ES2277432T3 - Compuestos y metodos para terapia y diagnosis de cancer de pulmon. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de polinucleótido aislada, que comprende la secuencia de nucleótidos proporcionada en SEQ ID NO: 160 o el complemento de la misma.
Description
Compuestos y métodos para terapia y diagnosis de
cáncer de pulmón.
La presente invención se refiere, en general, a
composiciones y a métodos para el tratamiento y el diagnóstico de
cáncer de pulmón. Más específicamente, la invención se refiere a
secuencias de nucleótidos que se expresan preferentemente en tejido
de tumor pulmonar, junto con polipéptidos codificados por secuencias
de nucleótidos de este tipo. Las secuencias de nucleótidos y los
polipéptidos de la invención se pueden utilizar en vacunas y
composiciones farmacéuticas para el tratamiento y diagnóstico de
cáncer de pulmón.
El cáncer de pulmón es la causa principal de la
muerte por cáncer tanto de hombres y mujeres en los EE.UU.,
reseñándose en 1994 172.000 nuevos casos estimados. La tasa de
supervivencia de cinco años de todos los pacientes de cáncer de
pulmón, independientemente de la fase de la enfermedad en el
diagnóstico, es solamente del 13%. Esto contrasta con una tasa de
supervivencia de cinco años del 46% entre casos detectados cuando la
enfermedad se encuentra todavía localizada. Sin embargo, únicamente
el 16% de los cánceres de pulmón se descubren antes de que la
enfermedad se haya diseminado.
Es difícil una detección temprana, ya que a
menudo no se observan síntomas clínicos hasta que la enfermedad
haya alcanzado una fase avanzada. Actualmente, el diagnóstico es
sustentado mediante el uso de rayos X del tórax, análisis del tipo
de células contenidas en el esputo y el examen con fibra óptica de
los pasajes bronquiales. Los regímenes de tratamiento se determinan
por el tipo y la fase del cáncer, e incluyen cirugía, terapia de
radiación y/o quimioterapia. A pesar de una considerable
investigación en las terapias de la enfermedad, el cáncer de pulmón
sigue siendo difícil de tratar.
Por consiguiente, sigue siendo una necesidad en
la técnica vacunas mejoradas, métodos de tratamiento y técnicas
diagnósticas para el cáncer de pulmón.
El documento WO 96/02552 describe un marcador
del cáncer de pulmón.
En síntesis, la presente invención proporciona
compuestos y métodos para la terapia del cáncer de pulmón. En un
primer aspecto, se proporcionan moléculas de polinucleótidos
aisladas que codifican polipéptidos del tumor pulmonar,
comprendiendo las moléculas de polinucleótidos de este tipo una
secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
(a) secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 160; (b) secuencias
complementarias a una secuencia proporcionada en SEQ ID NO:
160.
En un segundo aspecto, se proporcionan
polipéptidos aislados que comprenden al menos una porción
inmunogénica de una proteína del tumor pulmonar o una variante de
la misma. En realizaciones específicas, polipéptidos de este tipo
comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula
de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo que consiste en (a) secuencias citadas en SEQ
ID NO: 160; (b) secuencias complementarias a una secuencia
proporcionada en SEQ ID NO: 160.
En aspectos relacionados, se proporcionan
vectores de expresión que comprenden las moléculas de
polinucleótidos de la invención junto con células hospedantes
transformadas o transfectadas con vectores de expresión de este
tipo. En realizaciones preferidas, las células hospedantes se
seleccionan del grupo que consiste en células de E. coli,
levaduras y mamíferos.
En otro aspecto, se proporcionan proteínas de
fusión que comprenden un primer y un segundo polipéptidos de la
invención o, alternativamente, un polipéptido de la invención y un
antígeno del tumor pulmonar conocido.
La presente invención proporciona, además,
composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los
polipéptidos, proteínas de fusión o moléculas de polinucleótidos
anteriores y un vehículo fisiológicamente aceptable, junto con
vacunas que comprenden uno o más de este tipo de polipéptidos,
proteínas de fusión o moléculas de polinucleótidos en combinación
con un reforzador de la respuesta inmune.
En aspectos relacionados, la presente
descripción proporciona métodos para inhibir el desarrollo del
cáncer de pulmón en un paciente, que comprende administrar a un
paciente una cantidad eficaz de al menos una de las composiciones
farmacéuticas y/o vacunas anteriores.
Adicionalmente, la presente invención
proporciona métodos para el inmunodiagnóstico del cáncer de pulmón,
junto con kits para el uso en métodos de este tipo. Se describen
polipéptidos que comprenden al menos una porción inmunogénica de
una proteína de tumor pulmonar o una variante de dicha proteína que
difiere solamente en sustituciones y/o modificaciones
conservativas, en donde la proteína de tumor pulmonar comprende una
secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de
polinucleótido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que
consiste en secuencias de nucleótidos citadas en SEQ ID NO: 160, y
variantes de las mismas. Polipéptidos de este tipo se pueden
emplear útilmente en el diagnóstico y la vigilancia del cáncer de
pulmón.
En un aspecto específico de la presente
invención, se proporcionan métodos para detectar el cáncer de pulmón
en un paciente, que comprenden: (a) poner en contacto una muestra
biológica obtenida de un paciente con un agente de unión que es
capaz de unirse a uno de los polipéptidos anteriores; y (b) detectar
en la muestra una proteína o polipéptido que se une al agente de
unión. En realizaciones preferidas, el agente de unión es un
anticuerpo, lo más preferiblemente un anticuerpo monoclonal.
En aspectos relacionados, se proporcionan
métodos para vigilar el progreso del cáncer de pulmón en un
paciente, que comprende: (a) poner en contacto una muestra
biológica obtenida de un paciente con un agente de unión que es
capaz de unirse a uno de los polipéptidos anteriores; (b) determinar
en la muestra una cantidad de una proteína o polipéptido que se une
al agente de unión; (c) repetir las etapas (a) y (b); y comparar las
cantidades de polipéptido detectado en las etapas (b) y (c).
Dentro de aspectos relacionados, la presente
invención proporciona anticuerpos, preferiblemente anticuerpos
monoclonales, que se unen a los polipéptidos de la invención, así
como kits diagnósticos que comprenden anticuerpos de este tipo, y
métodos de utilizar anticuerpos de este tipo para inhibir el
desarrollo del cáncer de pulmón.
La presente invención proporciona, además,
métodos para detectar el cáncer de pulmón, que comprende: (a)
obtener una muestra biológica de un paciente; (b) poner en contacto
la muestra con un primer un segundo cebadores de oligonucleótidos
en una reacción en cadena de la polimerasa, siendo al menos uno de
los cebadores de oligonucleótidos específico para una molécula de
polinucleótido que codifica uno de los polipéptidos anteriores; y
(c) detectar en la muestra una secuencia de polinucleótidos que se
amplifica en presencia del primer y segundo cebadores de
oligonucleótidos. En una realización preferida, al menos uno de los
cebadores de oligonucleótidos comprende al menos aproximadamente 10
nucleótidos contiguos de una molécula de polinucleótido que incluye
una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:
160.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona un método para detectar cáncer de pulmón en un paciente
que comprende (a) poner en contacto una muestra biológica obtenida
de un paciente con una sonda de oligonucleótido específica para una
molécula de polinucleótido que codifica uno de los polipéptidos
anteriores; y (c) detectar en la muestra una secuencia de
polinucleótidos que se hibrida a la sonda de oligonucleótidos.
Preferiblemente, la sonda de oligonucleótidos comprende al menos
aproximadamente 15 nucleótidos contiguos de una molécula de
polinucleótidos que tiene una secuencia parcial seleccionada del
grupo que consiste en SEQ ID NO:160.
En aspectos relacionados, se proporcionan kits
de diagnóstico que comprenden las sondas o cebadores de
oligonucleótidos anteriores.
Todavía en un aspecto adicional, se describen
métodos para el tratamiento del cáncer de pulmón en un paciente,
comprendiendo los métodos obtener PBMC (siglas en inglés - células
mononucleares de la sangre periférica) del paciente, incubar las
PBMC con un polipéptido de la presente invención (o un
polinucleótido que codifica un polipéptido de este tipo) para
proporcionar células T incubadas y administrar las células T
incubadas al paciente. La presente invención proporciona
adicionalmente métodos para el tratamiento del cáncer de pulmón,
que comprende incubar células presentadoras de antígeno con un
polipéptido de la presente invención (o un polinucleótido que
codifica un polipéptido de este tipo) para proporcionar células
presentadoras de antígenos incubadas y administrar al paciente las
células presentadoras de antígenos incubadas. En determinadas
realizaciones, las células presentadoras de antígenos se
seleccionan del grupo que consiste en células dendríticas y
macrófagos. También se proporcionan composiciones para el
tratamiento del cáncer de pulmón que comprenden células T o células
presentadoras de antígenos que han sido incubadas con un polipéptido
o polinucleótido de la presente invención. Estos y otros aspectos
de la presente invención resultarán evidentes tras la referencia a
la siguiente descripción detallada.
Tal como se ha señalado antes, la presente
invención está dirigida, en general, a composiciones y a su uso en
terapia y diagnóstico de cáncer de pulmón y a métodos para el
diagnóstico del cáncer de pulmón. Las composiciones descritas en
esta memoria incluyen polipéptidos, proteínas de fusión y moléculas
de polinucleótidos. También incluidas dentro de la presente
invención se encuentran moléculas (tales como un anticuerpo o
fragmento del mismo) que se unen a los polipéptidos de la
invención. A moléculas de este tipo se las alude en esta memoria
como "agentes de unión".
En un aspecto, la presente invención describe
polipéptidos que comprenden una porción inmunogénica de una
proteína de tumor pulmonar humana, en donde la proteína de tumor
pulmonar incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una
molécula de polinucleótidos que incluye una secuencia seleccionada
del grupo que consiste en (a) la secuencia de nucleótidos citada en
SEQ ID NO:160, (b) los complementos de dichas secuencias de
nucleótidos. Tal como se utiliza en esta memoria, el término
"polipéptido" abarca cadenas de aminoácidos de cualquier
longitud, incluidas proteínas de longitud completa, en donde los
residuos aminoácidos están enlazados por enlaces péptido
covalentes. Así, un polipéptido que comprende una porción de una de
las proteínas de tumor pulmonar anteriores puede consistir en su
totalidad en la porción, o la porción puede estar presente dentro de
un polipéptido mayor que contiene secuencias adicionales. Las
secuencias adicionales se pueden derivar de la proteína nativa o
pueden ser heterólogas, y secuencias de este tipo pueden (pero no
necesitan) ser inmunorreactivas y/o antigénicas. Tal como se
detalla en lo que sigue, polipéptidos de este tipo pueden aislarse
del tejido de tumor pulmonar o pueden prepararse por medios
sintéticos o recombinantes.
Tal como se utiliza en esta memoria, una
"porción inmunogénica" de una proteína de tumor pulmonar es una
porción que es capaz de provocar una respuesta inmune en un
paciente que padece cáncer de pulmón, y como tal se une a
anticuerpos presentes dentro del suero de un paciente de cáncer de
pulmón. Porciones inmunogénicas de este tipo comprenden, en
general, al menos aproximadamente 5 residuos aminoácidos, más
preferiblemente al menos aproximadamente 10 y, lo más
preferiblemente, al menos aproximadamente 20 residuos aminoácidos.
Porciones inmunogénicas de las proteínas descritas en esta memoria
se pueden identificar en ensayos de unión a anticuerpos. Ensayos de
este tipo pueden realizarse, en general, utilizando cualesquiera de
una diversidad de medios conocidos por un experto ordinario en la
técnica tal como se describe, por ejemplo, en Harlow y Lane.
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988. Por ejemplo, un
polipéptido puede ser inmovilizado sobre un soporte sólido (tal
como se describe más abajo) y puede ser puesto en contacto con
sueros de pacientes para permitir la unión de anticuerpos dentro de
los sueros al polipéptido inmovilizado. A continuación, los sueros
no ligados pueden ser retirados y los anticuerpos unidos pueden ser
detectados, utilizando por ejemplo, Proteína A marcada con
^{125}I. Alternativamente, se puede utilizar un polipéptido para
generar anticuerpos monoclonales y policlonales para uso en la
detección del polipéptido en la sangre u otros fluidos de pacientes
de cáncer de pulmón. Métodos para preparar e identificar porciones
inmunogénicas de antígenos de secuencia conocida son bien conocidos
en la técnica e incluyen los resumidos en Paul, Fundamental
Immunology 3ª ed. Raven Press, 1993, págs
243-247.
El término "polinucleótido(s)", tal
como se utiliza en esta memoria, significa un polímero de cadena
sencilla o doble de bases desoxiribonucleótido o ribonucleótido, e
incluye ADN y correspondientes moléculas de ARNm, incluidas
moléculas de ARNhn y ARNm, cadenas tanto sentido como
anti-sentido, y comprende ADNc, ADN genómico y ADN
recombinante, así como polinucleótidos total o parcialmente
sintetizados. Una molécula de ARNhn contiene intrones y corresponde
a una molécula de ADN de una manera generalmente de uno a uno. Una
molécula de ARNm corresponde a una molécula de ARNhn y ADN de la
que se han escindido los intrones. Un polinucleótido puede
consistir en un gen completo o en cualquier porción del mismo.
Polinucleótidos anti-sentido operativos pueden
comprender un fragmento del correspondiente polinucleótido y, por lo
tanto, la definición de "polinucleótido" incluye todos los
fragmentos anti-sentido operativos de este tipo.
Las composiciones y métodos de la presente
invención abarcan también variantes de los polipéptidos y
polinucleótidos anteriores, Una "variante" de polipéptido, tal
como se utiliza en esta memoria, es un polipéptido que difiere del
polipéptido citado únicamente en sustituciones y/o modificaciones
conservativas, de modo que se conservan las propiedades
terapéuticas, antigénicas y/o inmunogénicas del polipéptido. En una
realización preferida, polipéptidos variantes difieren de una
secuencia identificada por sustitución, deleción o adición de cinco
aminoácidos o menos. Variantes de este tipo pueden ser
identificadas, en general, modificando una de las secuencias de
polipéptidos anteriores y evaluando las propiedades antigénicas del
polipéptido modificado utilizando, por ejemplo, los procesos
representativos descritos en esta memoria. Variantes de polipéptidos
exhiben preferiblemente al menos aproximadamente 70%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, y lo más
preferiblemente al menos aproximadamente 95% de identidad
(determinada según se describe más abajo) con respecto a los
polipéptidos identificados.
Tal como se utiliza en esta memoria, una
"sustitución conservativa" es una en la que un aminoácido está
sustituido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de
modo que un experto en la técnica de la Química de los Péptidos
esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática
del polipéptido permanezca sustancialmente sin variar. En general,
los siguientes grupos de aminoácidos representan cambios
conservativos: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2)
cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg,
his; y (5) phe, tyr, trp, his.
Variantes pueden contener también o,
alternativamente, otras modificaciones, incluidas la deleción o
adición de aminoácidos que tengan una influencia mínima sobre las
propiedades antigénicas, la estructura secundaria y la naturaleza
hidropática del polipéptido. Por ejemplo, un polipéptido puede estar
conjugado a una secuencia señal (o conductora) en el extremo
N-terminal de la proteína, que dirige
co-traducción o post-traducción la
transferencia de la proteína. El polipéptido también se puede
conjugar a un enlazador u otra secuencia para facilitar la
síntesis, purificación o identificación del polipéptido (por ejemplo
poli-His), o para reforzar la unión del polipéptido
a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido puede conjugarse a
una región Fc de inmunoglobulina.
Una "variante" de nucleótido es una
secuencia que difiere de la secuencia de nucleótidos citada al tener
una o más deleciones, sustituciones o adiciones de nucleótidos.
Modificaciones de este tipo se pueden fácilmente introducir
utilizando técnicas de mutagénesis estándares tales como mutagénesis
dirigida al oligonucleótido y específica para el sitio, según se
enseña, por ejemplo, por Adelman et al. (DNA, 2:183,
1983). Variantes de nucleótidos pueden ser variantes alélicas que
se producen de forma natural o variantes que se producen de forma
no natural. Secuencias de nucleótidos variantes exhiben
preferiblemente al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente
al menos aproximadamente 80% y, lo más preferiblemente, al menos 90%
de identidad (determinada según se describe más abajo) con respecto
a la secuencia citada.
Los antígenos proporcionados por la presente
invención incluyen variantes que son codificadas por secuencias de
polinucleótidos que son esencialmente homólogas a una o más de las
secuencias de polinucleótidos específicamente citadas en esta
memoria. "Homología sustancial", tal como se utiliza en esta
memoria, se refiere a secuencias de polinucleótidos que son capaces
de hibridarse bajo condiciones moderadamente estrictas. Condiciones
moderadamente estrictas adecuadas incluyen un prelavado en una
solución de 5X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); hibridación
a 50°C-65°C, 5X SSC, durante una noche, o en el caso
de una homología entre especies cruzadas, a 45°C con 0,5X SSC;
seguido de lavado dos veces a 65°C durante 20 minutos, cada vez con
2X, 0,5X y 0,2X SSC que contiene SDS al 0,1%. Secuencias de
polinucleótidos hibridantes de este tipo se encuentran también
dentro del alcance de esta invención, al igual que secuencias de
nucleótidos que, debido a la degeneración del código, codifican un
polipéptido inmunogénico que es codificado por una secuencia de
polinucleótidos hibridante.
Dos secuencias de nucleótidos o polipéptidos se
dice que son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o
residuos aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se
alinean para una correspondencia máxima tal como se describe más
abajo. Comparaciones entre dos secuencias se realizan típicamente al
comparar las secuencias a lo largo de una ventana de comparación
para identificar y comparar regiones locales de similitud de la
secuencia. Una "ventana de comparación", tal como se utiliza
en esta memoria, se refiere a un segmento de al menos
aproximadamente 20 posiciones contiguas, habitualmente 30 a
aproximadamente 75, 40 a aproximadamente 50, en las que una
secuencia puede ser comparada con una secuencia de referencia del
mismo número de posiciones contiguas después de que las dos
secuencias están óptimamente alineadas.
La alineación óptima de las secuencias para la
comparación puede realizarse utilizando el programa Megalign en la
serie de software bioinformático Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison,
WI), utilizando parámetros por defecto. Este programa incorpora
varios esquemas de alineación descritos en las siguientes
referencias: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in
proteins - Matrices for detecting distant relationships, en Dayhoff,
M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National
Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, supl. 3,
págs. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to
Alignment and Phylogenes págs. 626-645 Methods
in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA;
Higgins, D.G. y Sharp, P.M. (1989) Fast and sensitive multiple
sequence alignments on a microcomputer CABIOS 5:
151-153; Myers, E. W. y Muller W. (1988) Optimal
alignments in linear space CABIOS 4:11-17; Robinson,
E.D. (1971) Comb. Theor 11:105: Santou, N. Nes, M. (1987)
The neighbor joining method. A new method for reconstructing
phylogenetic trees Mol. Biol. Evol.
4:406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R. (1973)
Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical
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Lipman, D.J. (1983) Rapid similarity searches of nucleic acid and
protein data banks Proc. Natl. Acad., Sci. USA.
80:726-730.
Preferiblemente, el "porcentaje de identidad
de la secuencia" se determina comparando dos secuencias
óptimamente alineadas a lo largo de una ventana de comparación de
al menos 20 posiciones, en donde la porción de la secuencia de
polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender
adiciones o deleciones (es decir huecos) de 20 por ciento o menos,
habitualmente 5 a 15 por ciento, ó 10 a 12 por ciento, en
comparación con las secuencias de referencia (que no comprenden
adiciones ni deleciones) para una alineación óptima de las dos
secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de
posiciones en las que las bases de ácidos nucleicos o el residuo de
aminoácido idénticos se produce en las dos secuencias para
proporcionar el número de posiciones apareadas, dividiendo el
número de posiciones apareadas por el número total de posiciones en
la secuencia de referencia (es decir el tamaño de la ventana) y
multiplicando los resultados por 100 para proporcionar el
porcentaje de identidad de la secuencia.
También se incluye en el alcance de la presente
invención alelos de los genes que codifican la secuencia de
nucleótidos citadas en esta memoria. Tal como se utiliza en esta
memoria, un "alelo" o "secuencia alélica" es una forma
alternativa del gen que puede resultar de al menos una mutación en
la secuencia de ácidos nucleicos. Los alelos pueden dar como
resultados ARNms o polipéptidos alterados, cuya estructura o función
puede o no estar alterada. Cualquier gen dado puede tener ninguna,
una o muchas formas alélicas. Cambios mutacionales comunes que dan
origen a alelos se atribuyen generalmente a deleciones, adiciones o
sustituciones naturales de nucleótidos. Cada uno de estos tipos de
cambios pueden producirse solos o en combinación con los otros, una
o más veces en una secuencia dada.
Para polipéptidos del tumor pulmonar con
propiedades inmunorreactivas, las variantes se pueden identificar,
alternativamente, modificando la secuencia de aminoácidos de uno de
los polipéptidos anteriores, y evaluando la inmunorreactividad en
el polipéptido modificado. Para polipéptidos del tumor pulmonar
útiles para la generación de agentes de unión diagnósticos, se
puede identificar una variante evaluando un polipéptido modificado
en cuanto a la capacidad de generar anticuerpos que detectan la
presencia o ausencia de cáncer de pulmón. Secuencias modificadas de
este tipo se pueden preparar y someter a ensayo utilizando, por
ejemplo, los procedimientos representativos descritos en esta
memoria.
Los polipéptidos del tumor pulmonar de la
presente invención, y moléculas de polinucleótidos que codifican
polipéptidos de este tipo se pueden aislar de tejido de tumor
pulmonar utilizando cualquiera de una diversidad de métodos bien
conocidos en la técnica. Secuencias de polinucleótidos que
corresponden a un gen (o una porción del mismo) que codifican una
de las proteínas del tumor pulmonar de la invención se pueden aislar
de una genoteca de ADNc del tumor pulmonar utilizando una técnica
de sustracción según se describe en detalle más abajo. Ejemplos de
secuencias de polinucleótidos de este tipo se proporcionan en SEQ ID
NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153,
154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168 y 171.
Secuencias de polinucleótidos parciales, así obtenidas, se pueden
utilizar para diseñar cebadores de oligonucleótidos en cuanto a la
amplificación de secuencias de polinucleótidos de longitud completa
a partir de una genoteca de ADN genómico humano o a partir de una
genoteca de ADNc de tumor pulmonar en una reacción en cadena de la
polimerasa (PCR - siglas en inglés), utilizando técnicas bien
conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Mullis et al., Cold
Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1987; Erlich ed.,
PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989). Para este enfoque,
cebadores específicos para la secuencia se pueden diseñar en base a
las secuencias de nucleótidos proporcionadas en esta memoria y se
pueden adquirir o sintetizar.
Una porción amplificada se puede utilizar para
aislar un gen de longitud completa a partir de una genoteca
adecuada (por ejemplo una genoteca de ADNc de tumor pulmonar)
utilizando técnicas bien conocidas. Dentro de técnicas de este
tipo, una genoteca (ADNc o genómica) se rastrea utilizando una o más
sondas o cebadores de polinucleótidos adecuados para la
amplificación. Preferiblemente, una genoteca se selecciona en cuanto
al tamaño para que incluya moléculas mayores. Genotecas cebadas
aleatoriamente también se pueden preferir para identificar regiones
de genes 5' y situadas más arriba. Se prefieren genotecas genómicas
para obtener intrones y prolongar secuencias 5'.
Para las técnicas de hibridación, una secuencia
parcial se puede marcar (por ejemplo mediante traslación de
incisión o marcaje en el extremo con ^{32}P) utilizando técnicas
bien conocidas. Después, una genoteca bacteriana o bacteriófaga se
rastrea hibridando filtros que contienen colonias bacterianas
desnaturalizadas (o céspedes que contienen halos de fagos) con la
sonda marcada (véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring
Harbor, NY, 1989). Colonias o halos hibridantes se seleccionan y
expanden, y el ADN se aísla para el análisis adicional. Clones de
ADNc se pueden analizar para determinar la cantidad de secuencia
adicional, por ejemplo mediante PCR, utilizando un cebador
procedente de la secuencia parcial y un cebador procedente del
vector. Mapas de restricción y secuencias parciales se pueden
generar para identificar uno o más clones solapantes. La secuencia
completa se puede luego determinar utilizando técnicas estándares
que pueden implicar generar una serie de clones de deleción. Las
secuencias solapantes resultantes se reúnen luego en una única
secuencia contigua. Una molécula de ADNc de longitud completa se
puede generar ligando fragmentos adecuados, utilizando técnicas
bien conocidas.
Alternativamente, existen numerosas técnicas de
amplificación para obtener una secuencia codificadora de longitud
completa a partir de una secuencia de ADNc parcial. Dentro de
técnicas de este tipo, la amplificación se realiza generalmente a
través de PCR. Cualquiera de una diversidad de kits comercialmente
disponibles se puede utilizar para efectuar la etapa de
amplificación. Los cebadores se pueden diseñar utilizando técnicas
bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Mullis et al.,
Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 51:263, 1987; Erlich ed.,
PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989) y también se puede emplear
software bien conocido en la técnica. Los cebadores tienen
preferiblemente una longitud de 22-30 nucleótidos,
con un contenido en GC de al menos 50% y se reasocian a la
secuencia diana a temperaturas de aproximadamente 68°C a 72°C. La
región amplificada se puede secuenciar tal como se describe antes y
secuencias solapantes se pueden reunir en una secuencia
contigua.
Una técnica de amplificación de este tipo es PCR
inversa (véase Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186,
1988) que utiliza enzimas de restricción para generar un fragmento
en la región conocida del gen. A continuación, el fragmento se
circulariza mediante ligamiento intramolecular y se utiliza como un
molde para la PCR con cebadores divergentes derivados de la región
conocida. Dentro de un enfoque alternativo, secuencias adyacentes a
una secuencia parcial se pueden recuperar mediante amplificación con
un cebador a una secuencia de enlazador y un cebador específico a
una región conocida. Las secuencias amplificadas se someten
típicamente a una segunda ronda de amplificación con el mismo
cebador del enlazador y un segundo cebador específico para la región
conocida. Una variación de este proceso, que emplea dos cebadores
que inician la extensión en direcciones opuestas a partir de la
secuencia conocida, se describe en el documento WO 96/38591.
Técnicas adicionales incluyen PCR de captura (Lagerstrom et al.,
PCR Methods Applic. 1:111-19, 1991) y PCR
caminante (Parker et al., Nucl. Acids. Res.
19:3055-60, 1991). La amplificación mediada por
transcripción, o TMA (siglas en inglés), es otro método que puede
utilizarse para la amplificación de ADN, ARNr o ARNm según se
describe en la patente nº PCT/US91/03184. Este método
autocatalítico e isotérmico no basado en PCR utiliza dos cebadores y
dos enzimas: ARN polimerasa y transcriptasa inversa. Un cebador
contiene una secuencia de promotor para la ARN polimerasa. En la
primera amplificación, el promotor-cebador se
hibrida al ARNr diana en un sitio definido. La transcriptasa inversa
crea una copia de ADN del ARNr diana mediante extensión desde el
extremo 3' del promotor-cebador. El ARN en el
complejo resultante se degrada, y un segundo cebador se une a la
copia de ADN. Una nueva cadena de ADN se sintetiza a partir del
extremo del cebador mediante transcriptasa inversa, creando ADN de
doble cadena. La ARN polimerasa reconoce la secuencia de promotor
en el molde de ADN e inicia la transcripción. Cada uno de los
amplicones de ARN recién sintetizados vuelve a entrar en el proceso
de TMA y sirve como molde para una nueva ronda de replicación que
conduce a la expansión exponencial del amplicón de ARN. También se
pueden emplear otros métodos que emplean la amplificación para
obtener una secuencia de ADNc de longitud completa.
En determinados casos, es posible obtener una
secuencia de ADNc de longitud completa mediante el análisis de
secuencias proporcionadas en una base de datos de etiqueta de
secuencia expresada (EST- siglas en inglés), tal como la disponible
de GenBank. Investigaciones de ESTs solapantes se pueden realizar en
general utilizando programas bien conocidos (por ejemplo
investigaciones NCBI BLAST) y ESTs de este tipo se pueden utilizar
para generar una secuencia de longitud completa contigua.
Una vez que se ha obtenido una secuencia de
polinucleótidos que codifica un polipéptido, el polipéptido se
puede producir de modo recombinante insertando la secuencia de
polinucleótidos en un vector de expresión y expresando el
polipéptido en un hospedante apropiado. Para expresar polipéptidos
recombinantes de esta invención se puede emplear cualquiera de una
diversidad de vectores de expresión conocidos por los expertos
ordinarios en la técnica. La expresión se puede conseguir en una
célula hospedante apropiada que ha sido transformada o transfectada
con un vector de expresión que contiene una molécula de
polinucleótido que codifica el polipéptido recombinante. Células
hospedantes adecuadas incluyen células de procariotas, levaduras,
insectos y eucarióticas superiores. Preferiblemente, las células
hospedantes empleadas son E. coli, levadura o una línea de
células de mamíferos tal como células COS o CHO. Las secuencias de
polinucleótidos expresadas de esta manera pueden codificar
polipéptidos que aparecen de forma natural, porciones de
polipéptidos que aparecen de forma no natural u otras variantes de
los mismos. Sobrenadantes de sistemas de hospedante/vector adecuados
que segreguen el polipéptido recombinante se pueden concentrar
primeramente utilizando un filtro comercialmente disponible. A
continuación, el concentrado se puede aplicar a una matriz de
purificación adecuada, tal como una matriz de afinidad o una resina
de intercambio de iones. Finalmente, se pueden emplear una o más
etapas de HPLC de fase inversa para purificar adicionalmente el
polipéptido recombinante.
Los polipéptidos del tumor pulmonar descritos en
esta memoria también se pueden generar por medios sintéticos. En
particular, polipéptidos sintéticos con menos de aproximadamente 100
aminoácidos y, generalmente, menos de aproximadamente 50
aminoácidos se pueden generar utilizando técnicas bien conocidas por
los expertos ordinarios en la técnica. Por ejemplo, polipéptidos de
este tipo se pueden sintetizar utilizando cualquiera de las técnicas
en fase sólida comercialmente disponibles, tal como el método de
síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que aminoácidos se
añaden secuencialmente a una cadena de aminoácidos en crecimiento
(véase, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc.
85:2149-2146, 1963). El equipo para la síntesis
automatizada de polipéptidos está comercialmente disponible de
suministradores tales como Perkin Elmer/Applied BioSystems Division
(Foster City, CA), y se puede hacer funcionar de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Además, antígenos del tumor pulmonar se pueden
identificar mediante clonación de la expresión de células T. Una
fuente de células T específicas para tumores procede de tumores
quirúrgicamente escindidos de pacientes humanos. En un método para
aislar y caracterizar células T específicas para tumores, el tumor
escindido es desmenuzado y digerido enzimáticamente durante varias
horas para liberar células tumorales y linfocitos infiltrantes
(células T infiltrantes de tumores o TILs - siglas en inglés). Las
células se lavan en tampón HBSS y se hacen pasar sobre un gradiente
discontinuo de Ficoll (100%/75%/HBSS) para separar células tumorales
y linfocitos de células no viables. Se recolectan dos bandas de las
interfases; la banda superior en la interfase de 75%/HBSS contiene
predominantemente células tumorales, mientras que la banda inferior
en la interfase 100%/75%/HBSS contiene una mayoría de linfocitos.
Las TILs se expanden en cultivo mediante técnicas bien conocidas en
la técnica, pero preferiblemente en medios de cultivo suplementados
con 10 ng/ml de IL-7 y 100 U/ml de
IL-2 o, alternativamente, se cultivan y expanden en
placas de cultivo tisular que han sido
pre-adsorbidas con anticuerpo monoclonal
anti-CD3 (OKT3). Los cultivos de TIL resultantes se
analizan mediante FACS para confirmar que la gran mayoría son
células T CD8+ (> 90% de la población introducida).
Además, las células tumorales son también
expandidas en cultivo utilizando técnicas convencionales bien
conocidas en la técnica para establecer una línea de células
tumorales que posteriormente se confirma que son células de
carcinoma de pulmón mediante análisis inmunohistoquímico. La línea
de células tumorales se transduce con un vector retroviral para
expresar CD80 humana. La línea de células tumorales se caracteriza
adicionalmente mediante análisis FACS para confirmar los fuertes
niveles de expresión de CD80, moléculas MHC clase I y II.
La especificidad de las líneas TIL para el tumor
pulmonar se confirma mediante análisis de liberación de
INF-\gamma y/o TNF-\alpha
citocina. Por ejemplo, células TIL procedentes de cultivos del día
21 se co-cultivan con células tumorales autólogas o
alogénicas, LCL inmortalizado con EBV, o líneas de células testigo
Daudi y K582, y el sobrenadante del cultivo se vigila mediante
ELISA en cuanto a la presencia de citocinas. La expresión de estas
citocinas específicas en presencia de células tumorales o testigo
negativas indica si las líneas TIL son específicas para el tumor y
reconocen en potencia el antígeno tumoral presentado por las
moléculas MHC autólogas.
Las líneas TIL específicas para el tumor
caracterizadas se pueden expandir y clonar por métodos bien
conocidos en la técnica. Por ejemplo, las líneas TIL se pueden
expandir a números adecuados para la clonación por expresión de
células T utilizando anticuerpo anti-CD3 soluble en
cultivo con LCLs transformadas con EBV e irradiadas y células
alimentadores PBL en presencia de 20 U/ml de IL-2.
Clones procedentes de las líneas de TIL expandidas se pueden
generar mediante técnicas de dilución limitante convencionales. En
particular, células TIL se siembran a razón de 0,5 células/pocillo
en una placa de fondo en U de 96 pocillos y se estimulan con células
tumorales autólogas transducidas con CD-80, LCL
transformada con EBV y células alimentadoras PBL en presencia de 50
U/ml de IL-2. Estos clones se pueden analizar
adicionalmente en cuanto a la especificidad del tumor mediante
microcitoxicidad con ^{51}Cr y bioanálisis de
IFN-\gamma. Adicionalmente, el elemento de
restricción MHC reconocido por los clones TIL se puede determinar
mediante estudios de bloqueo del anticuerpo bien conocidos en la
técnica.
Las líneas o clones CTL descritos anteriormente
se pueden emplear para identificar antígenos específicos para
tumores. Por ejemplo, fibroblastos autólogos o LCL procedentes de un
paciente se pueden transfectar o transducir con fragmentos de
polinucleótidos derivados de una genoteca de ADNc del tumor pulmonar
para generar células diana que expresan polipéptidos tumorales. Las
células diana que expresan polipéptidos tumorales en el contexto de
MHC serán reconocidas por la línea o clon CTL, dando como resultado
una activación de células T que puede ser vigilada mediante
análisis de detección de citocinas. El gen tumoral que es expresado
por la célula diana y es reconocido por CTL específico para tumores
se aísla después mediante técnicas descritas anteriormente. En
general, independientemente del método de preparación, los
polipéptidos descritos en esta memoria se preparan de una forma
aislada y esencialmente pura (es decir, los polipéptidos son
homogéneos según se determina por la composición de aminoácidos y
el análisis de la secuencia primaria). Preferiblemente, los
polipéptidos tienen una pureza de al menos aproximadamente 90%, más
preferiblemente de al menos aproximadamente 95% y, lo más
preferiblemente una pureza de al menos aproximadamente 99%. En
determinadas realizaciones preferidas, descritas con mayor detalle
más abajo, los polipéptidos esencialmente puros se incorporan en
composiciones farmacéuticas o vacunas para uso en uno o más de los
métodos descritos en esta memoria.
En un aspecto relacionado, la presente invención
proporciona proteínas de fusión que comprenden un primer y un
segundo polipéptido de la invención o, alternativamente, un
polipéptido de la presente invención y un antígeno del tumor
pulmonar conocido, junto con variantes de proteínas de fusión de
este tipo. Las proteínas de fusión de la presente invención pueden
(pero no necesitan) incluir un péptido enlazador entre el primer y
el segundo polipéptidos.
Una secuencia de polinucleótidos que codifica
una proteína de fusión de la presente invención se construye
utilizando técnicas de ADN recombinante conocidas para ensamblar
secuencias de polinucleótidos separadas que codifican el primer y
el segundo polipéptidos en un vector de expresión apropiado. El
extremo 3' de una secuencia de ADN que codifica el primer
polipéptido se liga, con o sin un enlazador peptídico, al extremo 5'
de una secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido, de
modo que los marcos de lectura de las secuencias se encuentran en
fase para permitir la traducción de ARNm de las dos secuencias de
ADN en una sola proteína de fusión que conserva la actividad
biológica tanto del primero como del segundo polipéptidos.
Una secuencia del enlazador peptídico se puede
emplear para separar el primero y el segundo polipéptidos una
distancia suficiente para asegurar que cada polipéptidos se pliegue
en sus estructuras secundaria y terciaria. Una secuencia de
enlazador peptídico de este tipo se incorpora en la proteína de
fusión utilizando técnicas convencionales bien conocidas en la
técnica. Secuencias de enlazador peptídico adecuadas se pueden
elegir en base a los siguientes factores: (1) su capacidad de
adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad de
adoptar una estructura secundaria que podría interactuar con
epítopos funcionales en los primero y segundo polipéptidos; y (3)
la carencia de residuos hidrófobos o cargados que pudieran
reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Secuencias
de enlazador peptídico preferidas contienen residuos Gly, Asn y
Ser. Otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala, también
se pueden utilizar en la secuencia del enlazador. Secuencias de
aminoácidos que se pueden emplear útilmente como enlazadores
incluyen las descritas en Maratea et al., Gene
40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad
Sci. USA. 83:8258-8262, 1986; patente de EE.UU.
nº 4.935.233 y patente de EE.UU. nº 4.715.180. La secuencia de
enlazador pueden tener una longitud de 1 a aproximadamente 50
aminoácidos. No se requieren secuencias peptídicas cuando el primer
y el segundo polipéptidos no tienen regiones de aminoácidos
N-terminales no esenciales que pueden utilizarse
para separar los dominios funcionales y prevenir una interferencia
estérica.
Las secuencias de polinucleótidos ligadas están
operativamente enlazadas a elementos reguladores de la transcripción
o traducción. Los elementos reguladores responsables de la
expresión del polinucleótido están situados únicamente en 5' con
respecto a la secuencia de ADN que codifica los primeros
polipéptidos. De manera similar, codones de terminación que
requieren señales de terminación de la traducción y de terminación
de la transcripción, están solamente presentes en la posición 3'
con respecto a la secuencia de ADN que codifica el segundo
polipéptido.
También se proporcionan proteínas de fusión que
comprenden un polipéptido de la presente invención junto con una
proteína inmunogénica no relacionada. Preferiblemente, la proteína
inmunogénica es capaz de provocar una respuesta de rellamada.
Ejemplos de proteínas de este tipo incluyen las proteínas del
tétanos, tuberculosis y hepatitis (véase, por ejemplo, Stoute et
al. New Engl. J. Med., 336:86-91 (1997)).
Polipéptidos de la presente invención que
comprenden una porción inmunogénica de una proteína del tumor
pulmonar se pueden generalmente utilizar para la terapia del cáncer
de pulmón, en donde el polipéptido estimula la respuesta inmune
propia del paciente hacia las células de tumor pulmonar. La presente
invención proporciona, así, métodos para utilizar uno o más de los
compuestos descritos en esta memoria (que pueden ser polipéptidos,
moléculas de polinucleótidos o proteínas de fusión) para la
inmunoterapia del cáncer de pulmón en un paciente. Tal como se
utiliza en esta memoria, un "paciente" se refiere a cualquier
animal homeotermo, preferiblemente un ser humano. Un paciente puede
verse afectado por la enfermedad o puede estar exento de una
enfermedad detectable. Por consiguiente, los compuestos descritos
en esta memoria se pueden utilizar para tratar el cáncer de pulmón
o para inhibir el desarrollo del cáncer de pulmón. Los compuestos se
administran preferiblemente ya sea antes o después de la
extirpación quirúrgica de tumores primarios y/o del tratamiento
mediante la administración de radioterapia y fármacos
quimioterapéuticos convencionales.
En estos aspectos, el polipéptido de la
invención está generalmente presente dentro de una composición
farmacéutica o una vacuna. Composiciones farmacéuticas pueden
comprender uno o más polipéptidos, cada uno de los cuales puede
contener una o más de las secuencias anteriores (o variantes de las
mismas) y un vehículo fisiológicamente aceptable. Las vacunas
pueden comprender uno o más de este tipo de polipéptidos y un
reforzador de la respuesta inmune no específico, en donde el
reforzador de la respuesta inmune no específico es capaz de provocar
o reforzar una respuesta inmune a un antígeno exógeno. Ejemplos de
reforzadores de la respuesta inmune no específicos incluyen
adyuvantes, microesferas biodegradables (por ejemplo galactida
poliláctica) y liposomas (en los que se incorpora el polipéptido).
Composiciones farmacéuticas y vacunas también pueden contener otros
epítopos de antígenos del tumor pulmonar, ya sea incorporados en
una proteína de fusión según se describe antes (es decir un sólo
polipéptido que contiene múltiples epítopos) o presentes dentro de
un polipéptido separado.
Alternativamente, una composición farmacéutica o
vacuna puede contener un polinucleótido que codifica uno o más de
los polipéptidos y/o proteínas de fusión anteriores, de modo que el
polipéptido se genera in situ. En composiciones
farmacéuticas y vacunas de este tipo, el polinucleótido puede estar
presente dentro de cualquiera de una diversidad de sistemas de
suministro conocidos por los expertos ordinarios en la técnica,
incluidos sistemas de expresión de ácidos nucleicos, bacterias y
sistemas de expresión virales. Sistemas de expresión de ácidos
nucleicos apropiados contienen las secuencias de polinucleótidos
necesarias para la expresión en el paciente (tal como un promotor
adecuado). Sistemas de suministro bacteriano implican la
administración de una bacteria (tal como
Bacillus-Calmette-Guerrin)
que expresa un epítopo de un antígeno celular pulmonar sobre su
superficie de la célula. En una realización preferida, los
polinucleótidos pueden introducirse utilizando un sistema de
expresión viral (por ejemplo vacunal u otros virus de la viruela,
retrovirus o adenovirus) que puede implicar el uso de un virus no
patógeno (defectuoso), competente para la replicación. Sistemas
adecuados se describen, por ejemplo en Fisher-Hoch
et al., PNAS 86:317-321, 1989; Flexner et
al Ann N.Y. Acad. Sci. 569: 86-103, 1989;
Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990;
patentes de EE.UU. nºs 4.603.112, 4.769.330 y 5.017.487; documento
WO 89/01973; patente de EE.UU. nº 4.777.127; GB 2.200.651; EP
0.345.242; documento WO 91/02805; Berkner, Biotechniques
6:616-627, 1988; Rosenfeld et al.,
Science 252:431-434, 1991; Kolls et al., PNAS
91:215-219, 1994; Kass-Eisler
et al., PNAS 90:11498-11502, 1993; Guzman
et al., Circulation 88:2838-2848, 1993; y
Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993.
Técnicas para incorporar polipéptidos en sistemas de expresión de
este tipo son bien conocidas para los expertos ordinarios en la
técnica. Los polinucleótidos también pueden estar "desnudos"
según se describe, por ejemplo, en la solicitud PCT publicada WO
90/11092, y Ulmer et al., Science
259:1745-1749, 1993, revisado por Cohen,
Science 259:1691-1692, 1993. La absorción de
polinucleótidos desnudos se puede incrementar vistiendo los
polinucleótidos sobre perlas biodegradables que son transportadas
eficazmente al interior de las células.
Las vías y la frecuencia de administración, así
como la dosificación, variarán de un individuo a otro y pueden ser
paralelas a las que actualmente se utilizan en la inmunoterapia de
otras enfermedades. En general, las composiciones farmacéuticas y
vacunas se pueden administrar mediante inyección (por ejemplo
intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), por vía
intranasal (por ejemplo mediante aspiración) o por vía oral. Entre
1 y 10 dosis se pueden administrar a lo largo de un período de
3-24 semanas. Preferiblemente, se administran 4
dosis a un intervalo de 3 meses y después de ello se pueden dar
periódicamente administraciones de refuerzo. Protocolos
alternativos pueden ser apropiados para pacientes individuales. Una
dosis adecuada es una cantidad de polipéptido o polinucleótido que
es eficaz para hacer surgir una respuesta inmune (celular y/o
humoral) contra células del tumor pulmonar en un paciente tratado.
Una respuesta inmune adecuada se encuentra al menos
10-50% por encima del nivel basal (es decir no
tratado). En general, la cantidad de polipéptido presente en una
dosis (o producida in situ por la o las moléculas de
polinucleótidos en una dosis) oscila entre aproximadamente 1 pg y
aproximadamente 100 mg por kg de hospedante, típicamente de
aproximadamente 10 pg a aproximadamente 1 mg y, preferiblemente, de
aproximadamente 100 pg a aproximadamente 1 \mug. Tamaños de dosis
adecuados variarán con el tamaño del paciente, pero típicamente
oscilarán entre aproximadamente 0,01 mL y aproximadamente 5 mL.
Mientras que cualquier vehículo adecuado
conocido por los expertos ordinarios en la técnica se puede emplear
en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de
vehículo variará en función del modo de administración. Para la
administración por vía parenteral, tal como inyección subcutánea, el
vehículo comprende preferiblemente agua, solución salina, alcohol,
un lípido, una cera y/o un tampón. Para la administración por vía
oral, se puede emplear cualquiera de los vehículos anteriores o un
soporte sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de
magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y/o
carbonato de magnesio. También se pueden emplear microesferas
biodegradables (por ejemplo glicolida poliláctica) como vehículos
para las composiciones farmacéuticas de esta invención.
Microesferas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en
las patentes de EE.UU. nºs 4.897.268 y 5.075.109.
En las vacunas de esta invención se puede
emplear cualquiera de una diversidad de reforzadores de la respuesta
inmune. Por ejemplo, puede incluirse un adyuvante. La mayoría de
los adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger el
antígeno frente a un rápido catabolismo, tal como hidróxido de
aluminio o aceite mineral, y un estimulador no específico de la
respuesta inmune, tal como lípido A, Bordella pertussis o
Mycobacterium tuberculosis. Adyuvantes de este tipo están
comercialmente disponibles tales como, por ejemplo, adyuvante
incompleto de Freund y adyuvante completo de Freund (Difco
Laboratories, Detroit, MI) y Merck Adyuvant 65 (Merck and Company,
Inc., Rahway, NJ). Polipéptidos y polinucleótidos descritos en esta
memoria también se pueden emplear en la inmunoterapia adoptiva para
el tratamiento del cáncer. La inmunoterapia adoptiva puede ser
clasificada ampliamente en una inmunoterapia activa o pasiva. En la
inmunoterapia activa, el tratamiento se basa en la estimulación
in vivo del sistema inmune del hospedante endógeno para
reaccionar contra tumores con la administración de agentes
modificadores de la respuesta inmune (por ejemplo vacunas contra
tumores, adyuvantes bacterianos y/o citocinas).
En la inmunoterapia pasiva, el tratamiento
implica el suministro de reactivos biológicos con una reactividad
tumor-inmune establecida (tal como células efectoras
o anticuerpos) que pueden mediar directa o indirectamente en
efectos antitumorales y que no dependen necesariamente de un sistema
inmune de hospedante intacto. Ejemplos de células efectoras
incluyen linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T CD8+ citotóxicos,
células helper T CD4+, linfocitos T gamma/delta, linfocitos
infiltrantes de tumores), células exterminadoras (tales como células
exterminadoras naturales, células exterminadoras activadas por
linfocina), células B o células presentadoras de antígenos (tales
como células dendríticas y macrófagos) que expresan los antígenos
descritos. Los polipéptidos descritos en esta memoria también se
pueden utilizar para generar anticuerpos o anticuerpos
anti-idiotípicos (tal como en la patente de EE.UU.
nº 4.918.164) para la inmunoterapia pasiva.
\newpage
El método predominante de procurar números
adecuados de células T para la inmunoterapia adoptiva consiste en
desarrollar células T inmunes in vitro. Las condiciones del
cultivo para expandir células T específicas para el antígeno
sencillas a un número de varios billones con retención del
reconocimiento del antígeno in vivo son bien conocidas en la
técnica. Estas condiciones del cultivo in vitro utilizan
típicamente una estimulación intermitente con antígeno, a menudo en
presencia de citocinas, tal como IL-2, y células
alimentadoras no divisoras. Tal como se señala antes, los
polipéptidos inmunorreactivos descritos en esta memoria se pueden
utilizar para expandir rápidamente cultivos de células T
específicos para el antígeno con el fin de generar un número
suficiente de células para la inmunoterapia. En particular, células
presentadoras de antígenos tales como células dendríticas,
macrófagos, monocitos, fibroblastos o células B, se pueden pulsar
con polipéptidos inmunorreactivos, o una secuencia o secuencias de
polinucleótidos se pueden introducir en células presentadoras de
antígenos utilizando una diversidad de técnicas convencionales bien
conocidas en la técnica. Por ejemplo, células presentadoras de
antígenos se pueden transfectar o transducir con una secuencia de
polipéptidos, en donde dicha secuencia contiene una región de
promotor apropiada para aumentar la expresión y se pueden expresar
como parte de un virus recombinante u otro sistema de expresión.
Varios vectores virales se pueden utilizar para transducir una
célula presentadora de antígenos que incluye virus de la varicela,
virus vacuna y adenovirus; también, células presentadoras de
antígenos se pueden transfectar con secuencias de polipéptidos
descritas en esta memoria mediante una diversidad de medios que
incluyen tecnología de la pistola de genes, suministro mediado por
lípidos, electroporación, choque osmótico y mecanismos de suministro
en partículas, dando como resultado niveles de expresión eficaces y
aceptables, según se determina por un experto ordinario en la
técnica. Para que las células T cultivadas sean eficaces en
terapia, las células T cultivadas deben ser capaces de desarrollarse
y de distribuirse ampliamente y de sobrevivir durante largo tiempo
in vivo. Estudios han demostrado que células T cultivadas
pueden ser inducidas a que se desarrollen in vivo y que
sobrevivan durante un largo plazo en números sustanciales mediante
estimulación repetida con antígeno suplementado con
IL-2 (véase, por ejemplo, Cheever, M., et
al. "Therapy With Cultured T Cells: Principles Revisited,"
Immunological Reviews, 157:177, 1997).
Los polipéptidos descritos en esta memoria
también se pueden emplear para generar y/o aislar células T
reactivas contra tumores que luego se pueden administrar al
paciente. En una técnica, líneas de células y específicas para
antígenos se pueden generar mediante inmunización in vivo con
péptidos cortos que corresponden a porciones inmunogénicas de los
polipéptidos descritos. Los clones de CD8+CTL específicos para
antigenos, resultantes se pueden aislar del paciente, se pueden
expandir utilizando técnicas de cultivo tisular convencionales y se
pueden devolver al paciente.
Alternativamente, se pueden emplear péptidos
correspondientes a porciones inmunogénicas de los polipéptidos para
generar subconjuntos de células T reactivas contra tumores mediante
estimulación selectiva in vitro y expansión de células T
autólogas para proporcionar células T específicas para antígenos que
pueden transferirse subsiguientemente al paciente según se
describe, por ejemplo, por Chang et al., (Crit. Rev.
Oncol. Hematol., 22(3), 213, 1996). Células del sistema
inmune, tales como células T, se pueden aislar de la sangre
periférica de un paciente utilizando un sistema de separación de
células comercialmente disponible tal como el sistema de CellPro
Incorporated (Bothell, WA) CEPRATE® (véase la patente de EE.UU. nº
5.240.856; patente de EE.UU. nº 5.215.926; documentos WO 89/06280;
WO 91/16116 y WO 92/07243). Las células separadas se estimulan con
uno o más de los polipéptidos inmunorreactivos contenidos dentro de
un vehículo de suministro tal como una microesfera, para
proporcionar células T específicas para antígenos. La población de
células T específicas para antígenos tumorales se expande luego
utilizando técnicas convencionales, y las células se administran de
nuevo al paciente.
En otras realizaciones, receptores de células T
y/o de anticuerpos específicos para los polipéptidos descritos en
esta memoria se pueden clonar, expandir y transferir a otros
vectores o células efectoras para uso en la inmunoterapia adoptiva.
En particular, las células T se pueden transfectar con los genes
apropiados para que expresen los dominios variables procedentes de
anticuerpos monoclonales específicos para tumores en calidad de los
elementos de reconocimiento extracelular y unir a las cadenas de
señalización del receptor de células T, dando como resultado la
activación de células T, lisis específica y liberación de citocinas.
Esto permite que la célula T redirija su especificidad de una
manera independiente de MHC. Véase, por ejemplo, Eshhar, Z.,
Cancer Immunol Immunother,
45(3-4):131-6, 1997 y Hwu,
P., et al., Cancer Res,
55(15):3369-73, 1995. Otra realización puede
incluir la transfección de cadenas del receptor de células T alfa y
beta específicas para antígenos tumorales en células T
alternativas, tal como en Cole, DJ, et al, Cancer Res,
55(4):748-52, 1995.
En una realización adicional, células
dendríticas singeneicas o autólogas se pueden pulsar con péptidos
correspondientes al menos a una porción inmunogénica de un
polipéptido descrito en esta memoria. Las células dendríticas
específicas para antígenos resultantes se pueden transferir a un
paciente o emplear para estimular células T para proporcionar
células T específicas para el antígeno que pueden, a su vez, ser
administradas a un paciente. El uso de células dendríticas pulsadas
con péptidos para generar células T específicas para antígenos y el
subsiguiente uso de células T específicas para antígenos de este
tipo para erradicar tumores en un modelo murínico ha sido
demostrado por Cheever et al., Immunological Reviews 157:177,
1997).
Además, vectores que expresan el polinucleótido
descrito se pueden introducir en células germinales tomadas del
paciente y se pueden propagar clonalmente in vitro para el
trasplante autólogo de nuevo al mismo paciente.
Adicionalmente, vectores que expresan los
polinucleótidos descritos se pueden introducir en las células
germinales tomadas del paciente y propagar clonalmente in
vitro para el trasplante autólogo de nuevo al mismo paciente.
Polipéptidos y proteínas de fusión de la presente invención también
se pueden utilizar, de manera alternativa, para generar agentes de
unión tales como anticuerpos o fragmentos de los mismos que son
capaces de detectar tumores pulmonares humanos metastáticos.
Agentes de unión de la presente invención pueden prepararse, en
general, utilizando métodos conocidos por los expertos ordinarios
en la técnica, que incluyen procesos representativos descritos en
esta memoria. Los agentes de unión son capaces de diferenciar entre
pacientes con y sin cáncer de pulmón, utilizando los análisis
representativos descritos en esta memoria. En otras palabras,
anticuerpos u otros agentes de unión desarrollados contra una
proteína de tumor pulmonar, o una porción adecuada de las mismas,
generará una señal que indica la presencia de cáncer de pulmón
primario o metastático en al menos aproximadamente el 20% de
pacientes que padecen la enfermedad, y generarán una señal negativa
indicando la ausencia de la enfermedad en al menos aproximadamente
el 90% de individuos sin cáncer de pulmón primario o metastático.
Porciones adecuadas de proteínas de tumor pulmonar de este tipo son
porciones que son capaces de generar un agente de unión que indica
la presencia de cáncer de pulmón primario o metastático
esencialmente en la totalidad (es decir al menos aproximadamente
80% y, de preferencia, al menos aproximadamente 90%) de los
pacientes para los que se indica un cáncer de pulmón utilizando la
proteína de longitud completa, y que indica la ausencia de cáncer
de pulmón esencialmente en la totalidad de todas aquellas muestras
que serían negativas cuando se someten a ensayo con la proteína de
longitud completa. Los análisis representativos descritos más
abajo, tales como el ensayo de sándwich de dos anticuerpos, pueden
emplearse generalmente para evaluar la capacidad de un agente de
unión para detectar tumores pulmonares humanos metastáticos.
La capacidad de un polipéptido preparado según
se describe en esta memoria para generar anticuerpos capaces de
detectar tumores pulmonares humanos primarios o metastáticos se
puede evaluar generalmente desarrollando uno o más anticuerpos
contra el polipéptido (utilizando, por ejemplo, un método
representativo descrito en esta memoria) y determinando la
capacidad de anticuerpos de este tipo para detectar dichos tumores
en pacientes. Esta determinación se puede realizar sometiendo a
ensayo muestras biológicas de pacientes con y sin cáncer de pulmón
primario o metastático en cuanto a la presencia de un polipéptido
que se une a los anticuerpos generados. Análisis de ensayo de este
tipo se pueden realizar, por ejemplo, utilizando un proceso
representativo descrito más abajo. Polipéptidos que generan
anticuerpos capaces de detectar al menos un 20% de tumores
pulmonares primarios o metastáticos mediante procedimientos de este
tipo se consideran útiles en análisis para detectar tumores
pulmonares humanos primarios o metastáticos. Anticuerpos específicos
para polipéptidos se pueden utilizar solos o en combinación para
mejorar la sensibilidad.
Polipéptidos capaces de detectar tumores
pulmonares humanos primarios o metastáticos se pueden utilizar como
marcadores para diagnosticar cáncer de pulmón o para vigilar el
progreso de la enfermedad en pacientes. En una realización, el
cáncer de pulmón en un paciente se puede diagnosticar evaluando una
muestra biológica obtenida del paciente en cuanto al nivel de uno o
más de los polipéptidos anteriores con relación a un valor de corte
predeterminado. Tal como se utiliza en esta memoria, "muestras
biológicas" adecuadas incluyen sangre, sueros, orina y/o
secreciones pulmonares.
El nivel de uno o más de los polipéptidos
anteriores se puede evaluar utilizando cualquier agente de unión
específico para el o los polipéptidos. Un "agente de unión", en
el contexto de esta invención, es cualquier agente (tal como un
compuesto o una célula) que se une a un polipéptido según se
describe antes. Tal como se utiliza en esta memoria, "unión"
se refiere a una asociación no covalente entre dos moléculas
separadas (cada una de las cuales puede estar libre (es decir en
solución) o presentes sobre la superficie de una célula o un
soporte sólido), de modo que se forma un "complejo". Un
complejo de este tipo puede estar libre o inmovilizado (ya sea
covalente o no covalentemente) sobre un material de soporte. La
capacidad de unión puede evaluarse generalmente determinando una
constante de unión para la formación del complejo. La constante de
unión es el valor obtenido cuando la concentración del complejo se
divide por el producto de las concentraciones del componente. En
general, se dice que dos compuestos se "unen" en el contexto de
la presente invención cuando la constante de unión para la
formación del complejo excede de aproximadamente 10^{3} L/mol. La
constante de unión se puede determinar utilizando métodos bien
conocidos por los expertos ordinarios en la técnica.
Cualquier agente que satisfaga los requisitos
anteriores puede ser un agente de unión. Por ejemplo, un agente de
unión puede ser un ribosoma con o sin un componente peptídico, una
molécula de ARN o un péptido. En una realización preferida, el
participante en la unión es un anticuerpo, o un fragmento del mismo.
Anticuerpos de este tipo pueden ser policlonales o monoclonales.
Además, los anticuerpos pueden ser de cadena sencilla, quiméricos,
injertados con CDR o humanizados. Los anticuerpos se pueden preparar
por los métodos descritos en esta memoria y por otros métodos bien
conocidos por los expertos en la técnica.
Existe una diversidad de formatos de análisis
conocidos por los expertos ordinarios en la técnica para utilizar
un participante en la unión para detectar marcadores de polipéptidos
en una muestra. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En una
realización preferida, el análisis implica el uso de participante
de unión inmovilizado sobre un soporte sólido para unirse a y
separar el polipéptido del resto de la muestra. El polipéptido
unido puede entonces detectarse utilizando un segundo participante
en la unión que contiene un grupo informador. Segundos participantes
en la unión adecuados incluyen anticuerpos que se unen al complejo
de participante en la unión/polipéptido. Alternativamente, se puede
utilizar un análisis competitivo en el que un polipéptido es
marcado con un grupo informador y se le permite unirse al
participante en la unión inmovilizado después de la incubación del
participante en la unión con la muestra. El grado al que los
componentes de la muestra inhiben la unión del polipéptido marcado
al participante en la unión es indicativo de la reactividad de la
muestra con el participante en la unión inmovilizado.
El soporte sólido puede ser cualquier material
conocido por los expertos ordinarios en la técnica al que puede
fijarse el antígeno. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser un
pocillo de ensayo en una placa de microtitulación o una membrana de
nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Alternativamente, el soporte
puede ser una perla o disco tal como vidrio, fibra de vidrio, látex
o un material plástico tal como poliestireno o poli(cloruro
de vinilo). El soporte también puede ser una partícula magnética o
un sensor de fibra óptica tales como los descritos, por ejemplo, en
la patente de EE.UU. nº 5.359.681. El agente de unión puede ser
inmovilizado sobre el soporte sólido utilizando una diversidad de
técnicas conocidas por los expertos en la técnica, que se describen
ampliamente en la bibliografía de patentes y científica. En el
contexto de la presente invención, el término "inmovilización"
se refiere tanto a una asociación covalente, tal como adsorción como
una fijación covalente (que puede ser un enlace directo entre el
antígeno y grupos funcionales sobre el soporte o puede ser un enlace
a modo de un agente reticulante). Se prefiere la inmovilización
mediante adsorción en un pocillo de una placa de microtitulación o
a una membrana. En tales casos, la adsorción se puede conseguir
poniendo en contacto el agente de unión, en un tampón adecuado con
el soporte sólido durante una cantidad de tiempo adecuada. El
tiempo de contacto varía con la temperatura, pero típicamente oscila
entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 1 día. En general,
la conexión de un pocillo de una placa de microtitulación de
plástico (tal como poliestireno o poli(cloruro de vinilo))
con una cantidad del agente de unión que oscila entre
aproximadamente 10 ng y aproximadamente 10 \mug y, de
preferencia, de aproximadamente 100 ng y aproximadamente 1 \mug.
es suficiente para inmovilizar una cantidad adecuada de agente de
unión.
La fijación covalente de un agente de unión a un
soporte sólido se puede conseguir, en general, haciendo reaccionar
primero el soporte con un reactivo bifuncional que reaccionará tanto
con el soporte como con un grupo funcional, tal como un grupo
hidroxilo o amino, sobre el agente de unión. Por ejemplo, el agente
de unión se puede fijar covalentemente a soportes que tengan un
revestimiento polímero apropiado utilizando benzoquinona o mediante
condensación de un grupo aldehído sobre el soporte con una amina y
un hidrógeno activo sobre el participante en la unión (véase, por
ejemplo Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, en
A12-A13).
En determinadas realizaciones, el análisis es un
análisis de sándwich de dos anticuerpos. Este análisis se puede
realizar poniendo en contacto primero un anticuerpo que ha sido
inmovilizado sobre un soporte sólido, habitualmente el pocillo de
una placa de microtitulación, con la muestra, de modo que se permite
que los polipéptidos dentro de la muestra se unan al anticuerpo
inmovilizado. La muestra no unida se retira entonces de los
complejos de polipéptido-anticuerpo inmovilizados y
se añade un segundo anticuerpo (que contiene un grupo informador)
capaz de unirse a un sitio diferente en el polipéptido. La cantidad
de segundo anticuerpo que queda unida al soporte sólido se
determina luego utilizando un método apropiado para el grupo
informador específico.
Más específicamente, una vez que el anticuerpo
se ha inmovilizado sobre el soporte, según se describe antes, los
sitios de unión de la proteína restantes sobre el soporte se
bloquean típicamente. Cualquier agente de bloqueo adecuado conocido
por los expertos ordinarios en la técnica, tal como albúmina de
suero bovino o Tween 20® (Sigma Checimal Co., St. Louis. MO). A
continuación, el anticuerpo inmovilizado se incuba con la muestra y
se permite que el polipéptido se una al anticuerpo. La muestra se
puede diluir con un diluyente adecuado, tal como solución salina
tamponada con fosfato (PBS- siglas en inglés) antes de la
incubación. En general, un tiempo de contacto apropiado (es decir
tiempo de incubación) es el período de tiempo que es suficiente
para detectar la presencia de polipéptido dentro de una muestra
obtenida de un individuo con cáncer de pulmón. Preferiblemente, el
tiempo de contacto es suficiente para conseguir un nivel de unión
que sea al menos aproximadamente 95% del conseguido en equilibrio
entre polipéptido unido y no unido. Los expertos ordinarios en la
técnica reconocerán que el tiempo necesario para alcanzar un
equilibrio puede determinarse fácilmente analizando el nivel de
unión que se produce a lo largo de un período de tiempo. A
temperatura ambiente, es generalmente suficiente un tiempo de
incubación de aproximadamente 30 minutos.
La muestra no unida puede ser retirada entonces
mediante lavado del soporte sólido con tampón apropiado tal como
PBS que contiene Tween 20® al 0,1%. El segundo anticuerpo, que
contiene un grupo informador, se puede añadir entonces al soporte
sólido. Grupos informadores preferidos incluyen enzimas (tal como
peroxidasa de rábano picante), sustratos, cofactores, inhibidores,
colorantes, radionucleidos, grupos luminiscentes, grupos
fluorescentes y biotina. La conjugación de anticuerpo a grupo
informador se puede conseguir utilizando métodos convencionales
conocidos por los expertos ordinarios en la técnica.
El segundo anticuerpo se incuba luego con el
complejo de anticuerpo-polipéptido inmovilizado
durante una cantidad de tiempo suficiente para detectar el
polipéptido unido. Una cantidad de tiempo apropiada puede
generalmente determinarse analizando el nivel de unión que se
produce a lo largo de un período de tiempo. A continuación, el
segundo anticuerpo no unido se separa y el segundo anticuerpo unido
se detecta utilizando el grupo informador. El método empleado para
detectar el grupo informador depende de la naturaleza del grupo
informador. Para grupos radiactivos, son generalmente apropiados
métodos de recuento por centelleo o autorradiográficos. Métodos
espectroscópicos se pueden utilizar para detectar colorantes,
grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. La biotina se puede
detectar utilizando avidina, acoplada a un grupo informador
diferente (habitualmente un grupo radiactivo o fluorescente o una
enzima). Los grupos informadores de enzima pueden generalmente
detectarse mediante la adición de sustrato (generalmente durante un
período de tiempo específico), seguido de análisis espectroscópico u
otro análisis de los productos de reacción.
Para determinar la presencia o ausencia del
cáncer de pulmón la señal detectada a partir del grupo informador
que permanece unido al soporte sólido se compara generalmente con
una señal que corresponde a un valor de corte predeterminado. En
una realización preferida, el valor de corte es la señal mediana
media obtenida cuando el anticuerpo inmovilizado se incuba con
muestras de pacientes sin cáncer de pulmón. En general, una muestra
que genera una señal que se encuentra tres desviaciones estándares
por encima del valor de corte predeterminado se considera positiva
para el cáncer de pulmón. En una realización preferida alternativa,
el valor de corte se determina utilizando una Curva de Receptor -
Operador de acuerdo con el método de Sackett et al., Clinical
Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little
Brown and Co., 1985, págs. 106-7. En síntesis, en
esta realización, el valor de corte se puede determinar a partir de
una gráfica de pares de tasas positivas reales (es decir,
sensibilidad) y tasas positivas falsas (100% de especificidad) que
corresponden a cada uno de los posibles valores de corte para el
resultado del ensayo diagnóstico. El valor de corte en la gráfica
que está más próximo a la esquina izquierda superior (es decir el
valor que encierra el mayor aérea) es el valor de corte más
preciso, y una muestra que genera una señal que es mayor que el
valor de corte determinado por este método se puede considerar
positiva. Alternativamente, el valor de corte se puede desplazar
hacia la izquierda a lo largo de la gráfica, para minimizar la tasa
positiva falsa, o hacia la derecha para minimizar la tasa negativa
falsa. En general, una muestra que genera una señal que es mayor que
el valor de corte determinado por este método se considera positiva
para el cáncer de pulmón.
En una realización relacionada, el análisis se
efectúa en un formato de ensayo de flujo continuo o por bandas, en
donde el anticuerpo se inmoviliza sobre una membrana tal como
nitrocelulosa. En el ensayo de flujo continuo, polipéptidos dentro
de la muestra se unen al anticuerpo inmovilizado a medida que la
muestra pasa a través de la membrana. Después, un segundo
anticuerpo marcado se une al complejo de
anticuerpo-polipéptido a medida que una solución
que contiene el segundo anticuerpo fluye a través de la membrana. La
detección del segundo anticuerpo unido puede efectuarse entonces
tal como se describe antes. En el formato de ensayo por bandas, un
extremo de la membrana al que está unido el anticuerpo se sumerge en
una solución que contiene la muestra. La muestra migra a lo largo
de la membrana a través de una región que contiene un segundo
anticuerpo y a la zona del anticuerpo inmovilizado. La
concentración de segundo anticuerpo en la zona del anticuerpo
inmovilizado indica la presencia de cáncer de pulmón. Típicamente,
la concentración del segundo anticuerpo en ese sitio genera un
modelo tal como una línea que puede leerse visualmente. La ausencia
de un modelo de este tipo indica un resultado negativo. En general,
la cantidad de anticuerpo inmovilizado sobre la membrana se
selecciona para generar una señal visualmente positiva en el
análisis de sándwich de dos anticuerpos, en el formato comentado
anteriormente. Preferiblemente, la cantidad de anticuerpo
inmovilizado sobre la membrana oscila entre aproximadamente 25 ng y
aproximadamente 1 \mug y, más preferiblemente, entre
aproximadamente 50 ng y aproximadamente 500 ng. Ensayos de este
tipo se pueden realizar típicamente con una cantidad muy pequeña de
muestra biológica.
Naturalmente, existen numerosos otros protocolos
de análisis que son adecuados para ser utilizados con los antígenos
o anticuerpos de la presente invención. Las descripciones anteriores
pretenden sólo ser a título de ejemplo.
En otra realización, los polipéptidos anteriores
se pueden utilizar como marcadores para el progreso del cáncer de
pulmón. En esta realización, se pueden realizar a lo largo del
tiempo análisis según se describen antes para el diagnóstico del
cáncer de pulmón, y se puede evaluar el cambio en el nivel de
polipéptido o polipéptidos reactivos. Por ejemplo, los análisis se
pueden realizar cada 24-72 horas durante un período
de 6 meses a 1 año y después se pueden realizar según se necesite.
En general, el cáncer de pulmón progresa en aquellos pacientes en
los que el nivel de polipéptido detectado por el agente de unión
aumenta a lo largo del tiempo. En contraposición, el cáncer de
pulmón no progresa cuando el nivel de polipéptido reactivo permanece
constante o disminuye con el tiempo.
Anticuerpos para ser utilizados en los métodos
anteriores se pueden preparar mediante cualquiera de una diversidad
de técnicas conocidas por los expertos ordinarios en la técnica.
Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,1988. En una técnica de
este tipo, un inmunógeno que comprende el polipéptido antigénico se
inyecta inicialmente en cualquiera de una amplia diversidad de
mamíferos (por ejemplo ratones, ratas, conejos, ovejas y cabras).
En esta etapa, los polipéptidos de esta invención pueden servir
como el inmunógeno sin modificación. Alternativamente, en particular
para polipéptidos relativamente cortos, se puede elegir una
respuesta inmune superior si el polipéptido está unido a una
proteína soporte tal como albúmina de suero bovino o hemocianina de
lapa bocallave. El inmunógeno se inyecta en el hospedante animal,
preferiblemente de acuerdo con un modelo determinado que incorpora
una o más inmunizaciones de refuerzo, y a los animales se les
sangra periódicamente. Anticuerpos policlonales específicos para el
polipéptido se pueden purificar entonces a partir de antisueros de
este tipo,
por ejemplo mediante cromatografía de afinidad utilizando el polipéptido acoplado a un soporte sólido adecuado.
por ejemplo mediante cromatografía de afinidad utilizando el polipéptido acoplado a un soporte sólido adecuado.
Anticuerpos monoclonales específicos para el
polipéptido antigénico de interés se pueden preparar, por ejemplo,
utilizando la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol.
6:511-519, 1976, y mejoras a la misma. En síntesis,
estos métodos implican la preparación de líneas de células
inmortales capaces de producir anticuerpos que tengan la
especificidad deseada (es decir, reactividad con el polipéptido de
interés). Líneas de células de este tipo se pueden producir, por
ejemplo, a partir de células de bazo obtenidas de un animal
inmunizado tal como se describe anteriormente. Después, las células
de bazo se inmortalizan, por ejemplo, mediante fusión con un
participante en la fusión de células de mieloma, preferiblemente uno
que sea sinérgico con el animal inmunizado. Se puede emplear una
diversidad de técnicas de fusión. Por ejemplo, las células de bazo y
las células de mieloma se pueden combinar con un detergente no
iónico durante unos pocos minutos y luego extender en placas a una
baja densidad en un medio selectivo que soporta el desarrollo de
células híbridas, pero no células de mieloma. Una técnica de
selección preferida utiliza la selección HAT (hipoxantina,
aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente,
habitualmente de aproximadamente 1 ó 2 semanas, se observan colonias
de híbridos. Las colonias sencillas se seleccionan y se someten a
ensayo en cuanto a la actividad de unión contra el polipéptido. Se
prefieren hibridomas que tengan una reactividad y especificidad
altas.
Anticuerpos monoclonales se pueden aislar a
partir de los sobrenadantes de colonias de hibridoma en desarrollo.
Además, se pueden emplear diversas técnicas para reforzar el
rendimiento, tal como inyección de la línea de células de hibridoma
en la cavidad peritoneal de un hospedante vertebrado adecuado, tal
como un ratón. Después, se pueden recolectar anticuerpos
monoclonales a partir del fluido ascites o la sangre. Los
contaminantes se pueden retirar de los anticuerpos mediante
técnicas convencionales tales como cromatografía, filtración en
gel, precipitación y extracción. Los polipéptidos de esta invención
se pueden utilizar en el procedimiento de purificación, por ejemplo
en una etapa de cromatografía por afinidad.
Anticuerpos monoclonales de la presente
invención se pueden también utilizar como reactivos terapéuticos,
para disminuir o eliminar tumores pulmonares. Los anticuerpos se
pueden utilizar por si mismos (por ejemplo para inhibir metástasis)
o acoplar a uno o más agentes terapéuticos. Agentes adecuados a este
respecto incluyen radionucleidos, inductores de diferenciación,
fármacos, toxinas y derivados de los mismos. Radionucleidos
preferidos incluyen ^{90}Y, ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I,
^{186}Re, ^{188}Re, ^{211}At y ^{212}Bi. Fármacos
preferidos incluyen metotrexato y análogos de pirimidina y purina.
Inductores de diferenciación preferidos incluyen ésteres de formol
y ácido butírico. Toxinas preferidas incluyen ricina, abrina, la
toxina difteria, toxina cólera, gelonina, exotoxina de Pseudomonas,
toxina Shigella y proteína antiviral de hierba carmín.
Un agente terapéutico se puede acoplar (por
ejemplo unir covalentemente) a un anticuerpo monoclonal adecuado,
ya sea directa o indirectamente (por ejemplo a través de un grupo
enlazador). Es posible una reacción directa entre un agente y un
anticuerpo, cuando cada uno posee un sustituyente capaz de
reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleófilo tal como
un grupo amino o sulfhidrílo puede ser capaz de reaccionar con un
grupo que contiene carbonilo tal como un anhídrido o un haluro de
ácido, o con un grupo alquilo que contiene un buen grupo lábil (por
ejemplo un haluro) sobre el otro.
Alternativamente, puede ser deseable acoplar un
agente terapéutico-anticuerpo a través de un grupo
enlazador. Un grupo enlazador puede funcionar como un espaciador
para distanciar un anticuerpo de un agente con el fin de evitar la
interferencia con capacidades de unión. Un grupo enlazador también
puede servir para aumentar la reactividad química de un
sustituyente en un agente o un anticuerpo y, así, aumentar la
eficacia del acoplamiento. Un aumento en la reactividad química
también puede facilitar el uso de agentes, o grupos funcionales en
agentes que, de otro modo, no sería posible.
Resultará evidente para los expertos en la
técnica que como grupo enlazador se puede emplear una diversidad de
reactivos bifuncionales o polifuncionales, tanto homo- como
hetero-funcionales (tales como los descritos en el
catálogo de Pierce Chemical Co., Rockford, IL). El acoplamiento se
puede efectuar, por ejemplo, a través de grupos amino, grupos
carboxilo, grupos sulfhidrílo o residuos carbohidrato oxidados.
Existen numerosas referencias que describen una metodología de este
tipo, por ejemplo la patente de EE.UU. nº 4.671.958 expedida a
Rodwell et al.
Los casos en los que un agente terapéutico es
más potente cuando está exento de la porción de anticuerpo de los
inmunoconjugados de la presente invención, puede ser deseable
utilizar un grupo enlazador que sea escindible durante o tras la
internalización en una célula. Se ha descrito un cierto número de
diferentes grupos enlazadores escindibles. Los mecanismos para la
liberación intracelular de un agente a partir de esos grupos
enlazadores incluyen escisión mediante reducción de un enlace
disulfuro (por ejemplo, patente de EE.UU. nº 4.489.710, expedida a
Spitler), mediante irradiación de un enlace fotolábil (por ejemplo,
patente de EE.UU. nº 4.625.014 expedida a Senter et al.),
mediante hidrólisis de cadenas laterales de aminoácidos
derivatizadas (por ejemplo, patente de EE.UU. nº 4.638.045,
expedida a Kohn et al.), mediante hidrólisis mediada por el
complemento de suero (por ejemplo, patente de EE.UU. nº 4.671.958,
expedida a Rodwell et al.) e hidrólisis catalizada por
ácidos (por ejemplo, patente de EE.UU. nº 4.569.789, expedida a
Blattler et al.).
Puede ser deseable acoplar más de un agente a un
anticuerpo. En una realización, múltiples moléculas de un agente
son acopladas a una molécula de anticuerpo. En otra realización, más
de un tipo de agente puede estar acoplado a un anticuerpo.
Independientemente de la realización particular, inmunoconjugados
con más de un agente se pueden preparar en una diversidad de
maneras. Por ejemplo, más de un agente se puede acoplar directamente
a una molécula de anticuerpo o se pueden utilizar enlazadores que
proporcionan múltiples sitios para la fijación. Alternativamente,
se puede utilizar un soporte.
Un soporte puede portar los agentes de una
diversidad de maneras, incluida la unión covalente, ya sea
directamente o a través de un grupo enlazador. Soportes adecuados
incluyen proteínas tales como albúminas (por ejemplo patente de
EE.UU. nº 4.507.234 expedida a Kato et al.), péptidos y
polisacáridos tales como aminodextrano (por ejemplo, patente de
EE.UU. nº 4.699.784, expedida a Shih et al.). Un soporte
también puede portar un agente mediante unión no covalente o
mediante encapsulación tal como dentro de una vesícula de liposoma
(por ejemplo patentes de EE.UU. nºs 4.429.008 y 4.873.088).
Soportes específicos para agentes radionucleidos incluyen pequeñas
moléculas radiohalogenadas y compuestos quelantes. Por ejemplo, la
patente de EE.UU. nº 4.735.792 describe pequeñas moléculas
radiohalogenadas representativas y sus síntesis. Un quelato
radionucleido puede formarse a partir de compuestos quelantes que
incluyen los que contienen átomos de nitrógeno y azufre en calidad
de los átomos donantes para la unión del metal, u óxido de metal,
radionucleido. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.673.562,
expedida a Davison et al., describe compuestos quelantes
representativos y sus síntesis.
\newpage
Se puede utilizar una diversidad de vías de
administración para los anticuerpos y los inmunoconjugados.
Típicamente, la administración será por vía intravenosa,
intramuscular, subcutánea o en el lecho de un tumor reseccionado.
Resultará evidente que la dosis precisa del
anticuerpo/inmunoconjugado variará en función del anticuerpo
utilizado, de la densidad de antígenos en el tumor y de la tasa de
clarificación del anticuerpo.
Reactivos diagnósticos de la presente invención
también pueden comprender secuencias de polinucleótidos que
codifican uno o más de los polipéptidos anteriores o una o más
porciones de los mismos. Por ejemplo, al menos dos cebadores de
oligonucleótidos se pueden emplear en un análisis basado en la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar ADNc
específico para tumores pulmonares derivado de una muestra
biológica, en donde al menos uno de los cebadores oligonucleótidos
es específico para una molécula de polinucleótido que codifica una
proteína de tumor pulmonar de la presente invención. A continuación,
se detecta la presencia del ADNc amplificado utilizando técnicas
bien conocidas en la técnica, tal como electroforesis en gel.
Similarmente, sondas de oligonucleótidos específicas para una
molécula de polinucleótido que codifica una proteína de tumor
pulmonar de la presente invención se pueden utilizar en un análisis
de hibridación para detectar la presencia de un polipéptido de la
invención en una muestra biológica.
Tal como se utiliza en esta memoria, la
expresión "cebador/sonda de oligonucleótido específico para una
molécula de polinucleótido" significa una secuencia de
oligonucleótidos que tiene al menos aproximadamente 60%, de
preferencia al menos aproximadamente 75% y, más preferiblemente, al
menos aproximadamente el 90% de identidad con la molécula de
polinucleótido en cuestión. Cebadores y/o sondas de oligonucleótidos
que pueden emplearse útilmente en los métodos diagnósticos de la
invención tienen preferiblemente al menos aproximadamente
10-40 nucleótidos. En una realización preferida,
los cebadores de oligonucleótidos comprenden al menos
aproximadamente 10 nucleótidos contiguos de una molécula de
polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID
NO: 1-109, 111, 113, 115-151, 153,
154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168 y 171.
Preferiblemente, sondas de oligonucleótidos para uso en los métodos
diagnósticos de la invención comprenden al menos aproximadamente 15
oligonucleótidos contiguos de una molécula de polinucleótidos que
comprende una secuencia proporcionada en SEQ ID NO:
1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154,
157, 158, 160, 162-164, 167, 168 y 171. Técnicas
tanto para análisis basados en PCR como análisis de hibridación son
bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Mullis et
al. Ibid; Ehrlich, Ibid). Así, se pueden utilizar
cebadores o sondas para detectar secuencias específicas para el
tumor pulmonar en muestras biológicas, incluida sangre, semen,
tejido pulmonar y/o tejido de tumor pulmonar.
Los siguientes Ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración y no a modo de limitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo ilustra el aislamiento de moléculas
de ADNc que codifican polipéptidos específicos para el tumor
pulmonar procedente de genotecas de ADNc de tumor pulmonar.
Una genoteca de expresión de ADNc de carcinoma
de células escamosas de pulmón humano se construyó a partir de ARN
de poli A^{+} procedente de una agrupación de dos tejidos de
pacientes utilizando un kit Superscript Plasmid System for cDNA
Synthesis and Plasmid Cloning (BRL Life Technologies, Gaithersburg,
MD) siguiendo el protocolo del fabricante. Específicamente, tejidos
de carcinoma de pulmón se homogeneizaron con politron (Kinematica,
Suiza) y el ARN total se extrajo utilizando el reactivo Trizol (BRL
Life Technologies) según las directrices del fabricante. A
continuación, el ARN de poli A^{+} se purificó utilizando una
columna de oligo dT celulosa según se describe en Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989. ADNc de primera cadena
se sintetizó utilizando el cebador NotI/Oligo-dT18.
El ADNc de doble cadena se sintetizó, se ligó con adaptadores
BstXI/EcoRI (Invitrogen, San Diego, CA) y se digerió con NotI.
Después del fraccionamiento del tamaño con columnas de
fraccionamiento del tamaño de ADNc (BRL Life Technologies), el ADNc
se ligó en el sitio de BstXI/NotI de pcDNA3.1 (Invitrogen) y se
transformó en células DH10B de E. coli ElectroMax (BRL Life
Technologies) mediante electroporación.
Utilizando el mismo proceso, se preparó una
genoteca de expresión de ADNc de pulmón humano normal a partir de
una agrupación de cuatro muestras de tejido. Las genotecas de ADNc
se caracterizaron al determinar el número de colonias
independientes, el porcentaje de clones que portaban el inserto, el
tamaño medio del inserto y mediante análisis de la secuencia. La
genoteca de carcinoma de células escamosas de pulmón contenía 2,7 x
10^{6} colonias independientes, teniendo el 100% de los clones una
inserción y siendo el tamaño medio de la inserción de 2100 pares de
bases. La genoteca de ADNc de pulmón normal contenía 1,4 x 10^{6}
colonias independientes, teniendo inserciones el 90% de los clones
y siendo el tamaño medio de la inserción de 1800 pares de bases.
Para las dos genotecas, el análisis de la secuencia demostró que la
mayoría de los clones tenían una secuencia de ADNc de longitud
completa y se sintetizaron a partir de ARNm.
La sustracción de la genoteca de ADNc se realizó
utilizando las genotecas de ADNc de carcinoma de células escamosas
pulmonares y de ADNc de pulmón normal, según se describe por Hara
et al. (Blood, 84:189-199, 1994) con
algunas modificaciones. Específicamente, una genoteca de ADNc
sustraída de células escamosas de pulmón y específica para
carcinoma se generó como sigue. La genoteca de ADNc de tejido normal
(80 \mug) se digerió con BamHI y XhoI, seguido de una reacción de
relleno con fragmento de Klenow de ADN polimerasa. Después de la
extracción con fenol-cloroformo y de la
precipitación con etanol, el ADN se disolvió en 133 \mul de
H_{2}O, se desnaturalizó por calor y se mezclaron 133 \mul (133
\mug) de biotina Photoprobe (Vector Laboratories, Burlingame,
CA). Tal como se recomienda por el fabricante, la mezcla resultante
se irradió con una lámpara solar de 270 W sobre hielo durante 20
minutos. Se añadió biotina Photoprobe adicional (67 \mul), y se
repitió la reacción de biotinilación. Después de la extracción con
butanol durante cinco veces, el ADN se precipitó con etanol y se
disolvió en 23 \mul de H_{2}O para formar el ADN impulsor
(driver).
Para formar el ADN trazador, 10 \mug de
genoteca de ADNc de carcinoma de células escamosas de pulmón se
digerieron con NotI y SpeI, se extrajo con
fenol-cloroformo y se hizo pasar a través de
columnas Chorma spin-400 (Clontech, Palo Alto, CA).
Típicamente, 5 pg de ADNc se recuperaron después de la columna de
fraccionamiento. Después de la precipitación con etanol, el ADN
trazador se disolvió en 5 \mul de H_{2}O. El ADN trazador se
mezcló con 15 \mul de ADN impulsor y 20 \mul de tampón de
hibridación 2 x (NaCl 1,5 M/EDTA 10 mM/HEPES 50 mM pH
7,5/dodecilsulfato de sodio al 0,2%), recubierto con aceite mineral
y se desnaturalizó térmicamente por completo. La muestra se
transfirió inmediatamente a un baño de agua a 68ºC y se incubó
durante 20 horas (hibridación larga [HL]). La mezcla de reacción se
sometió entonces a un tratamiento con estreptavidina, seguido de
extracción con fenol/cloroformo. Este proceso se repitió tres veces
más. El ADN sustraído se precipitó, se disolvió en 12 \mul de
H_{2}O, se mezcló con 8 \mul de ADN impulsor y 20 \mul de
tampón de hibridación 2 X y se sometió a una hibridación a 68°C
durante 2 horas (hibridación corta [HC]). Después de la separación
de ADN de doble cadena biotinilado, el ADNc sustraído se ligó en el
sitio NotI/SpeI de pBCSK^{+} resistente al cloranfenicol
(Stratagene, La Jolla, CA) y se transformó en células DH10B de E.
coli ElectroMax mediante electroporación para generar una
genoteca de ADNc sustraída específica para carcinoma de células
escamosas de pulmón (a la que se alude en lo que sigue como
"sustracción pulmonar I").
Una segunda genoteca de ADNc sustraída
específicamente de carcinoma de células escamosas de pulmón (a la
que se alude como "sustracción pulmonar II") se generó de una
manera similar a la genoteca de sustracción I de pulmón, excepto
que en el ADN impulsor se incluyeron ocho genes frecuentemente
recuperados procedentes de la sustracción pulmonar I y se
recuperaron 24.000 clones independientes.
Para analizar las genotecas de ADNc sustraídas,
el ADN del plásmido se preparó a partir de 320 clones
independientes, tomados aleatoriamente a partir de las genotecas
específicas de carcinoma de células escamosas de pulmón sustraídas.
Los clones de ADNc representativos se caracterizaron adicionalmente
mediante secuenciación del ADN con un secuenciador automatizado
modelo 373 A y/o modelo 377 de Perkin Elmer/Appliel Biosystems
Division (Foster City, CA). Las secuencias de ADNc para sesenta
clones aislados se proporcionan en SEQ ID NO: 1-60.
Estas secuencias se compararon con secuencias conocidas en el banco
de genes utilizando las bases de datos de EMBL y GenBank
(liberación 96). No se encontraron homologías significativas con las
secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 2, 3,19, 38 y 46. Se
encontró que las secuencias de SEQ ID NO: 1, 6-8,
10-13, 15, 17, 18, 20-27, 29, 30,
32, 34-37, 39-45,
47-49, 51, 52, 55 y 57-59 mostraban
una cierta homología con etiquetas de secuencia expresadas
previamente identificadas (ESTs- siglas en inglés). Se encontró que
las secuencias de SEQ ID NO. 9, 28, 31 y 33 mostraban una cierta
homología con secuencias de genes no humanos previamente
identificadas y se encontró que las secuencias de SEQ ID NO: 4, 5,
14, 50, 53, 56 y 60 mostraban una cierta homología con las
secuencias de genes previamente identificadas en seres humanos.
El proceso de sustracción descrito anteriormente
se repitió utilizando la genoteca de ADNc de carcinoma de células
escamosas de pulmón anterior como ADN trazador y la genoteca de ADNc
procedente de hígado y corazón normal (construida a partir de una
agrupación de una muestra de cada tejido según se describe antes),
más veinte otros clones de ADNc que frecuentemente eran recuperados
en las sustracciones pulmonares I y II en calidad del ADN impulsor
(sustracción pulmonar III). La genoteca de ADNc de hígado y corazón
normales contenía 1,76 x 10^{6} clones independientes, teniendo
el 100% de los clones inserciones y siendo el tamaño medio de la
inserción de 1600 pares de bases. Se aislaron diez clones
adicionales (SEQ ID NO: 61-70). La comparación de
estas secuencias de ADNc con las del banco de genes según se
describe antes no relevó ninguna homología significativa con
respecto a las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 62 y 67. Se
encontró que las secuencias de SEQ ID NO: 61,
63-66, 68 y 69 mostraban una cierta homología con
ESTs previamente aislados, y se encontró que la secuencia
proporcionada en SEQ ID NO: 70 mostraba una cierta homología con el
gen de rata previamente identificado.
Una genoteca de expresión de ADNc de
adenocarcinoma de pulmón humano se construyó como se describe antes.
La genoteca contenía 3,2 x 10^{6} colonicas independientes,
teniendo el 100% de los clones una inserción y siendo el tamaño
medio de inserción de 1500 pares de bases. La sustracción de la
genoteca se realizó como se describe antes, utilizando genotecas de
expresión de ADNc de hígado y corazón normales descritas
anteriormente como ADNc impulsor. Se recuperaron dos mil
seiscientos clones independientes.
El análisis de las secuencias de ADNc iniciales
procedentes de 100 clones independientes reveló muchos genes
proteínico ribosomales. Las secuencias de ADNc para quince clones
aislados en esta sustracción se proporcionan en SEQ ID NO:
71-86. La comparación de estas secuencias con las
del banco de genes según se describe antes no relevó ninguna
homología significativa con respecto a la secuencia proporcionada en
SEQ ID NO: 84. Se encontró que las secuencias de SEQ ID NO: 71, 73,
74, 77, 78 y 80-82 mostraban una cierta homología
con ESTs previamente aislados, y se encontró que las secuencias de
SEQ ID NO: 72, 75, 76, 79, 83 y 85 mostraban una cierta homología
con genes humanos previamente identificados.
Utilizando cebadores específicos para genes, se
examinaron niveles de expresión de ARNm para siete polipéptidos de
tumores pulmonares representativos descritos en el Ejemplo 1 en una
diversidad de tejidos normales y tumorales utilizando
RT-PCR.
En síntesis, el ARN total se extrajo de una
diversidad de tejidos normales y tumorales utilizando el reactivo
Trizol según se describe antes. La síntesis de la primera cadena se
llevó a cabo utilizando 2 \mug de ARN total con transcriptasa
inversa SuperScript II (BRL Life Technologies) a 42°C durante una
hora. Después, el ADNc se amplificó mediante PCR con cebadores
específicos de genes. Para asegurar la naturaleza semicuantitativa
de la RT-PCR, se utilizó con
\beta-actina como un control interno para cada uno
de los tejidos examinados. 1 \mul de una dilución 1:30 de ADNc se
empleó para permitir la amplificación del intervalo lineal del molde
de \beta-actina y era lo suficientemente sensible
para reflejar las diferencias en los números de copias iniciales.
Utilizando estas condiciones, se determinaron los niveles de
\beta-actina para cada reacción de transcripción
inversa procedente de cada tejido. La contaminación de ADN se
minimizó mediante el tratamiento con ADNasa y asegurando un
resultado de PCR negativo cuando se utilizaba ADNc de primera cadena
que se preparó sin añadir transcriptasa inversa.
Los niveles de expresión de ARNm se examinaron
en cinco tipos diferentes de tejido tumoral (carcinoma de células
escamosas pulmonares de 3 pacientes, adenocarcinoma pulmonar, tumor
de colon procedente de 2 pacientes, tumor de mama y tumor de
próstata) y trece tejidos normales diferentes (pulmón de 4 donantes,
próstata, cerebro, riñón, hígado, ovarios, músculo esquelético,
piel, intestino delgado, estómago, miocardio, retina y testículos).
Utilizando una cantidad décuple de ADNc se encontró que el antígeno
LST-S1-90 (SEQ ID NO:3) era
expresado a altos niveles en carcinoma de células escamosas de
pulmón y en tumor de mama, y a niveles bajo hasta indetectables en
los otros tejidos examinados.
El antígeno
LST-S2-68 (SEQ ID NO:15) parece ser
específico para el tumor pulmonar y de mama, pero la expresión
también se detectó en riñones normales. Los antígenos
LST-S1-169 (SEQ ID NO:6) y
LST-S1-133 (SEQ ID NO:5) parecen
ser muy abundantes en tejidos pulmonares (tanto normales como
tumorales), disminuyendo la expresión de estos dos genes en la
mayoría de los tejidos normales sometidos a ensayo. Tanto
LST-S1-169 como
LST-S1-133 también se expresaron en
tumores de mama y de colon. Los antígenos
LST-S1-6 (SEQ ID NO:7) y
LST-S1-12-5F (SEQ
ID NO: 47) no mostraban una expresión específica para el tumor o el
tejido, siendo la expresión de
LST-S1-28 rara y solamente
detectable en unos pocos tejidos. El antígeno
LST-S3-7 (SEQ ID NO:63) mostró una
expresión específica para tumores de pulmón y de mama, siendo
detectado su mensaje únicamente en testículos normales cuando la
PCR se realizó durante 30 ciclos. Una expresión de nivel menor se
detectó en algunos tejidos normales cuando el número de ciclos
aumentó a 35. Se encontró que el antígeno
LST-S3-13 (SEQ ID NO: 66) se
expresaba en 3 de 4 tumores pulmonares, un tumor de mama y las dos
muestras de tumor de colon. Su expresión en tejidos normales era
baja en comparación con tumores y solamente se detectaba en 1 de 4
tejidos pulmonares normales y en tejidos normales procedentes de
riñones, ovarios y retina. La expresión de los antígenos
LST-S3-4 (SEQ ID NO:63) y
LST-S3-14 (SEQ ID NO:67) era rara y
no mostraba ninguna especificidad para el tejido o tumor.
Consistente con análisis de la transferencia Northern, los
resultados de RT-PCT en el antígeno
LAT-S1-A-10A (SEQ
ID NO: 78) sugirieron que su expresión es elevada en tejidos de
pulmón, colon, estómago e intestino delgado, incluidos tumores de
pulmón y colon, mientras que su expresión era baja o indetectable en
los otros tejidos.
Un total de 2002 fragmentos de ADNc aislados en
las sustracciones pulmonares I, II y III antes descritas se
amplificaron mediante PCR de la colonia y se determinaron sus
niveles de expresión de ARNm en tumor pulmonar, pulmones normales y
diversos otros tejidos normales y tumorales utilizando una
tecnología de microdisposición (Synteni, Palo Alto, CA). En
síntesis, los productos de amplificación por PCR se puntearon sobre
portaobjetos en un formato de disposición, ocupando cada producto
una única localización en la disposición. El ARNm se extrajo de la
muestra de tejido a ensayar, se transcribió inversamente y se
generaron sondas de ADNc marcadas por fluorescencia. Las
microdisposiciones se sondearon con las sondas de ADNc marcadas, se
escanearon los portaobjetos y se midió la intensidad de
fluorescencia. Esta intensidad se correlaciona con la intensidad de
hibridación. Diecisiete clones de ADNc no redundantes mostraron una
sobre-expresión en tumores escamosos pulmonares,
siendo la expresión en tejidos normales ensayados (pulmones, piel,
nódulo linfático, colon, hígado, páncreas, mama, corazón, médula
ósea, intestino grueso, riñones, estómago, cerebro, intestino
delgado, vejiga y glándula salivar), siendo indetectables o 10
veces menores en comparación con tumores escamosos pulmonares. Las
secuencias de ADNc parciales determinadas para el clon L513S se
proporcionan en SEQ ID NO: 87 y 88, para el de L514S se
proporcionan en SEQ ID NO: 89 y 90; para el de L516S en SEQ ID NO:
91 y 92; para el de L517S en SEQ ID NO: 93; para el de L519S en SEQ
ID NO: 94; para el de L520S en SEQ ID NO: 95 y 96; para el de L521S
en SEQ ID NO: 97 y 98; para el de L522S en SEQ ID NO: 99; para el de
L523S en SEQ ID NO: 100; para el de L524S en SEQ ID NO: 101; para
el de L52SS en SEQ ID NO: 102; para el de L526S en SEQ ID NO: 103;
para el de L527S en SEQ ID NO: 104; para el de L528S en SEQ ID NO:
105; para el de L529S en SEQ ID NO: 106; y para el de L530S en SEQ
ID NO: 107 y 108. Adicionalmente, las secuencias de ADNc de longitud
completa para L503S y L514S (variantes 1 y 2) se proporcionan en
SEQ ID NO: 151, 153 y 154, respectivamente, proporcionándose la
correspondiente secuencia de aminoácidos predicha en SEQ ID NO:
152, 155 y 156. Debido a polimorfismos, parece ser que el clon
L531S tiene dos formas. Una primera secuencia de ADNc de longitud
completa determinada para L531S se proporciona en SEQ ID NO: 109,
proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos
predicha en SEQ ID NO: 110. Una segunda secuencia de ADNc de
longitud completa determinada para L531S se proporciona en SEQ ID
NO: 111, proporcionándose la correspondiente secuencia de
aminoácidos predicha en SEQ ID NO: 112. La secuencia de SEQ ID NO:
111 es idéntica a la de SEQ ID NO: 109, excepto que contiene una
inserción de 27 pb. De manera similar L514S también tiene dos
formas alternativamente cortadas y empalmadas; el primer ADNc
variante se lista como SEQ ID NO: 153, con la secuencia de
aminoácidos correspondiente como SEQ ID NO: 155. La segunda forma
variante del ADNc de longitud completa L514S se alude como SEQ ID
NO: 154, con su secuencia de aminoácidos correspondiente como SEQ
ID NO: 156.
La clonación de longitud completa de L524S (SEQ
ID NO: 101) proporcionó dos variantes (SEQ ID NO: 163 y 164), con
las correspondientes secuencias de aminoácidos predichas (SEQ ID NO:
165 y 166) respectivamente. Ambas variantes han demostrado
codificar péptidos relacionados con la hormona paratiroide.
La comparación de las secuencias de L514S y
L531S (SEQ ID NO:87 y 88, 89 y 90 y 109, respectivamente) con las
del banco de genes, según se describe antes, no relevó ninguna
homología significativa con las secuencias conocidas. Se encontró
que las secuencias de L513S, L516S, L517S, L519S, L520S y L530S (SEQ
ID NO:87 y 88, 91 y 92, 93, 94, 95 y 96, 107 y 108,
respectivamente) mostraban una cierta homología con las ESTs
previamente identificadas. Las secuencias de L521S, L522S, L523S,
L524S, L525S, L526S, L527S, L528S y L529S (SEQ ID NO:97 y 98, 99,
100, 101, 102, 103, 104, 105 y 106, respectivamente) se encontró que
representaban genes conocidos. En SEQ ID NO:113 se proporcionan las
secuencias de ADNc de longitud completa determinadas para L520S,
proporcionándose en SEQ ID NO:114 la correspondiente secuencia de
aminoácidos predicha. El subsiguiente análisis de la
microdisposición ha demostrado que L520S es
sobre-expresado en tumores de mama además de tumores
escamosos de pulmón.
El análisis adicional ha demostrado que L529S
(SEQ ID NO:106 y 115), L525S (SEQ ID NO:102 y 120) y L527S (SEQ ID
NO:104) son componentes citosoletales y proteínas específicas para
células potencialmente escamosas. L529S es conexina 26, una
proteína de unión del hueco. Ésta se expresa altamente en el tumor
escamoso pulmonar 9688T y se sobre-expresa
moderadamente en otros dos. Sin embargo, el nivel de expresión menor
de conexina 26 también es detectable en piel normal, colon, hígado
y estómago. Se ha reseñado la sobre-expresión de
conexina 26 en algunos tumores de mama, y una forma mutada de L529S
puede dar como resultado la sobre-expresión en
tumores pulmonares. L525S es placofilina 1, una proteína desmosomal
que se encuentra en las uniones adherentes portadoras de halos de
la piel. Los niveles de expresión de ARNm de L525S son muy elevados
en tres de cuatro tumores escamosos pulmonares sometidos a ensayo y
en la piel normal. L527S ha sido identificado como la isoforma de
queratina 6, queratina tipo II de 58 kd y citoqueratina 13 y muestra
una sobreexpresión en tumores escamosos y una baja expresión en la
piel normal, tejidos de mama y de colon. De manera notable,
queratina y genes relacionados con la queratina se han documentado
ampliamente como potenciales marcadores para el cáncer de pulmón,
incluido CYFRA2.1 (Pastor, A., et al., Eur. Respir. J.,
10:603-609, 1997). L513S (SEQ ID NO:87 y 88) muestra
una sobre-expresión moderada en varios tejidos
tumorales sometidos a ensayo y codifica una proteína que se aisló
primero como un antígeno de pemfigo vulgar.
L520S (SEQ ID NO:95 y 96) y L521S (SEQ ID NO:97
y 98) se expresan altamente en tumores escamosos pulmonares y L520S
se suprarregula en la glándula salivar normal y L521S se
sobreexpresa en la piel normal. Ambos pertenecen a una familia de
pequeñas proteínas ricas en prolina y representan marcadores para
células escamosas totalmente diferenciadas. L521S ha sido descrito
como un marcador específico para el tumor escamoso pulmonar (Hu, R,
et al., Lung Cancer, 20:25-30, 1998). L515S
(SEQ ID NO:162) codifica IGF-\beta2, y L516S es un
homólogo de aldosa-reductasa y ambos se expresan
moderadamente en tumores escamosos pulmonares y en el colon normal.
De manera notable, L516S (SEQ ID NO:91 y 92) se suprarregula en
tumores metastáticos pero no en adenocarcinoma pulmonar primario,
un indicio de su papel potencial en metástasis y un potencial
marcador de diagnóstico. L522S (SEQ ID NO:99) se
sobre-expresa moderadamente en tumores escamosos
pulmonares con una expresión mínima en tejidos normales. L522S ha
demostrado pertenecer a una alcohol deshidrogenasa de clase IV,
ADH7, y su perfil de expresión sugiere que es un antígeno
específico de células escamosas. L523S (SEQ ID NO:100) se
sobre-expresa moderadamente en tumor escamoso
pulmonar, líneas de células de cáncer de páncreas humano y tejidos
cancerígenos pancreáticos, sugiriendo que este gen puede ser un
antígeno compartido entre cáncer de células escamosas pancreáticas y
pulmonares.
L524S (SEQ ID NO: 101) se
sobre-expresa en la mayoría de los tumores escamosos
sometidos a ensayo y es homóloga con el péptido relacionado con la
hormona paratiroides (PTHrP) que es conocido que provoca una
hipercalcemia humoral asociada con tumores malignos tales como
leucemia, cáncer de próstata y de mama. Se piensa también que PTHrP
está muy comúnmente asociado con carcinoma escamoso de pulmón y
raramente con adenocarcinoma de pulmón (Davidson, L.A., et al,
J. Pathol., 178:398-401, 1996). L528S (SEQ ID
NO: 105) está muy sobre-expresado en dos tumores
escamosos pulmonares con una expresión moderada en otros dos tumores
escamosos, un adenocarcinoma de pulmón y algunos tejidos normales,
incluida la piel, nódulos linfáticos, corazón, estómago y pulmón.
Codifica el gen NMB que es similar al precursor del gen específico
para melanocitos Pmel17 que se reseña se expresa preferentemente en
líneas de células de melanoma potenciales bajas metastásicas. Esto
sugiere que L528S pueda ser un antígeno compartido tanto en
carcinoma de células de melanoma como escamosas pulmonares. L526S
(SEQ ID NO: 103) se sobre-expresa en todos los
tejidos tumorales de células escamosas pulmonares y ha demostrado
compartir una homología con un gen (ATM) en el que una mutación
provoca una ataxia telangiectasia, un trastorno genético en seres
humanos que provoca una predisposición al cáncer, entre otros
síntomas. ATM codifica una proteína que activa el punto de
verificación del ciclo de células mediada por p53 a través de la
unión directa y la fosforilación de la molécula p53.
Aproximadamente el 40% del cáncer de pulmón está asociado con
mutaciones en p53 y se especula que la
sobre-expresión de ATM es el resultado de una
compensación por la pérdida de la función de p53, pero se desconoce
si la sobre-expresión es la causa del resultado del
carcinoma de células escamosas pulmonares. Adicionalmente, la
expresión de L526S (ATM) también se detecta en adenocarcinoma
metastático, pero no de pulmón, sugiriendo un papel en la
metástasis
Ochocientos cincuenta y siete clones procedentes
de una genoteca de sustracción de ADNc, que contenían ADNc
procedente de una agrupación de dos tumores escamosos de pulmón
humano sustraídos frente a ocho ADNcs de tejido humano normal que
incluían pulmón, PBMC, cerebro, corazón, riñón, hígado, páncreas y
piel (Clontech, Palo Alto, CA) se derivaron y sometieron a una
primera ronda de amplificación por PCR. Esta genoteca se sometió a
una segunda ronda de amplificación por PCR siguiendo el protocolo
del fabricante. Los fragmentos de ADNc resultantes se subclonaron
en el vector P7-Adv vector (Clontech, Palo Alto, CA)
y se transformaron en E. coli DH5\alpha (Gibco, BRL). El
ADN se aisló de clones independientes y se secuenció utilizando un
secuenciador automatizado modelo 373A de Perkin Elmer/Applied
Biosystems Division.
Se secuenciaron ciento sesenta y dos clones
positivos. La comparación de las secuencias de ADN de estos clones
con las del banco de genes utilizando las bases de datos EMBL y
GenBank, según se describe antes, no reveló ninguna homología
significativa en 13 de estos clones, a los que se alude en lo que
sigue como Contig 13, 16, 17, 19, 22, 24, 29, 47, 49,
56-59. Las secuencias de ADNc determinadas para
estos clones se proporcionan en SEQ ID NO: 125,
127-129, 131-133, 142, 144,
148-150 y 157, respectivamente. Se encontró que los
Contigs 1, 3-5, 7-10, 12, 11, 15,
20, 31, 33, 38, 39, 41, 43, 44, 45, 48, 50, 53, 54 (SEQ ID NO:
115-124, 126, 130, 134-141, 143,
145-147, respectivamente) mostraban un cierto grado
de homología con secuencias de ADN previamente identificadas. Se
encontró que Contig 57 (SEQ ID NO: 149) representa el clon L519S
(SEQ ID NO: 94) descrito en la solicitud de patente de EE.UU. nº
09/123.912, presentada el 27 de julio de 1998. Al mejor entender del
inventor, ninguna de estas secuencias ha demostrado ser previamente
diferencialmente sobre-expresada en tumores
pulmonares.
Los niveles de expresión de ARNm para los clones
representativos en tejidos de tumor pulmonar, tejidos de pulmón
normal (n=4), PBMC en reposo, glándula salivar, corazón, estómago,
nódulos linfáticos, músculo esquelético, paladar blando, intestino
delgado, intestino grueso, bronquios, vejiga, tonsila, riñón,
esófago, médula ósea, colon, glándula adrenal, páncreas y piel
(todos ellos derivados de seres humanos) se determinaron mediante
RT-PCR según se describe antes. Los niveles de
expresión utilizando la tecnología de microdisposición, según se
describe antes, se examinaron en una muestra de cada tipo de tejido,
a menos que se indique de otro modo.
Se encontró que Contig 3 (SEQ ID NO: 116) se
expresaba mucho en todos los tumores de células escamosas de cabeza
y cuello sometidos a ensayo (17/17) y se expresaba en la mayoría
(8/12) de los tumores escamosos pulmonares (alta expresión en 7/12,
moderada en 2/12 y baja en 2/12), al tiempo que expresaba una
expresión negativa para 2/4 tejidos pulmonares normales y una baja
expresión en las restantes dos muestras. Contig 3 mostró una
expresión moderada en la piel y en el paladar blando, niveles de
expresión reducidos en PBMC en reposo, intestino grueso, glándula
salivar, tonsila, páncreas, esófago y colon. Se encontró que Contig
11 (SEQ ID NO: 124) era expresado en todos los tumores de células
escamosas de cabeza y cuello sometidos a ensayo (17/17): altamente
expresado en 14/17 y moderadamente expresado en 3/17.
Adicionalmente, la expresión en tumores escamosos pulmonares mostró
una elevada expresión en 3/12 y moderada en 4/12. Contig 11 era
negativo para 3/4 muestras de pulmón normal, teniendo las muestras
restantes sólo una baja expresión. Contig 11 mostró una reactividad
de baja a moderada con la glándula salivar, del paladar blando,
vejiga, tonsila, piel, esófago e intestino grueso. Se encontró que
Contig 13 (SEQ ID NO: 125) se expresaba en todos los tumores de
células escamosas de cabeza y cuello sometidos a ensayo (17/17): se
expresa altamente en 12/17 y se expresa moderadamente en 5/17.
Contig 13 se expresó en 7/12 tumores escamosos pulmonares, con una
elevada expresión en 4/12 y una expresión moderada en tres
muestras. El análisis de las muestras pulmonares normales mostró una
expresión negativa para 2/4 y una expresión de baja a moderada en
las restantes dos muestras. Contig 13 mostró una reactividad de baja
a moderada con PBMC en reposo, glándula salivar, vejiga, páncreas,
tonsila, piel, esófago e intestino grueso, así como una elevada
expresión en el paladar blando. Se encontró que Contig 16 (SEQ ID
NO: 127) se expresaba moderadamente en algunos tumores celulares
escamosos de cabeza y cuello (6/17) y en un tumor escamoso pulmonar;
al tiempo que no mostraba ninguna expresión en ninguna de las
muestras de pulmón normal sometidas a ensayo. Contig 16 mostraba
una baja reactividad con PBMC en reposo, intestino grueso, piel,
glándula salivar y paladar blando. Contig 17 (SEQ ID NO: 128)
mostró que se expresaba en todos los tumores de células escamosas de
cabeza y cuello sometidos a ensayo (17/17): se expresaba altamente
en 5/17 y se expresaba moderadamente en 12/17. Los niveles de
expresión en tumores escamosos pulmonares mostraron una muestra de
tumor con una alta expresión y 3/12 con niveles moderados. Contig
17 era negativa para 2/4 muestras pulmonares normales, teniendo las
muestras restantes sólo una baja expresión. Adicionalmente, se
encontró un bajo nivel de expresión en esófago y en el paladar
blando. Se encontró que Contig 19 (SEQ ID NO:129) se expresaba en la
mayoría de los tumores escamosos de cabeza y cuello sometidos a
ensayo (11/17): teniendo dos muestras altos niveles, mostrando 6/17
una expresión moderada y encontrándose una baja expresión en 3/17.
El ensayo en tumores escamosos pulmonares reveló una expresión
solamente moderada en 3/12 muestras. Los niveles de expresión en 2/4
de las muestras pulmonares normales eran negativas, teniendo las
otras dos muestras solamente una baja expresión. Contig 19 mostró
bajos niveles de expresión en esófago, PBMC en reposo, glándula
salivar, vejiga, paladar blando y páncreas.
Contig 22 (SEQ ID NO:113) demostró expresarse en
la mayoría de los tumores de células escamosas de cabeza y cuello
sometidas a ensayo (13/17) con una elevada expresión en cuatro de
estas muestras, una expresión moderada en 6/17 y una expresión baja
en 3/17. Se encontró que los niveles de expresión en tumores
escamosos pulmonares eran de moderados a altos para 3/12 tejidos
sometidos a ensayo, con una expresión negativa en dos muestras de
pulmón normal y una baja expresión en otras dos muestras (n=4).
Contig 22 mostró una baja expresión en la piel, la glándula salivar
y el paladar blando. De manera similar, se encontró que Contig 24
(SEQ ID NO:132) se expresaba en la mayoría de los tumores de
células escamosas de cabeza y cuello sometidos a ensayo (13/17) con
una elevada expresión en tres de estas muestras, una expresión
moderada en 6/17 y una baja expresión en 4/17. Se encontró que los
niveles de expresión en tumores escamosos pulmonares eran de
moderados a altos para 3/12 tejidos sometidos a ensayo con una
expresión negativa para tres muestras de pulmón normal y una baja
expresión en una muestra (n=4). Contig 24 mostró una baja expresión
en la piel, glándula salivar y paladar blando. Contig 29 (SEQ ID
NO:133) se expresó en casi todos los tumores de células escamosas de
cabeza y cuello sometidos a ensayo (16/17): se expresaba altamente
en 4/17, se expresaba moderadamente 11/17, con una baja expresión
en una muestra. También, se expresaba moderadamente en 3/12 tumores
escamosos pulmonares, siendo negativo para 2/4 muestras de tumores
normales. Contig 29 mostró una expresión de baja a moderada en el
intestino grueso, la piel, glándula salivar, páncreas, tonsila,
corazón y paladar blando. Contig 47 (SEQ ID NO:142) se expresaba en
la mayoría de los tumores de células escamosas de cabeza y cuello
sometidos a ensayo (12/17): expresión moderada en 10/17 y expresión
baja en dos muestras. En tumores escamosos pulmonares, se expresaba
altamente una muestra y se expresaba moderadamente en otras dos
(n=13). Contig 47 era negativo para 2/4 muestras de pulmón normal,
teniendo las restantes dos muestras una expresión moderada. También
Contig 47 mostró una expresión moderada en el intestino grueso y en
el páncreas y una expresión baja en la piel, glándula salivar,
paladar blando, estómago, vejiga, PBMC en reposo y tonsila.
Contig 48 (SEQ ID NO:143) se expresaba en todos
los tumores de células escamosas de cabeza y cuello sometidos a
ensayo (17/17): se expresaba altamente en 8/17 y se expresaba
moderadamente en 7/17, con una baja expresión en dos muestras. Los
niveles de expresión en tumores escamosos pulmonares eran de
elevados a moderados en tres muestras (n=13). Contig 48 era
negativo para una de cuatro muestras pulmonares normales, mostrando
el resto una expresión baja o moderada. Contig 48 mostró una
expresión moderada en el paladar blando, el intestino grueso, el
páncreas y la vejiga y mostró una baja expresión en el esófago,
glándula salivar, PBMC en reposo y corazón. Contig 49 (SEQ ID
NO:144) se expresaba a niveles de bajos a moderados en 6/17 tumores
de células escamosas de cabeza y cuello sometidos a ensayo. Los
niveles de expresión en tumores escamosos pulmonares eran moderados
en tres muestras (n= 13). Contig 49 era negativo para 2/4 muestras
de pulmón normal, mostrando las restantes muestras una baja
expresión. Se mostraron niveles de expresión moderados en la piel,
glándula salivar, intestino grueso, páncreas, vejiga y PBMC en
reposo, así como una baja expresión en el paladar blando, nódulos
linfáticos y tonsila. Contig 56 (SEQ ID NO:148) se expresaba en
niveles de bajos a moderados en 3/17 tumores de células escamosas
de cabeza y cuello sometidos a ensayo y en tumores escamosos
pulmonares, mostrando niveles de bajos a moderados en tres de las
trece muestras. De manera notable, se detectaron bajos niveles de
expresión en una muestra de tumor pulmonar de adenocarcinoma (n=2).
Contig 56 era negativo para 3/4 muestras de pulmón normal y mostró
niveles de expresión moderados en solamente el intestino grueso y
una baja expresión en la glándula salivar, paladar blando,
páncreas, vejiga y PBMC en reposo. Contig 58, también conocido como
L769P, (SEQ ID NO:150) se expresaba a niveles moderados en 11/17
tumores de células escamosas de cabeza y cuello sometidos a ensayo
y una baja expresión en una muestra adicional. La expresión en
tumores escamosos pulmonares mostró niveles de bajos a moderados en
tres de trece muestras. Contig 58 era negativo para 3/4 muestras de
pulmón normal, teniendo una muestra una baja expresión. Se
demostraron niveles de expresión moderada en la piel, el intestino
grueso y en PBMC en reposo, así como una baja expresión en la
glándula salivar, paladar blando, páncreas y vejiga. Contig 59 (SEQ
ID NO: 157) se expresaba en algunos tumores escamosos de cabeza y
cuello y pulmonares. También se detectó un bajo nivel de expresión
de Contig 59 en la glándula salivar y el intestino grueso.
Adicionalmente, la secuencia de ADNc de longitud
completa para Contig 22, al que se alude como L763P, se proporciona
en SEQ ID NO:158, proporcionándose la correspondiente secuencia
predicha de aminoácidos en SEQ ID NO:159. También, la secuencia de
ADNc de longitud completa que incorpora Contig 17, 19 y 24, a la que
se alude como L762P, se proporciona en SEQ ID NO:160,
proporcionándose en SEQ ID NO:161 la correspondiente secuencia de
aminoácidos predicha. El análisis adicional de L762P ha determinado
que es una proteína de la membrana de tipo 1 y se han secuenciado
dos variantes adicionales. La variante 1 (SEQ ID NO:167 y la
correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:169) es una
forma alternativamente cortada y empalmada de SEQ ID NO:160, dando
como resultado la deleción de 503 nucleótidos, así como la deleción
de un segmento corto de la proteína expresada. La variante 2 (SEQ
ID NO:168 y la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID
NO:170) tiene una deleción de dos nucleótidos en la región
codificante 3' en comparación con la SEQ ID NO:160, dando como
resultado una forma segregada de la proteína expresada.
La secuencia de ADNc de longitud completa para
Contig 56 (SEQ ID NO:148), a la que se alude como L773P, se
proporciona en SEQ ID NO:171, con la secuencia de aminoácidos
predicha en SEQ ID NO:172. El susbsiguiente análisis de
transferencia Northern de L773P demuestra que este transcrito está
diferencialmente sobre-expresado en tumores
escamosos y se detecta a aproximadamente 1,6 Kb en tejido de tumor
pulmonar primario y a aproximadamente 1,3 Kb en tejido tumoral de
cabeza y cuello primario.
El subsiguiente análisis de microdisposición ha
demostrado que Contig 58, a la que también se alude como L769S (SEQ
ID NO:150), se sobre-expresa en tumores de mama
además de tumores escamosos pulmonares.
Los polipéptidos se pueden sintetizar en un
sintetizador de péptidos 430A de Perkin Elmer/Applied Biosystems
División, utilizando la química FMOC con activación con HPTU
(hexafluorofosfato de
O-benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametiluronio).
Una secuencia Gly-Cys-Gly se puede
fijar al extremo amino del péptido para proporcionar un método de
conjugación, unión a una superficie inmovilizada o marcaje del
péptido. La escisión de los péptidos procedentes del soporte sólido
se puede llevar a cabo utilizando la siguiente muestra de mezcla de
escisión: ácido trifluoroacético: etanoditiol: tioanisol: agua:
fenol (40:1:2:2:3). Después de la escisión durante 2 horas, los
péptidos se pueden precipitar en
metil-t-butil-éter frío. Los nódulos
de péptidos pueden entonces disolverse en agua que contiene ácido
trifluoroacético (TFA) al 0,1% y liofilizarse antes de la
purificación por HPLC de fase inversa C18. Se puede utilizar un
gradiente de 0%-60% de acetonitrilo (que contiene TFA al 0,1%) en
agua (que contiene TFA al 0,1%) para eluir los péptidos. Después de
la liofilización de las fracciones puras, los péptidos se pueden
caracterizar utilizando electroproyección u otros tipos de
espectrometría de masas y mediante el análisis de aminoácidos.
<110> Wang, Tongtong
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> COMPUESTOS Y MÉTODOS PARA LA TERAPIA
DE CÁNCER DE PULMÓN
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> 210121.455PC
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT
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<141>
1999-03-16
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 172
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows versión 3.0
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 315
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
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<222> (1)...(315)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 380
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 346
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(346)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 372
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<220>
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<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(372)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 698
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(698)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 740
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
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<222> (1)...(740)
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<223> n = A,T,C o G
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 670
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapien
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(670)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 689
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
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<222> (1)...(689)
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<223> n = A,T,C o G
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 674
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> características misceláneas
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<222> (1)...(674)
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<223> n = A,T,C o G
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 346
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<220>
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<221> características misceláneas
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<222> (1)...(346)
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<223> n = A,T,C o G
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<210> 11
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<211> 602
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 685
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<220>
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<221> características misceláneas
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<222> (1)...(685)
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<223> n = A,T,C o G
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<210> 13
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<211> 694
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<220>
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<221> características misceláneas
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<222> (1)...(694)
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<223> n = A,T,C o G
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 679
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<220>
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<221> características misceláneas
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<222> (1)...(679)
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<223> n = A,T,C o G
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 695
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<220>
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<221> características misceláneas
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<222> (1)...(695)
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<223> n = A,T,C o G
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<400> 15
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<210> 16
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<211> 669
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<220>
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<221> características misceláneas
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<222> (1)...(669)
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<223> n = A,T,C o G
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<400> 16
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<210> 17
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<211> 697
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<221> características misceláneas
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<223> n = A,T,C o G
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<400> 17
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<221> características misceláneas
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<221> características misceláneas
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<213> Homo sapien
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<220>
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<222> (1)...(673)
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<223> n = A,T,C o G
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<211> 673
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<213> Homo sapien
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<220>
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<221> características misceláneas
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<222> (1)...(673)
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<220>
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<221> características misceláneas
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<222> (1)...(684)
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<223> n = A,T,C o G
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<213> Homo sapien
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<221> características misceláneas
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<222> (1)...(614)
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<223> n = A,T,C o G
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<213> Homo sapien
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<223> n = A,T,C o G
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 43
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<210> 44
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<211> 449
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
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<221> características misceláneas
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<211> 652
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<213> Homo sapien
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<221> características misceláneas
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<221> características misceláneas
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<221> características misceláneas
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<221> características misceláneas
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<223> n = A,T,C o G
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<213> Homo sapien
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<213> Homo sapien
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<221> características misceláneas
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<222> (1)...(423)
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<211> 423
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
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<222> (1)...(423)
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
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<223> n = A,T,C o G
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
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<213> Homo sapien
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Homo sapien
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<221> características misceláneas
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<212> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
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<222> (1)...(396)
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<223> n = A,T,C o G
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<213> Homo sapien
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<221> características misceláneas
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<223> n = A,T,C o G
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
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<222> (1)...(865)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
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<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 379
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(379)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(437)
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<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
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<211> 579
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(579)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 666
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<400> 76
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
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<222> (1)...(396)
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<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 793
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
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<222> (1)...(793)
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<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
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<210> 79
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<211> 456
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(456)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 284
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(284)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<400> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
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<211> 671
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(671)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(217)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
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<210> 83
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<211> 460
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<212> ADN
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<213> Homo sapien
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(460)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 323
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(323)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 771
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(771)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
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<210> 86
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<211> 628
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(628)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 518
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(518)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1844
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 523
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(523)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
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<210> 90
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<211> 604
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(604)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 858
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(858)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 585
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(585)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 567
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(567)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 620
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(620)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 470
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(470)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 660
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(660)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 441
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(441)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 600
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(600)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 667
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(667)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 583
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(583)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 592
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(592)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 587
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(587)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 496
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(496)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 575
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(575)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 619
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(619)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 506
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(506)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 452
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(452)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 502
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(502)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1308
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 391
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1419
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 400
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 957
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 161
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
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<213> Homo sapien
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<400> 172
Claims (44)
1. Una molécula de polinucleótido aislada, que
comprende la secuencia de nucleótidos proporcionada en SEQ ID NO:
160 o el complemento de la misma.
2. Un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos codificada por la molécula de
polinucleótido de la reivindicación 1.
3. Un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO: 161.
4. Un vector de expresión que comprende la
molécula de polinucleótido de la reivindicación 1.
5. Una célula hospedante transformada con el
vector de expresión de la reivindicación 4.
6. La célula hospedante de la reivindicación 5,
en donde la célula hospedante se selecciona del grupo consistente en
líneas de células de E. coli, levaduras y mamíferos.
7. Una composición farmacéutica, que comprende
el polipéptido de la reivindicación 2 o la reivindicación 3 y un
soporte fisiológicamente aceptable.
8. Una vacuna, que comprende una molécula de
polinucleótido aislada de la reivindicación 1 o el polipéptido de
las reivindicaciones 2 ó 3 y un reforzador de la respuesta inmune no
específico.
9. Una composición farmacéutica para el
tratamiento del cáncer de pulmón, que comprende un polipéptido de
acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 3 y un soporte
fisiológicamente aceptable.
10. Una vacuna para el tratamiento del cáncer de
pulmón, que comprende un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 2 o la reivindicación 3 y un reforzador de la
respuesta inmune no específico.
11. Una vacuna para el tratamiento del cáncer de
pulmón, que comprende una molécula de polinucleótido aislada de
acuerdo con la reivindicación 1 y un reforzador de la respuesta
inmune no específico.
12. Una proteína de fusión, que comprende al
menos un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2, que
preferiblemente comprende, además, un antígeno de tumor pulmonar
conocido.
13. Una composición farmacéutica, que comprende
una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 12, y un
soporte fisiológicamente aceptable.
14. Una vacuna, que comprende una proteína de
fusión de acuerdo con la reivindicación 12 y un reforzador de la
respuesta inmune no específico.
15. La vacuna de la reivindicación 8 ó 14, en
donde el reforzador de la respuesta inmune no específico es un
adyuvante.
16. La composición farmacéutica de una
cualquiera de las reivindicaciones 7, 9 ó 13, para uso en un método
para inhibir el desarrollo de cáncer de pulmón en un paciente.
17. La vacuna de una cualquiera de las
reivindicaciones 8, 10, 11, 14 ó 15, para uso en un método para
inhibir el desarrollo de cáncer de pulmón en un paciente.
18. Un método para detectar cáncer de pulmón en
un paciente, que comprende:
- (a)
- poner en contacto una muestra biológica obtenida del paciente con un agente de unión que es capaz de unirse a un polipéptido, comprendiendo el polipéptido al menos una porción inmunogénica de una proteína pulmonar o una variante de la misma, en donde dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de polinucleótido que comprende el polinucleótido proporcionado en SEQ ID NO: 160; y
- (b)
- detectar en la muestra una proteína o polipéptido que se una al agente de unión, detectando con ello el cáncer de pulmón en el paciente.
19. El método de la reivindicación 18, en el que
el agente de unión es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo
policlonal.
20. Un método para vigilar el progreso de cáncer
de pulmón en un paciente, que comprende:
\newpage
- (a)
- poner en contacto una muestra biológica obtenida del paciente con un agente de unión que es capaz de unirse a un polipéptido, comprendiendo dicho polipéptido al menos una porción inmunogénica de una proteína pulmonar o una variante de la misma, en donde dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos codificada por el polinucleótido que proporcionado en SEQ ID NO: 160; y
- (b)
- determinar en la muestra una cantidad de una proteína o polipéptido que se una al agente de unión;
- (c)
- repetir las etapas (a) y (b); y
- (d)
- comparar la cantidad de polipéptido detectado en las etapas (b) y (c) para vigilar el progreso del cáncer de pulmón en el paciente.
21. Un anticuerpo monoclonal, que es específico
para el polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos
codificada por el polinucleótido proporcionado en SEQ ID NO:
160.
22. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 21, para uso en un método para inhibir el desarrollo
de cáncer de pulmón en un paciente.
23. El anticuerpo de la reivindicación 22, en
donde el anticuerpo monoclonal está conjugado a un agente
terapéutico.
24. Un método para detectar cáncer de pulmón en
un paciente, que comprende:
- (a)
- poner en contacto una muestra biológica obtenida del paciente con al menos dos cebadores de oligonucleótidos en una reacción en cadena de la polimerasa, en donde al menos uno de los oligonucleótidos es específico para el polinucleótido proporcionado en SEQ ID NO: 160 o el complemento del mismo; y
- (b)
- detectar en la muestra una secuencia de polinucelótidos que se amplifica en presencia de los cebadores de oligonucleótidos, detectando con ello el cáncer de pulmón.
25. Un kit de diagnóstico, que comprende:
- (a)
- uno o más anticuerpos monoclonales de la reivindicación 21; y
- (b)
- un reactivo de detección.
26. El kit de la reivindicación 25, en donde los
anticuerpos monoclonales están inmovilizados sobre un soporte
sólido, que comprende preferiblemente nitrocelulosa, látex o un
material plástico.
27. El kit de las reivindicaciones 25 ó 26, en
donde el reactivo de detección comprende un grupo informador,
preferiblemente seleccionado del grupo consistente en radioisótopos,
grupos fluorescentes, grupos luminiscentes, enzimas, biotina y
partículas de colorante, conjugado a un agente de unión,
preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en
anti-inmunoglobulinas, proteína G, proteína A y
lectinas.
28. Un kit de diagnóstico que comprende al menos
dos cebadores de oligonucelótidos, siendo al menos uno de los
cebadores de oligonucleótidos específico para la molécula de
polinucleótido proporcionada en SEQ ID NO: 160 o el complemento de
la misma.
29. Un método de acuerdo con la reivindicación
24 o un kit de diagnóstico de la reivindicación 28, en el que al
menos uno de los cebadores de oligonucleótidos comprende al menos 10
nucleótidos contiguos de una molécula de polinucleótido que
comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 160.
30. Un método para detectar cáncer de pulmón en
un paciente, que comprende:
- (b)
- poner en contacto una muestra biológica obtenida del paciente con una sonda de oligonucleótidos específica para la molécula de polinucleótido proporcionada en SEQ ID NO: 160 o el complemento de la misma; y
- (c)
- detectar en la muestra una secuencia de polinucelótidos que se hibrida a la sonda de oligonucleótidos, detectando con ello el cáncer de pulmón en el paciente.
31. Un kit de diagnóstico que comprende una
sonda de oligonucelótidos específica para la molécula de
polinucleótido proporcionada en SEQ ID NO: 160 o el complemento de
la misma.
32. El método de la reivindicación 30 o el kit
de diagnóstico de la reivindicación 31, en el que la sonda de
oligonucléotidos comprende al menos 15 nucleótidos contiguos de la
molécula de polinucleótido proporcionada en SEQ ID NO: 160 o el
complemento de la misma.
\newpage
33. Un método para preparar un producto de
sangre, que comprende la etapa de: incubar células de la sangre
periférica, obtenidas de un paciente, en presencia de al menos un
polipéptido de la reivindicación 2, o al menos de un polinucleótido
de la reivindicación 1, de modo que proliferan células T.
34. El método de la reivindicación 33, en el que
la etapa de incubar las células T se repite una o más veces.
35. El método de la reivindicación 33 ó 34, que
comprende, además, la etapa de separar células T de las células de
la sangre periférica, de modo que las células incubadas son las
células T.
36. El método de la reivindicación 33 ó 34, que
comprende, además, separar células CD4+ o células CD8+ de las
células de la sangre periférica, de modo que las células
proliferadas son células T CD4+ o CD8+.
37. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 33 a 36 que comprende, además, clonar una o más
células T que proliferan en presencia del polipéptido o
polinucleótido.
38. Un producto de sangre, preparado de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37 para uso en un
método para tratar cáncer de pulmón.
39. Una composición para el tratamiento de
cáncer de pulmón en un paciente, que comprende células T
proliferadas en presencia de un polipéptido de la reivindicación 2,
o de un polinucleótido de la reivindicación 1, en combinación con un
soporte farmacéuticamente aceptable.
40. Antígeno que presenta células incubadas en
presencia de al menos un polipéptido de la reivindicación 2, o de al
menos un polinucleótido de la reivindicación 1, para uso en un
método para tratar cáncer de pulmón en un paciente.
41. El antígeno presentador de células de la
reivindicación 40, en donde las células presentadoras del antígeno
se seleccionan del grupo que consiste en células dendríticas y
células macrófagos.
42. Una composición para el tratamiento de
cáncer de pulmón en un paciente, que comprende células presentadoras
de antígenos incubadas en presencia de un polipéptido de la
reivindicación 2, o de un polinucleótido de la reivindicación 1, en
combinación con un soporte farmacéuticamente aceptable.
43. El uso de un anticuerpo monoclonal que se
une a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos
codificada por el polinucleótido proporcionado en SEQ ID NO: 160
para la fabricación de un medicamento para inhibir el desarrollo de
cáncer de pulmón en un paciente.
44. El uso de la reivindicación 43, en donde el
anticuerpo monoclonal está conjugado a un agente terapéutico.
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