ES2350041T3 - Composiciones y métodos para la terapia y diagnóstico del cáncer de ovarios. - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a una proteína de carcinoma de ovarios codificada por SEQ ID NO:391, que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:393 para uso en el tratamiento de cáncer de ovarios.

Description

CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere, en general, a la terapia del cáncer de ovarios. Más específicamente, la invención se refiere a polipéptidos que comprenden al menos una porción de una proteína del carcinoma de ovarios y a polinucleótidos que codifican a polipéptidos de este tipo, así como a anticuerpos y células del sistema inmune que reconocen específicamente a polipéptidos de este tipo. Polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos y células de este tipo se pueden utilizar en vacunas y composiciones farmacéuticas para el tratamiento del cáncer de ovarios.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El cáncer de ovarios es un problema sanitario importante para las mujeres en los Estados Unidos de América y de todo el mundo. A pesar de que se ha avanzado en la detección y terapia de este cáncer, no hay actualmente disponible vacuna u otro método de éxito universal para la prevención o el tratamiento. El control de la enfermedad se basa actualmente en una combinación de diagnóstico temprano y tratamiento agresivo, que puede incluir uno o más de una diversidad de tratamientos, tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia y terapia con hormonas. El curso del tratamiento para un cáncer particular se selecciona a menudo en base a una diversidad de parámetros de pronóstico, incluido un análisis de marcadores tumorales específicos. Sin embargo, el uso de marcadores establecidos conduce, a menudo, a un resultado que es difícil de interpretar, y en muchos pacientes de cáncer se continúa observando una elevada mortalidad.
Las inmunoterapias tienen el potencial de mejorar sustancialmente el tratamiento del cáncer y la supervivencia. Terapias de este tipo pueden implicar la generación o intensificación de una respuesta inmune a un antígeno de carcinoma de ovarios. Sin embargo, hasta la fecha se conocen relativamente pocos antígenos de carcinoma de ovarios y la generación de una respuesta inmune contra antígenos de este tipo no ha demostrado ser terapéuticamente beneficiosa.
Por consiguiente, existe la necesidad en la técnica de métodos mejorados para identificar antígenos de tumores de ovarios y de utilizar estos antígenos en la terapia del cáncer de ovarios. La presente invención satisface estas necesidades y proporciona, además, otras ventajas relacionadas.
Gillespie A.M et al, British Journal of Cancer, 1998, 78(6), 816-821, describe un estudio sobre la expresión de genes MAGE 1-4, BAGE y GAGE 1-3 y -6 en tumores de ovarios.
DATABASE EMBL [online], zt43h04.rt Soares ovary tumor NbHOT Homo sapiens cDNA clone 725143 5’, 8 de diciembre de 1998, recuperado de la base de datos EBI nº de acceso AA404225, describe (entrada completa en la base de datos) una secuencia parcial de ADNc que tiene un solapamiento de 563 nucleótidos con SEQ ID NO: 391. La muestra se derivó de un tumor de ovarios humano. SEQ ID NO: 391 es un polinucleótido más largo que el descrito en este documento.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
En síntesis, esta invención proporciona composiciones y su uso en la terapia de cáncer de ovarios. En un aspecto, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden una porción inmunogénica de una proteína de carcinoma de ovarios
o una variante de la misma que difiere en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones, de manera que no disminuye sustancialmente la capacidad de la variante de reaccionar con antisueros específicos para la proteína de carcinoma de ovarios. En particular, la proteína de carcinoma de ovarios comprende una secuencia que es codificada por una secuencia de polinucleótidos, seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 391 y complementos de polinucleótidos de este tipo.
En un primer aspecto de la presente invención se proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a una proteína de carcinoma de ovarios codificada por SEQ ID NO: 391, que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 393 para uso en el tratamiento de cáncer de ovarios.
De preferencia, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígenos está conjugado a una toxina.
Preferiblemente, además, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste en una toxina ricina, toxina abrina, toxina de la difteria, toxina del cólera, toxina gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de tipo Shigella y proteína antiviral de hierba carmín.
Ventajosamente, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígenos está conjugado a un radionucleido. Preferiblemente, en donde el radionucleido se selecciona del grupo que consiste en 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 211At y 212Bi. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona el uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a
una proteína de carcinoma de ovarios codificada por SEQ ID NO: 391, que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 393 para la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de cáncer de ovarios.
Preferiblemente, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígenos está conjugado a una toxina.
Preferiblemente, además, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste en una toxina ricina, toxina abrina, toxina de la difteria, toxina del cólera, toxina gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de tipo Shigella y proteína antiviral de hierba carmín.
Ventajosamente, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígenos está conjugado a un radionucleido.
Preferiblemente, en donde el radionucleido se selecciona del grupo que consiste en 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 211At y 212Bi.
En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de un cáncer de ovarios que expresa un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 393 codificada por SEQ ID NO: 391, comprendiendo la composición un soporte fisiológicamente aceptable en combinación con un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos de acuerdo con lo que antecede.
Estos y otros aspectos de la presente invención resultarán evidentes en base a la referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las figuras 1A-1S (SEQ ID NOs: 1-71) representan secuencias parciales de polinucleótidos que codifican antígenos representativos de carcinoma de ovarios secretados.
Las figuras 2A-2C representan secuencias de inserto completas para tres de los clones de la figura 1. La figura 2A muestra la secuencia designada O7E (11731; SEQ ID NO: 72), la figura 2B muestra la secuencia designada O9E (11785; SEQ ID NO: 73) y la figura 2C muestra la secuencia designada O8E (13695; SEQ ID NO: 74).
La figura 3 presenta resultados del análisis de la expresión por microarray de la secuencia de carcinoma de ovarios designada O8E.
La figura 4 presenta una secuencia parcial de un polinucleótido (designado 3g; SEQ ID NO: 75) que codifica una secuencia de carcinoma de ovarios que es una fusión por corte y empalme entre la oncoproteína TAX de tipo I del virus de la leucemia
de linfocitos T humanos y osteonectina.
La figura 5 presenta el polinucleótido de carcinoma de ovarios designado 3f (SEQ ID NO: 76).
La figura 6 presenta el polinucleótido de carcinoma de ovarios designado 6b (SEQ ID NO: 77).
Las figuras 7A y 7B presentan los polinucleótidos de carcinoma de ovarios designados 8e (SEQ ID NO: 78) y 8h (SEQ DI NO: 79).
La figura 8 presenta el polinucleótido de carcinoma de ovarios designado 12c (SEQ ID NO: 80).
La figura 9 presenta el polinucleótido de carcinoma de ovarios designado 12h (SEQ ID NO: 81).
La figura 10 representa resultados del análisis de la expresión por microarray de la secuencia de carcinoma de ovarios designada 3f.
La figura 11 representa resultados del análisis de la expresión por microarray de la secuencia de carcinoma de ovarios designada 6b.
La figura 12 representa resultados del análisis de la expresión por microarray de la secuencia de carcinoma de ovarios designada 8e.
La figura 13 representa resultados del análisis de la expresión por microarray de la secuencia de carcinoma de ovarios designada 12c.
La figura 14 representa resultados del análisis de la expresión por microarray de la secuencia de carcinoma de ovarios designada 12h.
Las figuras 15A-15EEE representan secuencias parciales de polinucleótidos adicionales que codifican antígenos representativos de carcinoma de ovarios secretados (SEQ ID NOs: 82-310).
La figura 16 es un diagrama que ilustra la localización de diversas secuencias O8E parciales dentro de la secuencia de longitud completa.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Como se ha señalado antes, la presente invención está dirigida, en general, a composiciones y métodos para la terapia del cáncer, tal como cáncer de ovarios. Las composiciones descritas en esta memoria pueden incluir polipéptidos inmunogénicos, polinucleótidos que codifican a polipéptidos de este tipo, agentes de unión, tales como anticuerpos, que se unen a un polipéptido, células presentadoras de antígenos (APCs
– por sus siglas en inglés) y/o células del sistema inmune (p. ej., células T). Polipéptidos de la presente invención comprenden generalmente al menos una porción inmunogénica de una proteína de carcinoma de ovarios o una variante de la misma. Se han identificado determinadas proteínas de carcinoma de ovarios utilizando una técnica de inmunoensayo y a ellas se alude en esta memoria como antígenos de carcinoma de ovarios. Un “antígeno de carcinoma de ovarios” es una proteína que es expresada por células de tumor de ovarios (preferiblemente células humanas) a un nivel que es al menos dos veces más elevado que el nivel en células normales de ovarios. Determinados antígenos de carcinoma de ovarios reaccionan de forma detectable (dentro de un inmunoensayo, tal como un ELISA o transferencia Western) con antisueros generados contra el suero de un animal inmunodeficiente al que se ha implantado un tumor de ovarios humanos. Antígenos de carcinoma de ovarios de este tipo son retirados o secretados a partir de un tumor de ovarios en los sueros del animal inmunodeficiente. Por consiguiente, determinados antígenos de carcinoma de ovarios proporcionados en esta memoria son antígenos secretados. Determinadas secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención comprenden generalmente una secuencia de ADN o de ARN que codifica la totalidad o una porción de un polipéptido de este tipo, o que es complementaria a una secuencia de este tipo.
La presente invención proporciona, además, secuencias de carcinoma de ovarios que se identifican utilizando técnicas para evaluar una expresión alterada dentro de un tumor de ovario. Secuencias de este tipo pueden ser secuencias de polinucleótidos o de proteínas. Secuencias de carcinoma de ovarios se expresan generalmente en un tumor de ovarios a un nivel que es al menos dos veces y, preferiblemente, al menos cinco veces mayor que el nivel de expresión en tejido normal de ovarios, según se determina utilizando un ensayo representativo proporcionado en esta memoria. En esta memoria se presentan determinadas secuencias parciales de polinucleótidos de carcinoma de ovarios. Proteínas codificadas por genes que comprenden secuencias de polinucleótidos de este tipo (o complementos de las mismas) también se consideran proteínas de carcinoma de ovarios.
Los anticuerpos son generalmente proteínas del sistema inmune o fragmentos de unión a antígenos de las mismas, que son capaces de unirse a al menos una porción de un polipéptido de carcinoma de ovarios según se describe en esta memoria. Células T que se pueden emplear en las composiciones proporcionadas en esta memoria son, generalmente, células T (p. ej., CD4-y/o CD8-) que son específicas para un polipéptido de este tipo. Determinados métodos descritos en esta memoria emplean, además, células presentadoras de antígenos (tales como células dendríticas o macrófagos) que expresan un polipéptido de carcinoma de ovarios según se proporciona en esta memoria.
POLINUCLEÓTIDOS DE CARCINOMA DE OVARIOS
Cualquier polinucleótido que codifique una proteína de carcinoma de ovarios o una porción u otra variante de la misma según se describe en esta memoria queda abarcado por la presente invención. Polinucleótidos preferidos comprenden al menos 15 nucleótidos consecutivos, preferiblemente al menos 30 nucleótidos consecutivos, y más preferiblemente al menos 45 nucleótidos consecutivos, que codifican una porción de una proteína de carcinoma de ovarios. Más preferiblemente, un polinucleótido codifica una porción inmunogénica de una proteína de carcinoma de ovarios, tal como un antígeno de carcinoma de ovarios. También quedan abarcados por la presente invención polinucleótidos complementarios a cualesquiera secuencias de este tipo. Los polinucleótidos pueden ser de cadena sencilla (codificante o antisentido) o de doble cadena, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o de ARN. Secuencias codificadoras o no codificadoras adicionales pueden, pero no tienen que estar presentes dentro de un polinucleótido de la presente invención, y un polinucleótido puede, pero no tiene que estar enlazado a otras moléculas y/o materiales de soporte.
Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica una proteína de carcinoma de ovarios o una porción de la misma) o puede comprender una variante de una secuencia de este tipo. Variantes de polinucleótidos pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, de manera que la inmunogenicidad del polipéptido codificado no queda disminuida con relación a una proteína de carcinoma de ovarios nativa. El efecto sobre la inmunogenicidad del polipéptido codificado puede ser evaluado generalmente según se describe en esta memoria. Variantes exhiben preferiblemente una identidad de al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente una identidad de al menos aproximadamente 80% y lo más preferiblemente una identidad de al menos aproximadamente 90% con una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína de carcinoma de ovarios nativa o una porción de la misma.
El porcentaje de identidad para dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos se puede determinar fácilmente comparando las secuencias utilizando algoritmos de ordenador bien conocidos por los expertos ordinarios en la técnica, tal como MegAlign, utilizando parámetros por defecto. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan típicamente al comparar las secuencias sobre una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de las secuencias. Una “ventana de comparación”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, habitualmente de 30 a aproximadamente 75, o de 40 a aproximadamente 50, en el que una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de haber alineado óptimamente las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para la comparación se puede realizar, por ejemplo, utilizando el programa MegAlign en la suite Lasergene de software de bioinformática (DNASTAR, Inc., Madison, WI), utilizando parámetros por defecto. Preferiblemente, el porcentaje de identidad de las secuencias se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos en la ventana puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) de 20% o menos, habitualmente de 5 a 15% o de 10 a 12%, con relación a la secuencia de referencia (que no contiene adiciones ni deleciones). El porcentaje de identidad se puede calcular determinando el número de posiciones en las que aparece en las dos secuencias las bases de ácidos nucleicos o el residuo de aminoácido idénticos para proporcionar el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de la secuencia.
Las variantes también, o alternativamente, pueden ser esencialmente homólogas a un gen nativo o una porción o complemento del mismo. Variantes de polinucleótidos de este tipo son capaces de hibridarse en condiciones moderadamente estrictas para formar una secuencia de ADN que aparece en la naturaleza que codifica una proteína de carcinoma de ovarios nativa (o una secuencia complementaria). Condiciones moderadamente estrictas adecuadas incluyen un prelavado en una disolución de 5 X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); hibridación a 50ºC-65ºC, 5 X SSC, durante una noche; seguido de lavado durante dos veces a 65ºC durante 20 minutos, en cada caso con 2X, 0,5X y 0,2X SSC que contiene SDS al 0,1%.
Se apreciará por parte de los expertos ordinarios en la técnica que, como resultado de la degeneración del código genético, existen muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido según se describe en esta memoria. Algunos de estos polinucleótidos portan una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, por parte de la presente invención se contemplan específicamente polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones. Además, están dentro del alcance de la presente invención alelos de los genes que comprenden las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en esta memoria. Los alelos son genes endógenos que se encuentran alterados como resultado de una o más mutaciones, tales como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultantes pueden, pero no necesitan tener una estructura o función alterada. Los alelos se pueden identificar utilizando técnicas convencionales (tales como hibridación, amplificación y/o comparación de las secuencias en las bases de datos).
Los polinucleótidos se pueden preparar utilizando cualquiera de una diversidad de técnicas. Por ejemplo, se puede identificar un polinucleótido de un carcinoma de ovarios, según se describe con mayor detalle más abajo, rastreando una genoteca de expresión del tumor de ovarios de pase tardío con antisueros generados contra sueros de ratones inmunocompetentes tras inyección a dichos ratones de sueros procedentes de ratones SCID a los que se les han implantado tumores de ovarios de pase tardío. También se pueden identificar polinucleótidos de carcinoma de ovarios utilizando cualquiera de una diversidad de técnicas diseñadas para evaluar la expresión diferencial de genes. Alternativamente, los polinucleótidos se pueden amplificar a partir de ADNc preparado a partir de células tumorales de ovarios. Polinucleótidos de este tipo se pueden amplificar a través de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR – siglas en inglés). Para este planteamiento se pueden diseñar cebadores específicos para la secuencia en base a la secuencia proporcionada en esta memoria, y se pueden adquirir o sintetizar.
Se puede utilizar una porción amplificada para aislar un gen de longitud completa a partir de una genoteca adecuada (p. ej., una genoteca de ADNc de carcinoma de ovarios), utilizando técnicas bien conocidas. Dentro de dichas técnicas se rastrea una genoteca (de ADNc o genómica) utilizando una o más sondas o cebadores de polinucleótidos adecuados para la amplificación. De preferencia, una genoteca se selecciona por el tamaño para que incluya moléculas mayores. También se pueden preferir genotecas cebadas al azar para identificar regiones de genes 5’ y situadas más arriba. Se prefieren genotecas genómicas para obtener intrones y extender las secuencias 5’.
Para las técnicas de hibridación se puede marcar una secuencia parcial (p. ej.,
mediante traslación de incisión o marcaje en el extremo con 32P) utilizando técnicas bien conocidas. Después se rastrea una genoteca bacteriana o de bacteriófagos al hibridar filtros que contienen colonias de bacterias desnaturalizadas (o céspedes que contienen placas de fagos) con la sonda marcada (véase, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Colonias hibridantes o placas se seleccionan y expanden y el ADN se aísla para el análisis ulterior. Se pueden analizar clones de ADNc para determinar la cantidad de secuencia adicional, por ejemplo mediante PCR, utilizando un cebador procedente de la secuencia parcial y un cebador procedente del vector. Se pueden generar mapas de restricción y secuencias parciales para identificar uno o más clones solapantes. Después se puede determinar la secuencia completa utilizando técnicas convencionales que pueden implicar generar una serie de clones de deleción. Las secuencias de solapamiento resultantes se reúnen luego para formar una sola secuencia contigua. Se puede generar una molécula de ADNc de longitud completa al ligar fragmentos adecuados, utilizando técnicas bien conocidas.
Alternativamente, existen numerosas técnicas de amplificación para obtener una secuencia codificadora de longitud completa a partir de una secuencia de ADNc parcial. En técnicas de este tipo, la amplificación se lleva a cabo generalmente a través de una PCR. Para realizar la etapa de amplificación se puede utilizar cualquiera de una diversidad de kits comercialmente disponibles. Los cebadores se pueden diseñar utilizando, por ejemplo, un software bien conocido en la técnica. Los cebadores tienen una longitud de preferiblemente 22-30 nucleótidos, tienen un contenido en GC de al menos 50% y se reasocian a la secuencia diana a temperaturas de aproximadamente 68ºC a 72ºC. La región amplificada se puede secuenciar según se describe antes y las secuencias solapantes se pueden reunir para forma una secuencia contigua.
Una técnica de amplificación de este tipo es la PCR inversa (véase Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16: 8186, 1988), que utiliza enzimas de restricción para generar un fragmento en la región conocida del gen. Luego, el fragmento se circulariza mediante ligación intramolecular y se utiliza como un molde para la PCR con cebadores divergentes derivados de la región conocida. Dentro de un planteamiento alternativo, se pueden recuperar secuencias adyacentes a una secuencia parcial mediante amplificación con un cebador a una secuencia de enlazador y una región específica para un cebador a una región conocida. Las secuencias amplificadas se someten, típicamente, a una segunda ronda de amplificación con el mismo cebador enlazador y un segundo cebador específico para la región conocida. Una variación de este proceso, que emplea dos cebadores que inician la extensión en direcciones opuestas a partir de la secuencia conocida, se describe en el documento WO 96/38591. Técnicas adicionales incluyen PCR de captura (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1: 111-19, 1991) y PCR caminante (Parker et al., Nucl. Acids Res, 19:3055-60, 1991). También se pueden emplear otros métodos que emplean la amplificación para obtener una secuencia de ADNc de longitud completa.
En ciertos casos es posible obtener una secuencia de ADNc de longitud completa mediante el análisis de secuencias proporcionadas en una base de datos de marcador de secuencia expresada (EST – siglas en inglés), tal como la disponible de GenBank. Generalmente se pueden efectuar búsquedas de ESTs solapantes utilizando programas bien conocidos (p. ej., búsquedas de NCBI BLAST), y ESTs de este tipo se pueden utilizar para generar una secuencia contigua de longitud completa.
En las figuras 1A-1S (SEQ ID NOs:1 a 71) y en las figuras 15A a 15EEE (SEQ ID NOs:82 a 310) se proporcionan determinadas secuencias de ácidos nucleicos de moléculas de ADNc que codifican porciones de antígenos de carcinoma de ovarios. Las secuencias proporcionadas en las figuras 1A-1S parecen ser nuevas. Para las secuencias en las figuras 15A-15EEE, las búsquedas en las bases de datos revelaron apareamientos con una identidad sustancial. Estos polinucleótidos se aislaron mediante rastreo serológico de una genoteca de expresión de ADNc de tumor de ovarios, utilizando una técnica diseñada para identificar antígenos de tumores secretados. En síntesis, una genoteca de expresión de tumor de ovarios de pase tardío se preparó a partir de un tumor de ovario humano derivado de SCID (OV9334) en el vector �-screen (Novagen). Los sueros utilizados para el rastreo se obtuvieron inyectando a ratones inmunocompetentes sueros de ratones SCID a los que se implantó un tumor de ovarios de pase tardío. Esta técnica permite la identificación de moléculas de ADNc que codifican porciones inmunogénicas de antígenos de tumores secretados.
Los polinucleótidos referidos en esta memoria, así como polinucleótidos de longitud completa que comprenden secuencias de este tipo, otras porciones de polinucleótidos de longitud completa de este tipo y secuencias complementarias a la totalidad o a una porción de moléculas de longitud completa de este tipo están específicamente abarcados por la presente invención. Resultará evidente para los expertos ordinarios en la técnica que esta técnica se puede también aplicar a la identificación de antígenos que son secretados a partir de otros tipos de tumores.
En las figuras 4-9 (SEQ ID NOs:75 -81) así como SEQ ID NOs:313 -384 se proporcionan otras secuencias de ácidos nucleicos de moléculas de ADNc que codifican porciones de proteínas de carcinoma de ovarios. Estas secuencias se identificaron rastreando un microarray de ADNcs en cuanto a la expresión asociada al tumor (es decir, la expresión que es al menos cinco veces mayor en un tumor de ovarios que en tejido normal de ovario, según se determina utilizando un ensayo representativo proporcionado en esta memoria). Rastreos de este tipo se realizaron utilizando un microarray Synteni (Palo Alto, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (y esencialmente según se describe por Schema et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619, 1996 y Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:21502155, 1997). Las SEQ ID NOs: 311 y 391 proporcionan secuencias de longitud completa que incorporan a determinadas de estas secuencias de ácidos nucleicos.
Para evaluar la expresión de un ADNc asociada a tumor se puede utilizar cualquiera de una diversidad de técnicas bien conocidas. Por ejemplo, se pueden emplear técnicas de hibridación utilizando sondas de polinucleótidos marcadas. De forma alternativa, o adicionalmente, se pueden utilizar técnicas de amplificación, tales como PCR en tiempo real (véase Gibson et al., Genome Research 6:995-1001, 1996; Heid et al., Genome Research 6:986-994, 1996). La PCR en tiempo real es una técnica que evalúa el nivel de producto de PCR que se acumula durante la amplificación. Esta técnica permite la evaluación cuantitativa de niveles de ARNm en múltiples muestras. En síntesis, ARNm se extrae de tejido tumoral y normal y el ADNc se prepara utilizando técnicas convencionales. La PCR en tiempo real se puede efectuar, por ejemplo, utilizando un instrumento 7700 Prism de Perkin Elmer/Applied Biosystems (Foster City, CA). Se pueden diseñar cebadores de apareamiento y sondas fluorescentes para genes de interés, utilizando, por ejemplo, el programa de expresión de cebadores proporcionado por Perkin Elmer/Applied Biosystems (Foster City, CA). Concentraciones óptimas de cebadores y sondas se pueden determinar inicialmente por parte de los expertos ordinarios en la técnica, y cebadores de control
(p. ej., �-actina) y sondas se pueden obtener en el comercio, por ejemplo de Perkin Elmer/Applied Biosystems (Foster City, CA). Con el fin de cuantificar la cantidad de ARN específico en una muestra, se genera una curva patrón utilizando un plásmido que contiene el gen de interés. Se pueden generar curvas patrón utilizando los valores Ct determinados en la PCR de tiempo real, los cuales se refieren a la concentración inicial de ADNc utilizada en el ensayo. Generalmente, son suficientes diluciones convencionales que oscilen entre 10-106 copias del gen de interés. Además, se genera una curva patrón para la secuencia de control. Esto permite la estandarización del contenido inicial en ARN de una muestra de tejido con respecto a la cantidad de control para fines comparativos.
Variantes de polinucleótidos se pueden preparar, generalmente, por cualquier método conocido en la técnica, incluida la síntesis química, por ejemplo mediante síntesis química de la fosforoamidita en fase sólida. También se pueden introducir modificaciones en una secuencia de polinucleótidos utilizando técnicas de mutagénesis convencionales, tales como mutagénesis específica para el sitio y dirigida al oligonucleótido (véase Adelman et al., DNA 2: 183, 1983). Alternativamente, moléculas de ARN se pueden generar mediante transcripción in vitro o in vivo de secuencias de ADN que codifican un antígeno de carcinoma de ovarios, o una porción del mismo, con la condición de que el ADN se incorpore en un vector con un promotor de ARN polimerasa adecuado (tal como T7 o SP6). Se pueden utilizar determinadas porciones para preparar un polipéptido codificado, según se describe en esta memoria. Adicionalmente, o de forma alternativa, se puede administrar una porción a un paciente, de modo que el polipéptido codificado se genera in vivo.
También se puede utilizar una porción de una secuencia complementaria a una secuencia codificadora (es decir, un polinucleótido antisentido) como una sonda o para modular la expresión del gen. Construcciones de ADNc que se pueden transcribir en ARN antisentido también se pueden introducir en células o tejidos para facilitar la producción de ARN antisentido. Se puede utilizar un polinucleótido antisentido, según se describe en esta memoria, para inhibir la expresión de una proteína de carcinoma de ovarios. La tecnología antisentido se puede utilizar para controlar la expresión del gen a través de una formación de triple hélice, que compromete la capacidad de la hélice doble de abrirse lo suficientemente para la unión de polimerasas, factores de transcripción o moléculas reguladoras (véase Gee et al., En Huber y Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co. (Mt. Kisco, NY; 1994). Alternativamente, se puede diseñar una molécula antisentido para que se hibride con una región de control de un gen (p. ej., promotor, reforzador o sitio de iniciación de la transcripción) y bloquee la transcripción del gen; o bloquee la traducción al inhibir la unión de un transcrito a ribosomas.
Cualquier polinucleótido se puede modificar adicionalmente para aumentar la estabilidad in vivo. Modificaciones posibles incluyen, pero no se limitan a la adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5’ y/ó 3’; el uso de fosforotioato ó 2’ O-metilo más que enlaces fosfodiesterasa en la cadena principal; y/o la inclusión de bases no tradicionales, tales como inosina, queosina y wibutosina, así como formas acetil-, metil, tio-y otras formas modificadas de adenina, citidina, guanina, timina y uridina.
Secuencias de nucelótidos según se describen en esta memoria se pueden unir a una diversidad de otras secuencias de nucleótidos utilizando técnicas de ADN recombinante establecidas. Por ejemplo, un polinucleótido se puede clonar en cualquiera de una diversidad de vectores de clonación, incluidos plásmidos, fagémidos, derivados de fago lambda y cósmidos. Vectores de interés particular incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación. En general, un vector contendrá un origen de replicación, funcional en al menos un organismo, sitios de endonucleasa de restricción convenientes y uno o más marcadores seleccionables. Otros elementos dependerán del uso deseado y resultarán evidentes para los expertos ordinarios en la técnica.
Dentro de determinadas realizaciones, los polinucleótidos se pueden formular con el fin de permitir la entrada en una célula de un mamífero, y la expresión en ella. Formulaciones de este tipo son particularmente útiles para fines terapéuticos, según se describe más abajo. Los expertos ordinarios en la técnica apreciarán que existen muchos modos de conseguir la expresión de un polinucleótido en una célula diana y se puede emplear cualquier método adecuado. Por ejemplo, un polinucleótido se puede incorporar en un vector viral, tal como, pero no limitado a adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus o virus vacuna u otros virus de erupciones pustulosas (p. ej., virus de la viruela aviar). Técnicas para incorporar ADN en vectores de este tipo son bien conocidas por los expertos ordinarios en la técnica. Un vector retroviral puede transferir o incorporar adicionalmente un gen para un marcador seleccionable (para ayudar a la identificación o selección de células transducidas) y/o un resto que se dirige a diana, tal como un gen que codifica un ligando para un receptor en una célula diana específica para hacer al vector específico para la diana. La fijación como objetivo también se puede conseguir utilizando un anticuerpo, por métodos conocidos por los expertos ordinarios en la técnica.
Otras formulaciones para fines terapéuticos incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos, incluidas emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal preferido para uso como un vehículo de suministro in vitro e in vivo es un liposoma (es decir, una vesícula de la membrana artificial). La preparación y el uso de sistemas de este tipo es bien conocido en la técnica.
POLIPÉPTIDOS DE CARCINOMA DE OVARIOS
Dentro del contexto de la presente invención, polipéptidos pueden comprender al menos una porción inmunogénica de una proteína de carcinoma de ovarios o una variante de la misma, según se describe en esta memoria. Como se ha señalado antes, determinadas proteínas de carcinoma de ovarios son antígenos de carcinoma de ovarios que son expresados por células de tumor de ovarios y reaccionan de forma detectable dentro de un inmunoensayo (tal como un ELISA) con antisueros generados contra suero procedente de un animal inmunodeficiente al que se le ha implantado un tumor de ovarios. Otras proteínas de carcinoma de ovarios son codificadas por polinucleótidos de carcinoma de ovarios a los que se hace referencia en esta memoria. Polipéptidos según se describen en esta memoria pueden ser de cualquier longitud. Pueden estar presentes secuencias adicionales derivadas de la proteína nativa y/o secuencias heterólogas, y secuencias de este tipo pueden (pero no tienen por que) poseer propiedades inmunogénicas o antigénicas adicionales.
Una “porción inmunogénica”, tal como se utiliza en esta memoria, es una porción de un antígeno que es reconocida (es decir, está unida específicamente) por un receptor de antígeno de superficie de células B y/o células T. Porciones inmunogénicas de este tipo comprenden generalmente al menos 5 residuos aminoácidos, más preferiblemente al menos 10 y todavía más preferiblemente al menos 20 residuos aminoácidos de una proteína de carcinoma de ovarios o una variante de la misma. Porciones inmunogénicas preferidas son codificadas por moléculas de ADNc, aisladas según se describe en esta memoria. Porciones inmunogénicas adicionales pueden identificarse generalmente utilizando técnicas bien conocidas, tales como las resumidas en Paul, Fundamental Immunology, 3ª ed., 243247 (Raven Press, 1993) y referencias citadas en el mismo. Técnicas de este tipo incluyen polipéptidos de rastreo en cuanto a la capacidad de reaccionar con anticuerpos, antisueros y/o líneas de células T o clones específicos para proteínas de carcinoma de ovarios. Tal como se utiliza en esta memoria, antisueros y anticuerpos son “específicos para proteínas de carcinoma de ovarios” si se unen específicamente a una proteína de carcinoma de ovarios (es decir, reaccionan con la proteína de carcinoma de ovarios en un ELISA u otro inmunoensayo, y no reaccionan de forma detectable con proteínas no relacionadas). Antisueros, anticuerpos y células T de este tipo se pueden preparar según se describe en esta memoria y utilizando técnicas bien conocidas. Una porción inmunogénica de una proteína de carcinoma de ovarios nativa es una porción que reacciona con antisueros, anticuerpos y/o células T de este tipo a un nivel que no es esencialmente menor que la reactividad del polipéptido de longitud completa (p. ej., en un ELISA y/o ensayo de reactividad de células T). Porciones inmunogénicas de este tipo pueden reaccionar dentro de este tipo de ensayos a un nivel que es similar a o mayor que la reactividad de la proteína de longitud completa. Rastreos de este tipo se pueden realizar generalmente utilizando métodos bien conocidos por los expertos ordinarios en la técnica, tales como los descritos en Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Por ejemplo, un polipéptido se puede inmovilizar sobre un soporte sólido y se puede poner en contacto con sueros de pacientes para permitir la unión de anticuerpos en los sueros con el polipéptido inmovilizado. Después, los sueros no unidos se pueden separar y los anticuerpos unidos se pueden detectar utilizando, por ejemplo, Proteína A marcada con 123I.
Como se ha señalado antes, una composición puede comprender una variante de una proteína de carcinoma de ovarios nativa. Una variante de “polipéptido”, tal como se utiliza en esta memoria, es un polipéptido que difiere de una proteína de carcinoma de ovarios nativa en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones, de manera que no disminuye sustancialmente la inmunogenicidad del polipéptido. En otras palabras, la capacidad de reaccionar de una variante con antisueros específicos para proteínas de carcinoma de ovarios se puede reforzar o puede permanecer inalterada con relación a la proteína de carcinoma de ovarios nativa, o se puede disminuir en menos de un 50% y preferiblemente en menos de un 20% con relación a la proteína de carcinoma de ovarios nativa. Variantes de este tipo se pueden identificar generalmente modificando una de las secuencias de polipéptidos anteriores y evaluando la reactividad del polipéptido modificado con anticuerpos o antisueros específicos para proteínas de carcinoma de ovarios según se describe en esta memoria. Variantes preferidas incluyen aquellas en las que se han separado una
o más porciones, tales como una secuencia líder N-terminal o un dominio de la transmembrana. Otras variantes preferidas incluyen variantes en las que se ha separado una pequeña porción (p. ej., 1-30 aminoácidos, preferiblemente 5-15 aminoácidos) del N-y/o C-terminal de la proteína madura.
Variantes de polipéptidos exhiben una identidad de preferiblemente al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 95% con el polipéptido nativo. Preferiblemente, una variante contiene sustituciones conservativas. Una “sustitución conservativa” es una en la cual un aminoácido está sustituido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de modo que un experto en la técnica de la química de péptidos esperaría que quedaran esencialmente inalteradas la estructura secundaria y la naturaleza hidrófoba del polipéptido. Sustituciones de aminoácidos pueden hacerse generalmente sobre la base de una similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilia y/o la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y aminoácidos con grupos en la cabeza polares, sin carga y que tienen valores de hidrofilia similares, incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservativos incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante también, o alternativamente, puede contener cambios no conservativos. Variantes también (o alternativamente) pueden estar modificadas, por ejemplo, por la deleción o adición de aminoácidos que tienen una influencia mínima sobre la inmunogenicidad, estructura secundaria y naturaleza hidropática del polipéptido.
Como se ha señalado antes, polipéptidos pueden comprender una secuencia señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína que dirige la transferencia de la proteína, de forma conjunta con la traducción o post-traducción. El polipéptido también puede estar conjugado a un enlazador u otra secuencia para simplificar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido (p. ej., poli-His) o para reforzar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido se puede conjugar a una región Fc de la inmunoglobulina.
Polipéptidos se pueden preparar utilizando cualquiera de una diversidad de técnicas bien conocidas. Polipéptidos recombinantes, codificados por secuencias de ADN según se describe antes, se pueden fácilmente preparar a partir de secuencias de ADN, utilizando cualquiera de una diversidad de vectores de expresión conocidos por los expertos ordinarios en la técnica. La expresión se puede conseguir en cualquier célula hospedante apropiada que haya sido transformada o transfectada con un vector de expresión que contenga una molécula de ADN que codifique un polipéptido recombinante. Células hospedantes adecuadas incluyen procariotas, levaduras y células eucarióticas superiores. Preferiblemente, las células hospedantes empleadas son E. coli, levaduras o una línea de células de mamífero, tal como COS o CHO. Los sobrenadantes procedentes de sistemas de hospedante/vector adecuados, que segregan proteína recombinante o polipéptido en medios de cultivo, se pueden concentrar primeramente utilizando un filtro comercialmente disponible. Tras la concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación adecuada, tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio de iones. Finalmente, se pueden emplear una o más etapas de HPLC de fase inversa para purificar adicionalmente un polipéptido recombinante.
Porciones y otras variantes con menos de aproximadamente 100 aminoácidos, y generalmente menos de aproximadamente 50 aminoácidos, también se pueden generar por medios sintéticos, utilizando técnicas bien conocidas para los expertos ordinarios en la técnica. Por ejemplo, polipéptidos de este tipo se pueden sintetizar utilizando cualquiera de las técnicas en fase sólida comercialmente disponibles, tales como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que aminoácidos son agregados secuencialmente a una cadena de aminoácidos en crecimiento. Véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. El equipo para la síntesis automatizada de polipéptidos está comercialmente disponible de suministradores tales como Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA) y se pueden hacer funcionar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Dentro de determinadas realizaciones específicas, un polipéptido puede ser una proteína de fusión que comprende múltiples polipéptidos según se describe en esta memoria, o que comprende un polipéptido según se describe en esta memoria y un antígeno tumoral conocido, tal como una proteína de carcinoma de ovarios o una variante de una proteína de este tipo. Un participante en la fusión puede, por ejemplo, ayudar a proporcionar epítopos helper T (un participante en la fusión inmunológico), preferiblemente epítopos helper T reconocidos por seres humanos, o puede ayudar a expresar la proteína (un reforzador de la expresión) a mayores rendimientos que la proteína recombinante nativa. Determinados participantes en la fusión preferidos son participantes en la fusión tanto inmunológicos como que refuerzan la expresión. Otros participantes en la fusión se pueden seleccionar de modo que aumenten la solubilidad de la proteína o permitan que la proteína sea dirigida a diana a los compartimientos intracelulares deseados. Todavía, participantes en la fusión adicionales incluyen marcadores de afinidad, que facilitan la purificación de la proteína.
Proteínas de fusión se pueden preparar generalmente utilizando técnicas convencionales, incluida la conjugación química. Preferiblemente, una proteína de fusión se expresa en forma de una proteína recombinante, permitiendo la producción de niveles incrementados, con relación a una proteína no fusionada, de un sistema de expresión. En síntesis, secuencias de ADN que codifican los componentes del polipéptido se pueden ensamblar por separado y se pueden ligar en un vector de expresión apropiado. El extremo 3’ de la secuencia de ADN que codifica un componente del polipéptido se liga, con o sin un enlazador de péptidos, al extremo 5’ de una secuencia de ADN que codifica el segundo componente del polipéptido, de manera que los marcos de lectura de las secuencias se encuentran en fase. Esto permite la traducción en una sola proteína de fusión que conserva la actividad biológica de los dos componentes del polipéptido.
Se puede emplear una secuencia de enlazador de péptidos para separar el primero y el segundo componentes del polipéptido una distancia suficiente para asegurar que cada uno de los polipéptidos se pliegue en sus estructuras secundaria y terciaria. Una secuencia de enlazador de péptidos de este tipo se incorpora en la proteína de fusión utilizando técnicas convencionales, bien conocidas en la técnica. Secuencias de enlazador de péptidos adecuadas se pueden elegir en base a los siguientes factores: (1) su capacidad de adoptar una conformación extendida flexible;
(2) su incapacidad de adoptar una estructura secundaria que pudiera interactuar con epítopos funcionales en el primero y segundo polipéptidos; y (3) la carencia de residuos hidrófobos o cargados que pudieran reaccionar con los epítopos funcionales de los polipéptidos. Secuencias de enlazador de péptidos preferidas contienen residuos Gly, Asn y Ser. En la secuencia del enlazador también se pueden utilizar otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala. Secuencias de aminoácidos que se pueden emplear útilmente en calidad de enlazadores incluyen las descritas en Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; patente de EE.UU. nº 4.935.233 y patente de EE.UU. nº
4.751.180. La secuencia del enlazador puede tener generalmente una longitud de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos. No se requieren secuencias del enlazador cuando el primer y el segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácidos N-terminales no esenciales que se pueden utilizar para separar los dominios funcionales y prevenir una interferencia estérica.
Las secuencias de ADN ligadas están operativamente enlazadas a elementos reguladores de la transcripción o de la traducción. Los elementos reguladores responsables de la expresión de ADN están situados sólo en la posición 5’ con respecto a la secuencia de ADN que codifica los primeros polipéptidos. De manera similar, codones de detención requeridos para señales de traducción final y de terminación de la transcripción están presentes sólo en la posición 3’ con respecto a la secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido.
También se proporcionan proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de la presente invención junto con una proteína inmunogénica no relacionada. Preferiblemente, la proteína inmunogénica es capaz de educir una respuesta de rellamada. Ejemplos de proteínas de este tipo incluyen proteínas del tétano, la tuberculosis y la hepatitis (véase, por ejemplo, Stoute et al., New Engl. J. Med. 336:8691, 1997).
Dentro de realizaciones preferidas, un participante en la fusión inmunológico se deriva de proteína D, una proteína de la superficie de la bacteria Haemophilus influenza B gram-negativa (documento WO 91/18926). Preferiblemente, un derivado de proteína D comprende aproximadamente el primer tercio de la proteína (p. ej., los primeros 100-110 aminoácidos N-terminales) y se puede lipidar un derivado de proteína D. Dentro de determinadas realizaciones preferidas, los primeros 109 residuos de un participante en la fusión de lipoproteína D están incluidos en el extremo N para proveer al polipéptido de epítopos de células T exógenos adicionales y para aumentar el nivel de expresión en E. coli (funcionando así como un reforzador de la expresión). La cola del lípido asegura una presentación óptima del antígeno a células presentadoras de antígenos. Otros participantes en la fusión incluyen la proteína no estructural procedente del virus de la influenza, NS1 (hemoaglutinina). Típicamente, se utilizan los 81 aminoácidos N-terminales, a pesar de que se pueden utilizar diferentes fragmentos que incluyen epítopos helper T.
En otra realización, el participante en la fusión inmunológico es la proteína conocida como LYTA o una porción de la misma (preferiblemente una porción C-terminal). LYTA se deriva de Streptococcus pneumoniae, el cual sintetiza una N-acetilL-alanina amidasa conocida como amidasa LYTA (codificada por el gen LytA; Gene 43:265-292, 1986). LYTA es una autolisina que degrada específicamente determinados enlaces en la cadena principal del péptido glicano. El dominio C-terminal de la proteína LYTA es el responsable de la afinidad por la colina o por algunos análogos de colina, tal como DEAE. Esta propiedad ha sido explotada para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LYTA de E. coli, útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LYTA en el extremo amino (véase Biotechnology 10:795-798, 1992). Dentro de una realización preferida, se puede incorporar una porción repetida de LYTA en una proteína de fusión. Una porción repetida se encuentra en la región Cterminal que comienza en el residuo 178. Una porción repetida particularmente preferida incorpora los residuos 188-305.
En general, se aíslan polipéptidos (incluidas proteínas de fusión) y polinucleótidos según se describe en esta memoria. Un polipéptido o polinucleótido “aislado” es uno que está separado de su entorno original. Por ejemplo, una proteína que se produce en la naturaleza está aislada si está separada de alguno o de todos los materiales co-existentes en el sistema natural. Preferiblemente, polipéptidos de este tipo son al menos aproximadamente 90% puros, más preferiblemente al menos aproximadamente 95% puros y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 99% puros. Se considera que un polinucleótido está aislado si, por ejemplo, está clonado en un vector que no es parte del entorno natural.
AGENTES DE UNIÓN
La presente invención proporciona, además, agentes, tales como anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígenos, que se unen específicamente a una proteína de carcinoma de ovarios. Tal como se utiliza en esta memoria, se dice que un anticuerpo
o fragmento de unión a antígenos del mismo “se une específicamente” a una proteína de carcinoma de ovarios si reacciona a un nivel detectable (por ejemplo en un ELISA) con una proteína de carcinoma de ovarios y no reacciona de forma detectable con proteínas no relacionadas en condiciones similares. Tal como se utiliza en esta memoria, “unir” se refiere a una asociación no covalente entre dos moléculas separadas, de modo que se forma un “complejo”. La capacidad de unir se puede evaluar, por ejemplo, determinando una constante de unión para la formación del complejo. La constante de unión es el valor obtenido cuando la concentración del complejo se divide por el producto de las concentraciones de los componentes. En general, en el contexto de la presente invención se dice que dos compuestos “se unen” cuando la constante de unión para la formación del complejo excede de aproximadamente 103 L/mol. La constante de unión se puede determinar utilizando métodos bien conocidos en la técnica.
Los agentes de unión pueden ser capaces, además, de diferenciar entre pacientes con y sin un cáncer, tal como cáncer de ovarios, utilizando los ensayos representativos proporcionados en esta memoria. En otras palabras, los anticuerpos u otros agentes de unión que se unen a un antígeno de carcinoma de ovarios generarán una señal indicativa de la presencia de un cáncer en al menos aproximadamente el 20% de los pacientes con la enfermedad, y generarán una señal negativa, indicando la ausencia de la enfermedad en al menos aproximadamente el 90% de los individuos sin el cáncer. Para determinar si un agente de unión satisface este requisito, muestras biológicas (p. ej., sangre, sueros, leucoforesis, orina y/o biopsias de tumores) de pacientes con y sin un cáncer (según se determina utilizando tests clínicos convencionales) se pueden someter a ensayo según se describe en esta memoria en cuanto a la presencia de polipéptidos que se unen al agente de unión. Resultará evidente que debería ensayarse un número estadísticamente significativo de muestras con y sin la enfermedad. Cada uno de los agentes de unión debería satisfacer los criterios anteriores; sin embargo, los expertos ordinarios en la técnica reconocerán que se pueden utilizar en combinación agentes de unión para mejorar la sensibilidad.
Cualquier agente que satisfaga los requisitos anteriores puede ser un agente de unión. Por ejemplo, un agente de unión puede ser un ribosoma, con o sin un componente peptídico, una molécula de ARN o un polipéptido. En una realización preferida, un agente de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígenos del mismo. Los anticuerpos se pueden preparar por cualquiera de una diversidad de técnicas conocidas por los expertos ordinarios en la técnica. Véase, p.ej., Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, se pueden producir anticuerpos mediante técnicas de cultivo celular, incluida la generación de anticuerpos monoclonales según se describe en esta memoria, o vía transfección de genes de anticuerpos en hospedantes adecuados de células bacterianas o de mamíferos, con el fin de permitir la producción de anticuerpos recombinantes. En una técnica, un inmunógeno que comprende el polipéptido se inyecta inicialmente en cualquiera de una amplia diversidad de mamíferos (p. ej., ratones, ratas, conejos, ovejas o cabras). En esta etapa, los polipéptidos de esta invención pueden servir como el inmunógeno sin modificación. Alternativamente, en particular para polipéptidos relativamente cortos, se puede educir una respuesta inmune superior si el polipéptido está unido a una proteína vehículo, tal como albúmina de suero bovino o hemocianina de lamprea bocallave. El inmunógeno se inyecta en el hospedante animal, de preferencia de acuerdo con un programa predeterminado que incorpora una o más inmunizaciones de refuerzo y se extrae sangre de los animales periódicamente. Después, anticuerpos policlonales específicos para el polipéptido se pueden purificar a partir de antisueros de este tipo, por ejemplo mediante cromatografía de afinidad utilizando el polipéptido acoplado a un soporte sólido adecuado.
Anticuerpos monoclonales específicos para un polipéptido antigénico de interés se pueden preparar, por ejemplo, utilizando la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976 y mejoras en la misma. En síntesis, estos métodos implican la preparación de líneas de células inmortales, capaces de producir anticuerpos que tengan la especificidad deseada (es decir, una reactividad con el polipéptido de interés). Líneas celulares de este tipo se pueden producir, por ejemplo, a partir de células de bazo obtenidas de un animal inmunizado según se describe antes. Las células de bazo se inmortalizan luego, por ejemplo mediante fusión con un participante en la fusión de células de mieloma, preferiblemente uno que sea singeneico con el animal inmunizado. Se puede emplear una diversidad de técnicas de fusión. Por ejemplo, las células de bazo y las células de mieloma se pueden combinar con un detergente no iónico durante unos pocos minutos y luego se extienden en placas a una densidad baja en un medio de selección que soporta el crecimiento de células híbridas, pero no de células de mieloma. Una técnica de selección preferida utiliza la selección HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, habitualmente de aproximadamente 1 a 2 semanas, se observan colonias de híbridos. Se seleccionan colonias individuales y se testan sus sobrenadantes del cultivo en cuanto a la actividad de unión contra el polipéptido. Se prefieren hibridomas con elevadas reactividad y especificidad.
Anticuerpos monoclonales se pueden aislar a partir de los sobrenadantes de colonias de hibridoma en crecimiento. Además, se pueden emplear diversas técnicas para mejorar el rendimiento, tales como la inyección de la línea de células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un hospedante vertebrado adecuado, tal como un ratón. Luego se pueden recolectar anticuerpos monoclonales a partir del fluido ascitis o la sangre. Los contaminantes se pueden separar de los anticuerpos mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía, filtración en gel, precipitación y extracción. Los polipéptidos de esta invención se pueden utilizar en el proceso de purificación, por ejemplo en una etapa de cromatografía de afinidad.
Dentro de determinadas realizaciones, se puede preferir el uso de fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos. Fragmentos de este tipo incluyen fragmentos Fab, que se pueden preparar utilizando técnicas convencionales. En síntesis, inmunoglobulinas se pueden purificar a partir de suero de conejo mediante cromatografía de afinidad en columnas de perlas de proteína A (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) y se pueden digerir por parte de papaína para proporcionar fragmentos Fab y Fc. Los fragmentos Fab y Fc se pueden separar mediante cromatografía de afinidad en columnas de
perlas de proteína A.
Los anticuerpos monoclonales de la presente invención se pueden acoplar a uno o más agentes terapéuticos. Agentes adecuados a este respecto incluyen radionucleidos, inductores de la diferenciación, fármacos, toxinas y derivados de los mismos. Radionucleidos preferidos incluyen 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 211At y 212Bi. Fármacos preferidos incluyen metotrexato y análogos de pirimidina y purina. Inductores de la diferenciación preferidos incluyen ésteres de forbol y ácido butírico. Toxinas preferidas incluyen ricina, abrina, toxina de la difteria, toxina del cólera, gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de tipo Shigella y proteína antiviral de hierba carmín.
Un agente terapéutico se puede acoplar (p. ej., unir covalentemente) a un anticuerpo monoclonal adecuado ya sea directa o indirectamente (p. ej., a través de un grupo enlazador). Es posible una reacción directa entre un agente y un anticuerpo cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleófilo, tal como un grupo amino o sulfhidrilo, en uno de ellos puede ser capaz de reaccionar con un grupo con contenido en carboxilo, tal como un anhídrido o un haluro de ácido, o con un grupo alquilo que contiene un buen grupo lábil (p. ej., un haluro) en el otro.
Alternativamente, puede ser deseable acoplar un agente terapéutico y un anticuerpo a través de un grupo enlazador. Un grupo enlazador puede funcionar como un espaciador para separar a un anticuerpo de un agente con el fin de evitar una interferencia con las capacidades de unión. Un grupo enlazador también puede servir para aumentar la reactividad química de un sustituyente en un agente o un anticuerpo y, así, aumentar la eficacia del acoplamiento. Un aumento en la reactividad química también puede facilitar el uso de agentes, o de grupos funcionales en agentes, lo cual no sería posible de otro modo.
Resultará evidente para los expertos en la técnica que en calidad de grupo enlazador se puede emplear una diversidad de reactivos bifuncionales o polifuncionales, tanto homo-como hetero-funcionales (según se describe en el catálogo de Pierce Chemical Co., Rockford, IL). El acoplamiento se puede efectuar, por ejemplo, a través de grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo o residuos carbohidrato oxidados. Existen numerosas referencias que describen una metodología de este tipo, p. ej. patente de EE.UU. Nº 4.671.958, expedida a Rodwell et al.
En los casos en los que un agente terapéutico es más potente cuando está libre de la porción de anticuerpo de los inmunoconjugados de la presente invención, puede ser deseable utilizar un grupo enlazador que se pueda escindir durante o tras su internalización en una célula. Se han descrito un cierto número de diferentes grupos enlazadores escindibles. Los mecanismos para la liberación intracelular de un agente a partir de estos grupos enlazadores incluyen la escisión por reducción de un enlace disulfuro (p. ej. patente de EE.UU. Nº 4.489.710, expedida a Spitler), por irradiación de un enlace fotolábil (p. ej. patente de EE.UU. Nº 4.625.014, expedida a Senter et al.), por hidrólisis de cadenas laterales de aminoácidos derivatizadas (p. ej. patente de EE.UU. Nº 4.638.045, expedida a Kohn et al.), por hidrólisis mediada por complemento de suero (p. ej. patente de EE.UU. Nº 4.671.958, expedida a Rodwell et al.) e hidrólisis catalizada por ácidos (p. ej. patente de EE.UU. Nº 4.569.789, expedida a Blattler et al.).
Puede ser deseable acoplar más de un agente a un anticuerpo. En una realización, múltiples moléculas de un agente se acoplan a una molécula de un anticuerpo. En otras realizaciones, más de un tipo de agente se puede acoplar a un anticuerpo. Independientemente de la realización particular, inmunoconjugados con más de un agente se pueden preparar de una diversidad de maneras. Por ejemplo, más de un agente se puede acoplar directamente a una molécula de anticuerpo, o se pueden utilizar enlazadores que proporcionan múltiples sitios para la fijación. Alternativamente, se puede utilizar un vehículo.
Un vehículo puede portar los agentes de una diversidad de maneras, incluida la unión covalente ya sea directamente o a través de un grupo enlazador. Vehículos adecuados incluyen proteínas tales como albúminas (p. ej. patente de EE.UU. Nº 4.507.234, expedida a Kato et al.), péptidos y polisacáridos tales como aminodextrano
(p. ej. patente de EE.UU. Nº 4.699.784, expedida a Shih et al.). Un vehículo también puede portar un agente mediante unión no covalente o mediante encapsulación, tal como dentro de una vesícula de liposoma (p. ej. patentes de EE.UU. Nºs 4.429.008 y 4.873.088). Vehículos específicos para agentes radionucleidos incluyen pequeñas moléculas radiohalogenadas y compuestos quelantes. Por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 4.735.792 describe pequeñas moléculas radiohalogenadas representativas y sus síntesis. Un quelato de radionucleido se puede formar a partir de compuestos quelantes que incluyen aquellos que contienen átomos de nitrógeno y azufre en calidad de átomos donantes para unir el radionucleido de metal u óxido de metal. Por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 4.673.562, expedida a Davison et al., describe compuestos quelantes representativos y sus síntesis.
Se puede utilizar una diversidad de vías de administración para los anticuerpos y los inmunoconjugados. Típicamente, la administración será intravenosa, intramuscular, subcutánea o en el lecho de un tumor reseccionado. Resultará evidente que la dosis precisa de anticuerpo/inmunoconjugado variará en función del anticuerpo utilizado, de la densidad de antígenos en el tumor y de la tasa de aclaramiento del anticuerpo.
También se proporcionan en esta memoria anticuerpos anti-idiotípicos que mimetizan una porción inmunogénica de una proteína de carcinoma de ovarios. Anticuerpos de este tipo se pueden dirigir contra un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo, que se une específicamente a una porción inmunogénica de una proteína de carcinoma de ovarios, utilizando técnicas bien conocidas. Anticuerpos antiidiotípicos que mimetizan una porción inmunogénica de una proteína de carcinoma de ovarios son los anticuerpos que se unen a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a una porción inmunogénica de una proteína de carcinoma de ovarios, según se describe en esta memoria.
CÉLULAS T
Composiciones inmunoterapéuticas también, o alternativamente, pueden comprender células T específicas para una proteína de carcinoma de ovarios. Células de este tipo se pueden preparar, generalmente, in vitro o ex vivo, utilizando procesos convencionales. Por ejemplo, las células T se pueden presentar dentro de (o aisladas a partir de) la médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica de un mamífero, tal como un paciente, utilizando un sistema de separación de células comercialmente disponible, tal como el sistema CEPRATE™, disponible de CellPro Inc., Bothell WA (véase también la patente de EE.UU. Nº 5.240.856; la patente de EE.UU. Nº 5.215.926; documentos WO 89/06280; WO 91/16116 y WO 92/07243). Alternativamente, las células T se pueden derivar de líneas o cultivos de células de seres humanos y de animales no humanos, relacionados o no relacionados.
Las células T se pueden estimular con un polipéptido de carcinoma de ovarios, polinucleótido que codifica un polipéptido de carcinoma de ovarios y/o una célula presentadora de antígenos (APC) que expresa un polipéptido de este tipo. Una estimulación de este tipo se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la generación de células T que son específicas para el polipéptido. Preferiblemente, un polipéptido o polinucleótido de carcinoma de ovarios está presente dentro de un vehículo de suministro, tal como una microesfera, para facilitar la generación de células T específicas.
Se considera que las células T son específicas para un polipéptido de carcinoma de ovarios si las células T exterminan a células diana revestidas con un polipéptido de carcinoma de ovarios o expresan un gen que codifica un polipéptido de este tipo. La especificidad de las células T se puede evaluar utilizando cualquiera de una diversidad de técnicas convencionales. Por ejemplo, dentro de un ensayo de liberación de cromo o un ensayo de proliferación, un índice de estimulación de más del incremento doble en la lisis y/o proliferación, comparado con controles negativos, indica una especificidad de las células T. Ensayos de este tipo se pueden realizar, por ejemplo, según se describe en Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994. Alternativamente, la detección de la proliferación de células T se puede conseguir mediante una diversidad de técnicas conocidas. Por ejemplo, la proliferación de células T se puede detectar midiendo una tasa incrementada de síntesis de ADN (p. ej., mediante marcaje por impulsos de cultivos de células T con timidina tritiada y midiendo la cantidad de timidina tritiada incorporada en el ADN). El contacto con un polipéptido de carcinoma de ovarios (200 ng/ml -100 �g/ml, preferiblemente 100 ng/ml -25 �g/ml) durante 3 – 7 días debería dar como resultado al menos un incremento doble en la proliferación de células T, y/o un contacto según se describe antes durante 2-3 horas debería dar como resultado una activación de las células T, según se mide utilizando ensayos convencionales de citoquina en los que un incremento doble en el nivel de liberación de citoquina (p. ej., TNF o IFN-�) es indicativo de la activación de células T (véase Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1998)). Células T que han sido activadas en respuesta a un polipéptido de carcinoma de ovarios, polinucleótido o APC que expresa un polipéptido de carcinoma de ovarios pueden ser CD4+ y/o CD8+. Células T específicas para un polipéptido de carcinoma de ovarios se pueden expandir utilizando técnicas convencionales. Dentro de realizaciones preferidas, las células T se derivan de un paciente o de un donante relacionado o no relacionado y se administran al paciente tras la estimulación y expansión.
Para fines terapéuticos, las células T CD4+ o CD8+ que proliferan en respuesta a un polipéptido de carcinoma de ovarios, polinucleótido o APC se pueden expandir en número ya sea in vitro o in vivo. La proliferación de células T de este tipo se puede conseguir de una diversidad de maneras. Por ejemplo, las células T se pueden re-exponer a un polipéptido de carcinoma de ovarios, con o sin la adición de factores de crecimiento de células T, tales como interleuquina-2 y/o células estimuladoras que sintetizan un polipéptido de carcinoma de ovarios. Alternativamente, una o más células T que proliferan en presencia de un polipéptido de carcinoma de ovarios se pueden expandir en número mediante clonación. Métodos para clonar células son bien conocidos en la técnica e incluyen dilución limitante. Tras la expansión, las células se pueden volver a administrar al paciente según se describe, por ejemplo, por Chang et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 22:213, 1996.
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y VACUNAS
Dentro de determinados aspectos, polipéptidos, polinucleótidos, agentes de unión y/o células del sistema inmune según se describen en esta memoria se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas o vacunas. Las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más de estos compuestos o células y un soporte fisiológicamente aceptable. Las vacunas pueden comprender uno o más de estos compuestos o células y un reforzador de la respuesta inmune no específico. Un reforzador de la respuesta inmune, no específico, puede ser cualquier sustancia que refuerce una respuesta inmune a un antígeno exógeno. Ejemplos de reforzadores de la respuesta inmune, no específicos, incluyen adyuvantes, microesferas biodegradables (p. ej., galactida poliláctica) y liposomas (en los cuales se incorpora el compuesto; véase, p. ej., Fullerton, patente de EE.UU. Nº 4.235.877). La preparación de vacuna se describe en general, por ejemplo, en M.F. Powell y M.J. Newman, compiladores, “Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)”, Plenum Press (NY, 1995). Composiciones farmacéuticas y vacunas dentro del alcance de la presente invención también pueden contener otros compuestos que pueden ser biológicamente activos o inactivos. Por ejemplo, pueden estar presentes una o más porciones inmunogénicas de otros antígenos tumorales, ya sea incorporadas en un polipéptido de fusión o como un compuesto separado dentro de la composición o vacuna.
Una composición farmacéutica o vacuna puede contener ADN que codifica uno
o más polipéptidos según se describe antes, de manera que el polipéptido se genera in situ. Como se ha señalado antes, el ADN puede estar presente dentro de cualquiera de una diversidad de sistemas de suministro conocidos por los expertos ordinarios en la técnica, incluidos sistemas de expresión de ácidos nucleicos, sistemas de expresión de bacterias y virales. Sistemas de expresión de ácidos nucleicos apropiados contienen las secuencias de ADN necesarias para la expresión en un paciente (tal como una señal de promotor y de terminación adecuada). Sistemas de suministro bacterianos implican la administración de una bacteria (tal como Bacillus-Calmette-Guerrin) que expresa una porción inmunogénica del polipéptido sobre su superficie de la célula. En una realización preferida, el ADN se puede introducir utilizando un sistema de expresión viral (p. ej., virus vacuna u otro virus de erupciones pustulosas, retrovirus o adenovirus), que puede implicar el uso de un virus competente en la replicación, no patógeno (defectuoso). Sistemas adecuados se describen, por ejemplo, en Fisher-Hoch et al., PNAS 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990; patentes de EE.UU. Nºs 4.603.112, 4.769.330 y 5.017.487; documento WO 89/01973; patente de EE.UU. Nº 4.777.127; GB 2.200.651; EP 0.345.242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991; Kolls et al., PNAS 91:215219, 1994; Kass-Eisler et al., PNAS 90:11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993; y Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993. Técnicas para incorporar ADN en sistemas de expresión de este tipo son bien conocidas por los expertos ordinarios en la técnica. El ADN también puede estar “desnudo” según se describe, por ejemplo, en Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 y revisado por Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. La absorción de ADN desnudo se puede incrementar revistiendo el ADN sobre perlas biodegradables que son eficazmente transportadas a las células.
Mientras que en las composiciones farmacéuticas de esta invención se puede emplear cualquier soporte adecuado conocido por los expertos ordinarios en la técnica, el tipo de soporte variará dependiendo del modo de administración. Composiciones de la presente invención se pueden formular para cualquier manera apropiada de administración, incluida, por ejemplo, la administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, subcutánea o intramuscular. Para la administración parenteral, tal como la inyección subcutánea, el soporte comprende preferiblemente agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para la administración oral, se puede emplear cualquiera de los soportes anteriores o un soporte sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. También se pueden emplear como soportes para la composición farmacéutica de esta invención microesferas biodegradables (p. ej., polilactato, poliglicolato). Microesferas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. Nºs
4.897.268 y 5.075.109.
Composiciones de este tipo también pueden comprender tampones (p. ej., solución salina tamponada neutra o solución salina tamponada con fosfato), hidratos de carbono (p. ej., glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos, tales como glicina, antioxidantes, agentes quelantes, tales como EDTA o glutation, adyuvantes (p. ej., hidróxido de aluminio) y/o conservantes. Alternativamente, las composiciones de la presente invención se pueden formular como un liofilizado. Los compuestos también se pueden encapsular dentro de liposomas utilizando una tecnología bien conocida.
En las vacunas de esta invención se puede emplear cualquiera de una diversidad de reforzadores de la respuesta inmune. Por ejemplo, puede incluirse un adyuvante. La mayoría de los adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger al antígeno de un rápido catabolismo, tal como hidróxido de aluminio o un aceite mineral, y un estimulador de las respuestas inmunes, tal como lípido A, proteínas derivadas de Bortadella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Adyuvantes adecuados están comercialmente disponibles, por ejemplo, en forma de Adyuvante Incompleto y Adyuvante Completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI), Adyuvante Merck 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ), alum, microesferas biodegradables, monofosforil lípido A y quil A. También se pueden utilizar como adyuvantes citoquinas, tales como GM-CSF o interleuquina-2, -7 ó -12.
Dentro de las vacunas proporcionadas en esta memoria, la composición adyuvante se diseña preferiblemente para que induzca una respuesta inmune, predominantemente del tipo Th1. Niveles elevados de citoquinas del tipo Th1 (p. ej., IFN-�, IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducción de las respuestas inmunes mediadas por células a un antígeno administrado. En contraposición, niveles elevados de citoquinas del tipo Th2 (p. ej., IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y TNF-�) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales. Tras la aplicación de una vacuna según se proporciona en esta memoria, un paciente soportará una respuesta inmune que incluye respuestas de tipo Th1 y Th2. Dentro de una realización preferida, en la que una respuesta es predominantemente del tipo Th1, el nivel de citoquinas del tipo Th1 aumentará a una mayor medida que el nivel de citoquinas del tipo Th2. Los niveles de estas citoquinas se pueden evaluar fácilmente utilizando ensayos convencionales. Para una revisión de las familias de citoquinas, véase Mosmann y Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7;145-173, 1989.
Adyuvantes preferidos para uso en educir una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferiblemente monfosforil lípido A 3-de-O-acilado (3D-MPL), junto con una sal de aluminio. Adyuvantes MPL están disponibles de Ribi ImmunoChem Research Inc, (Hamilton, MT; véanse las patentes de EE.UU. Nºs 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y 4.912.094). También se prefiere AS-2 (SmithKline Beecham). Oligonucleótidos con contenido en CpG (en los que el dinucleótido CpG no está metilado) también inducen una respuesta predominantemente de Th1. Oligonucleótidos de este tipo son bien conocidos y se describen, por ejemplo, en el documento WO 96/02555. Otro adyuvante preferido es una saponina, preferiblemente QS21, que se puede utilizar sola o en combinación con otros adyuvantes. Por ejemplo, un sistema mejorado implica la combinación de un derivado de monfosforil lípido A y saponina, tal como la combinación de QS21 y 3D-MPL, según se describe en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica, en la que la QS21 se enfría bruscamente con colesterol, según se describe en el documento 96/33739. Otras formulaciones preferidas comprenden una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Una formulación de adyuvante, particularmente potente, que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210. Se puede utilizar cualquier vacuna proporcionada en esta memoria utilizando métodos bien conocidos que dan como resultado una combinación de antígeno, reforzador de la respuesta inmune y un soporte o excipiente adecuado.
Las composiciones descritas en esta memoria se pueden administrar como parte de una formulación de liberación retardada (es decir, una formulación tal como una cápsula o esponja que efectúa una lenta liberación de compuesto tras su administración). Formulaciones de este tipo se pueden preparar generalmente utilizando una tecnología bien conocida y se administran, por ejemplo, por implantación oral, rectal o subcutánea, o por implantación en el sitio diana deseado. Formulaciones de liberación retardada pueden contener un polipéptido, polinucleótido
o anticuerpo dispersado en una matriz de soporte y/o contenido en un depósito rodeado por una membrana controladora de la velocidad. Soportes para uso en este tipo de formulaciones son biocompatibles y también pueden ser biodegradables; preferiblemente, la formulación proporciona un nivel de liberación del componente activo relativamente constante. La cantidad de compuesto activo contenido en una formulación de liberación retardada depende del sitio de la implantación, la velocidad y la duración esperada de la liberación y de la naturaleza del estado a tratar o prevenir.
En las composiciones farmacéuticas y vacunas se puede emplear cualquiera de una diversidad de vehículos de suministro para facilitar la producción de una respuesta inmune específica para el antígeno que fija como objetivo células tumorales. Vehículos de suministro incluyen células presentadoras de antígenos (APCs), tales como células dendríticas, macrófagos, células B, monocitos y otras células que puedan ser tratadas mediante ingeniería para que sean APCs eficaces. Células de este tipo pueden, pero no tienen que ser modificadas genéticamente para aumentar la capacidad de presentar el antígeno, para mejorar la activación y/o mantener la respuesta de células T, para tener efectos anti-timorales per se y/o para ser inmunológicamente compatibles con el receptor (es decir, haplotipo HLA apareado). Las APCs pueden aislarse generalmente de cualquiera de una diversidad de fluidos biológicos y órganos, incluidos tejidos tumorales y peritumorales, y pueden ser células autólogas, alogénicas, singeneicas o xenogeneicas.
Determinadas realizaciones preferidas de la presente invención usan células dendríticas o progenitores de las mismas en calidad de células presentadoras de antígenos. Células dendríticas son APCs altamente potentes (Banchereau y Steinman, Nature 392:245-251, 1998) y han demostrado ser eficaces como un adyuvante fisiológico para educir una inmunidad antitumoral profiláctica o terapéutica (véase Timmerman y Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529, 1999). En general, las células dendríticas pueden ser identificadas en base a su forma típica (estrellada in situ, con acusados procesos citoplásmicos (dendritas) visibles in vitro) y en base a la falta de marcadores de diferenciación de células B (CD19 y CD20), células T (CD3), monocitos (CD14) y células exterminadoras naturales (CD56), según se determina utilizando ensayos convencionales. Naturalmente, las células dendríticas pueden ser tratadas por ingeniería para que expresen receptores específicos en la superficie de la célula o ligandos que no se encuentran comúnmente en células dendríticas in vivo o ex vivo,y células dendríticas modificadas de este tipo están contempladas por la presente invención. Como una alternativa a las células dendríticas, células dendríticas cargadas con antígeno de vesículas secretadas (denominadas exosomas) pueden utilizarse en una vacuna (véase Zitvogel et al., Nature Med. 4: 594-600, 1998).
Células dendríticas y progenitores se pueden obtener a partir de sangre periférica, médula ósea, células infiltrantes de tumores, células infiltrantes de tejidos peritumorales, nódulos linfáticos, bazo, piel, sangre del cordón umbilical o cualquier otro tejido o fluido adecuado. Por ejemplo, las células dendríticas se pueden diferenciar ex vivo añadiendo una combinación de citoquinas, tales como GM-CSF, IL4, IL-3 y/o TNF� a cultivos de monocitos recolectados de la sangre periférica. Alternativamente, células CD34 positivas recolectadas de la sangre periférica, la sangre del cordón umbilical o la médula ósea se pueden diferenciar en células dendríticas, añadiendo al medio de cultivo combinaciones de GM-CSF, IL-3, TNF�, ligando de CD40, LPS, ligando ft3 y/u otro u otros compuestos que inducen la
maduración y proliferación de células dendríticas.
Las células dendríticas se clasifican convenientemente como células “inmaduras” y “maduras”, lo que permite discriminar de un modo fácil entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, esta nomenclatura no debería limitarse para que excluyera todas las etapas de diferenciación intermedias posibles. Células dendríticas inmaduras se caracterizan como una APC con una alta capacidad de la absorción y tratamiento de antígenos, lo cual se correlaciona con la elevada expresión del receptor Fcy, receptor de manosa y marcador DEC-205. El fenotipo maduro se caracteriza típicamente por una menor expresión de estos marcadores, pero por una elevada expresión de moléculas de la superficie de la célula, responsables de la activación de células T, tales como MHC de clase I y de clase II, moléculas de adhesión (p. ej., CD54 y CD11) y moléculas co-estimuladoras (p. ej., CD40, CD80 y CD86).
Las APCs se pueden generalmente transfectar con un polinucleótido que codifica un antígeno de carcinoma de ovarios (o porción u otra variante del mismo), de manera que el antígeno o una porción inmunogénica del mismo se expresa sobre la superficie de la célula. Una transfección de este tipo puede tener lugar ex vivo,y después una composición o vacuna que comprende células transfectadas de este tipo se puede utilizar para fines terapéuticos, según se describe en esta memoria. Alternativamente, se puede administrar a un paciente un vehículo de suministro de genes que fija como objetivo una célula dendrítica u otra célula presentadora de antígenos, dando como resultado una transfección que se produce in vivo. La transfección in vivo y ex vivo de células dendríticas puede realizarse, por ejemplo, generalmente utilizando cualesquiera métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en el documento WO 97/24447, o el planteamiento de la pistola de genes descrito por Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75:456-460, 1997. La carga con antígenos de células dendríticas se puede conseguir incubando células dendríticas o células progenitoras con el polipéptido, ADN (desnudo o en el interior de un vector de plásmido) o ARN; o con una bacteria recombinante o virus que expresan el antígeno
(p. ej., vectores de vacuna, de la viruela aviar, de adenovirus o de lentivirus). Antes de la carga, el polipéptido se puede conjugar covalentemente a un participante inmunológico que proporciona una ayuda a células T (p. ej., una molécula soporte). Alternativamente, una célula dendrítica se puede pulsar con un participante inmunológico no conjugado, por separado o en presencia del polipéptido.
TERAPIA DEL CÁNCER
En aspectos adicionales de la presente invención, las composiciones descritas en esta memoria se pueden utilizar para la inmunoterapia del cáncer, tal como cáncer de ovarios. Dentro de este tipo de métodos, las composiciones farmacéuticas y las vacunas se administran típicamente a un paciente. Tal como se utiliza en esta memoria, un “paciente” se refiere a cualquier animal de sangre caliente, preferiblemente un ser humano. Un paciente puede estar o no afectado de cáncer. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas y vacunas anteriores se pueden utilizar para prevenir el desarrollo de un cáncer o para tratar un paciente afectado de un cáncer. Dentro de determinadas realizaciones preferidas, un paciente está afectado de cáncer de ovarios. Un cáncer de este tipo se puede diagnosticar utilizando criterios generalmente aceptados en la técnica, incluida la presencia de un tumor maligno. Composiciones farmacéuticas y vacunas se pueden administrar antes o tras la extirpación quirúrgica de tumores primarios y/o el tratamiento, tal como la administración de radioterapia o fármacos quimioterapéuticos convencionales.
Dentro de determinadas realizaciones, la inmunoterapia puede ser una inmunoterapia activa, en la que el tratamiento se basa en la estimulación in vivo del sistema inmune endógeno del hospedante para reaccionar contra tumores con la administración de agentes modificadores de la respuesta inmune (tales como vacunas contra tumores, adyuvantes bacterianos y/o citoquinas).
Dentro de otras realizaciones, la inmunoterapia puede ser una inmunoterapia pasiva, en la que el tratamiento implica el suministro de agentes con una reactividad inmune al tumor establecida (tales como células efectoras o anticuerpos) que pueden mediar, directa o indirectamente, en los efectos antitumorales y que no depende necesariamente de un sistema inmune intacto del hospedante. Ejemplos de células efectoras incluyen linfocitos T (tales como linfocitos T CD8+ citotóxicos y linfocitos infiltrantes de tumores T CD4+ helper), células asesinas (tales como células Asesinas Naturales y células asesinas activadas por linfocina), células B y células presentadoras de antígenos (tales como células dendríticas y macrófagos) que expresan un polipéptido proporcionadas en esta memoria. Receptores de células T y receptores de anticuerpos específicos para los polipéptidos enumerados en esta memoria se pueden clonar, expresar y transferir a otros vectores o células efectoras para una inmunoterapia adoptiva. Los polipéptidos proporcionados en esta memoria también se pueden utilizar para generar anticuerpos o anticuerpos anti-idiotípicos (según se describe antes y en la patente de EE.UU. Nº 4.918.164) para la
inmunoterapia pasiva.
Células efectoras se pueden obtener, generalmente, en cantidades suficientes para la inmunoterapia adoptiva mediante desarrollo in vitro, según se describe en esta memoria. En la técnica son bien conocidas las condiciones del cultivo para expandir células efectoras específicas para antígenos sencillos a varios billones en número con la retención del reconocimiento de antígenos in vivo. Condiciones de cultivo in vitro de este tipo utilizan típicamente una estimulación intermitente con antígeno, a menudo en presencia de citoquinas (tal como IL-2) y células cebadoras no divisoras. Como se ha señalado antes, los polipéptidos inmunorreactivos, según se proporcionan en esta memoria, se pueden utilizar para expandir rápidamente cultivos de células T específicos para antígenos con el fin de generar un número suficiente de células para la inmunoterapia. En particular, células presentadoras de antígenos, tales como células dendríticas, macrófagos o células B, se pueden pulsar con polipéptidos inmunorreactivos o se pueden transfectar con uno o más polinucleótidos utilizando técnicas convencionales bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, células presentadoras de antígenos se pueden transfectar con un polinucleótido que tiene un promotor apropiado para aumentar la expresión en un virus recombinante u otro sistema de expresión. Células efectoras cultivadas para uso en terapia deben ser capaces de crecer y distribuirse ampliamente y de sobrevivir durante largo tiempo en un número sustancial mediante estimulación repetida con antígeno suplementado con IL-2 (véase, por ejemplo, Cheever et al., Immunological Reviews 157:177, 1997).
Alternativamente, un vector que expresa un polipéptido enumerado en esta memoria se puede introducir en células madre tomadas de un paciente y se puede propagar por clonación in vitro por trasplante autólogo de nuevo en el mismo paciente.
Vías y frecuencia de administración, así como la dosificación, variarán de un individuo a otro y se pueden establecer fácilmente utilizando técnicas convencionales. En general, las composiciones farmacéuticas y las vacunas se pueden administrar mediante inyección (p. ej., intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), por vía intranasal (p. ej., mediante aspiración), por vía oral o en el lecho de un tumor reseccionado. Preferiblemente, entre 1 y 10 dosis se pueden administrar a lo largo de un periodo de 52 semanas. Preferiblemente, se administran 6 dosis a intervalos de 1 mes, y después de ello se pueden administrar periódicamente vacunaciones de refuerzo. Para pacientes individuales pueden ser apropiados protocolos alternativos. Una dosis adecuada es una cantidad de un compuesto que, cuando se administra según se describe antes, es capaz de fomentar una respuesta inmune anti-tumoral, y se encuentra al menos un 10-15% por encima del nivel basal (es decir, no tratado). Una respuesta de este tipo se puede vigilar midiendo los anticuerpos anti-tumorales en un paciente o mediante generación, dependiente de la vacuna, de células efectoras citolíticas, capaces de asesinar a las células tumorales del paciente in vitro. Vacunas de este tipo también deberían ser capaces de provocar una respuesta inmune que conduzca a un resultado clínico mejorado (p. ej., remisiones más frecuentes, supervivencia completa o parcial o exenta de enfermedades durante más tiempo) en pacientes vacunados en comparación con pacientes no vacunados. En general, para composiciones farmacéuticas y vacunas que comprenden uno o más polipéptidos, la cantidad de cada uno de los polipéptidos presentes en intervalos de dosis oscilantes entre aproximadamente 100 �g y 5 mg por kg de hospedante. Cantidades de dosis adecuadas variarán con el tamaño del paciente, pero típicamente oscilarán entre aproximadamente 0,1 mL y aproximadamente 5 mL.
En general, una dosificación y un régimen de tratamiento apropiados proporcionan el o los compuestos activos en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico y/o profiláctico. Una respuesta de este tipo se puede vigilar estableciendo un resultado clínico mejorado (p. ej., remisiones más frecuentes, supervivencia completa o parcial o exenta de enfermedades durante más tiempo) en pacientes tratados en comparación con pacientes no tratados. Incrementos en respuestas inmunes preexistentes a un antígeno de carcinoma de ovarios se correlacionan generalmente con un resultado clínico mejorado. Respuestas inmunes de este tipo se pueden evaluar generalmente utilizando ensayos de proliferación convencional, citotoxicidad o de citoquina, que se pueden realizar utilizando muestras obtenidas de un paciente antes y después del tratamiento.
RASTREOS PARA IDENTIFICAR ANTÍGENOS DE CARCINOMA DE OVARIOS SECRETADOS
La presente invención proporciona métodos para identificar antígenos tumorales secretados. Dentro de este tipo de métodos, se implantan tumores en animales inmunodeficientes, tales como ratones SCID, y se mantienen durante un tiempo suficiente para permitir la secreción de antígenos tumorales en el suero. En general, los tumores se pueden implantar por vía subcutánea o en el interior de la almohadilla grasa gonadal de un animal inmunodeficiente y se mantienen durante 1-9 meses, de preferencia 1-4 meses. La implantación se puede efectuar generalmente según se describe en el documento WO 97/18300. El suero que contiene antígenos secretados se utiliza luego para preparar antisueros en ratones inmunocompetentes, utilizando técnicas convencionales y según se describe en esta memoria. En síntesis, 50-100 �L de sueros (agrupados de tres conjuntos de ratones inmunodeficientes, portando cada conjunto un tumor de ovarios humano derivado de SCID diferente) se pueden mezclar en la relación 1:1 (vol:vol) con un adyuvante apropiado, tal como RIBIMPL o MPL + TDM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y se inyectan por vía intraperitoneal en animales inmunocompetentes singeneicos a intervalos mensuales durante un total de 5 meses. Antisueros de animales inmunizados de tal manera se pueden obtener extrayendo sangre después de la tercera, cuarta y quinta inmunizaciones. El antisuero resultante se pre-aclara generalmente de antígenos de E. coli y de fagos y se utiliza (generalmente después de dilución, tal como en la relación 1:200) en un rastreo de expresión serológico.
La genoteca es típicamente una genoteca de expresión que contiene ADNcs procedentes de uno o más tumores del tipo que fue implantado en ratones SCID. Esta genoteca de expresión se puede preparar en cualquier vector adecuado, tal como �screen (Novagen). ADNcs que codifican un polipéptido que reacciona con el antisuero se pueden identificar utilizando técnicas convencionales, y se pueden secuenciar. Moléculas de ADNc de este tipo se pueden caracterizar adicionalmente para evaluar la expresión en tejidos tumoral y normal y para evaluar la secreción de antígenos en pacientes.
Los métodos proporcionados en esta memoria tienen ventajas frente a otros métodos para el descubrimiento de antígenos tumorales. En particular, todos los antígenos identificados por este tipo de métodos deberían ser secretados o liberados a través de necrosis de las células tumorales. Antígenos de este tipo se pueden presentar sobre la superficie de células tumorales durante un tiempo suficiente para permitir la fijación como objetivo y la exterminación por parte del sistema inmune después de la vacunación.
MÉTODOS PARA DETECTAR CÁNCER
En general, un cáncer se puede detectar en un paciente en base a la presencia de una o más proteínas de carcinoma de ovarios y/o polinucleótidos que codifican tales proteínas en una muestra biológica (tal como sangre, sueros, orina y/o biopsias de tumores) obtenida del paciente. En otras palabras, proteínas de este tipo se pueden utilizar como marcadores para indicar la presencia o ausencia de un cáncer, tal como cáncer de ovarios. Además, proteínas de este tipo pueden ser útiles para la detección de otros cánceres. Los agentes de unión proporcionados en esta memoria permiten generalmente la detección del nivel de proteína que se une al agente en la muestra biológica. Se pueden utilizar cebadores y sondas de polinucleótidos para detectar el nivel de ARNm que codifica una proteína tumoral, que también es indicativa de la presencia o ausencia de un cáncer. En general, una secuencia asociada a un carcinoma de ovarios debería estar presente a un nivel que es al menos tres veces superior en el tejido tumoral que en el tejido normal.
Existe una diversidad de formatos de ensayo conocidos por los expertos ordinarios en la técnica para utilizar un agente de unión para detectar marcadores de polipéptidos en una muestra. Véase, p. ej., Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, la presencia o ausencia de un cáncer en un paciente se puede determinar (a) poniendo en contacto una muestra biológica obtenida de un paciente con un agente de unión; (b) detectando en la muestra un nivel de polipéptido que se une al agente de unión; y (c) comparando el nivel de polipéptido con un valor de corte predeterminado.
En una realización preferida, el ensayo implica el uso de un agente de unión inmovilizado sobre un soporte sólido para unirse a y separar el polipéptido del resto de la muestra. El polipéptido unido se puede detectar luego utilizando un reactivo de detección que contiene un grupo informador y se une específicamente al complejo de agente de unión/polipéptido. Reactivos de detección de este tipo pueden comprender, por ejemplo, un agente de unión que se une específicamente al polipéptido o un anticuerpo u otro agente que se une específicamente al agente de unión, tal como una anti-inmunoglobulina, proteína G, proteína A o una lectina. Alternativamente, se puede utilizar un ensayo competitivo en el cual un polipéptido se marca con un grupo informador y se deja que se una al agente de unión inmovilizado tras la incubación del agente de unión con la muestra. El grado al que los componentes de la muestra inhiben la unión del polipéptido marcado al agente de unión es indicativo de la reactividad de la muestra con el agente de unión inmovilizado. Polipéptidos adecuados para uso en ensayos de este tipo incluyen proteínas de carcinoma de ovarios de longitud completa y porciones de las mismas a las que se une el agente de unión, según se describe antes.
El soporte sólido puede ser cualquier material conocido por los expertos ordinarios en la técnica al que se puede fijar la proteína tumoral. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser un pocillo de ensayo en una placa de microtitulación o una membrana de nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Alternativamente, el soporte puede ser una perla o disco, tal como vidrio, fibra de vidrio, látex, o un material plástico, tal como poliestireno o poli(cloruro de vinilo). El soporte también puede ser una partícula magnética o un sensor de fibra óptica, tales como los descritos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. Nº 5.359.681. El agente de unión puede ser inmovilizado sobre el soporte sólido utilizando una diversidad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica, que se describen ampliamente en la bibliografía de patentes y científica. En el contexto de la presente invención, el término “inmovilización” se refiere tanto a una asociación no covalente, tal como adsorción, como a la fijación covalente (que puede ser un enlace directo entre el agente y grupos funcionales en el soporte, o puede ser un enlace por medio de un agente reticulante). Se prefiere la inmovilización por adsorción a un pocillo de una placa de microtitulación
o a una membrana. En tales casos, la adsorción se puede conseguir poniendo en contacto el agente de unión, en un tampón adecuado, con el soporte sólido durante un tiempo adecuado. El tiempo de contacto varía con la temperatura, pero típicamente se encuentra entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 1 día. En general, la puesta en contacto de un pocillo de una placa de microtitulación de plástico (tal como poliestireno o poli(cloruro de vinilo) con una cantidad de agente de unión que oscila entre aproximadamente 10 ng y aproximadamente 10 �g, y preferiblemente entre aproximadamente 100 ng y aproximadamente 1 �g, es suficiente para inmovilizar una cantidad adecuada de agente de unión.
La fijación covalente del agente de unión a un soporte sólido se puede conseguir generalmente haciendo reaccionar primero el soporte con un reactivo bifuncional que reaccionará tanto con el soporte como con un grupo funcional, tal como un grupo hidroxilo o amino, en el agente de unión. Por ejemplo, el agente de unión puede ser fijado covalentemente a soportes que tienen un revestimiento polímero apropiado utilizando benzoquinona o por condensación de un grupo aldehído sobre el soporte con una amina y un hidrógeno activo sobre el participante en la unión (véase, p. ej., Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, en A12-A13).
En determinadas realizaciones, el ensayo es un ensayo con dos anticuerpos en sándwich. Este ensayo se puede llevar a cabo poniendo primero en contacto un anticuerpo que ha sido inmovilizado sobre un soporte sólido, habitualmente el pocillo de una placa de microtitulación, con la muestra, de manera que se deja que polipéptidos dentro de la muestra se unan al anticuerpo inmovilizado. Después, la muestra no unida se separa de los complejos inmovilizados de polipéptido-anticuerpo y se añade un reactivo de detección (preferiblemente un segundo anticuerpo capaz de unirse a un sitio diferente en el polipéptido) que contiene un grupo informador. Luego se determina la cantidad de reactivo de detección que permanece unida al soporte sólido, utilizando un método apropiado para el grupo informador específico.
Más específicamente, una vez que el anticuerpo está inmovilizado sobre el soporte según se ha descrito antes, se bloquean típicamente los sitios de unión restantes de la proteína sobre el soporte. Se puede utilizar cualquier agente de bloqueo adecuado conocido por los expertos ordinarios en la técnica, tal como albúmina de suero bovino o Tween 20™ (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO). El anticuerpo inmovilizado se incuba después con la muestra y se deja que el polipéptido se una al anticuerpo. La muestra se puede diluir con un diluyente adecuado, tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS – siglas en inglés) antes de la incubación. En general, un tiempo de contacto (es decir, tiempo de incubación) apropiado es un periodo de tiempo que es suficiente para detectar la presencia del polipéptido en una muestra obtenida de un individuo con cáncer de ovarios. Preferiblemente, el tiempo de contacto es suficiente para conseguir un nivel de unión que sea al menos el 95% del conseguido en equilibrio entre polipéptido unido y no unido. Los expertos ordinarios en la técnica reconocerán que el tiempo necesario para conseguir el equilibrio se puede determinar fácilmente sometiendo a ensayo el nivel de unión que se produce a lo largo de un periodo de tiempo. A la temperatura ambiente, es generalmente suficiente un tiempo de incubación de aproximadamente 30 minutos.
Después, la muestra no unida se puede separar lavando el soporte sólido con un tampón apropiado, tal como PBS que contiene Tween 20™ al 0,1%. El segundo anticuerpo, que contiene un grupo informador, se puede añadir después al soporte sólido. Grupos informadores preferidos incluyen los grupos enumerados antes.
Luego, el reactivo de detección se incuba con el complejo anticuerpopolipéptido inmovilizado durante un tiempo suficiente para detectar el polipéptido unido. Una cantidad apropiada de tiempo se puede determinar generalmente sometiendo a ensayo el nivel de unión que se produce a lo largo de un periodo de tiempo. El reactivo de detección no unido se separa luego y el reactivo de detección unido se detecta utilizando el grupo informador. El método empleado para detectar el grupo informador depende de la naturaleza del grupo informador. Para grupos radiactivos, son generalmente apropiados el recuento por centelleo o métodos autorradiográficos. Se pueden utilizar métodos espectroscópicos para detectar colorantes, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. La biotina se puede detectar utilizando avidina, acoplada a un grupo informador diferente (habitualmente un grupo radiactivo o fluorescente o una enzima). Grupos informadores de enzimas se pueden detectar generalmente mediante la adición de un sustrato (generalmente durante un periodo de tiempo específico), seguido de análisis espectroscópico u otro análisis de los productos de reacción.
Para determinar la presencia o ausencia de un cáncer, tal como cáncer de ovarios, la señal detectada del grupo informador que permanece unido al soporte sólido se compara generalmente con una señal que corresponde a un valor de corte predeterminado. En una realización preferida, el valor de corte para la detección de un cáncer es la señal media promedio, obtenida cuando el anticuerpo inmovilizado se incuba con muestras de pacientes sin el cáncer. En general, una muestra que genera una señal que está tres desviaciones estándares por encima del valor de corte predeterminado se considera positiva para el cáncer. En una realización preferida alternativa, el valor de corte se determina utilizando una curva de Receptor Operador de acuerdo con el método de Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, págs. 106-7. En síntesis, en esta realización el valor de corte se puede determinar a partir de una gráfica de pares de tasas verdaderas positivas (es decir, la sensibilidad) y tasas falsas positivas (100% de especificidad) que corresponden a cada uno de los valores de corte posibles para el resultado del ensayo diagnóstico. El valor de corte en la gráfica que se encuentra lo más próximo a la esquina izquierda superior (es decir, el valor que encierra el área mayor) es el valor de corte más preciso, y se puede considerar positiva una muestra que genera una señal que es mayor que el valor de corte determinado por este método. Alternativamente, el valor de corte se puede desplazar hacia la izquierda a lo largo de la gráfica con el fin de minimizar la tasa falsa positiva, o hacia la derecha, con el fin de minimizar la tasa falsa negativa. En general, una muestra que genera una señal que es mayor que el valor de corte determinado por este método se considera positiva para un cáncer.
En una realización relacionada, el ensayo se lleva a cabo en un formato de ensayo de flujo a través o de tira, en el que el agente de unión se inmoviliza sobre una membrana, tal como nitrocelulosa. En el ensayo de flujo a través, polipéptidos en la muestra se unen al agente de unión inmovilizado a medida que la muestra atraviesa la membrana. Después se une un segundo agente de unión marcado al complejo agente de unión-polipéptido a medida que una disolución que contiene el segundo agente de unión fluye a través de la membrana. La detección del segundo agente de unión unido se puede luego efectuar como se ha descrito antes. En el formato de ensayo de tira, un extremo de la membrana al que está unido el agente de unión se sumerge en una disolución que contiene la muestra. La muestra migra a lo largo de la membrana a través de una zona que contiene el segundo agente de unión y a la zona del agente de unión inmovilizado. La concentración del segundo agente de unión en la zona del anticuerpo inmovilizado indica la presencia de un cáncer. Típicamente, la concentración del segundo agente de unión en ese sitio genera un dibujo, tal como una línea, que se puede leer visualmente. La ausencia de un dibujo de este tipo indica un resultado negativo. En general, se selecciona la cantidad de agente de unión inmovilizado sobre la membrana para generar un dibujo visualmente discernible cuando la muestra biológica contiene un nivel de polipéptido que sería suficiente para generar una señal positiva en el ensayo con dos anticuerpos en sándwich, en el formato comentado antes. Agentes de unión preferidos para uso en ensayos de este tipo son anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos. Preferiblemente, la cantidad de anticuerpo inmovilizado sobre la membrana oscila entre aproximadamente 25 ng y aproximadamente 1 �g, y más preferiblemente entre aproximadamente 50 ng y aproximadamente 500 ng. Ensayos de este tipo se pueden realizar, típicamente, con una muy pequeña cantidad de muestra biológica.
Naturalmente, existen numerosos otros protocolos de ensayo que son adecuados para uso con las proteínas tumorales o agentes de unión de la presente invención. Las descripciones anteriores pretenden ser solamente ejemplares. Por ejemplo, resultará evidente para los expertos ordinarios en la técnica que los protocolos anteriores se pueden modificar fácilmente para utilizar polipéptidos de carcinoma de ovarios para detectar anticuerpos que se unen a polipéptidos de este tipo en una muestra biológica. La detección de anticuerpos específicos para proteínas de carcinoma de ovarios de este tipo se puede correlacionar con la presencia de un cáncer.
Un cáncer también, o de forma alternativa, se puede detectar en base a la presencia de células T que reaccionan específicamente con una proteína de carcinoma de ovarios en una muestra biológica. En determinados métodos, una muestra biológica que comprende células T CD4+ y/o CD8+ aisladas de un paciente se incuba con una proteína de carcinoma de ovarios, un polinucleótido que codifica un polipéptido de este tipo y/o una APC que expresa al menos una porción inmunogénica de un polipéptido de este tipo y se detecta la presencia o ausencia de una activación específica de las células T. Muestras biológicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a células T aisladas. Por ejemplo, las células T se pueden aislar de un paciente por técnicas rutinarias (tales como centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll/Hypaque de linfocitos de la sangre periférica). Las células T se pueden incubar in vitro durante 2-9 días (típicamente 4 días) a 37ºC con una proteína de carcinoma de ovarios (p. ej., 5 -25 �g/ml). Puede ser deseable incubar otra parte alícuota de una muestra de células T en ausencia de una proteína de carcinoma de ovarios para servir como control. Para células T CD4+, la activación se detecta preferiblemente evaluando la proliferación de las células T. Para células T CD8+ la activación se detecta preferiblemente evaluando la actividad citolítica. Un nivel de proliferación que es al menos dos veces mayor y/o un nivel de actividad citolítica que es al menos un 20% mayor que en pacientes exentos de la enfermedad indica la presencia de un cáncer en el paciente.
Como se ha señalado antes, un cáncer también, o de forma alternativa, se puede detectar en base al nivel de ARNm que codifica una proteína de carcinoma de ovarios en una muestra biológica. Por ejemplo, al menos dos cebadores de oligonucleótidos se pueden emplear en un ensayo basado en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar una porción de un ADNc de proteína de carcinoma de ovarios derivado de una muestra biológica, en donde al menos uno de los cebadores de oligonucleótidos es específico para (es decir, se hibrida a) un polinucleótido que codifica la proteína de carcinoma de ovarios. El ADNc amplificado se separa luego y se detecta utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, tal como electroforesis en gel. De manera similar, sondas de oligonucleótidos que se hibridan específicamente a un polinucleótido que codifica una proteína de carcinoma de ovarios se pueden utilizar en un ensayo de hibridación para detectar la presencia de polinucleótido que codifica la proteína tumoral en una muestra biológica.
Para permitir la hibridación en condiciones de ensayo, los cebadores y las sondas de oligonucleótidos deberían comprender una secuencia de oligonucleótidos que tenga una identidad de al menos aproximadamente el 60%, de preferencia al menos aproximadamente el 75% y, más preferiblemente, al menos aproximadamente el 90% con una porción de un polinucleótido que codifica una proteína de carcinoma de ovarios con una longitud de al menos 10 nucleótidos y, preferiblemente, al menos 20 nucleótidos. Preferiblemente, los cebadores y/o las sondas de oligonucleótidos se hibridan a un polinucleótido que codifica un polipéptido descrito en esta memoria en condiciones moderadamente estrictas, según se define antes. Cebadores y/o sondas de oligonucleótidos que se pueden emplear útilmente en los métodos de diagnóstico descritos en esta memoria tienen una longitud de preferiblemente al menos 10-40 nucleótidos. En una realización preferida, los cebadores de oligonucleótidos comprenden al menos 10 nucleótidos contiguos, más preferiblemente al menos 15 nucleótidos contiguos de una molécula de ADN con una secuencia proporcionada en esta memoria. Técnicas tanto para ensayos basados en la PCR como ensayos de hibridación son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, 1987; Erlich comp., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989).
Un ensayo preferido emplea la RT-PCR, en el que la PCR se aplica en unión con la transcripción inversa. Típicamente, ARN se extrae de una muestra biológica, tal como un tejido de biopsia, y se transcribe inversamente para producir moléculas de ADNc. La amplificación por PCR utilizando al menos un cebador específico genera una molécula de ADNc, que se puede separar y visualizar utilizando, por ejemplo, electroforesis en gel. La amplificación se puede realizar en muestra biológicas tomadas de un paciente de ensayo y de un individuo que no está afectado de cáncer. La reacción de amplificación se puede realizar en varias diluciones de ADNc que abarcan dos órdenes de magnitud. Se considera típicamente positivo un incremento doble o mayor en la expresión de varias diluciones de la muestra de paciente de ensayo en comparación con las mismas diluciones de la muestra no cancerosa.
En otra realización, proteínas de carcinoma de ovarios y polinucleótidos que codifican proteínas de este tipo se pueden utilizar como marcadores para vigilar el progreso del cáncer. En esta realización, se pueden realizar a lo largo del tiempo ensayos como se describe antes para el diagnóstico de un cáncer y se puede evaluar el cambio en el nivel de polipéptido o polipéptidos reactivos. Por ejemplo, los ensayos se pueden realizar cada 24-72 horas durante un periodo de 6 meses hasta 1 año y, después de ello, se pueden realizar según se necesite. En general, un cáncer progresa en aquellos pacientes en los que el nivel de polipéptido detectado por el agente de unión aumenta con el tiempo. En contraposición, el cáncer no progresa cuando el nivel de polipéptido reactivo permanece constante o disminuye con el tiempo.
Se pueden realizar determinados ensayos diagnósticos in vivo directamente en un tumor. Uno de estos ensayos implica poner en contacto células tumorales con un agente de unión. El agente de unión unido se puede luego detectar directa o indirectamente a través de un grupo informador. Agentes de unión de este tipo también se pueden utilizar en aplicaciones histológicas. Alternativamente, en tales aplicaciones se pueden utilizar sondas de polinucleótidos.
Como se ha señalado antes, para mejorar la sensibilidad se pueden someter a ensayo en una muestra dada múltiples marcadores de proteínas de carcinoma de ovarios. Resultará evidente que agentes de unión específicos para diferentes proteínas proporcionados en esta memoria se pueden combinar en un ensayo individual. Además, se pueden utilizar concurrentemente múltiples cebadores o sondas. La selección de marcadores de proteínas tumorales se puede basar en experimentos rutinarios para determinar combinaciones que resulten en una sensibilidad óptima. Adicional, o alternativamente, ensayos de proteínas tumorales proporcionados en esta memoria se pueden combinar con ensayos para otros antígenos tumorales conocidos.
KITS DE DIAGNÓSTICO
La presente invención proporciona, además, kits para uso en cualquiera de los métodos de diagnóstico anteriores. Kits de este tipo comprenden, típicamente, dos o más componentes necesarios para realizar un ensayo diagnóstico. Los componentes pueden ser compuestos, reactivos, recipientes y/o un equipo. Por ejemplo, un recipiente dentro de un kit puede contener un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que se une específicamente a una proteína de carcinoma de ovarios. Anticuerpos o fragmentos de este tipo se pueden proporcionar fijados a un material de soporte según se describe antes. Uno o más recipientes adicionales pueden contener elementos, tales como reactivos o tampones, a utilizar en el ensayo. Kits de este tipo también, o alternativamente, pueden contener un reactivo de detección según se describe antes que contiene un grupo informador adecuado para la detección directa o indirecta de la unión del anticuerpo.
Alternativamente, un kit se puede diseñar para detectar el nivel de ARNm que codifica una proteína de carcinoma de ovarios en una muestra biológica. Kits de este tipo comprenden generalmente al menos una sonda o cebador de oligonucleótidos, según se describe antes, que se hibrida a un polinucleótido que codifica una proteína de carcinoma de ovarios. Un oligonucleótido de este tipo se puede utilizar, por ejemplo, en un ensayo de la PCR o de hibridación. Componentes adicionales que pueden estar presentes en kits de este tipo incluyen un segundo oligonucleótido y/o un reactivo de diagnóstico o recipiente para facilitar la detección de un polinucleótido que codifica una proteína de carcinoma de ovarios.
Los siguientes Ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 Identificación de ADNcs representativos de proteína de carcinoma de ovarios
Este Ejemplo ilustra la identificación de moléculas de ADNc que codifican proteínas de carcinoma de ovarios.
Sueros de ratones anti-SCID (generados contra sueros de ratones SCID portadores de carcinoma de ovarios de pase tardío) se pre-aclararon de E. coli y de antígenos de fagos y se utilizaron en una dilución 1:200 en un rastreo de expresión serológica. La genoteca rastreada se hizo a partir de un tumor de ovarios humano derivado de SCID (OV9334) utilizando un kit de construcción de genoteca de ADNc por cebado con RH oligo(dT) direccional y el vector �Screen (Novagen). Se empleó un lambda screen de bacteriófago. Se rastrearon aproximadamente 400.000 ufp (unidades formadoras de placas) de la genoteca de OV9334 amplificada.
Se aislaron 196 clones positivos. Determinadas secuencias que parecen ser nuevas se proporcionan en las Figuras 1A-1S y en las SEQ ID NOs: 1 a 71. En las Figuras 2A-2C (SEQ ID NOs: 72 a 74) se muestran tres secuencias de insertos completas. Otros clones que tienen secuencias conocidas se presentan en las Figuras 15A-15EEE (SEQ ID NOs: 82 a 310). Las búsquedas en la base de datos identificó las siguientes secuencias que eran sustancialmente idénticas a las secuencias presentadas en las Figuras 15A-15EEE.
Estos clones se caracterizaron adicionalmente utilizando una tecnología del microarray para determinar los niveles de expresión en una diversidad de tejidos tumorales y normales. Análisis de este tipo se realizaron utilizando un microarray de Synteni (Palo Alto, CA), de acuerdo las instrucciones del fabricante. Los productos de amplificación por PCR se dispusieron ordenadamente en portaobjetos, ocupando cada uno de los productos una localización única en la disposición ordenada. Se extrajo ARNm de la muestra de tejido a ensayar, se transcribió inversamente y se generaron muestras de ADNc marcadas por fluorescencia. Los microarrays se sondaron con las sondas de ADNc marcadas y los portaobjetos se escanearon para medir la intensidad de la fluorescencia. Los datos se analizaron utilizando el software GEMtools proporcionado por Synteni. Los resultados para un clon (13695, al que se alude también como O8E) se muestran en la Figura 3.
Ejemplo 2 Identificación de ADNcs de carcinoma de ovarios utilizando la tecnología del microarray
Este Ejemplo ilustra la identificación de polinucleótidos de carcinoma de ovarios mediante sustracción con la PCR y análisis del microarray. Se analizaron microarrays de ADNcs en cuanto a la expresión específica para tumores de ovarios utilizando un microarray de Synteni (Palo Alto, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (y esencialmente según se describe por Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619, 1996 y Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:21502155, 1997).
Se realizó una sustracción por PCR utilizando un probador que comprende ADNc de cuatro tumores de ovarios (tres de los cuales eran tumores metastásicos) y un conductor de ADNc procedente de cinco tejidos normales (glándula adrenal, pulmón, páncreas, bazo y cerebro). Fragmentos de ADNc recuperados de esta sustracción se sometieron a análisis del microarray de ADN en el que los fragmentos se amplificaron por PCR, se adhirieron a chips y se hibridaron con sondas marcadas por fluorescencia derivadas de ARNms de tumores de ovarios humanos y una diversidad de tejidos humanos normales. En este análisis los portaobjetos se escanearon y se midió la intensidad por fluorescencia, y los datos se analizaron utilizando el software GEMtools de Synteni. En general, secuencias que muestran al menos un incremento de 5 veces en la expresión en células tumorales (con relación a células normales) se consideraron antígenos tumorales de ovarios. Los resultados de la fluorescencia se analizaron y los clones que exhibían una expresión incrementada en los tumores de ovarios se caracterizaron adicionalmente mediante secuenciación del ADN y búsquedas en las bases de datos para determinar la novedad de la secuencia.
Utilizando ensayos de este tipo se identificó un antígeno tumoral de ovarios que es una fusión por corte y empalme entre la oncoproteína TAX de tipo I del virus de la leucemia de linfocitos T humanos (véase Jin et al., Cell 93:81-91, 1998) y una proteína de la matriz extracelular denominada osteonectina. En el punto de fusión existe una secuencia de unión por corte y empalme. La secuencia de este clon se presenta en la Figura 4 y en la SEQ ID NO:75. La osteonectina, no cortada y empalmada e inalterada, también se identificó independientemente a partir de ensayos de este tipo.
A clones adicionales identificados por este método se alude en esta memoria como 3f, 6b, 8e, 8h, 12c y 12h. Secuencias de estos clones se muestran en las Figuras 5 a 9 y en las SEQ ID NOs: 76 a 81. Se realizaron análisis de microarray
5 según se describe antes y se presentan en las Figuras 10 a 14. Se obtuvo una secuencia de longitud completa que abarcaba los clones 3f, 6b, 8e y 12h rastreando una genoteca de ADNc de tumor de ovarios (derivado de SCID). Esta secuencia de 2996 pares de bases (designada O772P) se presenta en SEQ ID NO: 311 y la secuencia de proteínas de 914 aminoácidos codificada se muestra en la SEQ ID
10 NO:312. El análisis PSORT indica una proteína de la transmembrana tipo 1a localizada en la membrana del plasma. Además de determinadas secuencias descritas antes, este rastreo identificó las siguientes secuencias:
Secuencia
Comentarios
OV4vG11 (SEQ ID NO:313)
clon humano 1119D9 en el cromosoma 20p12
OV4vB11 (SEQ ID NO:314)
UWGC:y14c094 humano del cromosoma 6p21
OV4vD9 (SEQ ID NO:315)
clon humano 1049G16 en el cromosoma 20q12-13.2
OV4vD5 (SEQ ID NO:316)
gen KIAA0014 humano
OV4vC2 (SEQ ID NO:317)
gen KIAA0084 humano
OV4vF3 (SEQ ID NO:318)
cromosoma humano 19 cósmido R31167
OV4VC1 (SEQ ID NO:319)
nuevo
OV4vH3 (SEQ ID NO:320)
nuevo
OV4vD2 (SEQ ID NO:321)
nuevo
O815P (SEQ ID NO:322)
nuevo
OV4vC12 (SEQ ID NO:323)
nuevo
OV4vA4 (SEQ ID NO:324)
nuevo
OV4vA3 (SEQ ID NO:325)
nuevo
OV4v2A5 (SEQ ID NO:326)
nuevo
O819P (SEQ ID NO:327)
nuevo
O818P (SEQ ID NO:328)
nuevo
O817P (SEQ ID NO:329)
nuevo
O816P (SEQ ID NO:330)
nuevo
Ov4vC5 (SEQ ID NO:331)
nuevo
21721 (SEQ ID NO:332)
lumican humano
21719 (SEQ ID NO:333)
proteína II de unión a ácido retinoico humana
21717 (SEQ ID NO:334)
subunidad de ATPasa de proteosoma 26S humano
21654 (SEQ ID NO:335)
copina I humana
21627 (SEQ ID NO:336)
gamma-2 enolasa específica para neurona humana
21623 (SEQ ID NO:337)
geranilgeranil transferasa II humana
21621 (SEQ ID NO:338)
proteína quinasa dependiente de ciclina humana
21616 (SEQ ID NO:339)
factor potenciador de prepro-megacariocitos humano
21612 (SEQ ID NO:340)
UPH1 humana
21558 (SEQ ID NO:341)
similar a RalGDS 2 (RGL2) humana
21555 (SEQ ID NO:342)
autoantígeno P542 humano
21548 (SEQ ID NO:343)
proteína relacionada con actina (ARP2) humana
21462 (SEQ ID NO:344)
proteína interactuante con huntingtina humana
21441 (SEQ ID NO:345)
producto 90K (antígeno asociado a tumores) humano
21439 (SEQ ID NO:346)
proteína reguladora de nucleótidos de guanina humana (tim 1)
21438 (SEQ ID NO:347)
antígeno autoinmune Ku (p70/p80) humano
21237 (SEQ ID NO:348)
S-laminina humana
21436 (SEQ ID NO:349)
riboforina 1 humana
21435 (SEQ ID NO:350)
chaperonina citoplásmica humana hTRiC5
21425 (SEQ ID NO:351)
EMX2 humana
21423 (SEQ ID NO:352)
gen p87/p89 humano
21419 (SEQ ID NO:353)
HPBRII-7 humana
21252 (SEQ ID NO:354)
T1-227H humana
21251 (SEQ ID NO:355)
culina 1 humana
21247 (SEQ ID NO:356)
inhibidor de proteasa tipo kunitz (KOP)
21244-1 (SEQ ID NO:357)
receptor F de la proteína tirosina fosfatasa (PTPRF) humano
21718 (SEQ ID NO:358)
repetición LTR humana
OV2-90 (SEQ ID NO:359)
nuevo
imagen1
Proteína de unión a poli A humana (SEQ ID NO:361)
Pleitrofina human (SEQ ID NO:362)
Clon 278C19 de PAC humano (SEQ ID NO:363)
LLRep3 humana (SEQ ID NO:364)
Inhib. de proteasa tipo Kunitz humano (SEQ ID NO:365)
Gen KIAA0106 humano (SEQ ID NO:366)
Queratina humana (SEQ ID NO:367)
HIV-1TAR humano (SEQ ID NO:368)
Nexina deriva de glia humana (SEQ ID NO:369)
Fibronectina humana (SEQ ID NO:370)
ECMproBM40 humano (SEQ ID NO:371)
Colágeno humano (SEQ ID NO:372)
Alfa-enolasa humana (SEQ ID NO:373)
Aldolasa humana (SEQ ID NO:374)
Factor de crecimiento de transf. humano BIG H3 (SEQ ID NO:375)
Osteonectina SPARC humana (SEQ ID NO:376)
Proteasa de leucocitos SLP1 humana (SEQ ID NO:377)
ATP sint. mitocondrial humano (SEQ ID NO:378)
Clon 461P17 de sec. de ADN humano (SEQ ID NO:379)
Caja pro Y de dbpB humana (SEQ ID NO:380)
Queratina de 40 kDa humana (SEQ ID NO:381)
Arginosuccinato sint. humano (SEQ ID NO:382)
Fosfoproteína ribosomal ácida humana (SEQ ID NO:383)
Pro de unión a laminina de carcinoma de colon humana (SEQ ID NO:384)

Este rastreo identificó, además, múltiples formas del clon O772P, a las que se alude en esta memoria como 21013, 21003 y 21008. El análisis PSORT indica que
5 21003 (SEQ ID NO:386; traducida como SEQ ID NO:389) y 21008 (SEQ ID NO:387; traducida como SEQ ID NO:390) representan formas de la proteína de la transmembrana de tipo 1a de O772P. 21013 (SEQ ID NO:385; traducida como SEQ ID NO:388) parece ser una forma truncada de la proteína y por el análisis PSORT se pronostica que es una proteína secretada.
10 Análisis de la secuencia adicionales dieron como resultado un clon de longitud completa para O8E (2627 pares de bases, lo que concuerda con el tamaño de mensaje observado por el análisis Northern; SEQ ID NO: 391). Esta secuencia de nucleótidos se obtuvo como sigue: Se encontró que la secuencia O8E original (OrigO8Econs) se solapaba en 33 nucleótidos con una secuencia procedente de un clon EST (IMAGEnº1987589). Este clon proporcionó 1042 nucleótidos adicionales más arriba de la secuencia O8E original. El enlace entre el EST y O8E se confirmó secuenciando múltiples fragmentos de PCR generados a partir de una genoteca de tumor primario de ovarios utilizando cebadores a la secuencia de EST única y la secuencia de O8E (ESTxO8EPCR). Se indicó adicionalmente el estado de longitud completa cuando la PCR anclada procedente de la genoteca de tumor de ovarios dio varios clones (AnchoredPCR cons) que todos terminaban más arriba de la putativa metionina de partida, pero fracasaban en proporcionar cualquier información de secuencia adicional. La Figura 16 representa un diagrama que ilustra la localización de cada secuencia parcial dentro de la secuencia de O8E de longitud completa.
Dos secuencias de proteínas se pueden traducir a partir de la O8E de longitud completa. Para “a” (SEQ ID NO:393) comienza con una supuesta metionina de partida. Una segunda forma “b” (SEQ ID NO:392) incluye 27 residuos adicionales situados más arriba respecto del extremo 5’ de la secuencia de nucelótidos.
De lo que antecede se apreciará que, a pesar de que se han descrito en esta memoria, para fines de ilustración, realizaciones específicas de la invención, se pueden hacer diversas modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Por consiguiente, la invención no queda limitada, a excepción de las reivindicaciones anejas.
SUMARIO DEL LISTADO DE SECUENCIAS
SEQ ID NOs:1-71 son polinucleótidos de antígeno de carcinoma de ovarios mostrados en las Figuras 1A-1S.
SEQ ID NOs:72-74 son polinucleótidos de antígeno de carcinoma de ovarios mostrados en las Figuras 2A-2C.
SEQ ID NO:75 es el polinucleótido de carcinoma de ovarios 3g (Figura 4).
SEQ ID NO:76 es el polinucleótido de carcinoma de ovarios 3f (Figura 5).
SEQ ID NO:77 es el polinucleótido de carcinoma de ovarios 6b (Figura 6).
SEQ ID NO:78 es el polinucleótido de carcinoma de ovarios 8e (Figura 7A).
SEQ ID NO:79 es el polinucleótido de carcinoma de ovarios 8h (Figura 7B).
SEQ ID NO:80 es el polinucleótido de carcinoma de ovarios 12e (Figura 8).
SEQ ID NO:81 es el polinucleótido de carcinoma de ovarios 12h (Figura 9). SEQ ID NOs:82-310 son polinucleótidos de antígenos de carcinoma de ovarios mostrados en las Figuras 15A-15EEE. SEQ ID NO:311 es una secuencia de longitud completa del polinucleótido de
5 carcinoma de ovarios O772P. SEQ ID NO:312 es la secuencia de aminoácidos de O772P. SEQ ID NOs:313-384 son polinucleótidos de antígenos de carcinoma de
ovarios. SEQ ID NOs:385-390 presentan secuencias de formas de O772P. 10 SEQ ID NO:391 es una secuencia de longitud completa del polinucleótido de carcinoma de ovarios O8E. SEQ ID NOs:392-393 son secuencias de proteínas codificadas por O8E.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Corixa Corporation
<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA LA TERAPIA Y EL DIAGNÓSTICO DEL CÁNCER DE OVARIOS
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Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1.-Un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a una proteína de carcinoma de ovarios codificada por SEQ ID NO:391, que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:393 para uso en el tratamiento de cáncer de ovarios.
  2. 2.-El anticuerpo o fragmento de unión a antígenos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígenos está conjugado a una toxina.
  3. 3.-El anticuerpo o fragmento de unión a antígenos de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste en una toxina ricina, toxina abrina, toxina de la difteria, toxina del cólera, toxina gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de tipo Shigella y proteína antiviral de hierba carmín.
  4. 4.-El anticuerpo o fragmento de unión a antígenos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígenos está conjugado a un radionucleido.
  5. 5.-El anticuerpo o fragmento de unión a antígenos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el radionucleido se selecciona del grupo que consiste en 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 211At y 212Bi.
  6. 6.-El uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo que se une específicamente a una proteína de carcinoma de ovarios codificada por SEQ ID NO:391, que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:393 para la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de cáncer de ovarios.
  7. 7.-El uso de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígenos está conjugado a una toxina.
  8. 8.-El uso de la reivindicación 7, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste en una toxina ricina, toxina abrina, toxina de la difteria, toxina del cólera, toxina gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de tipo Shigella y proteína antiviral de hierba carmín.
  9. 9.-El uso de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígenos está conjugado a un radionucleido.
    5
  10. 10.-El uso de la reivindicación 9, en donde el radionucleido se selecciona del grupo que consiste en 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 211At y 212Bi.
  11. 11.-Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de un cáncer de
    10 ovarios que expresa un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:393 codificada por SEQ ID NO:391, comprendiendo la composición un soporte fisiológicamente aceptable en combinación con un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
    1/92
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