレートを室温で３０分間イ
ンキュベートした。この時、プレートをさらに６回洗浄した。ＴＭＢ基質でシグ
ナルを展開することを、先に記載した。

【０１３０】第２のアッセイにおいて、２Ｄ３を、２００ｎｇ／ウェルの９６ウェルプレー
ト（Ｃｏｓｔｅｒ／Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＣａｍｂｒｉｄｇｅＭＡ）において４℃
で一晩かけてコーティングし、ＰＢＳＴ中で洗浄し、次いで室温で２時間かけて
保護した。次いで、血清（５０μｌ）をプレートに添加し、そして室温で１時間
かけてインキュベートした。次いで、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を
含むリン酸緩衝液生理食塩水で６回洗浄した。次いで、正常な１％のウサギ血清
を含むＰＢＳ中の、ビオチン化した３１Ａ５モノクローナル抗体（０．５μｇ／
ｍｌ）を、添加し、そしてこのプレートを、室温で１時間かけてさらにインキュ
ベートした。さらに６回洗浄した後、ストレプトアビジンＨＲＰおよびＴＭＢイ
ンキュベーションを、先に記載のように実施した。

【０１３１】図７Ａ〜７Ｃは、ビオチン化した３１Ａ５、６Ｂ１２または２Ｄ３を含むマウ
スモノクローナル抗体のサンドイッチングおよびＭＢ４１５溶解物および上清中
のママグロビンを検出する能力の例である。図８において、ビオチン化したモノ
クローナル２Ｄ３と組合せた、ポリクローナル抗９６７血清についての検量線の
直線部分を示す。この線は、転移性乳癌を有する７人の患者のママグロビン血清
サンプルを定量するために使用した。これらの５／７が、１〜１０ｎｇ／ｍｌの
範囲の血清レベルを有するママグロビンについて陽性であった。同じ実施例にお
いて、９／１１の正常なサンプルは、陰性であり、そしてカットオフ未満であっ
た。ママグロビンおよびママグロビンＲＮＡは、図９に示されるように２Ｄ３お
よび２９Ｃ１１のサンドイッチを使用する、これらと同じ乳癌患者のサンプルに
おいて検出可能であった。全実験において、ママグロビンのレベルは、検量線を
使用して得られ、そして陰性コントロールおよび陽性コントロールは、期待され
たものであった。

【０１３２】（実施例３）（ママグロビンに特異的な抗オリゴサッカライド抗体の同定）本実施例は、グリコシル化感受性様式でママグロビンに特異的に結合する抗体
（乳癌細胞において発現されるママグロビンの示差的にグリコシル化される部位
に対する抗体を含む）の調製を示す。

【０１３３】異なるグリコシル化の組み合わせに対する２０〜３０個の抗体を含む抗体ライ
ブラリー（ＧｌｙｃｏｔｅｃｈＣｏｒｐ．、ＲｏｃｋｖｉｌｌｅＭＤ）を、
従来のＥＬＩＳＡ技術およびブロッティング技術を介して、乳癌腫細胞株由来の
ネイティブママグロビンを使用してスクリーニングする。ネイティブママグロビ
ンは、標準的生化学的精製手順を使用して、ＭＤＡ−ＭＢ−４１５乳癌腫細胞か
ら精製する。ウサギおよびマウスの両方を、ネイティブママグロビンで免疫する
。ＳＬＡＭ技術を使用して、ネイティブママグロビンに結合するが脱グリコシル
化酵素を使用してオリゴサッカライドを奪われたママグロビンには結合しない、
ウサギモノクローナル抗体を産生する。同一のアプローチを使用して、ネイティ
ブママグロビンで免疫したマウスから産生されるハイブリドーマ上清をスクリー
ニングする。

【０１３４】ウサギおよびマウスにて産生される抗体についてのグリコシル化エピトープを
、糖質（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）ライブラリー（ＧｌｙｃｏｔｅｃｈＣｏ
ｒｐ．）を使用してマッピングする。この糖質ライブラリーは、その抗体に対す
る糖質（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）エピトープの規定を可能にする、種々の群
のオリゴサッカライドの組み合わせからなる。ママグロビンに特異的な抗オリゴ
サッカライド抗体の同定、単離および特徴づけの際、サンドイッチＥＬＩＳＡア
ッセイを実施する。このアッセイにおいて、乳癌患者由来の血清から、抗ママグ
ロビンポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（ママグロビンのＣ末端の
１６個のアミノ酸であるエピトープに結合する）を用いてママグロビンを捕捉し
、そしてその抗糖質抗体を検出に使用する。得られたＥＬＩＳＡアッセイは、乳
癌について感度が良くかつ正確な診断を提供する。

【０１３５】（実施例４）（ママグロビンについてのヒトＣＤ４Ｔ細胞エピトープの同定）本実施例は、ママグロビンを認識するＣＤ４Ｔ細胞の産生を示す。

【０１３６】ＣＤ４Ｔ細胞応答を、ママグロビンタンパク質配列全体にわたって重複する
２０マーペプチドでパルスした樹状細胞（ＤＣ）を使用して正常なドナーのＰＢ
ＭＣから産生した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、重複するペプチド（各１０μｇ／ｍＬ
）の混合物でパルスしたＤＣを用いて３〜４回刺激した。一次刺激はＩＬ−６お
よびＩＬ−１２を含み、そして他のすべての刺激は０．５ｎｇ／ｍＬＩＬ−２
および５ｎｇ／ｍＬＩＬ−７を含む、Ｉｓｃｏｖｅｓ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培
地（ＩＭＤＭ）にて行った。それらのペプチドを図１０に示す。その後これらの
株を、プライムしたペプチドまたはＥｃｏｌｉ由来の組換えママグロビンとの反
応性について、アッセイした。図１１Ａおよび１１Ｂに示されるように、多数の
ＣＤ４Ｔ細胞株が、プライムしたペプチドおよびママグロビンタンパク質との
反応性を示した。ペプチド５Ａ（ＥＹＫＥＬＬＱＥＦＩＤＤＮＡＴＴＮＡＩＤ：
配列番号４）とこれらの株の優勢な反応性が出現した。このペプチド５Ａは、そ
のママグロビン配列のアミノ酸４１〜６０に対応する。これらの結果は、ペプチ
ド５Ａが、ママグロビンの免疫原性ＣＤ４エピトープを示すことを示す。

【０１３７】（実施例５）（ママグロビンについてのヒトＣＤ８Ｔ細胞エピトープの同定）本実施例は、ママグロビンを認識するＣＤ８Ｔ細胞の産生を示す。

【０１３８】ＨＬＡＡ２Ｋｂマウスを、ＨＬＡＡ２に結合することが予期された９マー
ペプチド（図１２に示される）で免疫した。免疫は、フロイント不完全アジュバ
ント中にある１４０μｇのＢ型肝炎ウイルスコアペプチド（Ｔｈペプチド）とと
もに１００μｇのペプチドを使用して、足蹠（ｆｏｏｔｐａｄ）に皮下に実施し
た。免疫の３週間後、脾細胞を取り出し、そしてペプチドでパルスしたＡＰＣと
ともにインビトロで培養してＣＴＬ株を惹起した。その後、標準的クロム放出ア
ッセイにおいて、ペプチドでパルスした、ママグロビンで形質導入した標的細胞
の認識についてＣＴＬ株を評価した。次いで、ペプチドでパルスした標的を認識
するＣＴＬ株を、形質導入されて安定にママグロビンタンパク質を発現する標的
に関して試験した。ママグロビンのアミノ酸２〜１０に対応する９マーペプチド
ＫＬＬＭＶＬＭＬＡ（ｍｇｂ１；配列番号５）で免疫したマウス由来のＣＴＬ
株は、ペプチドでパルスされた標的およびママグロビンで形質導入された標的の
両方を認識することが示された（図１３Ａ〜１３Ｃおよび１４Ａ〜１４Ｃ）。こ
れらのデータは、この９マーペプチドＫＬＬＭＶＬＭＬＡ（配列番号５）が、マ
マグロビンが天然に保有するＣＴＬエピトープでありかつＨＬＡＡ２により拘
束されることを、示す。

【０１３９】（実施例６）（患者の血液サンプルにおけるママグロビンＲＮＡの検出）本実施例は、乳癌を診断する目的のために血液中のママグロビン発現を検出す
るためのＰＣＲの使用を示す。

【０１４０】ＲＮＡ抽出：ＲＮＡを、凍結した腫瘍および正常組織および細胞株（ＭＢ４１
５）から以下のように抽出した。組織サンプルを、ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔ
ｒｏｎ）を使用して、１ｍｌ／組織５０〜１００ｍｇのＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉ
ｂｃｏ、ＢＲＬ）中でホモジナイズし、そして細胞を、１ｍｌ／５〜１０×１０ ⁶ 細胞のＴｒｉｚｏｌ試薬と混合した。。次いで、ホモジナイズしたサンプルを
室温で５分間インキュベートし、続いて１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ試薬あたり０．２
ｍｌのクロロホルムを添加した。サンプルチューブに蓋をし、そして１５秒間激
しく振盪し、続いて室温で２〜３分間さらにインキュベーションした。サンプル
を２〜８℃で１５分間、１２，０００ｇで遠心分離し、そして上部水相を取り出
した。このＲＮＡ調製物を新しいチューブに移し、そしてホモジネーション工程
にて使用したＴｒｉｚｏｌ試薬１ｍｌあたり０．５ｍｌのイソプロピルアルコー
ルを添加して沈殿させた。サンプルを室温で１０分間インキュベートし、次いで
２〜８℃で１２，０００ｇにて１０分間遠心分離した。その上清をゲル様ペレッ
トから除去し、そしてそのペレットを７５％エタノール（１ｍｌ／Ｔｒｉｚｏｌ
１ｍｌ）で１回洗浄した。そのサンプルを混合し、次いで２〜８℃で５分間７
，５００ｇで遠心分離した。上清を除去し、そしてそのＲＮＡペレットを室温で
短く乾燥し、そしてＲＮａｓｅを含まない水に溶解した。

【０１４１】単離したＲＮＡをＤＮａｓｅで処理して、いかなるＤＮＡ混入物をも除去した
。７５μｌのヌクレアーゼを含まない水および第１鎖緩衝液（ＧｉｂｃｏＢＲ
Ｌ）中のＲＮＡ（５０μｇ）を、ＲＮａｓｅインヒビターであるＲＮａｓｉｎ（
Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下で、３７℃で３０分間、ＤＮａｓｅＩ（Ａｍｂｉｏｎ
）とともにインキュベートした。次いで、その反応混合物を、フェノール／クロ
ロホルムを用いて沈殿させ、そしてエッペンドルフ遠心分離機の最大速度で５分
間遠心分離した。最上層を新しいチューブに移し、そのチューブに３Ｍ酢酸ナト
リウムを２０μｌおよび１００％冷エタノールを４４０μｌ添加した。この混合
物をボルテックスし、そして再度５分間遠心分離した。上清を捨て、そしてペレ
ットを７５％冷エタノールで洗浄しそして遠心分離した。そのＲＮＡペレットを
、ＲＮａｓｅを含まない水に１〜２μｇ／ｍｌで再懸濁した。

【０１４２】ＲＮＡを、Ｄｙｎａｌ’ｓＥｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ濃縮ビーズおよ
びＤｙｎａｌ’ｓｍＲＮＡＤｉｒｅｃｔｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、
Ｎｏｒｗａｙ）を製造業者の指示書に従って使用して、全血から抽出した。Ｄｙ
ｎａｌ抽出キットを介して抽出したＲＮＡを、下記に示される２０ｍｌのＲｅｖ
ｅｒｓｅ転写混合物中にすぐに再懸濁し、そして逆転写させた。

【０１４３】逆転写：リアルタイムＰＣＲ組織パネルにおける使用のためのｃＤＮＡを、以
下のように調製した：２５μｇのＲＮＡを、２５μｌのＯｌｉｇｏｄＴ（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに７０℃で
１０分間インキュベートし、次いで、０．５ｍＭｄＮＴＰ、１０００単位のＲ
Ｎａｓｉｎ、０．０２ｍＭジチオスレイトールおよびＳｕｐｅｒｃｒｉｐｔＩ
Ｉ（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ）を含む、１２５μｌの希釈した逆転写酵素緩衝液（Ｇ
ｉｂｃｏ、ＢＲＬ）とともに４２℃で１時間インキュベートした。次いで、この
反応混合物を、リアルタイムＰＣＲにおける使用のために４℃まで冷却するかま
たは凍結した。この上皮から抽出した材料についての反応混合物は、２０μｌの
ＳｕｐｅｒｃｒｉｐｔＲＴ混合物（４μｌの５×緩衝液、２μｌの０．１Ｍ
ＤＴＴ、１μｌ１０ｍＭｄＮＴＰ混合物、１μｌ（２００単位）のｓｕｐｅ
ｒｓｃｒｉｐｔＩＩおよび１２μｌのＲＮａｓｅを含まない水）であった。次
いでこの混合物を５０℃で５分間インキュベートし、次いで４２℃で５０分間イ
ンキュベートし、次いで７０℃で１５分間不活化した。

【０１４４】リアルタイムＰＣＲ：リアルタイムＰＣＲ分析を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ
／ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７７００Ｐｒｉｓｍ装置にて実施
した。一致するプライマーおよび蛍光プローブを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／
ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）によ
り提供されるプライマー発現プログラムに従って、目的の遺伝子の各々について
設計した。そのように作製したプライマーおよびプローブは、リアルタイムＰＣ
Ｒにおいて、ユニバーサル熱サイクリングプログラムにて使用し得る。最初に、
そのプライマーおよびプローブを、チェッカーボード（ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒ
ｄ）アプローチを使用して、最適な濃度を決定するために力価測定（ｔｉｔｒａ
ｔｅ）した。標的腫瘍由来のｃＤＮＡのプールを、この最適化プロセスにおいて
使用した。次いで、これらの試薬を、その最適な濃度でリアルタイムＰＣＲにて
使用した。この反応は、２５μｌで実施した。すべての場合において、最終プロ
ーブ濃度は１５５ｎＭであった。ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰは０．２ｍ
Ｍであり、そしてｄＵＴＰは０．４ｍＭであった。Ａｍｐｌｉｔａｑｇｏｌｄ
およびＡｍｐｅｒａｓｅＵＮＧ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙＣＡ）を、１反応あたり０
．６２５単位および０．２５単位で使用した。ＭｇＣｌ₂は、最終濃度５ｍＭで
あった。微量のグリセロール、ゼラチンおよびＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ
ＣｈｅｍＣｏ、ＳｔＬｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加して、この反応を安定化した
。各反応は２μｌのテンプレートを含んだ。β−アクチンプライマーおよびプロ
ーブは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（
ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）から入手し、そしてそのサンプル中のβ−アク
チンの存在を定量するために類似した様式で使用した。フォワードプライマーは
９００ｎＭ、リバースプライマーは３００ｎＭであった。

【０１４５】そのサンプル中の特定のＲＮＡの量を定量するために、標準曲線を、目的の遺
伝子を含むプラスミドを使用して、並行して作製した。標準曲線は、このアッセ
イにおいて使用した初期ｃＤＮＡ濃度に関連する、リアルタイムＰＣＲで決定し
たＣｔ値を使用して作製した。目的の遺伝子の１０コピー〜１０⁶コピーの範囲
の標準希釈物を、この目的のために使用した。さらに、標準曲線を、２００ｆｇ
〜２０００ｐｇの範囲のβ−アクチンについて作製した。これにより、組織サン
プルの初期ＲＮＡ含量を、比較目的のためにβ−アクチンの量へと標準化するこ
とが可能になった。

【０１４６】使用したプライマーおよびプローブは、表１に示されるようであった。

【０１４７】（表Ｉ）（ママグロビンプライマーおよびプローブ）

【０１４８】

【表１】このママグロビン遺伝子配列は、３つのエキソンを含む。エキソン１は塩基９
９２〜１１１０にわたり、エキソン２は塩基１７１３〜１９００にわたり、そし
てエキソン３は塩基３７８９〜３９７４にわたる。開始Ｍｅｔは、塩基１０５６
にあり、そして終止コドンは塩基３７２５にある。定量的リアルタイムＰＣＲに
使用するプライマーおよびプローブはエキソン２に位置するが、しかしリバース
プライマーはエキソン２とエキソン３との間で分割されている。このプライマー
配置は、ゲノムＤＮＡの増幅を排除しない。組織サンプルすべてを、Ａｍｂｉｏ
ｎＤＮａｓｅＩを用いてＤＮａｓｅ処理した。これらのサンプルは、使用前
に混入ＤＮＡの存在について試験した。Ｄｙｎａｌ’ｓＥｐｉｔｈｅｌｉａｌ
ｃｅｌｌ濃縮ビーズおよびＤｙｎａｌ’ｓｍＲＮＡＤｉｒｅｃｔキットを
使用して全血から抽出したＲＮＡは、ＤＮａｓｅ処理しなかったが、これは、Ｒ
ＮＡのみについての非常に特異的単離法である。

【０１４９】図１５は、乳癌組織について高い程度の特異性を示すママグロビンについての
組織分布を示す。陽性であることが示された皮膚サンプルは、乳房整復部（ｒｅ
ｄｕｃｔｉｏｎ）に由来した。図１６は、乳癌細胞株ＭＢ４１５にて検出可能な
ママグロビンメッセージのコピーを細胞の量の関数として示し、これは、１つの
細胞が約１００００コピーを有することを示す。図１７は、Ｄｙｎａｌ単離法を
使用して転移性乳癌の患者の末梢血から単離した上皮細胞におけるママグロビン
の検出を、正常な血液サンプルからの類似の単離物と比較して示す。３３個の転
移性サンプルおよび１１個の正常サンプルを試験した。このデータは、ママグロ
ビンが転移性乳癌の個体の血液にて検出され得ること、およびこのような検出を
使用してこの疾患を診断し得ることを示す。

【０１５０】本発明の特定の実施形態が例示目的のために本明細書中に記載されているが、
種々の改変が本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得ることが、
上記から理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によるように制
限される以外は、制限されない。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１Ａは、ヒトママグロビンタンパク質に対して惹起された代表的なウサギお
よびマウスのモノクローナル抗体のまとめである。これらの抗ママグロビンモノ
クローナル抗体を用いてママグロビンを検出したアッセイのまとめが含まれる。
各モノクローナル抗体についてのエピトープ結合配列（配列番号１１〜１８）も
また列挙する。略号は以下である：ｎ．ｄ．＝決定されず；ＦＡＣＳ＝蛍光活性
細胞選別機；ＩＨＣ＝免疫組織化学。

【図１Ｂ】図１Ｂは、ウサギモノクローナル抗体６Ａ１（配列番号１９）、１６Ｄ８（配
列番号２０〜２１）、６Ｂ１２（配列番号２２）、２Ｄ３（配列番号２３）につ
いてのＣＤＲ配列を表す。

【図１Ｃ】図１Ｃは、ウサギモノクローナル抗体１４Ａ１２（配列番号２４）、２９Ｃ１
１（配列番号２５）および３１Ａ５（配列番号２６）についてのＣＤＲ配列を表
す。

【図２】図２は、エピトープマッピング研究のために用いたペプチドおよび組換え領域
と共にヒトママグロビンのアミノ酸配列（配列番号２７）を表す。ママグロビン
タンパク質配列に及ぶ種々のペプチド（Ｐｒｏ１−９（配列番号２７）、Ｐｒｏ
−２０（配列番号２７）およびＧｌｏｂ−２（配列番号２７））を合成し、そし
てＥＬＩＳＡ方法を用いたモノクローナル抗体のエピトープマッピングのために
用いた。各ペプチド配列は、太字および下線で示される。さらに、ママグロビン
のＮ末端組換えフラグメント（配列番号２８）をまた、エピトープマッピング研
究のために用いた。

【図３Ａ】図３Ａは、ＥＬＩＳＡ方法によって得られたウサギおよびマウスのモノクロー
ナル抗体についてのエピトープマッピングデータを表す。図３Ａは、マウスモノ
クローナル抗体のエピトープ結合領域を示す。陰をつけた領域は、抗体について
ポジティブであると考えられる。アフィニティー精製したウサギポリクローナル
９６７についてのエピトープ結合特異性もまた実証される。

【図３Ｂ】図３Ｂは、ＥＬＩＳＡ方法によって得られたウサギおよびマウスのモノクロー
ナル抗体についてのエピトープマッピングデータを表す。図３Ｂは、漸減濃度の
ママグロビンペプチドおよび組換えフラグメントを用いた、ウサギモノクローナ
ル抗体６Ｂ１２（図３Ｂ）についてのエピトープマッピングデータを表す。

【図３Ｃ】図３Ｃは、ＥＬＩＳＡ方法によって得られたウサギおよびマウスのモノクロー
ナル抗体についてのエピトープマッピングデータを表す。図３Ｃは、漸減濃度の
ママグロビンペプチドおよび組換えフラグメントを用いた、ウサギモノクローナ
ル抗体２９Ｃ１１（図３Ｃ）についてのエピトープマッピングデータを表す。

【図３Ｄ】図３Ｄは、ＥＬＩＳＡ方法によって得られたウサギおよびマウスのモノクロー
ナル抗体についてのエピトープマッピングデータを表す。図３Ｄは、漸減濃度の
ママグロビンペプチドおよび組換えフラグメントを用いた、ウサギモノクローナ
ル抗体２Ｄ３（図３Ｄ）についてのエピトープマッピングデータを表す。

【図４Ａ】図４Ａは、ＦＡＣＳ分析によるモノクローナル抗体の特徴付けの結果を表す。
各モノクローナル抗体を用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−４１５細胞においてママグロビ
ン発現を検出した。サンプルを２％ホルムアルデヒドにおいて固定し、そして０
．５％サポニンを用いて透過化した。ＭＣＦ−７細胞はママグロビンを発現せず
、そしてネガティブコントロールとして用いられた。

【図４Ｂ】図４Ｂは、ＦＡＣＳ分析によるモノクローナル抗体の特徴付けの結果を表す。
各モノクローナル抗体を用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−４１５細胞においてママグロビ
ン発現を検出した。サンプルを２％ホルムアルデヒドにおいて固定し、そして０
．５％サポニンを用いて透過化した。ＭＣＦ−７細胞はママグロビンを発現せず
、そしてネガティブコントロールとして用いられた。

【図５】図５は、各モノクローナル抗体によるママグロビンのウェスタンブロット検出
を表す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、示されるように、ＭＤＡ−ＭＢ−４１５細胞を増
殖させた培地、ＭＤＡ−ＭＢ−４１５細胞溶解産物および細菌によって発現され
た組換えママグロビンについて行った。ママグロビン発現は、示した抗体を用い
て検出された。

【図６】図６は、試験した他の組織においては発現しないが、乳房組織においてはママ
グロビンが発現することを示す表である。種々の組織におけるママグロビン発現
を、２９Ｃ１１ウサギモノクローナル抗体および３１Ａ５ウサギモノクローナル
抗体の組み合わせを用いた免疫組織化学的分析によって評価した。

【図７Ａ】図７Ａは、ＭＢ４１５細胞の溶解産物および上清中のママグロビンを検出する
ために、示したウサギモノクローナル抗体を用いて行ったサンドイッチアッセイ
の結果を例示するグラフである。

【図７Ｂ】図７Ｂは、ＭＢ４１５細胞の溶解産物および上清中のママグロビンを検出する
ために、示したウサギモノクローナル抗体を用いて行ったサンドイッチアッセイ
の結果を例示するグラフである。

【図７Ｃ】図７Ｃは、ＭＢ４１５細胞の溶解産物および上清中のママグロビンを検出する
ために、示したウサギモノクローナル抗体を用いて行ったサンドイッチアッセイ
の結果を例示するグラフである。

【図８】図８は、ビオチン化したモノクローナル抗体２Ｄ３と組み合わせてポリクロー
ナル抗９６７血清を用いたサンドイッチアッセイについての標準曲線を示すグラ
フである。

【図９】図９は、乳癌を有する患者および乳癌を有さない患者におけるママグロビンを
検出するために、代表的な示した抗体を用いたサンドイッチアッセイの結果を示
す表である。

【図１０】図１０は、エピトープマッピング研究のために用いたペプチド領域（配列番号
２９〜３６）に下線を付し、そして太字にした、ヒトママグロビンアミノ酸配列
（配列番号２７）を表す。

【図１１】図１１Ａおよび図１１Ｂは、示したように、ママグロビンおよびその種々の部
分についてのＣＤ４Ｔ細胞株の認識を例示するグラフである。図１１Ａは、種
々のタンパク質およびペプチドに応じた３つの異なるＣＤ４Ｔ細胞株のＴ細胞
増殖を示す。図１１Ｂは、同じタンパク質およびペプチドに応じた同じ細胞株に
よるインターフェロン−γ産生を示す。

【図１２】図１２は、ヒトママグロビンアミノ酸配列（配列番号２７）を、ＣＤ４⁺およ
びＴ細胞エピトープマッピング研究のために用いたペプチド領域（配列番号３７
〜４５）と共に表す。

【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは、ｍｇｂ１で免疫したＨＬＡＡ２トランスジェニックマ
ウス由来のＣＴＬによる、ｍｇｂ−１でパルスしたＪｕｒｋａｔＡ２Ｋｂ細胞の
認識を示すグラフである。３つの異なるマウス由来のＣＴＬを、示したように、
異なるエフェクター：標的比で試験した。各図は、ｍｇｂ−１でパルスした細胞
（黒丸）およびｍｇｂ−１でパルスしていない細胞（白丸）の比溶解パーセント
（ｐｅｒｃｅｎｔｓｐｅｃｉｆｉｃｌｙｓｉｓ）を示す。

【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃは、ｍｇｂ１で免疫したＨＬＡＡ２トランスジェニックマ
ウス由来のＣＴＬによる、ｍｇｂ−１でパルスしたＪｕｒｋａｔＡ２Ｋｂ細胞（
三角）、またはって全長ママグロビンを発現するＪｕｒｋａｔＡ２Ｋｂ細胞（マ
マグロビン）の認識を例示するグラフである。３つの異なるマウス由来のＣＴＬ
を、示したように、異なるエフェクター：標的比で試験した。各図において、ｍ
ｇｂ−１もママグロビンも発現しない細胞の比溶解パーセントは、丸によって表
される。

【図１５】図１５は、ママグロビンの組織分布を示すヒストグラムである。１ｎｇのβ−
アクチンあたりのママグロビンのコピー数を、示したように、種々の正常組織お
よび腫瘍組織について示す。

【図１６】図１６は、細胞の量の関数として乳癌細胞株ＭＢ４１５中のママグロビンメッ
セージのコピー数を示すグラフである。

【図１７】図１７は、Ｄｙｎａｌ単離方法を用いて転移性の乳癌を有する患者の末梢血か
ら単離された上皮細胞におけるママグロビンの検出を、正常な血液サンプル由来
の類似の単離物と比較して示すヒストグラムである。１ｎｇのβ−アクチンあた
りのママグロビンのコピー数を、示したように、３３の転移性サンプルおよび１
１の正常サンプルについて示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/18 ４Ｃ０８５Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ４Ｃ０８７ 16/18 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ４Ｈ０４５Ｃ１２Ｎ 5/06 ＭＣ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 33/574 ＡＣ１２Ｐ 21/08 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/574 5/00 Ｅ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ホウトン，レイモンドエル．アメリカ合衆国ワシントン 98021，ボセル， 242エヌディープレイスサウスイースト − 2636 (72)発明者リード，スティーブンジー．アメリカ合衆国ワシントン 98005，ベルビュー， 122エヌディープレイスエヌイー − 2843 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 CA04 CA09 HA14 HA15 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ52 QR55 QR62 QS25 QS34 4B064 AG27 CA10 DA05 DA14 4B065 AA94 AC20 BD39 CA46 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA18 BA23 CA18 DA38 MA01 NA14 ZB261 4C085 AA03 AA14 BB01 CC03 DD62 EE06 FF24 4C087 BB43 CA04 CA12 DA20 DA31 MA01 NA14 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA30 CA40 DA76 EA28 EA31 EA51

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトママグロビンの少なくとも７個連続したアミノ酸残基を
含む単離されたポリペプチドであって、該連続したアミノ酸残基は、ＩＤＥＬＫ
ＥＣＦＬＮＱＴＤＥＴＬＳＮＶＥ（Ｐｒｏ２；配列番号１）；ＴＴＮＡＩＤＥＬ
ＫＥＣＦＬＮＱ（Ｐｒｏ２−３；配列番号２）；ＳＱＨＣＹＡＧＳＧＣＰＬＬＥ
ＮＶＩＳＫＴＩ（Ｐｒｏ５；配列番号３）；ＥＹＫＥＬＬＱＥＦＩＤＤＮＡＴＴ
ＮＡＩＤ（ペプチド５Ａ；配列番号４）およびＫＬＬＭＶＬＭＬＡ（ｍｇｂ１；
配列番号５）からなる群より選択される配列内に存在し、そしてヒトママグロビ
ンの３０個以下連続した残基が、該ポリペプチド内に存在する、ポリペプチド。
【請求項２】前記ポリペプチドが、ヒトママグロビンの少なくとも９個連
続したアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】前記ポリペプチドが、ヒトママグロビンの少なくとも１５個
連続したアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】前記ポリペプチドが、アミノ酸配列ＴＴＮＡＩＤＥＬＫＥＣ
ＦＬＮＱ（Ｐｒｏ２−３；配列番号２）を含む、請求項１に記載のポリペプチド
。
【請求項５】請求項１に記載のポリペプチドを、生理学的に受容可能なキ
ャリアと組み合わせて含む、薬学的組成物。
【請求項６】請求項１に記載のポリペプチドを、免疫刺激物質と組み合わ
せて含む、ワクチン。
【請求項７】前記免疫刺激物質がアジュバントである、請求項６に記載の
ワクチン。
【請求項８】配列ＴＴＮＡＩＤＥＬＫＥＣＦＬＮＱ（Ｐｒｏ２−３；配列
番号２）を有するママグロビンエピトープに特異的に結合する、単離された抗体
またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】請求項８に記載の抗体またはそのフラグメントを、生理学的
に受容可能なキャリアと組み合わせて含む、薬学的組成物。
【請求項１０】患者における乳癌の発達を阻害するための方法であって、
有効量の請求項１に記載のポリペプチドを患者に投与し、それによって該患者に
おける乳癌の発達を阻害する工程を包含する、方法。
【請求項１１】患者における乳癌の発達を阻害するための方法であって、
有効量の請求項８に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを患者に投与し
、それによって該患者における乳癌の発達を阻害する工程を包含する、方法。
【請求項１２】患者における乳癌の存在または非存在を決定するための方
法であって、以下の工程：（ａ）患者から得た生物学的サンプルを、請求項８に記載の抗体またはその抗
原結合フラグメントと接触させる工程；（ｂ）該サンプル中の、該抗体またはその抗原結合フラグメントに結合するポ
リペプチドの量を決定する工程；および（ｃ）該ポリペプチドの量を所定のカットオフ値に対して比較し、それにより
、該患者における乳癌の存在または非存在を決定する工程を包含する、方法。
【請求項１３】前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１２に記
載の方法。
【請求項１４】工程（ｂ）が、結合したポリペプチドを、ママグロビンエ
ピトープと特異的に結合する第２の抗体と接触させる工程を包含する、請求項１
２に記載の方法。
【請求項１５】工程（ｂ）がさらに、前記第２の抗体から得られたシグナ
ルを標準曲線と比較する工程を包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】患者における乳癌の存在または非存在を決定するための方
法であって、以下の工程：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを、請求項１に記載のポリペプチド
と接触させる工程；（ｂ）該サンプル中の、該ポリペプチドに結合する抗体の量を検出する工程：
および（ｃ）該抗体の量を所定のカットオフ値に対して比較し、それにより該患者に
おける乳癌の存在または非存在を決定する工程を包含する、方法。
【請求項１７】患者における乳癌の進行をモニタリングするための方法で
あって、以下の工程：（ａ）第１の時点で患者から得られた生物学的サンプルを、請求項８に記載の
抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；（ｂ）該サンプル中の、該抗体またはその抗原結合フラグメントに結合するポ
リペプチドの量を検出する工程；（ｃ）その後の時点で該患者から得られた生物学的サンプルを用いて工程（ａ
）および工程（ｂ）を繰り返す工程：ならびに（ｄ）工程（ｃ）において検出されたポリペプチドの量を、工程（ｂ）におい
て検出された量に対して比較し、それにより、該患者における乳癌の進行をモニ
タリングする工程を包含する、方法。
【請求項１８】前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１７に記
載の方法。
【請求項１９】工程（ｂ）が、結合したポリペプチドを、ママグロビンエ
ピトープと特異的に結合する第２の抗体と接触させる工程を包含する、請求項１
７に記載の方法。
【請求項２０】工程（ｂ）がさらに、前記第２の抗体から得られたシグナ
ルを標準曲線と比較する工程を包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】患者における乳癌の進行をモニタリングするための方法で
あって、以下の工程：（ａ）第１の時点で患者から得られた生物学的サンプルを、請求項１に記載の
ポリペプチドと接触させる工程；（ｂ）該サンプル中の、該ポリペプチドに結合する抗体の量を検出する工程；（ｃ）その後の時点で該患者から得られた生物学的サンプルを用いて工程（ａ
）および工程（ｂ）を繰り返す工程：ならびに（ｄ）工程（ｃ）において検出された抗体の量を、工程（ｂ）において検出さ
れた量に対して比較し、それにより、該患者における乳癌の進行をモニタリング
する工程を包含する、方法。
【請求項２２】診断キットであって、以下：（ａ）１以上の請求項８に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント；およ
び（ｂ）レポーター基を含む検出試薬を備える、キット。
【請求項２３】前記検出試薬が、ママグロビンに特異的に結合する抗体で
ある、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】診断キットであって、以下：（ａ）１以上の請求項８に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント；およ
び（ｂ）組換えママグロビンを備える、キット。
【請求項２５】前記抗体が固体支持体に固定されている、請求項２２また
は２４に記載のキット。
【請求項２６】前記固体支持体が、ニトロセルロース、ラテックスまたは
プラスチック材料を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】前記検出試薬が、免疫グロブリン、抗免疫グロブリン、プ
ロテインＧ、プロテインＡまたはレクチンを含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２８】前記レポーター基が、放射性同位体、蛍光基、発光基、酵
素、ビオチンおよび色素粒子からなる群より選択される、請求項２２に記載のキ
ット。
【請求項２９】診断キットであって、以下：（ａ）１以上の請求項１に記載のポリペプチド；および（ｂ）レポーター基を含む検出試薬を備える、キット。
【請求項３０】前記ポリペプチドが、固体支持体に固定されている、請求
項２９に記載のキット。
【請求項３１】前記固体支持体が、ニトロセルロース、ラテックスまたは
プラスチック材料を含む、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】前記検出試薬が、免疫グロブリン、抗免疫グロブリン、プ
ロテインＧ、プロテインＡまたはレクチンを含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３３】前記レポーター基が、放射性同位体、蛍光基、発光基、酵
素、ビオチンおよび色素粒子からなる群より選択される、請求項２９に記載のキ
ット。
【請求項３４】グリコシル化ママグロビンに特異的に結合する、単離され
た抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３５】請求項３４に記載の抗体またはそのフラグメントを、生理
学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む、薬学的組成物。
【請求項３６】患者における乳癌の発達を阻害するための方法であって、
有効量の請求項３４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを患者に投与
し、それにより、該患者における乳癌の発達を阻害する工程を包含する、方法。
【請求項３７】患者における乳癌の存在または非存在を決定するための方
法であって、以下の工程：（ａ）患者から得た生物学的サンプルを、請求項３４に記載の抗体またはその
抗原結合フラグメントと接触させる工程；（ｂ）該サンプル中の、該抗体またはその抗原結合フラグメントに結合するポ
リペプチドの量を決定する工程；および（ｃ）該ポリペプチドの量を所定のカットオフ値に対して比較し、それにより
、該患者における乳癌の存在または非存在を決定する工程を包含する、方法。
【請求項３８】前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項３７に記
載の方法。
【請求項３９】工程（ｂ）が、結合したポリペプチドを、ママグロビンエ
ピトープと特異的に結合する第２の抗体と接触させる工程を包含する、請求項３
７に記載の方法。
【請求項４０】工程（ｂ）がさらに、前記第２の抗体から得られたシグナ
ルを標準曲線と比較する工程を包含する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】患者における乳癌の進行をモニタリングするための方法で
あって、以下の工程：（ａ）第１の時点で患者から得られた生物学的サンプルを、請求項３４に記載
の抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；（ｂ）該サンプル中の、該抗体またはその抗原結合フラグメントに結合するポ
リペプチドの量を検出する工程；（ｃ）その後の時点で該患者から得られた生物学的サンプルを用いて工程（ａ
）および（ｂ）を繰り返す工程：ならびに（ｄ）工程（ｃ）において検出されたポリペプチドの量を、工程（ｂ）におい
て検出された量に対して比較し、それにより、該患者における乳癌の進行をモニ
タリングする工程を包含する、方法。
【請求項４２】前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項４１に記
載の方法。
【請求項４３】工程（ｂ）が、結合したポリペプチドを、ママグロビンエ
ピトープと特異的に結合する第２の抗体と接触させる工程を包含する、請求項４
１に記載の方法。
【請求項４４】工程（ｂ）がさらに、前記第２の抗体から得られたシグナ
ルを標準曲線と比較する工程を包含する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】診断キットであって、以下：（ａ）１以上の請求項３４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント；お
よび（ｂ）レポーター基を含む検出試薬を備える、キット。
【請求項４６】前記検出試薬が、ママグロビンに特異的に結合する抗体で
ある、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】診断キットであって、以下：（ａ）１以上の請求項３４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント；お
よび（ｂ）組換えママグロビンを備える、キット。
【請求項４８】前記抗体が固体支持体に固定されている、請求項４５また
は４７に記載のキット。
【請求項４９】前記固体支持体が、ニトロセルロース、ラテックスまたは
プラスチック材料を含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】前記検出試薬が、免疫グロブリン、抗免疫グロブリン、プ
ロテインＧ、プロテインＡまたはレクチンを含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項５１】前記レポーター基が、放射性同位体、蛍光基、発光基、酵
素、ビオチンおよび色素粒子からなる群より選択される、請求項４５に記載のキ
ット。
【請求項５２】生物学的サンプルから腫瘍細胞を除去するための方法であ
って、生物学的サンプルを、ＥＹＫＥＬＬＱＥＦＩＤＤＮＡＴＴＮＡＩＤ（ペプ
チド５Ａ；配列番号４）およびＫＬＬＭＶＬＭＬＡ（ｍｇｂ１；配列番号５）か
らなる群より選択されるママグロビンエピトープと特異的に反応するＴ細胞と接
触させる工程を包含し、ここで、該接触させる工程が、該サンプルからのママグ
ロビンまたはそのペプチドエピトープを発現する細胞の除去を可能にするに充分
な条件下および時間にわたって行われる、方法。
【請求項５３】前記生物学的サンプルが、血液またはその画分である、請
求項５２に記載の方法。
【請求項５４】患者における乳癌の発達を阻害するための方法であって、
請求項５２に記載の方法に従って処理された生物学的サンプルを患者に投与する
工程を包含する、方法。
【請求項５５】ママグロビンに特異的なＴ細胞を刺激および／または増加
させるための方法であって、Ｔ細胞を、ヒトママグロビンの少なくとも７個でか
つ３０個以下連続したアミノ酸残基を含むペプチドと接触させる工程を包含し、
ここで、該ペプチドが、配列ＥＹＫＥＬＬＱＥＦＩＤＤＮＡＴＴＮＡＩＤ（ペプ
チド５Ａ；配列番号４）またはＫＬＬＭＶＬＭＬＡ（ｍｇｂ１；配列番号５）を
含み、該接触が、Ｔ細胞の刺激および／または増加を可能にするに充分な条件下
でおよび時間にわたって行われる、方法。
【請求項５６】前記ペプチドが、ヒトママグロビンの少なくとも９個連続
した残基を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】前記ペプチドが、ヒトママグロビンの少なくとも１５個連
続した残基を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】請求項５５に記載の方法に従って調製されたＴ細胞を含む
、単離されたＴ細胞集団。
【請求項５９】患者における乳癌の発達を阻害するための方法であって、
有効量の請求項５８に記載のＴ細胞集団を患者に投与する工程を包含する、方法
。
【請求項６０】患者における乳癌の発達を阻害するための方法であって、
以下の工程：（ａ）患者から単離されたＣＤ４⁺および／またはＣＤ８⁺のＴ細胞を、ヒトマ
マグロビンの少なくとも７個でかつ３０個以下連続したアミノ酸残基を含むペプ
チドと共にインキュベートし、その結果、Ｔ細胞が増殖する工程であって、ここ
で、該ペプチドが、配列ＥＹＫＥＬＬＱＥＦＩＤＤＮＡＴＴＮＡＩＤ（ペプチド
５Ａ；配列番号４）またはＫＬＬＭＶＬＭＬＡ（ｍｇｂ１；配列番号５）を含む
、工程；および（ｂ）有効量の該増殖したＴ細胞を該患者に投与し、それにより、該患者にお
ける乳癌の発達を阻害する工程を包含する、方法。
【請求項６１】前記ペプチドが、ヒトママグロビンの少なくとも９個連続
した残基を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】前記ペプチドが、ヒトママグロビンの少なくとも１５個連
続した残基を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】患者における乳癌の発達を阻害するための方法であって、
以下の工程：（ａ）患者から単離されたＣＤ４⁺および／またはＣＤ８⁺のＴ細胞を、ヒトマ
マグロビンの少なくとも７個でかつ３０個以下連続したアミノ酸残基を含むペプ
チドと共にインキュベートし、その結果、Ｔ細胞が増殖する工程であって、ここ
で、該ペプチドが、配列ＥＹＫＥＬＬＱＥＦＩＤＤＮＡＴＴＮＡＩＤ（ペプチド
５Ａ；配列番号４）またはＫＬＬＭＶＬＭＬＡ（ｍｇｂ１；配列番号５）を含む
、工程；（ｂ）少なくとも１つの増殖した細胞をクローニングする工程；および（ｃ）該患者に有効量の該クローニングされたＴ細胞を投与し、それにより、
該患者における乳癌の発達を阻害する工程を包含する、方法。
【請求項６４】前記ペプチドが、ヒトママグロビンの少なくとも９個連続
した残基を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】前記ペプチドが、ヒトママグロビンの少なくとも１５個連
続した残基を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】患者における乳癌の存在または非存在を決定するための方
法であって、患者から得られた全血またはその画分のサンプル中のママグロビン
ｍＲＮＡのレベルを検出する工程を包含し、ここで上皮細胞が、該サンプルから
除去されている、方法。
【請求項６７】ママグロビンＲＮＡのレベルが、以下：（ａ）前記サンプルを、ママグロビンをコードするポリヌクレオチドまたはそ
の相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）該サンプルにおいて、該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドの量を検出する工程；および（ｃ）該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を、
所定のカットオフ値に対して比較し、それにより、該患者における乳癌の存在ま
たは非存在を決定する工程によって検出される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドの量が、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて決定される、請求項６７に記載の
方法。
【請求項６９】前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドの量が、ハイブリダイゼーションアッセイを用いて決定される、請求項６
７に記載の方法。
【請求項７０】患者における乳癌の進行をモニタリングするための方法で
あって、以下の工程：（ａ）患者から得られた全血またはその画分のサンプル中のママグロビンｍＲ
ＮＡのレベルを検出する工程であって、ここで上皮細胞が、該サンプルから除去
されている、工程；（ｂ）その後の時点で該患者から得たサンプルを用いて工程（ａ）を繰り返す
工程；および（ｃ）工程（ｂ）において検出されたポリヌクレオチドの量を、工程（ａ）に
おいて検出された量と比較し、それにより、該患者における該癌の進行をモニタ
リングする工程を包含する、方法。
【請求項７１】工程（ａ）が、以下：（ｉ）患者から得られた生物学的サンプルを、ママグロビンポリヌクレオチド
にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程；および（ｉｉ）該サンプル中の、該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌ
クレオチドの量を検出する工程によって行われる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドの量が、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて決定される、請求項７１に記載の
方法。
【請求項７３】前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドの量が、ハイブリダイゼーションアッセイを用いて決定される、請求項７
１に記載の方法。