ES2308976T3 - Compuestos y metodos para la terapia y el diagnostico del cancer de pulmon. - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar la presencia de un cáncer de pulmón en un paciente, que comprende las operaciones de: (a) poner una muestra biológica obtenida del paciente en contacto con un anticuerpo, o un fragmento del mismo que se une a antígenos, que se une al polipéptido expuesto en la ID. SEC. nº 176; (b) detectar en la muestra una cantidad del polipéptido que se une al agente ligante; y (c) comparar la cantidad del polipéptido con un valor de corte predeterminado, y determinar la presencia de cáncer de pulmón en el paciente a partir de dicha comparación.
Description
Compuestos y métodos para la terapia y el
diagnóstico del cáncer de pulmón.
El presente invento se refiere, en general, al
diagnóstico del cáncer, tal como el cáncer de pulmón. Más
específicamente, el invento se refiere a polipéptidos que
comprenden al menos una porción de una proteína tumoral de pulmón,
y a polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. Dichos
polipéptidos y polinucleótidos pueden ser utilizados en vacunas y
composiciones farmacéuticas para la prevención y el tratamiento del
cáncer de pulmón y para el diagnóstico y el control de dichos
cánceres.
El cáncer de pulmón es la causa principal de
muerte por cáncer en hombres y mujeres en los Estados Unidos,
presentándose 172.000 nuevos casos estimados en 1994. El índice de
supervivencia a cinco años entre todos los pacientes con cáncer de
pulmón, independientemente de la fase de la enfermedad en el
diagnóstico, es sólo 13%. Esto contrasta con un índice de
supervivencia a cinco años de 46% entre los casos detectados
mientras la enfermedad está aún localizada. Sin embargo, sólo se
descubre un 16% de cánceres de pulmón antes de que la enfermedad se
haya propagado.
La detección precoz es difícil ya que a menudo
no se ven los síntomas clínicos hasta que la enfermedad ha
alcanzado una fase avanzada. Actualmente, el diagnóstico se ve
facilitado por el uso de rayos X torácicos, análisis del tipo de
células contenidas en esputo y examen de los pasos bronquiales
mediante fibra óptica. Los regímenes de tratamiento vienen
determinados por el tipo y la fase del cáncer e incluyen cirugía,
terapia por radiación y/o quimioterapia. A pesar de la considerable
investigación sobre terapias para la enfermedad, el cáncer de
pulmón sigue siendo difícil de tratar.
En consecuencia, en este campo técnico queda la
necesidad de técnicas diagnósticas mejoradas para el cáncer de
pulmón.
En breves palabras, el presente invento
proporciona composiciones y su uso en métodos para el diagnóstico
del cáncer de pulmón.
En un primer aspecto del presente invento, se
proporciona un método para detectar la presencia de un cáncer de
pulmón en un paciente, que comprende las operaciones de:
- (a)
- poner una muestra biológica obtenida del paciente en contacto con un anticuerpo, o un fragmento del mismo que se une a antígenos, que se une al polipéptido expuesto en la ID. SEC. nº 176;
- (b)
- detectar en la muestra una cantidad del polipéptido que se une al agente ligante; y
- (c)
- comparar la cantidad del polipéptido con un valor de corte predeterminado, y determinar la presencia de cáncer de pulmón en el paciente a partir de dicha comparación.
En un segundo aspecto del presente invento, se
proporciona el uso de un anticuerpo, o de un fragmento del mismo
que se une a antígenos, en un método in vitro para detectar
la presencia de un cáncer de pulmón en una muestra biológica, en el
que el anticuerpo puede detectar la presencia del polipéptido
expuesto en la ID. SEC. nº 176 en la muestra biológica.
En un tercer aspecto del presente invento, se
proporciona el uso del polipéptido expuesto en la ID. SEC. nº 176
en un método in vitro para detectar la presencia de cáncer de
pulmón en una muestra biológica, en el que el polipéptido se
utiliza para detectar en la muestra biológica la presencia de
células T que reaccionan específicamente con él.
En un cuarto aspecto del presente invento, se
proporciona un método para detectar la presencia de cáncer de
pulmón en un paciente, método que comprende las operaciones de:
- a)
- incubar una muestra biológica aislada que comprende células T CD4+ y/o CD8+ con el polipéptido expuesto en la ID. SEC. nº 176 o con un polinucleótido que codifica el mismo; y
- b)
- detectar la presencia o ausencia de activación específica de las células T.
También se proporciona el uso de cebadores
oligonucleotídicos en un ensayo basado en la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction), que
comprenden al menos 15 nucleótidos contiguos de una molécula de DNA
expuesta en la ID. SEC. nº 175, para detectar la presencia de cáncer
de pulmón en una muestra biológica.
Además, también se proporciona un sistema
diagnóstico para el cáncer de pulmón que comprende un anticuerpo
monoclonal o un fragmento del mismo que se une a antígenos, que se
une específicamente al polipéptido expuesto en la ID. SEC. nº 176,
y un reactivo de detección, en el que el reactivo de detección
comprende un grupo informador.
En un aspecto más del presente invento, se
proporciona un sistema diagnóstico para el cáncer de pulmón que
comprende al menos un oligonucleótido que comprende
15-40 nucleótidos contiguos del polinucleótido
expuesto en la ID. SEC. nº 175, y un reactivo diagnóstico, para uso
en una reacción en cadena de la polimerasa.
En otro aspecto del presente invento, se
proporciona un método para determinar la presencia de un cáncer de
pulmón en un paciente, que comprende las operaciones de:
- (a)
- poner una muestra biológica obtenida del paciente en contacto con un oligonucleótido que se hibrida con la secuencia expuesta en la ID. SEC. nº 175;
- (b)
- detectar en la muestra una cantidad de un polinucleótido que se hibrida con el oligonucleótido; y
- (c)
- comparar la cantidad del polinucleótido que se hibrida con el oligonucleótido con un valor de corte predeterminado y determinar la presencia del cáncer de pulmón en el paciente a partir de dicha comparación.
También se describen polipéptidos que comprenden
al menos una porción de una proteína tumoral de pulmón, o una
variante de la misma. Ciertas porciones y otras variantes son
inmunogénicas, por lo que la capacidad de la variante para
reaccionar con antisueros específicos de antígeno no está
sustancialmente disminuida. En ciertas realizaciones descritas, el
polipéptido comprende una secuencia que es codificada por una
secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en:
(a) secuencias expuestas en cualesquiera de las ID. SEC. números
1-3, 6-8, 10-13,
15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52,
54, 55, 57-59, 61-69, 71, 73, 74,
77, 78, 80-82, 84, 86-96,
107-109, 111, 113, 125, 127, 128, 129,
131-133, 142, 144, 148-151, 153,
154, 157, 158, 160, 167, 168, 171, 179, 182,
184-186, 188-191, 193, 194,
198-207, 209, 210, 213, 214, 217,
220-224, 253-337, 345, 347 y 349;
(b) variantes de una secuencia expuesta en cualquiera de las ID.
SEC. números 1-3, 6-8,
10-13, 15-27, 29, 30, 32,
34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59,
61-69, 71, 73, 74, 77, 78, 80-82,
84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125,
127, 128, 129, 131-133, 142, 144,
148-151, 153, 154, 157, 158, 160, 167, 168, 171,
179, 182, 184-186, 188-191, 193,
194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217,
220-224, 253-337, 345, 347 y 349; y
(c) complementos de una secuencia de (a) o (b). En realizaciones
específicas, los polipéptidos de la descripción presente comprenden
al menos una porción de una proteína tumoral que incluye una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las
secuencias expuestas en cualesquiera de las ID. SEC. números 152,
155, 156, 165, 166, 169, 170, 172, 174, 176,
226-252, 338-344 y 346, y variantes
de las mismas.
La presente descripción también proporciona
polinucleótidos que codifican un polipéptido como el anteriormente
descrito, o una porción de los mismos (tal como una porción que
codifica al menos 15 restos de aminoácido de una proteína tumoral
de pulmón), vectores de expresión que comprenden dichos
polinucleótidos, y células huésped transformadas o transfectadas
con dichos vectores de expresión.
En otros aspectos, la presente descripción
proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un
polipéptido o un polinucleótido como los anteriormente descritos y
un vehículo fisiológicamente aceptable.
En un aspecto relacionado del presente invento,
se proporcionan vacunas para uso profiláctico o terapéutico. Dichas
vacunas comprenden un polipéptido o un polinucleótido como los
anteriormente descritos y un inmunoestimulante.
La presente descripción proporciona además
composiciones farmacéuticas que comprenden: (a) un anticuerpo o un
fragmento del mismo que se une a antígenos, que se une
específicamente a una proteína tumoral de pulmón; y (b) un vehículo
fisiológicamente aceptable.
En otros aspectos, la descripción presente
proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden: (a) una
célula presentadora de antígenos que expresa un polipéptido como el
anteriormente descrito, y (b) un vehículo o excipiente
farmacéuticamente aceptable. Las células presentadoras de antígenos
incluyen células dendríticas, macrófagos, monocitos, fibroblastos y
células B.
En aspectos descritos relacionados, se
proporcionan vacunas que comprenden: (a) una célula presentadora de
antígenos que expresa un polipéptido como el anteriormente descrito,
y (b) un inmunoestimulante.
En otros aspectos, la descripción presente
proporciona además proteínas de fusión que comprenden al menos un
polipéptido como el anteriormente descrito, así como polinucleótidos
que codifican dichas proteínas de fusión.
En aspectos descritos relacionados, se
proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína
de fusión o un polinucleótido que codifica una proteína de fusión,
en combinación con un vehículo fisiológicamente aceptable.
Se describen vacunas que comprenden una proteína
de fusión o un polinucleótido que codifica una proteína de fusión,
en combinación con un inmunoestimulante.
En otros aspectos, la descripción presente
proporciona métodos para inhibir el desarrollo de un cáncer en un
paciente, que comprende administrar una composición farmacéutica o
una vacuna como las anteriormente expuestas al paciente.
La descripción presente proporciona además
métodos para eliminar células tumorales de una muestra biológica,
que comprende poner una muestra biológica en contacto con células T
que reaccionan específicamente con una proteína tumoral de pulmón,
en los que la operación de puesta en contacto es llevada a cabo bajo
unas condiciones y durante un tiempo suficiente que permiten la
eliminación de las células que expresan la proteína, de la
muestra.
También se describen métodos para inhibir el
desarrollo de un cáncer en un paciente, que comprenden administrar
una muestra biológica tratada del modo anteriormente descrito al
paciente.
Se describen métodos para estimular y/o propagar
células T específicas para una proteína tumoral de pulmón, que
comprenden poner células T en contacto con uno o más de (i) un
polipéptido como el anteriormente descrito, (ii) un polinucleótido
que codifica dicho polipéptido, y/o (iii) una célula presentadora de
antígenos que expresa dicho polipéptido; bajo unas condiciones y
durante un tiempo suficiente que permiten la estimulación y/o
propagación de las células T. También se proporcionan poblaciones de
células T determinadas que comprenden células T preparadas del modo
anteriormente descrito.
Se describen métodos para inhibir el desarrollo
de un cáncer en un paciente, que comprenden administrar una
cantidad eficaz de una población de células T como la anteriormente
descrita al paciente.
También se describen métodos para inhibir el
desarrollo de un cáncer en un paciente, que comprenden las
operaciones de: (a) incubar células T CD4+ y/o CD8+ determinadas de
un paciente con uno o más de: (i) un polipéptido que comprende al
menos una porción inmunogénica de una proteína tumoral de pulmón,
(ii) un polinucleótido que codifica dicho polipéptido, y (iii) una
célula presentadora de antígenos que expresa dicho polipéptido; y
(b) administrar una cantidad eficaz de las células T proliferadas al
paciente, inhibiéndose por ello el desarrollo de un cáncer en el
paciente. Aunque no es necesario, las células proliferadas pueden
ser clonadas antes de la administración al paciente.
En otros aspectos, el presente invento
proporciona métodos para determinar la presencia o ausencia de
cáncer de pulmón en un paciente, que comprenden: (a) poner una
muestra biológica, obtenida de un paciente, en contacto con un
anticuerpo que se une al polipéptido del presente invento; (b)
detectar en la muestra una cantidad del polipéptido que se une al
agente ligante; y (c) comparar la cantidad de polipéptido con un
valor de corte predeterminado y determinar, a partir de dicha
comparación, la presencia o ausencia de un cáncer en el paciente.
En realizaciones preferidas, el agente ligante es preferiblemente un
anticuerpo monoclonal.
El presente invento también proporciona, en
otros aspectos, métodos para controlar el progreso del cáncer de
pulmón en un paciente. Dichos métodos comprenden las operaciones de:
(a) poner una muestra biológica obtenida de un paciente en un
primer punto temporal, en contacto con un anticuerpo que se une a un
polipéptido como el anteriormente expuesto; (b) detectar en la
muestra una cantidad del polipéptido que se une al agente ligante;
(c) repetir las operaciones (a) y (b) utilizando una muestra
biológica obtenida del paciente en un punto temporal posterior; y
(d) comparar la cantidad de polipéptido detectada en la operación
(c) con la cantidad detectada en la operación (b) y controlar, a
partir de dicha comparación, el progreso del cáncer en el
paciente.
El presente invento proporciona además, en otros
aspectos, métodos para determinar la presencia o ausencia de cáncer
de pulmón en un paciente, que comprenden las operaciones de: (a)
poner una muestra biológica, obtenida de un paciente, en contacto
con un oligonucleótido que se hibrida con un polinucleótido que
codifica una proteína tumoral de pulmón del presente invento; (b)
detectar en la muestra un nivel de un polinucleótido,
preferiblemente mRNA, que se hibrida con el oligonucleótido; y (c)
comparar el nivel del polinucleótido que se hibrida con el
oligonucleótido con un valor de corte predeterminado y determinar, a
partir de dicha comparación, la presencia o ausencia de un cáncer
en el paciente. En ciertas realizaciones, la cantidad de mRNA es
detectada a través de una reacción en cadena de la polimerasa
utilizando, por ejemplo, al menos un cebador oligonucleotídico que
se hibrida con un polinucleótido que codifica un polipéptido como el
anteriormente expuesto, o con un complemento de dicho
polinucleótido. En otras realizaciones, la cantidad de mRNA se
detecta utilizando una técnica de hibridación en que se emplea una
sonda oligonucleotídica que se hibrida con un polinucleótido que
codifica un polipéptido como el anteriormente expuesto, o con un
complemento de dicho polinucleótido.
En aspectos relacionados, se proporcionan
métodos para controlar el progreso del cáncer de pulmón en un
paciente, que comprenden las operaciones de: (a) poner una muestra
biológica, obtenida de un paciente, en contacto con un
oligonucleótido que se hibrida con un polinucleótido que codifica
una proteína tumoral de pulmón del presente invento; (b) detectar
en la muestra una cantidad de un polinucleótido que se hibrida con
el oligonucleótido; (c) repetir las operaciones (a) y (b)
utilizando una muestra biológica obtenida del paciente en un punto
temporal posterior; y (d) comparar la cantidad de polinucleótido
detectada en la operación (c) con la cantidad detectada en la
operación (b) y controlar, a partir de dicha comparación, el
progreso del cáncer en el paciente.
En otros aspectos, la descripción presente
proporciona anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales, que
se unen a un polipéptido como el anteriormente descrito, así como
sistemas diagnósticos que comprenden dichos anticuerpos. También se
proporcionan sistemas diagnósticos que comprenden uno o más
cebadores o sondas oligonucleotídicos como los anteriormente
descritos. Estos y otros aspectos del presente invento resultarán
evidentes tras una referencia a la siguiente descripción detallada
y a los dibujos adjuntos.
- ID. SEC. nº 1
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-2.
- ID. SEC. nº 2
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-28.
- ID. SEC. nº 3
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-90.
- ID. SEC. nº 4
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-144.
- ID. SEC. nº 5
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-133.
- ID. SEC. nº 6
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-169.
- ID. SEC. nº 7
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-6.
- ID. SEC. nº 8
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-11.
- ID. SEC. nº 9
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-17.
- ID. SEC. nº 10
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-25.
- ID. SEC. nº 11
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-39.
- ID. SEC. nº 12
- es una primera determinada secuencia de cDNA para LST-S2-43.
- ID. SEC. nº 13
- es una segunda determinada secuencia de cDNA para LST-S2-43.
- ID. SEC. nº 14
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-65.
- ID. SEC. nº 15
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-68.
- ID. SEC. nº 16
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-72.
- ID. SEC. nº 17
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-74.
- ID. SEC. nº 18
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-103.
- ID. SEC. nº 19
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-N1-1F.
- ID. SEC. nº 20
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-N1-2A.
- ID. SEC. nº 21
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-N1-4H.
- ID. SEC. nº 22
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-N1-5A.
- ID. SEC. nº 23
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-N1-6B.
- ID. SEC. nº 24
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-N1-7B.
- ID. SEC. nº 25
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-N1-7H.
- ID. SEC. nº 26
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-N1-8A.
- ID. SEC. nº 27
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-N1-8D.
- ID. SEC. nº 28
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-N1-9A.
- ID. SEC. nº 29
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-N1-9E.
- ID. SEC. nº 30
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-N1-10A.
- ID. SEC. nº 31
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-N1-10G.
- ID. SEC. nº 32
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-N1-11A.
- ID. SEC. nº 33
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-N1-12C.
- ID. SEC. nº 34
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-N1-12E.
- ID. SEC. nº 35
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-B1-3D.
- ID. SEC. nº 36
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-B1-6C.
- ID. SEC. nº 37
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-B1-SD.
- ID. SEC. nº 38
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-B1-SF.
- ID. SEC. nº 39
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-B1-6G.
- ID. SEC. nº 40
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-B1-8A.
- ID. SEC. nº 41
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-B1-8D.
- ID. SEC. nº 42
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-B1-10A.
- ID. SEC. nº 43
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-B1-9B.
- ID. SEC. nº 44
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-B1-9F.
- ID. SEC. nº 45
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-B1-12D.
- ID. SEC. nº 46
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-I2-2B.
- ID. SEC. nº 47
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-I2-5F.
- ID. SEC. nº 48
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-I2-6B.
- ID. SEC. nº 49
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-I2-7F.
- ID. SEC. nº 50
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-I2-8G.
- ID. SEC. nº 51
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-I2-9E.
- ID. SEC. nº 52
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-I2-12B.
- ID. SEC. nº 53
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-H2-2C.
- ID. SEC. nº 54
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-H2-1G.
- ID. SEC. nº 55
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-H2-4G.
- ID. SEC. nº 56
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-H2-3H.
- ID. SEC. nº 57
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-H2-5G.
- ID. SEC. nº 58
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-H2-9B.
- ID. SEC. nº 59
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-H2-10H.
- ID. SEC. nº 60
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S2-H2-12D.
- ID. SEC. nº 61
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S3-2.
- ID. SEC. nº 62
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S3-4.
- ID. SEC. nº 63
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S3-7.
- ID. SEC. nº 64
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S3-8.
- ID. SEC. nº 65
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S3-12.
- ID. SEC. nº 66
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S3-13.
- ID. SEC. nº 67
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S3-14.
- ID. SEC. nº 68
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S3-16.
- ID. SEC. nº 69
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S3-21.
- ID. SEC. nº 70
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S3-22.
- ID. SEC. nº 71
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-7.
- ID. SEC. nº 72
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-A-1E.
- ID. SEC. nº 73
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-A-1G.
- ID. SEC. nº 74
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-A-3E.
- ID. SEC. nº 75
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-A-4E.
- ID. SEC. nº 76
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-A-6D.
- ID. SEC. nº 77
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-A-8D.
- ID. SEC. nº 78
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-A-10A.
- ID. SEC. nº 79
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-A-10C.
- ID. SEC. nº 80
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-A-9D.
- ID. SEC. nº 81
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-A-10D.
- ID. SEC. nº 82
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-A-9H.
- ID. SEC. nº 83
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-A-11D.
- ID. SEC. nº 84
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-A-12D.
- ID. SEC. nº 85
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-A-11E.
- ID. SEC. nº 86
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-S1-A-12E.
- ID. SEC. nº 87
- es la determinada secuencia de cDNA para L513S (T3).
- ID. SEC. nº 88
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 1 de L513S.
- ID. SEC. nº 89
- es una primera determinada secuencia de cDNA para L514S.
- ID. SEC. nº 90
- es una segunda determinada secuencia de cDNA para L514S.
- ID. SEC. nº 91
- es una primera determinada secuencia de cDNA para L516S.
- ID. SEC. nº 92
- es una segunda determinada secuencia de cDNA para L516S.
- ID. SEC. nº 93
- es la determinada secuencia de cDNA para L517S.
- ID. SEC. nº 94
- es la secuencia de cDNA extendida para LST-S1-169 (también conocida como L519S).
- ID. SEC. nº 95
- es una primera determinada secuencia de cDNA para L520S.
- ID. SEC. nº 96
- es una segunda determinada secuencia de cDNA para L520S.
- ID. SEC. nº 97
- es una primera determinada secuencia de cDNA para L521 S.
- ID. SEC. nº 98
- es una segunda determinada secuencia de cDNA para L521 S.
- ID. SEC. nº 99
- es la determinada secuencia de cDNA para L522S.
- ID. SEC. nº 100
- es la determinada secuencia de cDNA para L523S.
- ID. SEC. nº 101
- es la determinada secuencia de cDNA para L524S.
- ID. SEC. nº 102
- es la determinada secuencia de cDNA para L525S.
- ID. SEC. nº 103
- es la determinada secuencia de cDNA para L526S.
- ID. SEC. nº 104
- es la determinada secuencia de cDNA para L527S.
- ID. SEC. nº 105
- es la determinada secuencia de cDNA para L528S.
- ID. SEC. nº 106
- es la determinada secuencia de cDNA para L529S.
- ID. SEC. nº 107
- es una primera determinada secuencia de cDNA para L530S.
- ID. SEC. nº 108
- es una segunda determinada secuencia de cDNA para L530S.
- ID. SEC. nº 109
- es la determinada secuencia de cDNA de longitud completa para la forma corta de L531 S.
- ID. SEC. nº 110
- es la prevista secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. nº 109.
- ID. SEC. nº 111
- es la determinada secuencia de cDNA de longitud completa para la forma larga de L531S.
- ID. SEC. nº 112
- es la prevista secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. nº 111.
- ID. SEC. nº 113
- es la determinada secuencia de cDNA de longitud completa para L520S.
- ID. SEC. nº 114
- es la prevista secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. nº 113.
- ID. SEC. nº 115
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 1.
- ID. SEC. nº 116
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 3.
- ID. SEC. nº 117
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 4.
- ID. SEC. nº 118
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 5.
- ID. SEC. nº 119
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 7.
- ID. SEC. nº 120
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 8.
- ID. SEC. nº 121
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 9.
- ID. SEC. nº 122
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 10.
- ID. SEC. nº 123
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 12.
- ID. SEC. nº 124
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 11.
- ID. SEC. nº 125
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 13.
- ID. SEC. nº 126
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 15.
- ID. SEC. nº 127
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 16.
- ID. SEC. nº 128
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 17.
- ID. SEC. nº 129
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 19.
- ID. SEC. nº 130
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 20.
- ID. SEC. nº 131
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 22.
- ID. SEC. nº 132
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 24.
- ID. SEC. nº 133
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 29.
- ID. SEC. nº 134
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 31.
- ID. SEC. nº 135
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 33.
- ID. SEC. nº 136
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 38.
- ID. SEC. nº 137
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 39.
- ID. SEC. nº 138
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 41.
- ID. SEC. nº 139
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 43.
- ID. SEC. nº 140
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 44.
- ID. SEC. nº 141
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 45.
- ID. SEC. nº 142
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 47.
- ID. SEC. nº 143
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 48.
- ID. SEC. nº 144
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 49.
- ID. SEC. nº 145
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 50.
- ID. SEC. nº 146
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 53.
- ID. SEC. nº 147
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 54.
- ID. SEC. nº 148
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 56.
- ID. SEC. nº 149
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 57.
- ID. SEC. nº 150
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 58.
- ID. SEC. nº 151
- es la secuencia de cDNA de longitud completa para L530S.
- ID. SEC. nº 152
- es la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. nº 151.
- ID. SEC. nº 153
- es la secuencia de cDNA de longitud completa de una primera variante de L514S.
- ID. SEC. nº 154
- es la secuencia de cDNA de longitud completa de una segunda variante de L514S.
- ID. SEC. nº 155
- es la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. nº 153.
- ID. SEC. nº 156
- es la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. nº 154.
- ID. SEC. nº 157
- es la determinada secuencia de cDNA para el cóntigo 59.
- ID. SEC. nº 158
- es la secuencia de cDNA de longitud completa para L763P (también referida como cóntigo 22).
- ID. SEC. nº 159
- es la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. nº 158.
- ID. SEC. nº 160
- es la secuencia de cDNA de longitud completa para L762P (también referida como cóntigo 17).
- ID. SEC. nº 161
- es la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. nº 160.
- ID. SEC. nº 162
- es la determinada secuencia de cDNA para L515S.
- ID. SEC. nº 163
- es la secuencia de cDNA de longitud completa de una primera variante de L524S.
- ID. SEC. nº 164
- es la secuencia de cDNA de longitud completa de una segunda variante de L524S.
- ID. SEC. nº 165
- es la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. nº 163.
- ID. SEC. nº 166
- es la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. nº 164.
- ID. SEC. nº 167
- es la secuencia de cDNA de longitud completa de una primera variante de L762P.
- ID. SEC. nº 168
- es la secuencia de cDNA de longitud completa de una segunda variante de L762P.
- ID. SEC. nº 169
- es la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. nº 167.
- ID. SEC. nº 170
- es la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. nº 168.
- ID. SEC. nº 171
- es la secuencia de cDNA de longitud completa para L773P (también referida como cóntigo 56).
- ID. SEC. nº 172
- es la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. nº 171.
- ID. SEC. nº 173
- es una secuencia extendida de cDNA para L519S.
- ID. SEC. nº 174
- es la prevista secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. nº 174.
- ID. SEC. nº 175
- es la secuencia de cDNA de longitud completa para L523S.
- ID. SEC. nº 176
- es la prevista secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. nº 175.
- ID. SEC. nº 177
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub5-7A.
- ID. SEC. nº 178
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub5-8G.
- ID. SEC. nº 179
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub5-8H.
- ID. SEC. nº 180
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub5-10B.
- ID. SEC. nº 181
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub5-10H.
- ID. SEC. nº 182
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub5-12B.
- ID. SEC. nº 183
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub5-11C.
- ID. SEC. nº 184
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-1c.
- ID. SEC. nº 185
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-2f.
- ID. SEC. nº 186
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-2G.
- ID. SEC. nº 187
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-4d.
- ID. SEC. nº 188
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-4e.
- ID. SEC. nº 189
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-4f.
- ID. SEC. nº 190
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-3h.
- ID. SEC. nº 191
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-5d.
- ID. SEC. nº 192
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-5h.
- ID. SEC. nº 193
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-6h.
- ID. SEC. nº 194
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-7a.
- ID. SEC. nº 195
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-8a.
- ID. SEC. nº 196
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-7d.
- ID. SEC. nº 197
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-7e.
- ID. SEC. nº 198
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-8e.
- ID. SEC. nº 199
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-7g.
- ID. SEC. nº 200
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-9f.
- ID. SEC. nº 201
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-9h.
- ID. SEC. nº 202
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-11b.
- ID. SEC. nº 203
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-11c.
- ID. SEC. nº 204
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-12c.
- ID. SEC. nº 205
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-12e.
- ID. SEC. nº 206
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-12f.
- ID. SEC. nº 207
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-11g.
- ID. SEC. nº 208
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-12g.
- ID. SEC. nº 209
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-12h.
- ID. SEC. nº 210
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-II-1a.
- ID. SEC. nº 211
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-II-2b.
- ID. SEC. nº 212
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-II-2g.
- ID. SEC. nº 213
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-II-1h.
- ID. SEC. nº 214
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-II-4a.
- ID. SEC. nº 215
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-II-4b.
- ID. SEC. nº 216
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-II-3e.
- ID. SEC. nº 217
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-II-4f.
- ID. SEC. nº 218
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-II-4g.
- ID. SEC. nº 219
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-II-4h.
- ID. SEC. nº 220
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-II-5c.
- ID. SEC. nº 221
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-II-5e.
- ID. SEC. nº 222
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-II-6f.
- ID. SEC. nº 223
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-II-5g.
- ID. SEC. nº 224
- es la determinada secuencia de cDNA para LST-sub6-II-6g.
- ID. SEC. nº 225
- es la secuencia de aminoácidos para L528S.
- ID. SEC. nº 226-251
- son péptidos sintéticos derivados de L762P.
- ID. SEC. nº 252
- es la expresada secuencia de aminoácidos de L514S.
- ID. SEC. nº 253
- es la secuencia de DNA que corresponde a ID. SEC. nº 252.
- ID. SEC. nº 254
- es la secuencia de DNA de una construcción de expresión de L762P.
- ID. SEC. nº 255
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23785.
- ID. SEC. nº 256
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23786.
- ID. SEC. nº 257
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23788.
- ID. SEC. nº 258
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23790.
- ID. SEC. nº 259
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23793.
- ID. SEC. nº 260
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23794.
- ID. SEC. nº 261
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23795.
- ID. SEC. nº 262
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23796.
- ID. SEC. nº 263
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23797.
- ID. SEC. nº 264
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23798.
- ID. SEC. nº 265
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23799.
- ID. SEC. nº 266
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23800.
- ID. SEC. nº 267
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23802.
- ID. SEC. nº 268
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23803.
- ID. SEC. nº 269
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23804.
- ID. SEC. nº 270
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23805.
- ID. SEC. nº 271
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23806.
- ID. SEC. nº 272
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23807.
- ID. SEC. nº 273
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23808.
- ID. SEC. nº 274
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23809.
- ID. SEC. nº 275
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23810.
- ID. SEC. nº 276
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23811.
- ID. SEC. nº 277
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23812.
- ID. SEC. nº 278
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23813.
- ID. SEC. nº 279
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 23815.
- ID. SEC. nº 280
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25298.
- ID. SEC. nº 281
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25299.
- ID. SEC. nº 282
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25300.
- ID. SEC. nº 283
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25301.
- ID. SEC. nº 284
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25304.
- ID. SEC. nº 285
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25309.
- ID. SEC. nº 286
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25312.
- ID. SEC. nº 287
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25317.
- ID. SEC. nº 288
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25321.
- ID. SEC. nº 289
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25323.
- ID. SEC. nº 290
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25327.
- ID. SEC. nº 291
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25328.
- ID. SEC. nº 292
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25332.
- ID. SEC. nº 293
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25333.
- ID. SEC. nº 294
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25336.
- ID. SEC. nº 295
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25340.
- ID. SEC. nº 296
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25342.
- ID. SEC. nº 297
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25356.
- ID. SEC. nº 298
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25357.
- ID. SEC. nº 299
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25361.
- ID. SEC. nº 300
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25363.
- ID. SEC. nº 301
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25397.
- ID. SEC. nº 302
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25402.
- ID. SEC. nº 303
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25403.
- ID. SEC. nº 304
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25405.
- ID. SEC. nº 305
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25407.
- ID. SEC. nº 306
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25409.
- ID. SEC. nº 307
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25396.
- ID. SEC. nº 308
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25414.
- ID. SEC. nº 309
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25410.
- ID. SEC. nº 310
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25406.
- ID. SEC. nº 311
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25306.
- ID. SEC. nº 312
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25362.
- ID. SEC. nº 313
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25360.
- ID. SEC. nº 314
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25398.
- ID. SEC. nº 315
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25355.
- ID. SEC. nº 316
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25351.
- ID. SEC. nº 317
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25331.
- ID. SEC. nº 318
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25338.
- ID. SEC. nº 319
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25335.
- ID. SEC. nº 320
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25329.
- ID. SEC. nº 321
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25324.
- ID. SEC. nº 322
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25322.
- ID. SEC. nº 323
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25319.
- ID. SEC. nº 324
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25316.
- ID. SEC. nº 325
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25311.
- ID. SEC. nº 326
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25310.
- ID. SEC. nº 327
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25302.
- ID. SEC. nº 328
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25315.
- ID. SEC. nº 329
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25308.
- ID. SEC. nº 330
- es la determinada secuencia de cDNA para el clon 25303.
- ID. SEC. nº 331-337
- son las secuencias de cDNA de isoformas del compuesto homólogo del supresor tumoral p53, p63 (también referido como L530S).
- ID. SEC. nº 338-344
- son las secuencias de aminoácidos codificadas por ID. SEC. nº 331-337, respectivamente.
- ID. SEC. nº 345
- es una segunda secuencia de cDNA para el antígeno L763P.
- ID. SEC. nº 346
- es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ID. SEC. nº 345.
- ID. SEC. nº 347
- es una determinada secuencia de cDNA de longitud completa para L523S.
- ID. SEC. nº 348
- es la prevista secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. nº 347.
- ID. SEC. nº 349
- es la secuencia de cDNA que codifica la porción N-terminal de L773P.
- ID. SEC. nº 350
- es la secuencia de aminoácidos de la porción N-terminal de L773P.
Como se indicó anteriormente, el presente
invento se dirige, en general, a métodos para el diagnóstico del
cáncer de pulmón y al uso de una composición en dichos métodos. Las
composiciones aquí descritas pueden incluir polipéptidos tumorales
de pulmón, polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos,
agentes ligantes tales como anticuerpos, células presentadoras de
antígenos (APCs; del inglés, antigen presenting
cells) y/o células del sistema inmune (por ejemplo, células
T). Los polipéptidos del presente invento comprenden generalmente
al menos una porción (tal como una porción inmunogénica) de una
proteína tumoral de pulmón o una variante de la misma. Una
"proteína tumoral de pulmón" es una proteína que se expresa en
células tumorales de pulmón en un nivel que es al menos dos veces,
y preferiblemente al menos cinco veces, mayor que el nivel de
expresión en un tejido normal, según se determina utilizando un
ensayo representativo aquí proporcionado. Ciertas proteínas
tumorales de pulmón son proteínas tumorales que reaccionan
detectablemente [en un inmunoensayo, tal como un ensayo de
inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA; del inglés,
enzyme-linked immunosorption
assay) o una transferencia Western] con antisueros de un
paciente aquejado de cáncer de pulmón. Los polinucleótidos del
invento objetivo comprenden generalmente una secuencia de DNA o RNA
que codifica todo, o una porción de, dicho polipéptido, o una
secuencia que es complementaria de dicha secuencia. Los anticuerpos
son generalmente proteínas del sistema inmune, o fragmentos de las
mismas que se unen a antígenos, que son capaces de unirse a un
polipéptido como el anteriormente descrito. Las células
presentadoras de antígenos incluyen células dendríticas, macrófagos,
monocitos, fibroblastos y células B que expresan un polipéptido
como el anteriormente descrito. Las células T que pueden emplearse
en dichas composiciones son generalmente células T que son
específicas para un polipéptido como el anteriormente descrito.
El presente invento se basa en el descubrimiento
de proteínas tumorales de pulmón humanas. La secuencia del
polinucleótido que codifica la proteína tumoral específica del
invento se proporciona en la ID. SEC. nº 175.
Cualquier polinucleótido que codifique una
proteína tumoral de pulmón o una porción u otra variante de la
misma, como aquí se describen, queda abarcado por la descripción
presente. Los polinucleótidos preferidos comprenden al menos 15
nucleótidos consecutivos, preferiblemente al menos 30 nucleótidos
consecutivos y más preferiblemente al menos 45 nucleótidos
consecutivos, que codifican una porción de una proteína tumoral de
pulmón. Más preferiblemente, el polinucleótido codifica una porción
inmunogénica de una proteína tumoral de pulmón. Los polinucleótidos
complementarios de cualesquiera de dichas secuencias quedan también
abarcados por el presente invento. Los polinucleótidos pueden ser
de cadena sencilla (codificadores o antisentido) o de doble cadena,
y pueden ser moléculas de DNA (genómico, cDNA o sintético) o RNA.
Las moléculas de RNA incluyen moléculas de RNA heterogéneo nuclear
(hnRNA), que contienen intrones y corresponden a una molécula de DNA
de un modo uno a uno, y moléculas de mRNA, que no contienen
intrones. Aunque no es necesario, pueden estar presentes secuencias
codificadoras o no codificadoras adicionales en un polinucleótido
del presente invento, y, aunque no es necesario, un polinucleótido
puede estar unido a otras moléculas y/o materiales de soporte.
Los polinucleótidos pueden comprender una
secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica una
proteína tumoral de pulmón o una porción de la misma) o pueden
comprender una variante de dicha secuencia. Las variantes
polinucleotídicas pueden contener una o más sustituciones,
adiciones, supresiones y/o inserciones para que la inmunogenicidad
del polipéptido codificado no resulte disminuida con respecto a la
de una proteína tumoral nativa. El efecto sobre la inmunogenicidad
del polipéptido codificado puede ser generalmente evaluado del modo
aquí descrito. Las variantes presentan preferiblemente una identidad
de al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente una identidad
de al menos aproximadamente 80% y muy preferiblemente una identidad
de al menos aproximadamente 90% con respecto a una secuencia
polinucleotídica que codifica una proteína tumoral nativa de pulmón
o una porción de la misma. El término "variantes" también
abarca genes homólogos de origen xenogénico.
Se dice que dos secuencias polinucleotídicas o
polipeptídicas son "idénticas" si las secuencias de nucleótidos
o aminoácidos de las dos secuencias son iguales cuando se realiza
un alineamiento para una máxima correspondencia, como se describe
más adelante. Las comparaciones entre las dos secuencias se llevan
típicamente a cabo comparando las secuencias en una ventana de
comparación para identificar y comparar regiones locales con
similitud de secuencia. Como se utiliza aquí, una "ventana de
comparación" se refiere a un segmento de al menos aproximadamente
20 posiciones contiguas, normalmente de 30 a aproximadamente 75, 40
a aproximadamente 50, en que se puede comparar una secuencia con
una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas
una vez que se han alineado óptimamente las dos secuencias.
La alineación óptima de secuencias para
comparación puede ser llevada a cabo utilizando el programa Megalign
del conjunto Lasergene de software de bioinformática (DNASTAR,
Inc., Madison, Wisconsin, EE.UU.), usando los parámetros por
defecto. Este programa materializa varios esquemas de alineamiento
descritos en las referencias siguientes: M. O. Dayhoff (1978), "A
model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting
distant relationships" en "Atlas of Protein Sequence and
Structure", compilado por M. O. Dayhoff, National Biomedical
Research Foundation, Washington, Distrito de Columbia, EE.UU.,
Volumen 5, Supl. 3, páginas 345-358; J. Hein
(1990), "Unified Approach to Alignment and Phylogenes" páginas
626-645, "Methods in Enzymology", Volumen 183,
Academic Press, Inc., San Diego, California, EE.UU.; D. G. Higgins y
P. M. Sharp (1989), CABIOS 5: 151-153; E. W. Myers
y W. Muller (1988), CABIOS 4: 11-17; E. D. Robinson
(1971), Comb. Theor 11: 105; N. Santou y M. Nes (1987), Mol. Biol.
Evol. 4: 406-425; P. H. A. Sneath y R. R. Sokal
(1973), "Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of
Numerical Taxonomy", Freeman Press, San Francisco, California,
EE.UU.; W. J. Wilbur y D. J. Lipman (1983), Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 80: 726-730.
Preferiblemente, el "porcentaje de identidad
de secuencias" se determina comparando dos secuencias óptimamente
alineadas en una ventana de comparación de al menos 20 posiciones,
en que la porción de la secuencia polinucleotídica o polipeptídica
en la ventana de comparación puede comprender adiciones o
supresiones (es decir, huecos) de 20 por ciento o menos,
normalmente de 5 a 15 por ciento, o de 10 a 12 por ciento, en
comparación con las secuencias de referencia (que no comprenden
adiciones ni supresiones) para una alineación óptima de las dos
secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de
posiciones en que aparecen las bases de ácido nucleico o los restos
de aminoácido idénticos en ambas secuencias para obtener el número
de posiciones equivalentes, dividiendo el número de posiciones
equivalentes por el número total de posiciones en la secuencia de
referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los
resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de
secuencias.
Las variantes pueden también, o
alternativamente, ser sustancialmente homólogas a un gen nativo o a
una porción o complemento del mismo. Dichas variantes
polinucleotídicas son capaces de hibridarse bajo condiciones
moderadamente rigurosas con una secuencia de DNA presente en la
naturaleza que codifica una proteína tumoral nativa de pulmón (o
una secuencia complementaria). Las condiciones moderadamente
rigurosas adecuadas incluyen un prelavado en una disolución de SSC
5X, SDS al 0,5% y EDTA 1,0 mM (pH de 8,0) y una hibridación a
50ºC-65ºC, SSC 5X, durante la noche, seguidas de
dos lavados a 65º durante 20 minutos con cada uno de SSC 2X, 0,5X y
0,2X que contienen SDS al 0,1%.
Quienes tienen una experiencia normal en la
técnica apreciarán que, como resultado de la degeneración del
código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican
un polipéptido como el aquí descrito. Algunos de estos
polinucleótidos presentan una homología mínima con respecto a la
secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, los
polinucleótidos que varían a causa de diferencias en la utilización
de codones quedan específicamente contemplados por el presente
invento. Además, los alelos de los genes que comprenden las
secuencias polinucleotídicas aquí proporcionadas están dentro del
alcance del presente invento. Los alelos son genes endógenos que
están alterados como resultado de una o más mutaciones, tales como
supresiones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. Aunque no
necesariamente, el mRNA y la proteína resultantes pueden tener una
estructura o función alterada. Se pueden identificar los alelos
utilizando técnicas estándares (tales como hibridación,
multiplicación y/o comparación con secuencias de bases de
datos).
Se pueden preparar polinucleótidos utilizando
cualquiera de una diversidad de técnicas. Por ejemplo, se puede
identificar un polinucleótido, como se describe más adelante con
mayor detalle, explorando una micromatriz de cDNAs en cuanto a una
expresión tumoralmente asociada (es decir, una expresión que sea al
menos dos veces mayor en un tumor de pulmón que en un tejido
normal, según se determina utilizando un ensayo representativo aquí
proporcionado). Dichas exploraciones pueden ser llevadas a cabo
utilizando una micromatriz Synteni (Palo Alto, California, EE.UU.)
de acuerdo con las instrucciones del fabricante (y esencialmente del
modo descrito por Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93: 10.614-10.619, 1996, y por Heller et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155, 1997).
Alternativamente, los polipéptidos pueden ser multiplicados a partir
de cDNA preparado de células que expresan las proteínas aquí
descritas, tales como células tumorales de pulmón. Dichos
polinucleótidos pueden ser multiplicados por medio de una reacción
en cadena de la polimerasa (PCR). Para este planteamiento, se
pueden diseñar cebadores específicos de secuencia basándose en las
secuencias aquí proporcionadas, cebadores que pueden ser adquiridos
o sintetizados.
Se puede utilizar una porción multiplicada para
aislar un gen de longitud completa a partir de un banco adecuado
(por ejemplo, un banco de cDNA de tumor de pulmón) utilizando
técnicas bien conocidas. En dichas técnicas, se explora un banco
(de cDNA o genómico) utilizando uno o más cebadores o sondas
polinucleotídicos adecuados para multiplicación. Preferiblemente,
el banco es seleccionado en cuanto a tamaños para incluir moléculas
más grandes. También se pueden preferir bancos cebados aleatorios
para identificar regiones 5' y secuencia arriba de genes. Se
prefieren bancos genómicos para obtener intrones y secuencias 5' de
extensión.
Para técnicas de hibridación, se puede marcar
(por ejemplo, mediante traslado de cortes o marcación final con
^{32}P) una secuencia parcial utilizando técnicas bien conocidas.
Luego se explora un banco de bacterias o bacteriófagos hibridando
filtros que contienen colonias bacterianas desnaturalizadas (o capas
que contienen placas de fagos) con la sonda marcada (véase Sambrook
et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold
Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, EE.UU.,
1989). Se seleccionan y propagan las colonias o placas hibridantes
y se aísla el DNA para un análisis ulterior. Se pueden analizar los
clones de cDNA para determinar la cantidad de secuencia adicional
mediante, por ejemplo, una PCR en que se usa un cebador de la
secuencia parcial y un cebador del vector. Se pueden generar mapas
de restricción y secuencias parciales para identificar uno o más
clones solapantes. Luego se puede determinar la secuencia completa
usando técnicas estándares, lo que puede implicar la generación de
una serie de clones de deleción. Luego se ensamblan las secuencias
solapantes resultantes en una sola secuencia contigua. Se puede
generar una molécula de cDNA de longitud completa al ligar
fragmentos adecuados usando técnicas bien conocidas.
Alternativamente, hay numerosas técnicas de
multiplicación para obtener una secuencia de codificación de
longitud completa a partir de una secuencia parcial de cDNA. En
dichas técnicas, la multiplicación se lleva generalmente a cabo por
medio de PCR. Para llevar a cabo la operación de multiplicación, se
puede usar cualquiera de una diversidad de sistemas comercialmente
asequibles. Se pueden diseñar cebadores usando, por ejemplo, un
software bien conocido en la técnica. Los cebadores tienen
preferiblemente una longitud de 22-30 nucleótidos,
tienen un contenido de GC de al menos 50% y se hibridan con la
secuencia diana a temperaturas de aproximadamente 68ºC a 72ºC. La
región multiplicada puede ser secuenciada del modo anteriormente
descrito, y las secuencias solapantes pueden ser ensambladas en una
secuencia contigua.
Una de dichas técnicas de multiplicación es la
PCR inversa (véase Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16: 8186,
1988), en que se usan enzimas de restricción para generar un
fragmento en la región conocida del gen. El fragmento es luego
vuelto circular por ligación intramolecular y es utilizado como
molde para la PCR con cebadores divergentes derivados de la región
conocida. En un planteamiento alternativo, se pueden recuperar
secuencias adyacentes a una secuencia parcial por multiplicación
con un cebador para una secuencia conectora y un cebador específico
para una región conocida. Las secuencias multiplicadas son
típicamente sometidas a un segundo ciclo de multiplicación con el
mismo cebador de conector y con un segundo cebador específico para
la región conocida. En el Documento WO 96/38591 se describe una
variación de este procedimiento, en la que se emplean dos cebadores
que inician la extensión en direcciones opuestas desde la secuencia
conocida. Otra de dichas técnicas es conocida como
"multiplicación rápida de extremos de cDNA" o RACE (del inglés,
rapid amplification of cDNA ends). Esta técnica implica el uso de
un cebador interno y un cebador externo, que se hibrida con una
región de poliA o una secuencia vector, para identificar secuencias
que son 5' y 3' con respecto a una secuencia conocida. Técnicas
adicionales incluyen PCR de captura (Lagerstrom et al., PCR
Methods Applic. 1: 111-19, 1991) y PCR itinerante
("walking") (Parker et al., Nucl. Acids Res. 19:
3055-60, 1991). Para obtener una secuencia de cDNA
de longitud completa, también se pueden emplear otros métodos en
que se emplea multiplicación.
En ciertos casos, es posible obtener una
secuencia de cDNA de longitud completa por análisis de las
secuencias proporcionadas en una base de datos de etiquetas de
secuencia expresada (ESTs; del inglés, expressed sequence tags),
tal como la asequible de GenBank. Se pueden llevar generalmente a
cabo búsquedas de ESTs solapantes usando programas bien conocidos
(por ejemplo, búsquedas NCBI BLAST), y dichas ESTs pueden ser
utilizadas para generar una secuencia contigua de longitud
completa. Mediante el análisis de fragmentos genómicos, también se
pueden obtener secuencias de DNA de longitud completa.
En las ID. SEC. números 1-109,
111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160,
162-164, 167, 168, 171, 173, 175,
177-224, 255-337, 345, 347 y 349 se
proporcionan ciertas secuencias de ácido nucleico de moléculas de
cDNA que codifican porciones de proteínas tumorales de pulmón.
Las variantes polinucleotídicas pueden ser
generalmente preparadas mediante cualquier método conocido en la
técnica, incluyendo la síntesis química mediante, por ejemplo,
síntesis química de la fosforamidita en fase sólida. También se
pueden introducir modificaciones en una secuencia polinucleotídica
utilizando técnicas de mutagénesis estándares, tal como la
mutagénesis específica del sitio y dirigida por oligonucleótidos
(véase Adelman et al., DNA 2: 183, 1983). Alternativamente,
se pueden generar moléculas de RNA mediante la transcripción in
vitro o in vivo de secuencias de DNA que codifican una
proteína tumoral de pulmón, o una porción de la misma, con tal de
que el DNA se incorpore a un vector con un adecuado promotor de RNA
polimerasa (tal como T7 o SP6). Se pueden utilizar ciertas
porciones para preparar un polipéptido codificado como el aquí
descrito. Además o alternativamente, se puede administrar una
porción a un paciente para que el polipéptido codificado se genere
in vivo (por ejemplo, al transfectar células presentadoras de
antígenos, tales como células dendríticas, con una construcción de
cDNA que codifica un polipéptido tumoral de pulmón y administrar
las células transfectadas al paciente).
También se puede utilizar una porción de una
secuencia complementaria de una secuencia de codificación (es
decir, un polinucleótido antisentido) como una sonda o para modular
la expresión génica. Construcciones de cDNA que pueden ser
transcritas en RNA antisentido pueden ser también introducidas en
células de tejidos para facilitar la producción de RNA antisentido.
Se puede utilizar un polinucleótido antisentido, como aquí se
describe, para inhibir la expresión de una proteína tumoral. Se
puede utilizar la tecnología antisentido para controlar la
expresión génica a través de la formación de hélices triples, lo que
compromete la capacidad de la hélice doble para abrirse
suficientemente para la unión de polimerasas, factores de
transcripción o moléculas reguladoras [véase Gee et al. en
Huber y Carr, "Molecular and Immunologic Approaches", Futura
Publishing Co. (Mt. Kisco, New York, EE.UU., 1994)].
Alternativamente, se puede diseñar una molécula antisentido para
que se hibride con una región de control de un gen (por ejemplo, un
promotor, potenciador o sitio de inicio de la transcripción) y
bloquee la transcripción del gen; o para bloquear la traducción al
inhibir la unión de un transcrito a ribosomas.
También se puede diseñar una porción de una
secuencia de codificación, o de una secuencia complementaria, como
una sonda o un cebador para detectar la expresión génica. Las sondas
pueden ser marcadas con una diversidad de grupos informadores,
tales como radionucleidos y enzimas, y tienen preferiblemente una
longitud de al menos 10 nucleótidos, más preferiblemente una
longitud de al menos 20 nucleótidos y aún más preferiblemente una
longitud de al menos 30 nucleótidos. Los cebadores, como se indicó
anteriormente, tienen preferiblemente una longitud de
22-30 nucleótidos.
Cualquier polinucleótido puede ser
adicionalmente modificado para aumentar la estabilidad in
vivo. Las posibles modificaciones incluyen, pero no se limitan
a, la adición de secuencias flanqueadoras a los extremos 5' y/o 3';
el uso de enlaces fosforotioato o
2'-O-metil en lugar de enlaces
fosfodiesterasa en la cadena principal; y/o la inclusión de bases
no tradicionales tales como inosina, queosina y wybutosina, así como
de formas acetílicas, metílicas y tiólicas y otras formas
modificadas de la adenina, citidina, guanina, timina y uridina.
Secuencias de nucleótidos como las aquí
descritas pueden ser unidas a una diversidad de otras secuencias de
nucleótidos utilizando técnicas de DNA recombinante establecidas.
Por ejemplo, un polinucleótido puede ser clonado en cualquiera de
una diversidad de vectores de clonación, incluyendo plásmidos,
fagémidos, derivados del fago lambda y cósmidos. Los vectores de
particular interés incluyen vectores de expresión, vectores de
replicación, vectores para generación de sondas y vectores de
secuenciación. En general, un vector contendrá un origen de
replicación funcional en al menos un organismo, sitios convenientes
para endonucleasas de restricción, y uno o más marcadores
seleccionables. Otros elementos dependerán del uso deseado y serán
evidentes para quienes tienen una experiencia normal en la
técnica.
En ciertas realizaciones, se pueden formular
polinucleótidos para permitir la entrada en una célula de un
mamífero y su expresión en ella. Dichas formulaciones son
particularmente útiles con fines terapéuticos, como se describe más
adelante. Quienes tienen una experiencia normal en la técnica
apreciarán que hay muchos modos de alcanzar la expresión de un
polinucleótido en una célula diana, y se puede emplear cualquier
método adecuado. Por ejemplo, un polinucleótido puede ser
incorporado a un vector vírico tal como, pero sin limitarse a, un
adenovirus, un virus adenoasociado, un retrovirus o un virus
vaccinia u otro poxvirus (por ejemplo, un poxvirus aviar). Los
polinucleótidos pueden ser también administrados como vectores
plasmídicos desnudos. Las técnicas para incorporar DNA a dichos
vectores son bien conocidas por quienes tienen una experiencia
normal en este campo técnico. Un vector retrovírico puede además
transferir o llevar incorporado un gen para un marcador
seleccionable (para facilitar la identificación o selección de las
células transducidas) y/o un grupo de acceso, tal como un gen que
codifica un ligando para un receptor de una célula diana específica,
para hacer al vector específico de la diana. El acceso puede ser
llevado también a cabo utilizando un anticuerpo, mediante métodos
conocidos por quienes tienen una experiencia normal en la
técnica.
Otras formulaciones con fines terapéuticos
incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de
macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, glóbulos y sistemas
basados en lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua,
micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal preferido
para uso como vehículo de distribución in vitro e in
vivo es un liposoma (es decir, una vesícula con membrana
artificial). La preparación y el uso de dichos sistemas son bien
conocidos en la técnica.
En el contexto de la presente descripción, los
polipéptidos pueden comprender al menos una porción inmunogénica de
una proteína tumoral de pulmón o una variante de la misma, como se
describe aquí. Como se indicó anteriormente, una "proteína
tumoral de pulmón" es una proteína que es expresada por células
tumorales de pulmón. Las proteínas que son proteínas tumorales de
pulmón también reaccionan detectablemente en un inmunoensayo (tal
como un ELISA) con antisueros de un paciente con cáncer de pulmón.
Los polipéptidos como los aquí descritos pueden tener cualquier
longitud. Pueden estar presentes secuencias adicionales derivadas de
la proteína nativa y/o secuencias heterólogas, y dichas secuencias
pueden poseer (aunque no necesariamente) otras propiedades
inmunogénicas o antigénicas.
Como se utiliza aquí, una "porción
inmunogénica" es una porción de una proteína que es reconocida
por (es decir, que se une específicamente a) un receptor antigénico
de la superficie de células B y/o células T. Dichas porciones
inmunogénicas comprenden generalmente al menos 5 restos de
aminoácido, más preferiblemente al menos 10, y aún más
preferiblemente al menos 20 restos de aminoácido, de una proteína
tumoral de pulmón o una variante de la misma. Ciertas porciones
inmunogénicas preferidas incluyen péptidos en que se han suprimido
una secuencia líder N-terminal y/o un dominio
transmembranal. Otras porciones inmunogénicas preferidas pueden
contener una pequeña supresión N-terminal y/o
C-terminal (por ejemplo, 1-30
aminoácidos, preferiblemente 5-15 aminoácidos) con
respecto a la proteína madura.
Se pueden identificar generalmente porciones
inmunogénicas utilizando técnicas bien conocidas, tales como las
resumidas por Paul, Fundamental Immunology, 3ª edición,
243-247 (Raven Press, 1993), y en las referencias
allí citadas. Dichas técnicas incluyen la exploración de
polipéptidos en cuanto a la capacidad para reaccionar con
anticuerpos, antisueros y/o líneas o clones de células T,
específicos de antígeno. Como se utiliza aquí, los antisueros y
anticuerpos son "específicos de antígeno" si se unen
específicamente a un antígeno (es decir reaccionan con la proteína
en un ELISA o en otro inmunoensayo y no reaccionan detectablemente
con proteínas no relacionadas). Dichos antisueros y anticuerpos
pueden ser preparados del modo aquí descrito y utilizando técnicas
bien conocidas. Una porción inmunogénica de una proteína tumoral
nativa de pulmón es una porción que reacciona con dichos antisueros
y/o células T en un nivel que no es sustancialmente menor que la
reactividad del polipéptido de longitud completa (por ejemplo, en
un ELISA y/o un ensayo de reactividad con células T). Dichas
porciones inmunogénicas pueden reaccionar en dichos ensayos con un
nivel que es similar o superior a la reactividad del polipéptido de
longitud completa. Dichas exploraciones pueden ser llevadas
generalmente a cabo utilizando métodos bien conocidos por quienes
tienen una experiencia normal en la técnica, tales como los
descritos por Harlow y Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Por ejemplo, un polipéptido
puede ser inmovilizado sobre un soporte sólido y ser puesto en
contacto con sueros de pacientes para permitir la unión de
anticuerpos de los sueros con el polipéptido inmovilizado. Los
sueros no unidos pueden ser luego eliminados, y los anticuerpos
unidos pueden ser detectados utilizando, por ejemplo, Proteína A
marcada con ^{125}I.
Como se indicó anteriormente, una composición
puede comprender una variante de una proteína tumoral nativa de
pulmón. Como se usa aquí, una "variante" del polipéptido es un
polipéptido que difiere de una proteína tumoral nativa de pulmón en
una o más sustituciones, supresiones, adiciones y/o inserciones, de
modo que la inmunogenicidad del polipéptido no resulta
sustancialmente disminuida. En otras palabras, la capacidad de una
variante para reaccionar con antisueros específicos de antígeno
puede resultar potenciada o inalterada con respecto a la de la
proteína nativa, o puede resultar disminuida en menos de un 50%, y
preferiblemente en menos de un 20%, con respecto a la de la
proteína nativa. Dichas variantes pueden ser generalmente
identificadas modificando una de las anteriores secuencias
polipeptídicas y evaluando la reactividad del modificado polipéptido
con anticuerpos o antisueros específicos de antígeno como los aquí
descritos. Las variantes preferidas incluyen aquellas en que se han
eliminado una o más porciones, tal como una secuencia líder
N-terminal o un dominio transmembranal. Otras
variantes preferidas incluyen variantes en que una pequeña porción
(por ejemplo, 1-30 aminoácidos, preferiblemente
5-15 aminoácidos) ha sido eliminada del extremo N
y/o C de la proteína madura.
Las variantes polipeptídicas presentan
preferiblemente una identidad (determinada del modo anteriormente
descrito) de al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente de
al menos aproximadamente 90% y muy preferiblemente de al menos
aproximadamente 95%, con respecto a los polipéptidos
identificados.
Preferiblemente, una variante contiene
sustituciones conservativas. Una "sustitución conservativa" es
aquélla en que un aminoácido es sustituido por otro aminoácido que
tiene propiedades similares, de modo que un experto en la técnica
de la química peptídica esperaría que la estructura secundaria y la
naturaleza hidropática del polipéptido resultaran sustancialmente
inalteradas. Las sustituciones de aminoácidos se pueden realizar
generalmente basándose en similitudes en la polaridad, carga,
solubilidad, hidrofobia, hidrofilia y/o naturaleza anfipática de
los restos. Por ejemplo, los aminoácidos negativamente cargados
incluyen el ácido aspartico y el ácido glutámico; los aminoácidos
positivamente cargados incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos
con grupos cabeceros polares no cargados que tienen valores de
hidrofilia similares incluyen leucina, isoleucina y valina;
glicocola y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina,
fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden
representar cambios conservativos incluyen: (1) ala, pro, gly, glu,
asp, gln, asn, ser y thr; (2) cys, ser, tyr y thr; (3) val, ile,
leu, met, ala y phe; (4) lys, arg e his; y (5) phe, tyr, trp e his.
Una variante puede además, o alternativamente, contener cambios no
conservativos. En una realización preferida, los polipéptidos
variantes difieren de una secuencia nativa por sustitución,
supresión o adición de cinco aminoácidos o menos. Las variantes
pueden además (o alternativamente) estar modificadas mediante, por
ejemplo, la supresión o adición de aminoácidos que ejercen una
influencia mínima sobre la inmunogenicidad, la estructura
secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido.
Como se indicó anteriormente, los polipéptidos
pueden comprender una secuencia señal (o líder) en el extremo
N-terminal de la proteína, que dirige cotraduccional
o postraduccionalmente la transferencia de la proteína. El
polipéptido puede estar además conjugado con un conector u otra
secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación
del polipéptido (por ejemplo, poli-His) o para
potenciar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por
ejemplo, un polipéptido puede estar conjugado con una región Fc de
inmunoglobulina.
Los polipéptidos pueden ser preparados
utilizando cualquiera de una diversidad de técnicas bien conocidas.
Los polipéptidos recombinantes codificados por secuencias de DNA
como las anteriormente descritas pueden ser fácilmente preparados a
partir de las secuencias de DNA utilizando cualquiera de una
diversidad de vectores de expresión conocidos por quienes tienen
una experiencia normal en la técnica. La expresión puede llevarse a
cabo en cualquier célula huésped apropiada que haya sido
transformada o transfectada con un vector de expresión que contiene
una molécula de DNA que codifica un polipéptido recombinante. Las
células huésped adecuadas incluyen procariontes, células de
levadura, células eucarióticas superiores y células vegetales.
Preferiblemente, las células huésped empleadas son de E.
coli, levadura o una línea celular de mamífero tal como COS o
CHO. En primer lugar, utilizando un filtro comercialmente
asequible, se pueden concentrar los sobrenadantes de los sistemas
de huésped/vector adecuados que secretan la proteína o polipéptido
recombinante a los medios de cultivo. Después de la concentración,
el producto de concentración puede ser aplicado a una adecuada
matriz de purificación, tal como una matriz de afinidad o una
resina de intercambio iónico. Finalmente, se pueden emplear una o
más operaciones de cromatografía de alta eficacia en estado líquido
(HPLC; del inglés, high performance liquid
chromatography) y fase inversa para purificar más el
polipéptido recombinante.
También se pueden generar porciones y otras
variantes que tengan menos de aproximadamente 100 aminoácidos, y
generalmente menos de aproximadamente 50 aminoácidos, por medios
sintéticos usando técnicas bien conocidas por quienes tienen una
experiencia normal en este campo técnico. Por ejemplo, dichos
polipéptidos pueden ser sintetizados utilizando cualquiera de las
técnicas en fase sólida comercialmente asequibles, tal como el
método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que se
añaden sucesivamente aminoácidos a una cadena de aminoácidos en
crecimiento; véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:
2149-2154, 1963. El equipo para la síntesis
automatizada de polipéptidos es comercialmente asequible de
proveedores tales como Perkin Elmer/Applied Biosystems Division
(Foster City, California, EE.UU.) y puede ser hecho funcionar de
acuerdo con las instrucciones del fabricante.
En ciertas realizaciones específicas, el
polipéptido puede ser una proteína de fusión que comprende múltiples
polipéptidos como los aquí descritos o que comprende al menos un
polipéptido como el aquí descrito y una secuencia no relacionada,
tal como una proteína tumoral conocida. La pareja de fusión puede,
por ejemplo, ayudar a proporcionar epítopos cooperadores T (una
pareja de fusión inmunológica), preferiblemente epítopos
cooperadores T reconocidos por seres humanos, o puede ayudar a la
expresión de la proteína (un agente potenciador de la expresión) con
mayores rendimientos que la proteína recombinante nativa. Ciertas
parejas de fusión preferidas son parejas de fusión tanto
inmunológicas como potenciadoras de la expresión. Se pueden
seleccionar otras parejas de fusión con objeto de aumentar la
solubilidad de la proteína o de permitir que la proteína se dirija a
compartimentos intracelulares deseados. Aún otras parejas de fusión
incluyen etiquetas de afinidad, que facilitan la purificación de la
proteína.
Las proteínas de fusión pueden ser generalmente
preparadas utilizando técnicas estándares, incluyendo la conjugación
química. Preferiblemente, la proteína de fusión se expresa como una
proteína recombinante, lo que permite la producción de niveles
aumentados, con respecto a los de una proteína no fusionada, en un
sistema de expresión. En resumen, secuencias de DNA que codifican
los componentes polipeptídicos pueden ser ensambladas separadamente
y ser ligadas en un vector de expresión apropiado. El extremo 3' de
la secuencia de DNA que codifica un componente polipéptido es
ligado, con o sin un conector peptídico, al extremo 5' de una
secuencia de DNA que codifica el segundo componente polipeptídico
para que los marcos de lectura de las secuencias estén en fase. Esto
permite la traducción en una sola proteína de fusión que conserva
la actividad biológica de ambos polipéptidos componentes.
Se puede emplear una secuencia conectora
peptídica para separar los componentes polipeptídicos primero y
segundo por una distancia suficiente para asegurar que cada
polipéptido se pliega en sus estructuras secundaria y terciaria.
Dicha secuencia conectora peptídica es incorporada a la proteína de
fusión utilizando técnicas estándares bien conocidas en este campo
técnico. Se pueden escoger secuencias conectoras peptídicas
adecuadas basándose en los factores siguientes: (1) su capacidad
para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su
incapacidad para adoptar una estructura secundaria que pudiera
interaccionar con epítopos funcionales de los polipéptidos primero
y segundo; y (3) la carencia de restos hidrófobos o cargados que
pudieran reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido.
Las secuencias conectoras peptídicas preferidas contienen restos de
Gly, Asn y Ser. También se pueden utilizar otros aminoácidos casi
neutros, tales como Thr y Ala, en la secuencia conectora. Las
secuencias de aminoácidos que pueden ser útilmente empleadas como
conectores incluyen las descritas por Maratea et al., Gene
40: 39-46, 1985; y Murphy et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 83: 8258-8262, 1986; y en la Patente
de EE.UU. número 4.935.223 y la Patente de EE.UU. número 4.751.180.
La secuencia conectora puede tener generalmente una longitud de 1 a
aproximadamente 50 aminoácidos. No se requieren secuencias
conectoras cuando los polipéptidos primero y segundo tienen
regiones de aminoácidos N-terminales no esenciales
que pueden ser usadas para separar los dominios funcionales y
evitar una interferencia estérica.
Las secuencias de DNA ligadas son operativamente
unidas a adecuados elementos reguladores de la transcripción o la
traducción. Los elementos reguladores responsables de la expresión
de DNA están solamente situados en 5' con respecto a la secuencia
de DNA que codifica los polipéptidos primeros. Similarmente, los
codones de parada necesarios para detener la traducción y las
señales de terminación de la transcripción están sólo presentes en
3' con respecto a la secuencia de DNA que codifica el polipéptido
segundo.
También se proporcionan proteínas de fusión que
comprenden un polipéptido del presente invento junto con una
proteína inmunogénica no relacionada. Preferiblemente, la proteína
inmunogénica es capaz de provocar una respuesta de memoria. Los
ejemplos de dichas proteínas incluyen proteínas del tétanos, la
tuberculosis y la hepatitis (véase, por ejemplo, Stoute et
al., New Engl. J. Med. 336: 86-91, 1997).
En realizaciones preferidas, la pareja de fusión
inmunológica procede de la proteína D, una proteína superficial de
la bacteria Gram negativa Haemophilus influenza B (Documento
WO 91/18926). Preferiblemente, un derivado de la proteína D
comprende aproximadamente el primer tercio de la proteína (por
ejemplo, los primeros 100-110 aminoácidos
N-terminales), y el derivado de la proteína D puede
estar lipidado. En ciertas realizaciones preferidas, se incluyen
los primeros 109 restos de una pareja de fusión de Lipoproteína D en
el extremo N para obtener el polipéptido con epítopos de células T
exógenas adicionales y para aumentar el nivel de expresión en E.
coli (actuando de este modo como un potenciador de la
expresión). La cola lipídica asegura la presentación óptima del
antígeno a las células presentadoras de antígenos. Otras parejas de
fusión incluyen la proteína no estructural de influenzavirus, NS1
(hemaglutinina). Típicamente, se usan los 81 aminoácidos
N-terminales, aunque se pueden utilizar fragmentos
diferentes que incluyan epítopos cooperadores T.
En otra realización, la pareja de fusión
inmunológica es la proteína conocida como LYTA, o una porción de la
misma (preferiblemente una porción C-terminal). LYTA
procede del Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una
N-acetil-L-alanina
amidasa conocida como amidasa LYTA (codificada por el gen LytA; Gene
43: 265-292, 1986). LYTA es una autolisina que
degrada específicamente ciertos enlaces de la cadena principal de
peptidoglicano. El dominio C-terminal de la
proteína LYTA es responsable de la afinidad a la colina o a ciertos
compuestos análogos a la colina, tal como el DEAE. Esta propiedad
ha sido explotada para el desarrollo de plásmidos que expresan
C-LYTA en E. coli, útiles para la expresión
de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas
híbridas que contienen el fragmento C-LYTA en el
extremo amínico (véase Biotechnology 10: 795-798,
1992). En una realización preferida, puede incorporarse una porción
de repetición de LYTA a una proteína de fusión. Se encuentra una
porción de repetición en la región C-terminal que
comienza en el resto 178. Una porción de repetición particularmente
preferida lleva incorporados los restos 188-305.
En general, se aíslan polipéptidos (incluyendo
proteínas de fusión) y polinucleótidos como los aquí descritos. Un
polipéptido o polinucleótido "aislado" es aquél que está
separado de su ambiente original. Por ejemplo, una proteína
presente en la naturaleza está aislada si está separada de algunos
de, o todos, los materiales coexistentes en el sistema natural.
Preferiblemente, dichos polipéptidos tienen una pureza de al menos
aproximadamente 90%, más preferiblemente una pureza de al menos
aproximadamente 95% y muy preferiblemente una pureza de al menos
aproximadamente 99%. Se considera que un polinucleótido está aislado
si, por ejemplo, está clonado en un vector que no forma parte del
ambiente natural.
La descripción presente proporciona además
agentes, tales como anticuerpos y fragmentos de los mismos que se
unen a antígenos, que se unen específicamente a una proteína tumoral
de pulmón. Como se utiliza aquí, se dice que un anticuerpo, o un
fragmento del mismo que se une a antígenos, se "une
específicamente" a una proteína tumoral de pulmón si reacciona
con un nivel detectable (por ejemplo, en un ELISA) con una proteína
tumoral de pulmón y no reacciona detectablemente bajo condiciones
similares con proteínas no relacionadas. Como se utiliza aquí,
"unión" se refiere a una asociación no covalente entre dos
moléculas distintas de modo que se forma un complejo. La capacidad
para unirse puede ser evaluada, por ejemplo, determinando la
constante de unión para la formación del complejo. La constante de
unión es el valor obtenido cuando la concentración del complejo es
dividida por el producto de las concentraciones de los componentes.
En general, se dice que dos compuestos "se unen", en el
contexto del presente invento, cuando la constante de unión para la
formación del complejo excede de aproximadamente 10^{3} l/mol. La
constante de unión puede ser determinada utilizando métodos bien
conocidos en la técnica.
Los agentes ligantes pueden además ser capaces
de diferenciar entre pacientes con y sin un cáncer, tal como cáncer
de pulmón, usando los ensayos representativos aquí proporcionados.
En otras palabras, los anticuerpos u otros agentes ligantes que se
unen a una proteína tumoral de pulmón generarán una señal que indica
la presencia de un cáncer en al menos aproximadamente el 20% de los
pacientes con la enfermedad y generarán una señal negativa que
indica la ausencia de la enfermedad en al menos aproximadamente el
90% de los individuos sin el cáncer. Para determinar si un agente
ligante satisface este requisito, se pueden analizar muestras
biológicas (por ejemplo, sangre, suero, esputo, orina y/o biopsias
tumorales) de pacientes con y sin cáncer (según se determina
utilizando pruebas clínicas estándares), del modo aquí descrito, en
cuanto a la presencia de polipéptidos que se unen al agente
ligante. Es evidente que se debería analizar un número
estadísticamente significativo de muestras con y sin la enfermedad.
Cada agente ligante debería satisfacer los criterios anteriores; sin
embargo, quienes tienen una experiencia normal en la técnica
reconocerán que se pueden utilizar agentes ligantes en combinación
para mejorar la sensibilidad.
Cualquier agente que satisfaga los requisitos
anteriores puede ser un agente ligante. Por ejemplo, un agente
ligante puede ser un ribosoma, con o sin un componente peptídico,
una molécula de RNA o un polipéptido. En una realización preferida,
un agente ligante es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se
une a antígenos. Se pueden preparar anticuerpos mediante
cualesquiera de una diversidad de técnicas conocidas por quienes
tienen una experiencia normal en este campo técnico. Véase, por
ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, se pueden producir
anticuerpos mediante técnicas de cultivo celular, incluyendo la
generación de anticuerpos monoclonales como los aquí descritos, o
por medio de la transfección de genes de anticuerpos en adecuados
huéspedes celulares de bacteria o mamífero, con objeto de permitir
la producción de anticuerpos recombinantes. En una técnica, un
inmunógeno que comprende el polipéptido es inicialmente inyectado
en cualesquiera de una gran variedad de mamíferos (por ejemplo,
ratones, ratas, conejos, ovejas o cabras). En esta operación, los
polipéptidos de este invento pueden servir como inmunógeno sin
modificación. Alternativamente, particularmente para polipéptidos
relativamente cortos, se puede provocar una respuesta inmune
superior si el polipéptido es unido a una proteína portadora, tal
como albúmina sérica bovina o hemocianina de lapa
Fissurella. Se inyecta el inmunógeno al huésped animal,
preferiblemente de acuerdo con un programa predeterminado que
incorpora una o más inmunizaciones de refuerzo, y se sangra
periódicamente a los animales. Luego se pueden purificar los
anticuerpos policlonales específicos para el polipéptido a partir
de dichos antisueros mediante, por ejemplo, cromatografía de
afinidad utilizando el polipéptido copulado a un soporte sólido
adecuado.
Se pueden preparar anticuerpos monoclonales
específicos para un polipéptido antigénico de interés utilizando,
por ejemplo, la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6:
511-519, 1976, y mejoras de la misma. En resumen,
estos métodos implican la preparación de líneas celulares inmortales
capaces de producir anticuerpos que tienen la especificidad (es
decir, reactividad con el polipéptido de interés) deseada. Dichas
líneas celulares pueden ser producidas, por ejemplo, a partir de
células de bazo obtenidas de un animal inmunizado del modo
anteriormente descrito. Las células de bazo son luego inmortalizadas
mediante, por ejemplo, fusión con una pareja de fusión de célula de
mieloma, preferiblemente una que sea singénica con respecto al
animal inmunizado. Se puede emplear una diversidad de técnicas de
fusión. Por ejemplo, se pueden combinar las células de bazo y las
células de mieloma con un detergente no iónico durante algunos
minutos y se pueden sembrar luego, con baja densidad, en un medio
selectivo que soporta el crecimiento de células híbridas pero no de
células de mieloma. En una técnica de selección preferida se
utiliza la selección en HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina).
Después de un tiempo suficiente, normalmente de aproximadamente 1 a
2 semanas, se observan colonias de híbridos. Se seleccionan
colonias individuales y se analizan sus sobrenadantes de cultivo en
cuanto a su actividad ligante frente al polipéptido. Se prefieren
los hibridomas que tienen una reactividad y una especificidad
elevadas.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser aislados
de los sobrenadantes de colonias de hibridomas en crecimiento.
Además, se pueden emplear diversas técnicas para aumentar el
rendimiento, tal como la inyección de la línea de hibridomas en la
cavidad peritoneal de un huésped vertebrado adecuado, tal como un
ratón. Los anticuerpos monoclonales pueden ser luego recolectados
del fluido ascítico o de la sangre. Los contaminantes pueden ser
separados de los anticuerpos mediante técnicas convencionales, tales
como cromatografía, filtración en gel, precipitación y extracción.
Los polipéptidos de este invento pueden ser utilizados en el proceso
de purificación, tal como, por ejemplo, en una operación de
cromatografía de afinidad.
En ciertas realizaciones, se puede preferir el
uso de fragmentos de anticuerpo que se unen a antígenos. Dichos
fragmentos incluyen fragmentos Fab, que pueden ser preparados
utilizando técnicas estándares. En resumen, se pueden purificar
inmunoglobulinas de suero de conejo mediante cromatografía de
afinidad en columnas con glóbulos de Proteína A (Harlow y Lane,
"Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Laboratory, 1988) y se pueden someter a digestión con papaína para
obtener fragmentos Fab y Fc. Los fragmentos Fab y Fc pueden ser
separados por cromatografía de afinidad en columnas con glóbulos de
proteína A.
Los anticuerpos monoclonales del presente
invento pueden ser copulados con uno o más agentes terapéuticos. A
este respecto, los agentes adecuados incluyen radionucleidos,
agentes inductores de diferenciación, fármacos, toxinas, y
derivados de los mismos. Los radionucleidos preferidos incluyen
^{90}Y, ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I, ^{186}Re, ^{188}Re,
^{211}At y ^{212}Bi. Los fármacos preferidos incluyen
metotrexato y compuestos análogos de pirimidina y purina. Los
agentes inductores de diferenciación preferidos incluyen ésteres de
forbol y ácido butírico. Las toxinas preferidas incluyen ricina,
abrina, toxina de difteria, toxina de cólera, gelonina, exotoxina
de Pseudomonas, toxina de Shigella y proteína
antiviral de Phytolacca americana.
Se puede copular (por ejemplo, enlazar
covalentemente) directa o indirectamente (por ejemplo, a través de
un grupo conector) un agente terapéutico a un anticuerpo monoclonal
adecuado. Es posible una reacción directa entre un agente y un
anticuerpo cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar
con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleófilo, tal como un grupo
amino o sulfhidrilo, de uno puede ser capaz de reaccionar con un
grupo que contiene carbonilo, tal como un anhídrido o un haluro de
ácido, o con un grupo alquilo que contiene un buen grupo lábil (por
ejemplo, un haluro), del otro.
Alternativamente, puede ser deseable copular un
agente terapéutico con un anticuerpo a través de un grupo conector.
Un grupo conector puede actuar como un espaciador para alejar el
anticuerpo del agente con objeto de evitar una interferencia en las
capacidades ligantes. Un grupo conector puede también servir para
aumentar la reactividad química de un sustituyente de un agente o
un anticuerpo y, de este modo, aumentar la eficacia de la
copulación. Un aumento de la reactividad química puede también
facilitar el uso de agentes, o de grupos funcionales de agentes,
que, de otra manera, no serían utilizables.
Resultará evidente a los expertos en la técnica
que, como grupo conector, se puede emplear una diversidad de
reactivos bifuncionales o polifuncionales, tanto homofuncionales
como heterofuncionales (tales como los descritos en el catálogo de
Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, EE.UU.). La copulación
puede efectuarse, por ejemplo, a través de grupos amino, grupos
carboxilo, grupos sulfhidrilo o restos oxidados de hidratos de
carbono. Hay numerosas referencias en que se describe dicha
metodología, tal como, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº
4.671.958, concedida a Rodwell et al.
Cuando un agente terapéutico es más potente
cuando se libera de la porción de anticuerpo de los productos de
inmunoconjugación del presente invento, puede ser deseable utilizar
un grupo conector que sea escindible durante o tras la
internalización en una célula. Se ha descrito un número de
diferentes grupos conectores escindibles. Los mecanismos de la
liberación intracelular de un agente de estos grupos conectores
incluye la escisión por reducción de un enlace disulfuro (por
ejemplo, Patente de EE.UU. nº 4.489.710, concedida a Spitler), por
irradiación de un enlace fotolábil (por ejemplo, Patente de EE.UU.
nº 4.625.014, concedida a Senter et al.), por hidrólisis de
cadenas laterales de aminoácidos derivatizados (por ejemplo, Patente
de EE.UU. nº 4.638.045, concedida a Kohn et al.), por
hidrólisis mediada por complemento sérico (por ejemplo, Patente de
EE.UU. nº 4.671.958, concedida a Rodwell et al.) y por
hidrólisis catalizada por ácido (por ejemplo, Patente de EE.UU. nº
4.569.789, concedida a Blattler et al.).
Puede ser deseable copular más de un agente con
un anticuerpo. En una realización, se copulan múltiples moléculas
de un agente con una molécula de anticuerpo. En otra realización, se
puede copular más de un tipo de agente con un anticuerpo.
Independientemente de la realización concreta, se pueden preparar
productos de inmunoconjugación con más de un agente de diversas
maneras. Por ejemplo, se puede copular directamente más de un agente
con una molécula de anticuerpo o se pueden utilizar conectores que
proporcionen múltiples sitios de fijación. Alternativamente, se
puede utilizar un portador.
Un portador puede llevar los agentes de diversas
maneras, incluyendo la unión covalente, sea directamente o sea a
través de un grupo conector. Los portadores adecuados incluyen
proteínas tales como albúminas (por ejemplo, Patente de EE.UU. nº
4.507.234, concedida a Kato et al.), péptidos y polisacáridos
tales como el aminodextrano (por ejemplo, Patente de EE.UU. nº
4.699.784, concedida a Shih et al.). Un portador puede llevar
también un agente por unión no covalente o por encapsulación, tal
como dentro de una vesícula liposómica (por ejemplo, Patentes de
EE.UU. números 4.429.008 y 4.873.088). Los portadores específicos
para agentes radionucleídicos incluyen compuestos quelantes y
moléculas pequeñas radiohalogenadas. Por ejemplo, en la Patente de
EE.UU. nº 4.735.792 se describen moléculas pequeñas
radiohalogenadas representativas y sus síntesis. Se puede formar un
quelato radionucleídico a partir de compuestos quelantes que
incluyen aquellos que contienen átomos de nitrógeno y azufre como
átomos dadores para unirse al radionucleido de metal u óxido
metálico. Por ejemplo, en la Patente de EE.UU. nº 4.673.562,
concedida a Davison et al., se describen compuestos quelantes
representativos y sus síntesis.
Se puede utilizar una diversidad de vías de
administración para los anticuerpos y los productos de
inmunoconjugación. Típicamente, la administración será intravenosa,
intramuscular, subcutánea o en el lecho de un tumor resecado.
Resultará evidente que la dosis precisa del anticuerpo/producto de
inmunoconjugación variará dependiendo del anticuerpo utilizado, la
densidad de antígeno en el tumor y la velocidad de aclaramiento del
anticuerpo.
Las composiciones inmunoterapéuticas pueden
comprender también, o alternativamente, células T específicas para
una proteína tumoral de pulmón. Dichas células pueden ser
generalmente preparadas in vitro o ex vivo utilizando
procedimientos estándares. Por ejemplo, se pueden aislar células T
de médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o
sangre periférica de un paciente, usando un sistema de separación
celular comercialmente asequible, tal como el sistema Isolex^{TM},
asequible de Nexell Therapeutics, Inc., Irvine, California, EE.UU.
(véanse también la Patente de EE.UU. nº 5.240.856, la Patente de
EE.UU. nº 5.215.926, y los Documentos WO 89/06280, WO 91/16116 y WO
92/07243). Alternativamente, las células T pueden proceder de seres
humanos relacionados o no relacionados, mamíferos no humanos, líneas
celulares o cultivos.
Las células T pueden ser estimuladas con un
polipéptido tumoral de pulmón, un polinucleótido que codifica un
polipéptido tumoral de pulmón y/o una célula presentadora de
antígenos (APC) que expresa dicho polipéptido. Dicha estimulación
es llevada a cabo bajo unas condiciones y durante un tiempo
suficientes para permitir la generación de células T que sean
específicas para el polipéptido. Preferiblemente, el polinucleótido
o polipéptido tumoral de pulmón está presente dentro de un vehículo
de distribución, tal como una microesfera, para facilitar la
generación de células T específicas.
Se considera que las células T son específicas
para un polipéptido tumoral de pulmón si las células T
específicamente proliferan, secretan citocinas o matan células
diana que están revestidas con el polipéptido o que expresan un gen
que codifica el polipéptido. La especificidad de las células T puede
ser evaluada utilizando cualquiera de una diversidad de técnicas
estándares. Por ejemplo, en un ensayo de liberación de cromo o un
ensayo de proliferación, un índice de estimulación superior a un
aumento de dos veces en la lisis y/o la proliferación, en
comparación con testigos negativos, indica especificidad de células
T. Dichos ensayos pueden ser llevados a cabo, por ejemplo, del modo
descrito por Chen et al., Cancer Res. 54:
1065-1070, 1994. Alternativamente, la detección de
la proliferación de células T puede ser llevada a cabo mediante una
diversidad de técnicas conocidas. Por ejemplo, se puede detectar la
proliferación de células T al medir un índice aumentado de síntesis
de DNA (por ejemplo, marcando, por impulsos, cultivos de células T
con timidina tritiada y midiendo la cantidad de timidina tritiada
incorporada al DNA). El contacto con un polipéptido tumoral de
pulmón (100 ng/ml-100 \mug/ml, preferiblemente
200 ng/ml-25 \mug/ml) durante 3-7
días debería dar lugar a un aumento de al menos dos veces en la
proliferación de las células T. Un contacto como el anteriormente
descrito durante 2-3 horas debería dar lugar a la
activación de las células T, según se mide al utilizar ensayos de
citocinas estándares en los que un aumento de dos veces en el nivel
de liberación de citocinas (por ejemplo, TNF o
IFN-\gamma) es indicativo de activación de
células T [véase Coligan et al., Current Protocols in
Immunology, volumen 1, Wiley Interscience (Greene 1998)]. Las
células T que han sido activadas en respuesta a un polipéptido
tumoral de pulmón, un polinucleótido o una APC que expresa el
polipéptido pueden ser CD4+ y/o CD8+. Las células T específicas de
proteínas tumorales de pulmón pueden ser propagadas utilizando
técnicas estándares. En realizaciones preferidas, las células T
proceden de un paciente o de un donante relacionado o no relacionado
y son administradas al paciente después de estimulación y
propagación.
Con fines terapéuticos, el número de las células
T CD4+ o CD8+ que proliferan en respuesta a un polipéptido tumoral
de pulmón, un polinucleótido o una APC puede ser multiplicado in
vitro o in vivo. La proliferación de dichas células T
in vitro puede ser llevada a cabo de diversas maneras. Por
ejemplo, las células T pueden ser reexpuestas a un polipéptido
tumoral de pulmón, o a un péptido corto que corresponda a una
porción inmunogénica de dicho polipéptido, con o sin la adición de
factores de crecimiento de células T, tal como la interleucina 2,
y/o células estimuladoras que sintetizan un polipéptido tumoral de
pulmón. Alternativamente, el número de una o más células T que
proliferan en presencia de una proteína tumoral de pulmón puede ser
multiplicado por clonación. Los métodos para clonar células son
bien conocidos en la técnica, e incluyen la dilución limitante.
Los polipéptidos, polinucleótidos, células T y/o
agentes ligantes aquí descritos pueden ser incorporados a
composiciones farmacéuticas o composiciones inmunogénicas (es decir,
vacunas). Las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más de
dichos compuestos y un vehículo fisiológicamente aceptable. Las
vacunas pueden comprender uno o más de dichos compuestos y un
inmunoestimulante. Un inmunoestimulante puede ser cualquier
sustancia que aumente o potencie una respuesta inmune a un antígeno
exógeno. Los ejemplos de inmunoestimulantes incluyen adyuvantes,
microesferas biodegradables (por ejemplo, poligalactida láctica) y
liposomas (a los que se incorpora el compuesto; véase, por ejemplo,
Fullerton, Patente de EE.UU. nº 4.235.877). La preparación de
vacunas es descrita en general en, por ejemplo, "Vaccine Design
(the subunit and adjuvant approach)", redactado por M. F. Powell
y M. J. Newman, Plenum Press (New York, EE.UU., 1995). Las
composiciones farmacéuticas y vacunas incluidas dentro del alcance
del presente invento pueden contener también otros compuestos, los
cuales pueden ser biológicamente activos o inactivos. Por ejemplo,
en la composición o la vacuna pueden estar presentes una o más
porciones inmunogénicas de otros antígenos tumorales, incorporadas a
un polipéptido de fusión o como un compuesto separado.
Una composición farmacéutica o una vacuna pueden
contener un DNA que codifique uno o más polipéptidos como los
anteriormente descritos, para que el polipéptido se genere in
situ. Como se indicó anteriormente, el DNA puede estar presente
en cualquiera de una diversidad de sistemas de distribución
conocidos por quienes tienen una experiencia normal en la técnica,
incluyendo sistemas de expresión de ácido nucleico y sistemas de
expresión bacterianos y víricos. En este campo técnico se conocen
bien numerosas técnicas de distribución génica, tales como las
descritas por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:
143-198, 1998, y en las referencias ahí citadas.
Los sistemas de expresión de ácido nucleico apropiados contienen las
necesarias secuencias de DNA para expresión en el paciente (tal
como un promotor y una señal de terminación adecuados). Los
sistemas de distribución bacterianos implican la administración de
una bacteria (tal como Bacillus
Calmette-Guerrin) que expresa una porción
inmunogénica del polipéptido en su superficie celular o que secreta
dicho epítopo. En una realización preferida, el DNA puede ser
introducido utilizando un sistema de expresión vírico (por ejemplo,
virus vaccinia u otro poxvirus, retrovirus o adenovirus), lo que
puede implicar el uso de un virus no patógeno (defectuoso),
competente en cuanto a la replicación. Se describen sistemas
adecuados en, por ejemplo, Fisher-Hoch et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 317-321,
1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:
86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:
17-21, 1990; Patentes de EE.UU. números 4.603.112,
4.769.330 y 5.017.487; Documento WO 89/01973; Patente de EE.UU. nº
4.777.127; Documentos GB 2.200.651, EP 0.345.242 y WO 91/02805;
Berkner, BioTechniques 6: 616-627, 1988; Rosenfeld
et al., Science 252: 431-434, 1991; Kolls
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
215-219, 1994; Kass-Eisler et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
11.498-11.502, 1993; Guzman et al.,
Circulation 88: 2838-2848, 1993; y Guzman et
al., Cir. Res. 73: 1202-1207, 1993. Las
técnicas para incorporar DNA a dichos sistemas de expresión son bien
conocidas por quienes tienen una experiencia normal en este campo
técnico. El DNA también puede ser "desnudo", como describen,
por ejemplo, Ulmer et al., Science 259:
1745-1749, 1993, y revisa Cohen, Science 259:
1691-1692, 1993. La incorporación de DNA desnudo
puede ser aumentada al depositar el DNA como revestimiento sobre
glóbulos biodegradables, los cuales son eficazmente transportados a
las células.
Aunque en las composiciones farmacéuticas de
este invento se puede emplear cualquier vehículo adecuado conocido
por quienes tienen una experiencia normal en la técnica, el tipo de
vehículo variará dependiendo del modo de administración. Las
composiciones del presente invento pueden ser formuladas para
cualquier modo de administración apropiado, incluyendo, por
ejemplo, las administraciones tópica, oral, nasal, intravenosa,
intracraneal, intraperitoneal, subcutánea e intramuscular. Para
administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el
vehículo comprende preferiblemente agua, disolución salina,
alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para administración oral,
se puede emplear cualquiera de los anteriores vehículos o un
vehículo sólido tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de
magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y
carbonato de magnesio. Para las composiciones farmacéuticas de este
invento, también se pueden emplear microesferas biodegradables (por
ejemplo, polilactato-poliglicolato) como vehículos.
En, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. números 4.897.268 y
5.075.109 se describen microesferas biodegradables adecuadas.
Dichas composiciones pueden también comprender
tampones (por ejemplo, disolución salina tamponada neutra o
disolución salina tamponada con fosfato), hidratos de carbono (por
ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol,
proteínas, polipéptidos o aminoácidos, tal como glicocola,
antioxidantes, agentes quelantes, tal como EDTA o glutatión,
adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio) y/o conservantes.
Alternativamente, las composiciones del presente invento pueden ser
formuladas como un producto liofilizado. Los compuestos pueden ser
también encapsulados en liposomas utilizando una tecnología bien
conocida.
\newpage
En las vacunas de este invento se pueden emplear
cualesquiera de una diversidad de inmunoestimulantes. Por ejemplo,
se puede incluir un adyuvante. La mayoría de los adyuvantes
contienen una sustancia destinada a proteger al antígeno de un
catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral,
y un estimulante de respuestas inmunes, tal como el lipido A o
proteínas derivadas de Bordetella pertusis o Mycobacterium
tuberculosis. Se dispone comercialmente de adyuvantes
adecuados, tales como, por ejemplo, Adyuvante Incompleto y
Adyuvante Completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Michigan,
EE.UU.); Adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway,
New Jersey, EE.UU.); AS-2 (SmithKline Beecham,
Philadelphia, Pennsylvania, EE.UU.); sales de aluminio, tales como
fosfato de aluminio y gel de hidróxido de aluminio (alumbre); sales
de calcio, hierro o zinc; una suspensión insoluble de tirosina
acilada; azúcares acilados; polisacáridos catiónica o aniónicamente
derivatizados; polifosfacenos; microesferas biodegradables;
monofosforil-lipido A (MPL; del inglés,
monophosphoryl lipid A) y Quil A. También se
pueden usar citocinas, tales como GM-CSF y las
interleucinas 2, 7 y 12 como adyuvantes.
En las vacunas aquí proporcionadas, la
composición adyuvante está preferiblemente destinada a inducir
predominantemente una respuesta inmune del tipo Th1. Unos niveles
elevados de citocinas de tipo Th1 (por ejemplo,
IFN-\gamma, TNF\alpha, IL-2 e
IL-12) tienden a favorecer la inducción de
respuestas inmunes, mediadas por células, a un antígeno
administrado. Por contraste, unos niveles elevados de citocinas de
tipo Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-5,
IL-6 e IL-10) tienden a favorecer la
inducción de respuestas inmunes humorales. Después de la aplicación
de una vacuna como la aquí proporcionada, el paciente soportará una
respuesta inmune que incluye respuestas de tipos Th1 y Th2. En una
realización preferida en que la respuesta es predominantemente del
tipo Th1, el nivel de citocinas de tipo Th1 aumentará en mayor
grado que el nivel de citocinas de tipo Th2. El nivel de estas
citocinas puede ser fácilmente evaluado utilizando ensayos
estándares. Para una revisión de las familias de citocinas, véase
Mosmann y Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173,
1989.
Los adyuvantes preferidos para uso en la
provocación de una respuesta de tipo predominantemente Th1 incluyen,
por ejemplo, una combinación de monofosforil-lípido
A, preferiblemente monofosforil-lípido A
3-des-O-acilado
(3D-MPL), junto con una sal de aluminio. Los
adyuvantes de MPL son asequibles de Ribi ImmunoChem Research Inc.
(Hamilton, Montana, EE.UU.) (véanse las Patentes de EE.UU. números
4.436.727, 4.877.611, 4.866.034 y 4.912.094). Los oligonucleótidos
que contienen CpG (en que el dinucleótido CpG no está metilado)
también inducen predominantemente una respuesta Th1. Dichos
oligonucleótidos son bien conocidos y se describen en, por ejemplo,
los Documentos WO 96/02555 y WO 99/33488. Por ejemplo, Sato et
al., Science 273: 352, 1996, también describen secuencias de
DNA inmunoestimulantes. Otro adyuvante preferido es una saponina,
preferiblemente QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham,
Massachusetts, EE.UU.), que puede ser utilizada sola o en
combinación con otros adyuvantes. Por ejemplo, un sistema mejorado
incluye la combinación de un monofosforil-lípido A
y un derivado de saponina, tal como la combinación de QS21 y
3D-MPL, como se describe en el Documento WO
94/00153, o una composición menos inmunológicamente reactiva en que
QS21 está sofocada con colesterol, como se describe en el Documento
WO 96/33739. Otras formulaciones preferidas comprenden tocoferol y
una emulsión de aceite en agua. En el Documento WO 95/17210 se
describe una formulación adyuvante particularmente potente que
incluye QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de
aceite en agua.
Otros adyuvantes preferidos incluyen Montanide
ISA 720 (Seppic, Francia), SAF (Chiron, California, EE.UU.), ISCOMS
(CSL), MF-59 (Chiron), la serie SBAS de adyuvantes
(por ejemplo, SBAS-2 y SBAS-4,
asequibles de SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox (Ribi
ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, EE.UU.),
RC-529 (Ribi ImmunoChem Research Inc. (Hamilton,
Montana, EE.UU.) y
aminoalquil-glucosaminida-4-fosfatos
(AGPs).
Cualquier vacuna aquí proporcionada puede ser
preparada utilizando métodos bien conocidos que dan lugar a una
combinación de antígeno, potenciador de la respuesta inmune y un
vehículo o excipiente adecuado. Las composiciones aquí descritas
pueden ser administradas como parte de una formulación de liberación
continua [es decir, una formulación tal como una cápsula, esponja o
gel (compuesta de polisacáridos, por ejemplo) que efectúa una
liberación lenta del compuesto después de la administración]. Dichas
formulaciones pueden ser generalmente preparadas utilizando una
tecnología bien conocida (véase, por ejemplo, Coombes et al.,
Vaccine 14: 1429-1438, 1996) y ser administradas
mediante, por ejemplo, vía oral o rectal, implantación subcutánea o
implantación en el deseado sitio diana. Las formulaciones de
liberación continua pueden contener un polipéptido, polinucleótido
o anticuerpo disperso en una matriz vehicular y/o contenido en un
depósito rodeado por una membrana que controla la velocidad de
liberación.
Los vehículos para uso en dichas formulaciones
son biocompatibles y pueden ser además biodegradables.
Preferiblemente, la formulación proporciona un nivel relativamente
constante de liberación del componente activo. Dichos vehículos
incluyen micropartículas de
poli(lactida-co-glicolida),
así como de poliacrilato, látex, almidón, celulosa y dextrano.
Otros vehículos de liberación retardada incluyen biovectores
supramoleculares que comprenden un núcleo hidrófilo no líquido (por
ejemplo, un polisacárido u oligosacárido reticulado) y,
opcionalmente, una capa externa que comprende un compuesto
anfipático, tal como un fosfolípido (véanse, por ejemplo, la Patente
de EE.UU. nº 5.151.254 y las solicitudes PCT WO 94/20078, WO
94/23701 y WO 96/06638). La cantidad de compuesto activo contenida
en una formulación de liberación continua depende del lugar de
implantación, la velocidad de liberación y la esperada duración de
la liberación, y la naturaleza del estado que se va a tratar o
prevenir.
En las composiciones farmacéuticas y las vacunas
se pueden emplear cualesquiera de una diversidad de vehículos de
distribución para facilitar la producción de una respuesta inmune
antigénicamente específica que se dirija a las células tumorales.
Los vehículos de distribución incluyen células presentadoras de
antígenos (APCs), tales como células dendríticas, macrófagos,
células B, monocitos y otras células que pueden ser diseñadas para
que sean APCs eficaces. Aunque no necesariamente, dichas células
pueden ser genéticamente modificadas para aumentar la capacidad
para presentar el antígeno, para mejorar la activación y/o el
mantenimiento de la respuesta de células T, para ejercer per
se efectos antitumorales y/o para que sean inmunológicamente
compatibles con el receptor (es decir, con un haplotipo de HLA
equivalente). Las APCs pueden ser generalmente aisladas de
cualesquiera de una diversidad de órganos y fluidos biológicos,
incluyendo tejidos tumorales y peritumorales, y pueden ser células
autólogas, alogénicas, singénicas o xenogénicas.
En ciertas realizaciones preferidas de la
descripción presente se utilizan células dendríticas o progenitores
de las mismas como células presentadoras de antígenos. Las células
dendríticas son APCs muy potentes (Banchereau y Steinman, Nature
392: 245-251, 1998), y se ha mostrado que son
eficaces como adyuvantes fisiológicos para provocar una inmunidad
antitumoral profiláctica o terapéutica (véase Timmerman y Levy, Ann.
Rev. Med. 50: 507-529, 1999). En general, se pueden
identificar las células dendríticas basándose en su forma típica
(estrellada in situ, con acusadas proyecciones citoplásmicas
(dendritas) visibles in vitro), su capacidad para
incorporar, procesar y presentar antígenos con elevada eficacia, y
su capacidad para activar respuestas de células T vírgenes. Por
supuesto, las células dendríticas pueden ser diseñadas para que
expresen ligandos o receptores específicos de la superficie celular
que no se encuentran comúnmente en las células dendríticas in
vivo ni ex vivo, y dichas células dendríticas modificadas
son contempladas por el presente invento. Como una alternativa a
las células dendríticas, se pueden utilizar vesículas secretadas
procedentes de células dendríticas cargadas con antígenos (llamadas
exosomas) en una vacuna (véase Zitvogel et al., Nature Med.
4: 594-600, 1998).
Las células dendríticas y los progenitores
pueden obtenerse de sangre periférica, médula ósea, células que se
infiltran en tumores, células que se infiltran en tejidos
peritumorales, ganglios linfáticos, bazo, piel, sangre de cordón
umbilical o cualquier otro tejido o fluido adecuado. Por ejemplo,
las células dendríticas pueden diferenciarse ex vivo al
añadir una combinación de citocinas tales como
GM-CSF, IL-4, IL-13
y/o TNF\alpha a cultivos de monocitos recolectados de sangre
periférica. Alternativamente, células CD34 positivas recolectadas
de sangre periférica, sangre de cordón umbilical o médula ósea
pueden diferenciarse hasta células dendríticas al añadir al medio
de cultivo combinaciones de GM-CSF,
IL-3, TNF\alpha, ligando de CD40, LPS, ligando de
flt3 y/o otro(s) compuesto(s) que inducen
diferenciación, maduración y proliferación de células
dendríticas.
Las células dendríticas son convenientemente
clasificadas como células "inmaduras" y "maduras", lo que
permite un modo sencillo para discriminar entre dos fenotipos bien
caracterizados. Sin embargo, no se debería interpretar que esta
nomenclatura excluye todas las posibles fases intermedias de
diferenciación. Las células dendríticas inmaduras se caracterizan
como APCs con una elevada capacidad de incorporación y procesamiento
de antígenos, lo que se correlaciona con la elevada expresión del
receptor de Fc\gamma y el receptor de manosa. El fenotipo maduro
se caracteriza típicamente por una menor expresión de estos
marcadores pero por una elevada expresión de moléculas de la
superficie celular responsables de la activación de células T, tales
como MHC de clase I y clase II, moléculas de adhesión (por ejemplo,
CD54 y CD11) y moléculas coestimulantes (por ejemplo, CD40, CD80,
CD86 y 4-1BB).
Las APCs pueden ser generalmente transfectadas
con un polinucleótido que codifica una proteína tumoral de pulmón
(o una porción u otra variante de la misma) para que el polipéptido
tumoral de pulmón, o una porción inmunogénica del mismo, se exprese
en la superficie celular. Dicha transfección puede tener lugar ex
vivo, y luego, con fines terapéuticos, se puede usar una
composición o vacuna que comprenda dichas células transfectadas,
como aquí se describe. Alternativamente, se puede administrar a un
paciente un vehículo de distribución génica que se dirija a una
célula dendrítica u otra célula presentadora de antígenos, lo que da
lugar a una transfección que se produce in vivo. Por
ejemplo, las transfecciones in vivo y ex vivo de
células dendríticas pueden llevarse generalmente a cabo utilizando
cualesquier métodos conocidos en la técnica, tales como los
descritos en el Documento WO 97/24447, o el planteamiento de la
pistola de genes descrito por Mahvi et al., Immunology and
Cell Biology 75: 456-460, 1997. La carga antigénica
de las células dendríticas puede ser llevada a cabo incubando las
células dendríticas o las células progenitoras con el polipéptido
tumoral de pulmón, DNA (desnudo o en un vector plasmídico) o RNA; o
con bacterias o virus recombinantes que expresan antígenos (por
ejemplo, vectores de virus vaccinia, virus de la viruela aviar,
adenovirus o lentivirus). Antes de la carga, el polipéptido puede
ser covalentemente conjugado con una pareja inmunológica que
proporcione la cooperación de células T (por ejemplo, una molécula
portadora). Alternativamente, se puede impulsar una célula
dendrítica con una pareja inmunológica no conjugada, separadamente
o en presencia del polipéptido.
Las vacunas y las composiciones farmacéuticas
pueden ser presentadas en recipientes de dosis unitaria o de
múltiples dosis, tal como viales o ampollas selladas.
Preferiblemente, dichos recipientes son herméticamente sellados
para preservar la esterilidad de la formulación hasta su uso. En
general, las formulaciones pueden ser almacenadas como
suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o
acuosos. Alternativamente, una vacuna o composición farmacéutica
puede ser almacenada en estado liofilizado, requiriéndose sólo la
adición de un vehículo líquido estéril inmediatamente antes de su
uso.
Las composiciones aquí descritas pueden ser
utilizadas para la inmunoterapia del cáncer, tal como el cáncer de
pulmón. En dichos métodos, se administran típicamente composiciones
farmacéuticas y vacunas a un paciente. Como se utiliza aquí, un
"paciente" se refiere a cualquier animal de sangre caliente,
preferiblemente un ser humano. El paciente puede estar aquejado de
cáncer o no. En consecuencia, las anteriores composiciones
farmacéuticas y vacunas pueden ser utilizadas para prevenir el
desarrollo de un cáncer o para tratar a un paciente aquejado de un
cáncer. Se puede diagnosticar un cáncer utilizando criterios
generalmente aceptados en la técnica, incluyendo la presencia de un
tumor maligno. Las composiciones farmacéuticas y vacunas pueden ser
administradas antes o después de la extirpación quirúrgica de
tumores primarios y/o de un tratamiento tal como la administración
de radioterapia o fármacos quimioterapéuticos convencionales.
En ciertas realizaciones, la inmunoterapia puede
ser una inmunoterapia activa, tratamiento que se basa en la
estimulación in vivo del sistema inmune endógeno del huésped,
para que reaccione contra tumores, con la administración de agentes
modificadores de la respuesta inmune (tales como los polipéptidos y
polinucleótidos aquí descritos).
En otras realizaciones, la inmunoterapia puede
ser una inmunoterapia pasiva, tratamiento que implica la
distribución de agentes con una establecida reactividad
tumoralmente inmune (tales como células efectoras o anticuerpos),
que pueden mediar directa o indirectamente en efectos antitumorales
y no dependen necesariamente de un sistema inmune intacto del
huésped. Los ejemplos de células efectoras incluyen células T como
las anteriormente discutidas, linfocitos T [tales como linfocitos T
citotóxicos (CTL) CD8^{+} y linfocitos T cooperadores CD4^{+}
que se infiltran en tumores], células asesinas (tales como células
asesinas naturales y células asesinas activadas por linfocinas),
células B y células presentadoras de antígenos (tales como células
dendríticas y macrófagos) que expresan un polipéptido aquí
proporcionado. Receptores de células T y receptores de anticuerpo
específicos para los polipéptidos aquí expuestos pueden ser
clonados, expresados y transferidos a otros vectores o células
efectoras para una inmunoterapia adoptiva. Los polipéptidos aquí
proporcionados pueden ser también utilizados para generar
anticuerpos o anticuerpos antiidiotípicos (como los anteriormente
descritos y los descritos en la Patente de EE.UU. número 4.918.164)
para una inmunoterapia pasiva.
Mediante crecimiento in vitro, como aquí
se describe, se pueden obtener generalmente células efectoras en
cantidades suficientes para una inmunoterapia adoptiva. Las
condiciones de cultivo para multiplicar el número de células
efectoras específicas de un solo antígeno a varios billones con
conservación del reconocimiento antigénico in vivo son bien
conocidas en la técnica. Dichas condiciones de cultivo in
vitro implican típicamente el uso de estimulación intermitente
con antígeno, a menudo en presencia de citocinas (tal como
IL-2) y células de soporte que no se dividen. Como
se indicó anteriormente, se pueden utilizar polipéptidos
inmunorreactivos como los aquí proporcionados para propagar
rápidamente los cultivos de células T específicas de antígeno con
objeto de generar un número suficiente de células para
inmunoterapia. En particular, células presentadoras de antígeno,
tales como células dendríticas, macrófagos, monocitos, fibroblastos
y/o células B, pueden ser impulsadas con polipéptidos
inmunorreactivos o ser transfectadas con uno o más polinucleótidos
usando técnicas estándares bien conocidas en este campo técnico. Por
ejemplo, las células presentadoras de antígeno pueden ser
transfectadas con un polinucleótido que tenga un promotor apropiado
para aumentar la expresión en un virus recombinante u otro sistema
de expresión. Las células efectoras en cultivo para uso en terapia
deben ser capaces de crecer y distribuirse ampliamente, y de
sobrevivir durante mucho tiempo in vivo. Ciertos estudios
han mostrado que se puede inducir el crecimiento in vivo y la
supervivencia de larga duración de las células efectoras en
cultivo, en números sustanciales, mediante la estimulación repetida
con antígeno complementado con IL-2 (véase, por
ejemplo, Cheever et al., Immunological Reviews 157: 177,
1997).
Alternativamente, un vector que expresa un
polipéptido aquí expuesto puede ser introducido en células
presentadoras de antígeno extraídas de un paciente y ser
clonalmente propagado ex vivo para su trasplante de vuelta
al mismo paciente. Las células transfectadas pueden ser
reintroducidas en el paciente usando cualquier medio conocido en la
técnica, preferiblemente en forma estéril mediante administración
intravenosa, intracavitaria, intraperitoneal o intratumoral.
Las vías y la frecuencia de administración de
las composiciones terapéuticas aquí descritas, así como la
dosificación, variarán de individuo a individuo y se pueden
establecer fácilmente utilizando técnicas estándares. En general,
las composiciones farmacéuticas y las vacunas se pueden administrar
por inyección (por ejemplo, intracutánea, intramuscular,
intravenosa o subcutánea), intranasalmente (por ejemplo, por
aspiración) u oralmente. Preferiblemente, se pueden administrar
entre 1 y 10 dosis durante un periodo de 52 semanas.
Preferiblemente, se administran 6 dosis a intervalos de 1 mes y,
más adelante, se pueden proporcionar periódicamente vacunaciones de
refuerzo. Pueden ser apropiados unos protocolos alternativos para
pacientes individuales. Una dosis adecuada es una cantidad de un
compuesto que, cuando se administra del modo anteriormente descrito,
es capaz de provocar una respuesta inmune antitumoral, respuesta
que está al menos un 10-50% por encima del nivel
basal (es decir, sin tratamiento). Dicha respuesta puede ser
controlada midiendo los anticuerpos antitumorales en el paciente o
mediante la generación, dependiente de la vacuna, de células
efectoras citolíticas capaces de matar in vitro las células
tumorales del paciente. Dichas vacunas deberían también ser capaces
de causar una respuesta inmune que condujera a un resultado clínico
mejorado (por ejemplo, remisiones más frecuentes; supervivencia
completa o parcial o más prolongada exenta de enfermedad) en los
pacientes vacunados con respecto a los pacientes no vacunados. En
general, para las composiciones farmacéuticas y vacunas que
comprenden uno o más polipéptidos, la cantidad de cada polipéptido
presente en una dosis varía de aproximadamente 25 \mug a 5 mg por
kg de huésped. Los tamaños de dosis adecuados variarán con el
tamaño del paciente, pero se extenderán típicamente de
aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 5 ml.
En general, una dosificación y un régimen de
tratamiento apropiados proporcionan el(los)
compuesto(s) activo(s)
en una cantidad suficiente para proporcionar el beneficio terapéutico y/o profiláctico. Dicha respuesta puede ser controlada al establecer un resultado clínico mejorado (por ejemplo, remisiones más frecuentes; supervivencia completa o parcial o más prolongada exenta de enfermedad) en los pacientes tratados en comparación con los pacientes no tratados. Los aumentos de las respuestas inmunes preexistentes a una proteína tumoral de pulmón se correlacionan generalmente con un resultado clínico mejorado. Dichas respuestas inmunes pueden ser generalmente evaluadas usando ensayos estándares de proliferación, citotoxicidad o citocinas, que pueden ser llevados a cabo utilizando muestras obtenidas de un paciente antes y después del tratamiento.
en una cantidad suficiente para proporcionar el beneficio terapéutico y/o profiláctico. Dicha respuesta puede ser controlada al establecer un resultado clínico mejorado (por ejemplo, remisiones más frecuentes; supervivencia completa o parcial o más prolongada exenta de enfermedad) en los pacientes tratados en comparación con los pacientes no tratados. Los aumentos de las respuestas inmunes preexistentes a una proteína tumoral de pulmón se correlacionan generalmente con un resultado clínico mejorado. Dichas respuestas inmunes pueden ser generalmente evaluadas usando ensayos estándares de proliferación, citotoxicidad o citocinas, que pueden ser llevados a cabo utilizando muestras obtenidas de un paciente antes y después del tratamiento.
En general, se puede detectar un cáncer en un
paciente basándose en la presencia de una o más proteínas tumorales
de pulmón, y/o de polinucleótidos que codifican dichas proteínas, en
una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, esputo, orina
y/o biopsias tumorales) obtenida del paciente. En otras palabras,
dichas proteínas pueden ser utilizadas como marcadores para indicar
la presencia o ausencia de un cáncer tal como un cáncer de pulmón.
Además, dichas proteínas pueden ser útiles para la detección de
otros cánceres. Los agentes ligantes aquí proporcionados permiten
generalmente la detección del nivel de antígeno que se une al agente
en la muestra biológica. Se pueden utilizar sondas y cebadores
polinucleotídicos para detectar el nivel del mRNA que codifica una
proteína tumoral, lo que también es indicativo de la presencia o
ausencia de un cáncer. En general, debería estar presente una
secuencia tumoral de pulmón en un nivel que fuera al menos tres
veces superior en tejido tumoral que en tejido normal.
Hay una diversidad de formatos de ensayo,
conocidos por quienes tienen una experiencia normal en la técnica,
en que se usa un agente ligante para detectar marcadores
polipeptídicos en una muestra; véase, por ejemplo, Harlow y Lane,
"Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Laboratory, 1988. En general, la presencia o ausencia de un cáncer
en un paciente puede ser determinada (a) poniendo una muestra
biológica, obtenida de un paciente, en contacto con un agente
ligante; (b) detectando en la muestra el nivel de polipéptido que
se une al agente ligante; y (c) comparando el nivel de polipéptido
con un valor de corte predeterminado.
En una realización preferida, el ensayo implica
la utilización de un agente ligante inmovilizado sobre un soporte
sólido para unirse al polipéptido y separarlo del resto de la
muestra. El polipéptido unido puede ser luego detectado utilizando
un reactivo de detección que contiene un grupo informador y se une
específicamente al complejo de agente ligante/polipéptido. Dichos
reactivos de detección pueden comprender, por ejemplo, un agente
ligante que se une específicamente al polipéptido y un anticuerpo u
otro agente que se une específicamente al agente ligante, tal como
una anti-inmunoglobulina, proteína G, proteína A o
una lectina. Alternativamente, se puede utilizar un ensayo
competitivo, en el que un polipéptido es marcado con un grupo
informador y es dejado unirse al inmovilizado agente ligante
después de la incubación del agente ligante con la muestra. El
grado con que los componentes de la muestra inhiben la unión del
polipéptido marcado al agente ligante es indicativo de la
reactividad de la muestra con respecto al agente ligante
inmovilizado. Los polipéptidos adecuados para uso en dichos ensayos
incluyen proteínas tumorales de pulmón de longitud completa y
porciones de las mismas a las que se une el agente ligante, como se
describió anteriormente.
El soporte sólido al que se puede fijar la
proteína tumoral puede ser cualquier material conocido por quienes
tienen una experiencia normal en la técnica. Por ejemplo, el soporte
sólido puede ser un pocillo de ensayo de una placa de
microtitulación o una membrana de nitrocelulosa u otra membrana
adecuada. Alternativamente, el soporte puede ser un glóbulo o un
disco, tal como de vidrio, fibra de vidrio, látex o un material
plástico tal como poliestireno o poli(cloruro de vinilo). El
soporte puede ser también una partícula magnética o un sensor de
fibra óptica, tales como los descritos en, por ejemplo, la Patente
de EE.UU. nº 5.359.681. El agente ligante puede ser inmovilizado
sobre el soporte sólido utilizando una diversidad de técnicas
conocidas por quienes tienen experiencia en este campo técnico, las
cuales son ampliamente descritas en la bibliografía científica y de
patentes. En el contexto del presente invento, el término
"inmovilización" se refiere tanto a una asociación no
covalente, tal como una adsorción, como a una fijación covalente
(que puede ser un enlace directo entre el agente y grupos
funcionales del soporte, o puede ser un enlace por medio de un
agente reticulante). Se prefiere la inmovilización por adsorción a
un pocillo de una placa de microtitulación o a una membrana. En
dichos casos, se puede llevar a cabo la adsorción al poner el agente
ligante, en un tampón adecuado, en contacto con el soporte sólido
durante un periodo adecuado de tiempo. El tiempo de contacto varía
con la temperatura, pero está típicamente entre aproximadamente 1
hora y aproximadamente 1 día. En general, la puesta de un pocillo
de una placa de microtitulación de plástico [tal como de
poliestireno o poli(cloruro de vinilo)] en contacto con una
cantidad de agente ligante que varía de aproximadamente 10 ng a
aproximadamente 10 \mug, y preferiblemente de aproxi-
madamente 100 ng a aproximadamente 1 \mug, es suficiente para inmovilizar una cantidad adecuada de agente ligante.
madamente 100 ng a aproximadamente 1 \mug, es suficiente para inmovilizar una cantidad adecuada de agente ligante.
La fijación covalente del agente ligante a un
soporte sólido puede ser llevada generalmente a cabo al hacer
reaccionar primero el soporte con un reactivo bifuncional que
reaccionará tanto con el soporte como con un grupo funcional, tal
como un grupo hidroxilo o amino, del agente ligante. Por ejemplo, el
agente ligante puede ser covalentemente fijado a soportes que
tienen un apropiado revestimiento de polímero utilizando
benzoquinona o por condensación de un grupo aldehído del soporte
con una amina y un hidrógeno activo de la pareja ligante (véase,
por ejemplo, Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, en
A12-A13).
En ciertas realizaciones, el ensayo es un ensayo
sándwich con dos anticuerpos. Este ensayo puede ser llevado a cabo
poniendo primero un anticuerpo que ha sido inmovilizado sobre un
soporte sólido, comúnmente el pocillo de una placa de
microtitulación, en contacto con la muestra, con lo que se deja que
los polipéptidos de la muestra se unan al anticuerpo inmovilizado.
Luego se separa la muestra no unida de los complejos de
polipéptido-anticuerpo inmovilizados y se añade un
reactivo de detección (preferiblemente un segundo anticuerpo capaz
de unirse a un sitio diferente del polipéptido) que contiene un
grupo informador. Luego se determina la cantidad de reactivo de
detección que permanece unido al soporte sólido utilizando un método
apropiado para el grupo informador específico.
Más específicamente, una vez que se ha
inmovilizado el anticuerpo sobre el soporte de la manera
anteriormente descrita, se bloquean típicamente los restantes
sitios del soporte que se unen a proteínas. Se utiliza cualquier
agente bloqueador adecuado conocido por quienes tienen una
experiencia normal en la técnica, tal como albúmina sérica bovina o
Tween 20^{TM} (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, EE.UU.).
Luego se incuba la muestra con el anticuerpo inmovilizado y se deja
que el polipéptido se una al anticuerpo. La muestra puede ser
diluida con un diluyente adecuado, tal como disolución salina
tamponada con fosfato (PBS; del inglés,
phosphate-buffered saline), antes de la incubación.
En general, un tiempo de contacto apropiado (es decir, el tiempo de
incubación) es un periodo de tiempo que es suficiente para detectar
la presencia de un polipéptido en una muestra obtenida de un
individuo con cáncer de pulmón. Preferiblemente, el tiempo de
contacto es suficiente para que se alcance un nivel de unión que es
al menos aproximadamente el 95% del alcanzado en el equilibrio entre
el polipéptido unido y el no unido. Quienes tienen experiencia
normal en la técnica reconocerán que el tiempo necesario para
alcanzar el equilibrio puede ser fácilmente determinado examinando
el nivel de unión que tiene lugar durante un periodo de tiempo. A
temperatura ambiental, un tiempo de incubación de aproximadamente 30
minutos es generalmente suficiente.
Luego se puede separar la muestra no unida
lavando el soporte sólido con un tampón apropiado, tal como PBS que
contiene Tween 20^{TM} al 0,1%. Luego se puede añadir el segundo
anticuerpo, que contiene un grupo informador, al soporte sólido.
Los grupos informadores preferidos incluyen los grupos anteriormente
citados.
Luego se incuba el reactivo de detección con el
complejo inmovilizado de anticuerpo-polipéptido
durante un periodo de tiempo suficiente para que se detecte el
polipéptido unido. El periodo de tiempo apropiado puede ser
generalmente determinado examinando el nivel de unión que tiene
lugar a lo largo de un periodo de tiempo. Luego se separa el
reactivo de detección no unido y, utilizando el grupo informador, se
detecta el reactivo de detección unido. El método empleado para
detectar el grupo informador depende de la naturaleza del grupo
informador. Para grupos radiactivos, los métodos autorradiográficos
y de cuenta de centelleo son generalmente apropiados. Se pueden
utilizar métodos espectroscópicos para detectar colorantes, grupos
luminiscentes y grupos fluorescentes. Se puede detectar la biotina
utilizando avidina copulada con un grupo informador diferente
(comúnmente un grupo radiactivo o fluorescente o una enzima). Los
grupos informadores enzimáticos pueden ser generalmente detectados
mediante la adición de un sustrato (generalmente durante un periodo
específico de tiempo), seguida de un análisis espectroscópico u
otro análisis de los productos de reacción.
Para determinar la presencia o ausencia de un
cáncer, tal como cáncer de pulmón, la señal detectada del grupo
informador que permanece unido al soporte sólido es generalmente
comparada con una señal que corresponde a un valor de corte
predeterminado. En una realización preferida, el valor de corte para
la detección de un cáncer es la señal media obtenida cuando el
anticuerpo inmovilizado es incubado con muestras de pacientes sin
el cáncer. En general, se considera que una muestra que genera una
señal que está tres desviaciones estándares por encima del valor de
corte predeterminado es positiva para el cáncer. En una realización
preferida alternativa, el valor de corte se determina usando una
Curva de Receptor-Operador de acuerdo con el método
de Sackett et al., "Clinical Epidemiology: A Basic Science
for Clinical Medicine", Little Brown and Co., 1985, páginas
106-7. En resumen, en esta realización, el valor de
corte puede ser determinado a partir de un gráfico de parejas de
índices de verdaderos positivos (es decir, sensibilidad) e índices
de falsos positivos (100%-especificidad) que corresponden a cada
valor de corte posible para el resultado de la prueba diagnóstica.
El valor de corte del gráfico que es el más cercano a la esquina
izquierda superior (es decir, el valor que encierra el área mayor)
es el valor de corte más preciso, y una muestra que genera una señal
que es mayor que el valor de corte determinado por este método
puede ser considerada positiva. Alternativamente, el valor de corte
puede ser desplazado a la izquierda por todo el gráfico para
minimizar el índice de falsos positivos, o a la derecha para
minimizar el índice de falsos negativos. En general, una muestra que
genera una señal que es superior al valor de corte determinado por
este método es considerada positiva para un cáncer.
En una realización relacionada, el ensayo es
llevado a cabo en un formato de ensayo en tira o de flujo a través,
en el que el agente ligante es inmovilizado sobre una membrana, tal
como de nitrocelulosa. En el ensayo de flujo a través, los
polipéptidos de la muestra se unen al agente ligante inmovilizado
conforme la muestra atraviesa la membrana. Luego se une un agente
ligante marcado segundo al complejo de agente
ligante-polipéptido conforme una disolución que
contiene el segundo agente ligante fluye a través de la membrana. La
detección del segundo agente ligante unido puede ser llevada luego
a cabo del modo anteriormente descrito. En el formato de ensayo en
tira, un extremo de la membrana a la que está unido el agente
ligante es sumergida en una disolución que contiene la muestra. La
muestra migra a lo largo de la membrana a través de una región que
contiene el segundo agente ligante y hasta el área del agente
ligante inmovilizado. Una concentración de segundo agente ligante
en el área del anticuerpo inmovilizado indica la presencia de un
cáncer. Típicamente, la concentración del segundo agente ligante en
ese sitio genera una figura, tal como una línea, que puede ser
visualmente leída. La ausencia de dicha figura indica un resultado
negativo. En general, la cantidad de agente ligante inmovilizado
sobre la membrana es seleccionada para que se genere una figura
visualmente discernible cuando la muestra biológica contiene un
nivel de polipéptido que sería suficiente para generar una señal
positiva en el ensayo sándwich con dos anticuerpos, en el formato
anteriormente discutido. Los agentes ligantes preferidos para uso
en dichos ensayos son anticuerpos y fragmentos de los mismos que se
unen a antígenos. Preferiblemente, la cantidad de anticuerpo
inmovilizado sobre la membrana varía de aproximadamente 25 ng a
aproximadamente 1 \mug, y más preferiblemente de aproximadamente
50 ng a aproximadamente 500 ng. Dichos ensayos pueden ser llevados
típicamente a cabo con una pequeñísima cantidad de muestra
biológica.
Por supuesto, existen otros numerosos protocolos
de ensayo que son adecuados para uso con las proteínas tumorales o
los agentes ligantes del presente invento. Con las anteriores
descripciones sólo se pretende ser ejemplar. Por ejemplo, resultará
evidente para quienes tienen una experiencia normal en la técnica
que los anteriores protocolos pueden ser fácilmente modificados
para utilizar polipéptidos tumorales de pulmón con objeto de
detectar anticuerpos que se unen a dichos polipéptidos en una
muestra biológica. La detección de dichos anticuerpos específicos
de proteínas tumorales de pulmón se puede correlacionar con la
presencia de un cáncer.
Un cáncer puede ser también, o alternativamente,
detectado basándose en la presencia de células T que reaccionan
específicamente con una proteína tumoral de pulmón en una muestra
biológica. En ciertos métodos, una muestra biológica que comprende
células T CD4^{+} y/o CD8^{+} aisladas de un paciente es
incubada con un polipéptido tumoral de pulmón, un polinucleótido
que codifica dicho polipéptido y/o una APC que expresa al menos una
porción inmunogénica de dicho polipéptido, y se detecta la
presencia o ausencia de una activación específica de las células T.
Las muestras biológicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a,
células T aisladas. Por ejemplo, se pueden aislar células T de un
paciente mediante técnicas rutinarias (tal como mediante la
centrifugación de linfocitos de sangre periférica en un gradiente
de densidades de Ficoll/Hypaque). Las células T pueden ser
incubadas in vitro durante 2-9 días
(típicamente 4 días) a 37ºC con el polipéptido (por ejemplo,
5-25 \mug/ml). Puede resultar deseable incubar
otra parte alícuota de una muestra de células T en ausencia de
polipéptido tumoral de pulmón, para que sirva como testigo. Para
células T CD4^{+}, la activación se detecta preferiblemente
evaluando la proliferación de las células T. Para células T
CD8^{+}, la activación se detecta preferiblemente evaluando la
actividad citolítica. Un nivel de proliferación que sea al menos dos
veces mayor y/o un nivel de actividad citolítica que sea al menos
20% mayor que en pacientes exentos de enfermedad indica la
presencia de un cáncer en el paciente.
Como se indicó anteriormente, un cáncer puede
ser también, o alternativamente, detectado basándose en el nivel de
mRNA que codifica una proteína tumoral de pulmón en una muestra
biológica. Por ejemplo, se pueden emplear al menos dos cebadores
oligonucleotídicos en un ensayo basado en la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) para multiplicar una porción de un cDNA tumoral
de pulmón derivado de una muestra biológica, en que al menos uno de
los cebadores oligonucleotídicos es específico para (es decir, se
hibrida con) un polinucleótido que codifica la proteína tumoral de
pulmón. Luego se separa el cDNA multiplicado y se detecta utilizando
técnicas bien conocidas en este campo técnico, tal como la
electroforesis en gel. Similarmente, en un ensayo de hibridación,
se pueden utilizar sondas oligonucleotídicas que se hibridan
específicamente con un polinucleótido que codifica una proteína
tumoral de pulmón, para detectar la presencia de un polinucleótido
que codifica la proteína tumoral en una muestra biológica.
Para permitir la hibridación bajo las
condiciones de ensayo, los cebadores y sondas oligonucleotídicos
deberían comprender una secuencia oligonucleotídica que tuviera una
identidad de al menos aproximadamente 60%, preferiblemente de al
menos aproximadamente 75% y más preferiblemente de al menos
aproximadamente 90%, con respecto a una porción de un
polinucleótido que codifica una proteína tumoral de pulmón, que
tiene una longitud de al menos 10 nucleótidos y preferiblemente de
al menos 20 nucleótidos. Preferiblemente, los cebadores y/o sondas
oligonucleotídicos se hibridarán, bajo condiciones moderadamente
rigurosas, con un polinucleótido que codifica un polipéptido aquí
descrito, como se definió anteriormente. Los cebadores y/o sondas
oligonucleotídicos que se pueden emplear útilmente en los métodos
diagnósticos aquí descritos tienen preferiblemente una longitud de
al menos 10-40 nucleótidos. En una realización
preferida, los cebadores oligonucleotídicos comprenden al menos 10
nucleótidos contiguos, más preferiblemente al menos 15 nucleótidos
contiguos, de una molécula de DNA que tiene una secuencia expuesta
en las ID. SEC. números 1-109, 111, 113,
115-151, 153, 154, 157, 158, 160,
162-164, 167, 168, 171, 173, 175,
177-224, 255-337, 345, 347 y 349.
Las técnicas tanto para ensayos basados en PCR como para ensayos de
hibridación son bien conocidas en este campo técnico (véanse, por
ejemplo, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant.
Biol. 51: 263, 1987; y "PCR Technology", redactado por Erlich,
Stockton Press, New York, EE.UU., 1989).
En un ensayo preferido se utiliza la
RT-PCR, en la que se aplica la PCR junto con la
transcripción inversa. Típicamente, se extrae RNA de una muestra
biológica, tal como un tejido de biopsia, y se somete a
transcripción inversa para producir moléculas de cDNA. Una
multiplicación por PCR en que se utiliza al menos un cebador
específico genera una molécula de cDNA que puede ser separada y
visualizada utilizando, por ejemplo, electroforesis en gel. La
multiplicación puede ser llevada a cabo sobre muestras biológicas
tomadas de un paciente de ensayo y de un individuo que no está
aquejado de un cáncer. La reacción de multiplicación puede ser
llevada a cabo sobre diversas diluciones de cDNA que abarquen dos
órdenes de magnitud. Típicamente, se considera positivo un aumento
de expresión de dos veces o más en diversas diluciones de la muestra
del paciente de ensayo en comparación con las mismas diluciones de
la muestra no cancerosa.
En otra realización, las composiciones descritas
pueden ser utilizadas como marcadores para el progreso del cáncer.
En esta realización, se pueden llevar a cabo ensayos como los
anteriormente descritos para el diagnóstico del cáncer a lo largo
del tiempo y se puede evaluar el cambio en el nivel del(de
los) polipéptido(s) o polinucleótido(s)
reactivo(s).
Por ejemplo, los ensayos pueden ser llevados a cabo cada 24-72 horas durante un periodo de 6 meses a 1 año y luego según se necesiten. En general, un cáncer progresa en aquellos pacientes en que el nivel del polipéptido o polinucleótido detectado aumenta con el tiempo. Por contraste, el cáncer no progresa cuando el nivel del polipéptido o polinucleótido reactivo permanece constante o disminuye con el tiempo.
Por ejemplo, los ensayos pueden ser llevados a cabo cada 24-72 horas durante un periodo de 6 meses a 1 año y luego según se necesiten. En general, un cáncer progresa en aquellos pacientes en que el nivel del polipéptido o polinucleótido detectado aumenta con el tiempo. Por contraste, el cáncer no progresa cuando el nivel del polipéptido o polinucleótido reactivo permanece constante o disminuye con el tiempo.
Ciertos ensayos diagnósticos in vivo
pueden ser llevados directamente a cabo sobre un tumor. Uno de
dichos ensayos implica poner células tumorales en contacto con un
agente ligante. El agente ligante unido puede ser luego directa o
indirectamente detectado por medio de un grupo informador. Dichos
agentes ligantes pueden ser también utilizados en aplicaciones
histológicas. Alternativamente, en dichas aplicaciones se pueden
utilizar sondas polinucleotídicas.
Como se indicó anteriormente, para mejorar la
sensibilidad, se pueden ensayar múltiples marcadores de proteínas
tumorales de pulmón en una muestra dada. Resultará evidente que, en
un solo ensayo, se pueden combinar agentes ligantes específicos
para las diferentes proteínas aquí proporcionadas. Además, se pueden
usar simultáneamente múltiples cebadores o sondas. La selección de
los marcadores de proteínas tumorales se puede basar en experimentos
rutinarios para determinar combinaciones que den lugar a una
sensibilidad óptima. Además, o alternativamente, se pueden combinar
ensayos para las proteínas tumorales aquí proporcionadas con ensayos
para otros antígenos tumorales conocidos.
El presente invento proporciona además sistemas
para uso en cualquiera de los métodos diagnósticos anteriores.
Dichos sistemas comprenden típicamente dos o más componentes
necesarios para llevar un ensayo diagnóstico a cabo. Los
componentes pueden ser compuestos, reactivos, recipientes y/o un
equipo. Por ejemplo, un recipiente de un sistema puede contener un
anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo, que se une
específicamente a una proteína tumoral de pulmón. Dichos
anticuerpos o fragmentos se pueden proporcionar fijados a un
material de soporte, como se describió anteriormente. Uno o más
recipientes adicionales pueden incluir elementos, tales como
reactivos o tampones, que se van a utilizar en el ensayo. Dichos
sistemas pueden contener también, o alternativamente, un reactivo
de detección como el anteriormente descrito que contiene un grupo
informador adecuado para la detección directa o indirecta de la
unión del anticuerpo.
Alternativamente, se puede diseñar un sistema
para detectar el nivel del mRNA que codifica una proteína tumoral
de pulmón en una muestra biológica. Dichos sistemas comprenden
generalmente al menos un cebador o sonda oligonucleotídico, como
los anteriormente descritos, que se hibrida con un polinucleótido
que codifica una proteína tumoral de pulmón. Dicho oligonucleótido
puede ser utilizado, por ejemplo, en un ensayo de PCR o de
hibridación. Los componentes adicionales que pueden estar presentes
en dichos sistemas incluyen un segundo oligonucleótido y/o un
recipiente o reactivo diagnóstico para facilitar la detección de un
polinucleótido que codifica una proteína tumoral de pulmón.
Los Ejemplos siguientes se presentan a modo de
ilustración y no a modo de limitación.
Este ejemplo ilustra el aislamiento de moléculas
de cDNA que codifican polipéptidos específicos de tumores
pulmonares, a partir de bancos de cDNA tumoral de pulmón.
Se construyó un banco de expresión de cDNA de
carcinoma de células escamosas de pulmón humano a partir de
RNA-poli(A)^{+} de una colección de
tejidos de dos pacientes usando el sistema plasmídico Superscript
para síntesis de cDNA y un sistema de clonación plasmídica (BRL
Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, EE.UU.) siguiendo el
protocolo del fabricante. Específicamente, se homogeneizaron tejidos
de carcinoma de pulmón con un aparato Polytron (Kinematica, Suiza)
y se extrajo el RNA total usando el reactivo Trizol (BRL Life
Technologies) de la manera descrita por el fabricante. Luego se
purificó el RNA-poli(A)^{+}
utilizando una columna de
oligo-dT-celulosa del modo descrito
por Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual", Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor,
New York, EE.UU., 1989. El cDNA de primera cadena fue sintetizado
utilizando el cebador NotI/Oligo-dT18. El cDNA de
doble cadena fue sintetizado, ligado con adaptadores BstXI/EcoRI
(Invitrogen, San Diego, California, EE.UU.) y sometido a digestión
con NotI. Después del fraccionamiento por tamaños con columnas para
fraccionamiento de cDNA por tamaños (BRL Life Technologies), el cDNA
fue ligado en el sitio BstXI/NotI de pcDNA3.1 (Invitrogen) y
utilizado para transformar células de E. coli DH10B
ElectroMax (BRL Life Technologies) mediante electroporación.
Utilizando el mismo procedimiento, se preparó un
banco de expresión de cDNA de pulmón humano normal a partir de una
colección de cuatro muestras tisulares. Los bancos de cDNA fueron
caracterizados determinando el número de colonias independientes,
el porcentaje de clones que llevaban el inserto y el tamaño medio
del inserto, y mediante análisis de secuencias. El banco de
carcinoma de células escamosas de pulmón contenía 2,7 x 10^{6}
colonias independientes, teniendo un inserto el 100% de los clones y
siendo 2010 pares de bases el tamaño medio del inserto. El banco de
cDNA de pulmón normal contenía 1,4 x 10^{6} colonias
independientes, teniendo insertos el 90% de los clones y siendo
1800 pares de bases el tamaño medio del inserto. Para ambos bancos,
el análisis de secuencias mostró que la mayoría de los clones tenían
una secuencia de cDNA de longitud completa y eran sintetizados a
partir de mRNA.
Se llevó a cabo la sustracción de bancos de cDNA
utilizando los anteriores bancos de cDNA de carcinoma de células
escamosas de pulmón y de pulmón normal, del modo descrito por Hara
et al. (Blood 84: 189-199, 1994) con algunas
modificaciones. Específicamente, se generó un banco de cDNA
sustraído, específico de carcinoma de células escamosas de pulmón,
del modo siguiente. Se sometió un banco de cDNA de tejido normal (80
\mug) a digestión con BamHI y XhoI, lo que fue seguido de una
reacción de compleción con el fragmento de Klenow de la DNA
polimerasa. Después de una extracción con
fenol-cloroformo y una precipitación con etanol, el
DNA fue disuelto en 133 \mul de H_{2}O, térmicamente
desnaturalizado y mezclado con 133 \mul (133 \mug) de biotina
Photoprobe (Vector Laboratories, Burlingame, California, EE.UU.).
Siguiendo las recomendaciones del fabricante, la mezcla resultante
fue irradiada, sobre hielo, con una lámpara solar de 270 W durante
20 minutos. Se añadió biotina Photoprobe adicional (67 \mul) y se
repitió la reacción de biotinilación. Después de extracción cinco
veces con butanol, el DNA fue precipitado con etanol y fue disuelto
en 23 \mul de H_{2}O para formar el DNA conductor.
Para formar el DNA trazador, 10 \mug del banco
de cDNA de carcinoma de células escamosas de pulmón fueron
sometidos a digestión con NotI y SpeI y a extracción con
fenol-cloroformo y fueron hechos pasar a través de
columnas Chroma Spin-400 (Clontech, Palo Alto,
California, EE.UU.). Típicamente, se recuperaron 5 \mug de cDNA
después de la columna de fraccionamiento por tamaños. Después de una
precipitación con etanol, se disolvió el DNA trazador en 5 \mul
de H_{2}O. El DNA trazador fue mezclado con 15 \mul de DNA
conductor y 20 \mul de tampón de hibridación 2x (NaCl 1,5 M/EDTA
10 mM/HEPES 50 mM, pH de 7,5/dodecilsulfato sódico al 0,2%),
cubierto con aceite mineral y completamente desnaturalizado por
calor. La muestra fue inmediatamente transferida a un baño de agua
a 68ºC y fue incubada durante 20 horas [hibridación larga (LH; del
inglés, long hybridization)]. La mezcla de reacción
fue luego sometida a un tratamiento con estreptavidina, seguido de
extracción con fenol/cloroformo. Este proceso fue repetido tres
veces más. El DNA sustraído fue precipitado, disuelto en 12 \mul
de H_{2}O, mezclado con 8 \mul de DNA conductor y 20 \mul de
tampón de hibridación 2x, y sometido a una hibridación a 68ºC
durante dos horas [hibridación corta (SH; del inglés, short
hybridization)]. Después de la separación del DNA de doble
cadena biotinilado, el cDNA sustraído fue ligado en el sitio
NotI/SpeI de pBCSK^{+} resistente a cloranfenicol (Stratagene, La
Jolla, California, EE.UU.) y fue usado para transformar células de
E. coli DH10B ElectroMax mediante electroporación, para
generar un banco de cDNA sustraído, específico de carcinoma de
células escamosas de pulmón (al que se hace referencia más adelante
como "sustracción I de pulmón").
Se generó un segundo banco de cDNA sustraído,
específico de carcinoma de células escamosas de pulmón (al que se
hace referencia como "sustracción II de pulmón"), de un modo
similar al banco I de sustracción de pulmón salvo porque se
incluyeron en el DNA conductor ocho genes de la sustracción I de
pulmón frecuentemente recuperados, y se recuperaron 24.000 clones
independientes.
Para analizar los bancos de cDNA sustraídos, se
preparó DNA plasmídico a partir de 320 clones independientes,
aleatoriamente escogidos de los bancos sustraídos específicos de
carcinoma de células escamosas de pulmón. Los clones de cDNA
representativos fueron adicionalmente caracterizados por
secuenciación de DNA con un secuenciador automatizado de Perkin
Elmer/Applied Biosystems Division, modelo 373A y/o modelo 377
(Foster City, California, EE.UU.). En las ID. SEC. números
1-60 se proporcionan las secuencias de cDNA para
sesenta clones aislados. Estas secuencias fueron comparadas con
secuencias conocidas del banco de genes utilizando las bases de
datos EMBL y GenBank (licencia 96). No se hallaron homologías
significativas con las secuencias proporcionadas en las ID. SEC.
números 2, 3, 19, 38 y 46. Se halló que las secuencias de ID. SEC.
números 1, 6-8, 10-13, 15, 17, 18,
20-27, 29, 30, 32, 34-37,
39-45, 47-49, 51, 52, 54, 55 y
57-59 muestran cierta homología con etiquetas de
secuencia expresada (ESTs) previamente identificadas. Se halló que
las secuencias de ID. SEC. números 9, 28, 31 y 33 muestran cierta
homología con secuencias génicas no humanas previamente
identificadas y se halló que las secuencias de ID. SEC. números 4,
5, 14, 50, 53, 56 y 60 muestran cierta homología con secuencias
génicas previamente identificadas en seres humanos.
El procedimiento de sustracción anteriormente
descrito fue repetido utilizando, como DNA trazador, el anterior
banco de cDNA de carcinoma de células escamosas de pulmón y, como
DNA conductor (sustracción III de pulmón), el anterior banco de
cDNA de tejido pulmonar normal y un banco de cDNA de hígado y
corazón normales (construido a partir de una colección de una
muestra de cada tejido, como se describió anteriormente), más otros
veinte clones de cDNA que se recuperaban frecuentemente en la
sustracciones I y II de pulmón. El banco de cDNA de hígado y
corazón normales contenía 1,76 x 10^{6} colonias independientes,
teniendo insertos el 100% de los clones y siendo 1600 pares de
bases el tamaño medio del inserto. Se aislaron diez clones
adicionales (ID. SEC. números 61-70). La
comparación de estas secuencias de cDNA con las del banco de genes
del modo anteriormente descrito no reveló homologías significativas
con las secuencias proporcionadas en las ID. SEC. números 62 y 67.
Se halló que las secuencias de ID. SEC. números 61,
63-66, 68 y 69 muestran cierta homología con ESTs
previamente aisladas y se halló que la secuencia proporcionada en la
ID. SEC. nº 70 muestra cierta homología con un gen de rata
previamente identificado.
En estudios ulteriores, se repitió el
procedimiento de sustracción anteriormente descrito utilizando el
anterior banco de cDNA de carcinoma de células escamosas de pulmón
como DNA trazador, y un banco de cDNA procedente de una colección
de pulmón, riñón, colon, páncreas, cerebro, células mononucleares de
sangre periférica (PBMC; del inglés, peripheral blood
mononuclear cells) en reposo, corazón, piel y esófago
normales como DNA conductor, constituyendo los cDNAs de esófago la
tercera parte del material conductor. Puesto que el esófago está
enriquecido en células epiteliales normales, incluyendo células
escamosas diferenciadas, es probable que este procedimiento
produzca un enriquecimiento en genes que son tumoralmente
específicos en vez de tisularmente específicos. En las ID. SEC.
números 177-224 se proporcionan las secuencias de
cDNA de 48 clones determinados en esta sustracción. Las secuencias
de ID. SEC. números 177, 178, 180, 181, 183, 187, 192,
195-197, 208, 211, 212, 215, 216, 218 y 219
mostraron cierta homología con genes previamente identificados. Las
secuencias de ID. SEC. números 179, 182, 184-186,
188-191, 193, 194, 198-207, 209,
210, 213, 214, 217, 220 y 224 mostraron cierta homología con ESTs
previamente determinadas. Las secuencias de ID. SEC. números
221-223 no mostraron homología con ninguna
secuencia previamente determinada.
Se construyó un banco de expresión de cDNA de
adenocarcinoma pulmonar humano del modo anteriormente descrito. El
banco contenía 3,2 x 10^{6} colonias independientes, teniendo un
inserto el 100% de los clones y siendo 1500 pares de bases el
tamaño medio del inserto. Se llevó a cabo una sustracción de bancos
del modo anteriormente descrito utilizando los anteriormente
descritos bancos de expresión de cDNA de pulmón normal y de hígado y
corazón normales como DNA conductor. Se recuperaron dos mil
seiscientos clones independientes.
El análisis inicial de las secuencias de cDNA de
100 clones independientes reveló muchos genes de proteínas
ribosómicas. En las ID. SEC. números 71-86 se
proporcionan las secuencias de cDNA de quince clones aislados en
esta sustracción. La comparación de estas secuencias con las del
banco de genes del modo anteriormente descrito no reveló homologías
significativas con la secuencia proporcionada en la ID. SEC. nº 84.
Se halló que las secuencias de ID. SEC. números 71, 73, 74, 77, 78
y 80-82 muestran cierta homología con ESTs
previamente aisladas y se halló que las secuencias de ID. SEC.
números 72, 75, 76, 79, 83 y 85 muestran cierta homología con genes
humanos previamente identificados.
En estudios ulteriores, se construyó un banco de
cDNA (al que se hace referencia como mets3616A) a partir de un
adenocarcinoma metastásico de pulmón. En las ID. SEC. números
255-279 se proporcionan las determinadas secuencias
de cDNA de 25 clones de este banco secuenciados al azar. El banco de
cDNA mets3616A fue sustraído de un banco de cDNA preparado a partir
de una colección de pulmón, hígado, páncreas, piel, riñón, cerebro
y PBMC en reposo normales. Para aumentar la especificidad de la
sustracción, se añadieron al conductor unos genes de los que se
había determinado que eran muy abundantes en el banco de cDNA
mets3616A, tales como EF1 alfa, integrina beta y proteína
anticoagulante PP4, así como cDNAs de los que se había hallado
previamente que se expresaban diferencialmente en bancos de cDNA de
adenocarcinoma pulmonar sustraídos. En las ID. SEC. números
280-330 se proporcionan las determinadas secuencias
de cDNA de 51 clones aislados del banco sustraído (al que se hace
referencia como mets3616A-S1).
La comparación de las secuencias de ID. SEC.
números 255-330 con las de las bases de datos
públicas no reveló homologías significativas con las secuencias de
ID. SEC. números 255-258, 260,
262-264, 270, 272, 275, 276, 279, 281, 287, 291,
296, 300 y 310. Las secuencias de ID. SEC. números 259, 261,
265-269, 271, 273, 274, 277, 278,
282-285, 288-290, 292, 294,
297-299, 301, 303-309, 313, 314,
316, 320-324 y 326-330 mostraron
cierta homología con secuencias génicas previamente identificadas,
mientras que las secuencias de ID. SEC. números 280, 286, 293, 302,
310, 312, 315, 317-319 y 325 mostraron cierta
homología con etiquetas de secuencia expresada (ESTs) previamente
aisladas.
Usando cebadores específicos de genes, se
examinaron los niveles de expresión de mRNA para siete polipéptidos
tumorales de pulmón representativos, descritos en el Ejemplo 1, en
una diversidad de tejidos normales y tumorales utilizando
RT-PCR.
En resumen, se extrajo el RNA total de una
diversidad de tejidos normales y tumorales utilizando el reactivo
Trizol del modo anteriormente descrito. La síntesis de la primera
cadena fue llevada a cabo utilizando 2 \mug de RNA total con
transcriptasa inversa SuperScript II (BRL Life Technologies) a 42ºC
durante una hora. Luego se multiplicó el cDNA por PCR con cebadores
específicos de genes. Para asegurar la naturaleza semicuantitativa
de la RT-PCR, se utilizó
\beta-actina como testigo interno para cada uno de
los tejidos examinados. Se empleó 1 \mul de una dilución 1:30 de
cDNA para permitir la multiplicación del molde de
\beta-actina en un intervalo lineal, lo que fue
suficientemente sensible para reflejar las diferencias en los
números de copias iniciales. Usando estas condiciones, se
determinaron los niveles de \beta-actina para cada
reacción de transcripción inversa de cada tejido. Se minimizó la
contaminación por DNA mediante tratamiento con DNasa y asegurando un
resultado de PCR negativo cuando se utilizaba el cDNA de primera
cadena que se había preparado sin añadir transcriptasa inversa.
Se examinaron los niveles de expresión de mRNA
en cinco tipos diferentes de tejido tumoral (carcinoma de células
escamosas de pulmón de 3 pacientes, adenocarcinoma de pulmón, tumor
de colon de 2 pacientes, tumor de mama y tumor de próstata) y trece
tejidos normales diferentes (pulmón de 4 donantes, próstata,
cerebro, riñón, hígado, ovario, músculo esquelético, piel,
intestino delgado, estómago, miocardio, retina y testículo). Al
utilizar una cantidad 10 veces mayor de cDNA, se halló que el
antígeno LST-S1-90 (ID. SEC. nº 3)
se expresaba con niveles elevados en el carcinoma de células
escamosas de pulmón y en el tumor de mama, y con niveles de bajos a
indetectables en los demás tejidos examinados.
Parece que el antígeno
LST-S2-68 (ID. SEC. nº 15) es
específico de los tumores de pulmón y mama; sin embargo, también se
detectó su expresión en riñón normal. Parece que los antígenos
LST-S1-169 (ID. SEC. nº 6) y
LST-S1-133 (ID. SEC. nº 5) son muy
abundantes en tejidos pulmonares (tanto normales como tumorales)
estando disminuida la expresión de estos dos genes en la mayoría de
los tejidos normales examinados.
LST-S1-169 y
LST-S1-133 también se expresaron en
tumores de mama y colon. Los antígenos
LST-S1-6 (ID. SEC. nº 7) y
LST-S2-I2-5F (ID.
SEC. nº 47) no mostraron expresiones tumoral ni tisularmente
específicas, siendo la expresión de
LST-S1-28 rara y sólo detectable en
unos pocos tejidos. El antígeno
LST-S3-7 (ID. SEC. nº 63) mostró
expresiones específicas de los tumores de pulmón y de mama,
detectándose sólo su mensaje en testículos normales cuando se llevó
a cabo la PCR durante 30 ciclos. Se detectó una expresión de menor
nivel en algunos tejidos normales cuando el número de ciclos fue
aumentado a 35. Se halló que el antígeno
LST-S3-13 (ID. SEC. nº 66) se
expresaba en 3 de los 4 tumores pulmonares, un tumor de mama y
ambas muestras de tumor de colon. Su expresión en tejidos normales
fue menor que en los tumores, y sólo se detectó en 1 de los 4
tejidos pulmonares normales y en tejidos normales de riñón, ovario
y retina. La expresión de los antígenos
LST-S3-4 (ID. SEC. nº 62) y
LST-S3-14 (ID. SEC. nº 67) era rara
y no mostraba ninguna especificidad tisular ni tumoral.
Consistentemente con los análisis por transferencia Northern, los
resultados de la RT-PCR en cuanto al antígeno
LST-S1-A-10A (ID.
SEC. nº 78) sugerían que su expresión es elevada en tejidos de
pulmón, colon, estómago e intestino delgado, incluyendo tumores de
pulmón y colon, mientras que su expresión era baja o indetectable en
otros tejidos.
Se multiplicó, por PCR de colonias, un total de
2002 fragmentos de cDNA aislados en las sustracciones pulmonares I,
II y III anteriormente descritas y, utilizando la tecnología de
micromatrices (Synteni, Palo Alto, California, EE.UU.), se
determinaron sus niveles de expresión de mRNA en tumor de pulmón,
pulmón normal y otros distintos tejidos normales y tumorales. En
resumen, los productos de la multiplicación por PCR fueron
depositados como puntos sobre portaobjetos en un formato de matriz,
ocupando cada producto una única posición en la matriz. Se extrajo
el mRNA de la muestra tisular que se iba a analizar y se sometió a
transcripción inversa, y se generaron sondas de cDNA
fluorescentemente marcadas. Se sondaron las micromatrices con las
sondas de cDNA marcadas, se exploraron los portaobjetos y se midió
la intensidad de la fluorescencia. Esta intensidad se correlaciona
con la intensidad de hibridación. Diecisiete clones de cDNA no
redundantes mostraron sobreexpresión en tumores escamosos de
pulmón, siendo la expresión en los tejidos normales examinados
(pulmón, piel, ganglio linfático, colon, hígado, páncreas, mama,
corazón, médula ósea, intestino grueso, riñón, estómago, cerebro,
intestino delgado, vejiga y glándula salival) indetectable o 10
veces menor que en los tumores escamosos de pulmón. Las
determinadas secuencias parciales de cDNA para el clon L513S se
proporcionan en las ID. SEC. números 87 y 88; aquéllas para L514S
se proporcionan en las ID. SEC. números 89 y 90; aquéllas para L516S
en las ID. SEC. números 91 y 92; aquélla para L517S en la ID. SEC.
nº 93; aquélla para L519S en la ID. SEC. nº 94; aquéllas para L520S
en las ID. SEC. números 95 y 96; aquéllas para L521S en las ID. SEC.
números 97 y 98; aquélla para L522S en la ID. SEC. nº 99; aquélla
para L523S en la ID. SEC. nº 100; aquélla para L524S en la ID. SEC.
nº 101; aquélla para L525S en la ID. SEC. nº 102; aquélla para
L526S en la ID. SEC. nº 103; aquélla para L527S en la ID. SEC. nº
104; aquélla para L528S en la ID. SEC. nº 105; aquélla para L529S en
la ID. SEC. nº 106; y aquéllas para L530S en las ID. SEC. números
107 y 108. Además, en la ID. SEC. nº 151 se proporciona la secuencia
de cDNA de longitud completa para L530S, proporcionándose en la ID.
SEC. nº 152 la prevista secuencia de aminoácidos correspondiente.
L530S muestra homología con una variante de corte y empalme de un
compuesto homólogo al supresor tumoral p53, p63. En las ID. SEC.
números 331-337 se proporcionan las secuencias de
cDNA de 7 isoformas conocidas de p63, proporcionándose en las ID.
SEC. números 338-344, respectivamente, las previstas
secuencias de aminoácidos correspondientes.
Parece que, a causa de polimorfismos, el clon
L531S tiene dos formas. En la ID. SEC. nº 109 se proporciona una
primera secuencia determinada de cDNA de longitud completa para
L531S, proporcionándose en la ID. SEC. nº 110 la prevista secuencia
de aminoácidos correspondiente. En la ID. SEC. nº 111 se proporciona
una segunda secuencia determinada de cDNA de longitud completa para
L531S, proporcionándose en la ID. SEC. nº 112 la prevista secuencia
de aminoácidos correspondiente. La secuencia de ID. SEC. nº 111 es
idéntica a la de la ID. SEC. nº 109 salvo porque contiene una
inserción de 27 pares de bases. Similarmente, L514S también tiene
dos formas alternativamente cortadas y empalmadas; el primer cDNA
variante se expone como ID. SEC. nº 153, proporcionándose en la ID.
SEC. nº 155 la correspondiente secuencia de aminoácidos. En la ID.
SEC. nº 154 se proporciona la segunda forma variante del cDNA de
longitud completa de L514S, proporcionándose en la ID. SEC. nº 156
la correspondiente secuencia de aminoácidos.
La clonación de longitud completa para L524S
(ID. SEC. nº 101) produjo dos variantes (ID. SEC. números 163 y
164), con las correspondientes previstas secuencias de aminoácidos
de ID. SEC. números 165 y 166, respectivamente. Se ha mostrado que
ambas variantes codifican un péptido relacionado con la hormona
paratiroidea.
Los intentos para aislar el cDNA de longitud
completa para L519S dieron lugar al aislamiento de la secuencia de
cDNA extendida proporcionada en la ID. SEC. nº 173, que contiene un
posible marco de lectura abierto. En la ID. SEC. nº 174 se
proporciona la prevista secuencia de aminoácidos codificada por la
secuencia de ID. SEC. nº 173. Además, en la ID. SEC. nº 175 se
proporciona la secuencia de cDNA de longitud completa para el clon
de ID. SEC. nº 100 (conocido como L523S), un gen conocido,
proporcionándose en la ID. SEC. nº 176 la prevista secuencia de
aminoácidos correspondiente. En estudios ulteriores, se aisló una
secuencia de cDNA de longitud completa para L523S a partir de un
banco de cDNA de tumores positivos para L523S, mediante
multiplicación por PCR utilizando cebadores génicamente específicos
diseñados a partir de la secuencia de ID. SEC. nº 175. En la ID.
SEC. nº 347 se proporciona la secuencia de cDNA determinada. En la
ID. SEC. nº 348 se proporciona la secuencia de aminoácidos
codificada por esta secuencia. Esta secuencia proteica difiere de la
secuencia proteica previamente publicada en dos posiciones de
aminoácido, es decir, en las posiciones 158 y 410.
La comparación de las secuencias de L514S y
L531S (ID. SEC. números 87 y 88, 89 y 90, y 109, respectivamente)
con las del banco de genes, como se describió anteriormente, no
reveló homologías significativas con secuencias conocidas. Se halló
que las secuencias de L513S, L516S, L517S, L519S, L520S y L530S (ID.
SEC. números 87 y 88, 91 y 92, 93, 94, 95 y 96, 107 y 108,
respectivamente) muestran cierta homología con ESTs previamente
identificadas. Se halló que las secuencias de L521S, L522S, L523S,
L524S, L525S, L526S, L527S, L528S y L529S (ID. SEC. números 97 y
98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 y 106, respectivamente)
representan genes conocidos. En la ID. SEC. nº 113 se proporciona
la determinada secuencia de cDNA de longitud completa para L520S,
proporcionándose en la ID. SEC. nº 114 la prevista secuencia de
aminoácidos correspondiente. Un análisis de micromatrices
subsiguiente ha mostrado que L520S está sobreexpresada en tumores
de mama además de en tumores escamosos de pulmón.
Un análisis ulterior ha demostrado que L529S
(ID. SEC. números 106 y 115), L525S (ID. SEC. números 102 y 120) y
L527S (ID. SEC. nº 104) son componentes citoesqueléticos y proteínas
específicas de células potencialmente escamosas. L529S es la
conexina 26, una proteína de unión comunicante ("gap
junction"). Está muy expresada en el tumor escamoso pulmonar
9688T y moderadamente sobreexpresada en otros dos. Sin embargo,
también es detectable una expresión de menor nivel de la conexina
26 en piel, colon, hígado y estómago normales. Se ha comunicado la
sobreexpresión de la conexina 26 en ciertos tumores de mama, y una
forma mutada de L529S puede dar lugar a sobreexpresión en tumores
de pulmón. L525S es la placofilina 1, una proteína desmosómica
hallada en las uniones adherentes de la piel que llevan placas. Los
niveles de expresión del mRNA de L525S están muy elevados en tres
de los cuatro tumores escamosos pulmonares examinados y en la piel
normal. La L527S ha sido identificada como la isoforma queratina 6,
queratina de tipo II de 58 kDa, y citoqueratina 13, y muestra
sobreexpresión en tumores escamosos y baja expresión en tejidos
normales de piel, mama y colon. Notablemente, se ha documentado
ampliamente que genes de queratina y relacionados con queratina son
posibles marcadores para el cáncer de pulmón, incluyendo CYFRA2.1
(A. Pastor et al., Eur. Respir. J. 10:
603-609, 1997). L513S (ID. SEC. números 87 y 88)
muestra una moderada sobreexpresión en diversos tejidos tumorales
examinados y codifica una proteína que fue aislada por vez primera
como un antígeno del pénfigo vulgar.
L520S (ID. SEC. números 95 y 96) y L521S (ID.
SEC. números 97 y 98) están muy expresadas en tumores escamosos
pulmonares, L520S está suprarregulada en la glándula salival normal
y L521S está sobreexpresada en la piel normal. Ambas pertenecen a
una familia de proteínas pequeñas, ricas en prolina, y representan
marcadores para células escamosas totalmente diferenciadas. L521S
ha sido descrita como un marcador específico para el tumor escamoso
de pulmón (R. Hu et al., Lung Cancer 20:
25-30, 1998). L515S (ID. SEC. nº 162) codifica
IGF-\beta2, y L516S es un compuesto homólogo de
aldosa reductasa, y ambas están moderadamente expresadas en tumores
escamosos de pulmón y en colon normal. Notablemente, L516S (ID.
SEC. números 91 y 92) está suprarregulada en tumores metastásicos
pero no en el adenocarcinoma pulmonar primario, una indicación de su
posible papel en la metástasis y como posible marcador de
pronóstico. L522S (ID. SEC. nº 99) está moderadamente sobreexpresada
en tumores escamosos de pulmón, con una expresión mínima en tejidos
normales. Se ha mostrado que L522S pertenece a una alcohol
deshidrogenasa de clase IV, ADH7, y su perfil de expresión sugiere
que es un antígeno específico de células escamosas. L523S (ID. SEC.
nº 100) está moderadamente sobreexpresada en el tumor escamoso de
pulmón, líneas celulares de cáncer pancreático humano y tejidos de
cáncer pancreático, lo que sugiere que este gen puede ser un
antígeno compartido entre los cánceres pancreático y de células
escamosas de pulmón.
L524S (ID. SEC. nº 101) está sobreexpresada en
la mayoría de los tumores escamosos examinados y es homóloga del
péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP; del inglés,
parathyroid hormone-related peptide),
que es más conocido por causar una hipercalcemia humoral asociada
con tumores malignos tales como leucemia y cánceres de próstata y
mama. También se cree que PTHrP está asociado muy comúnmente con el
carcinoma escamoso de pulmón y raramente con el adenocarcinoma de
pulmón (L. A. Davidson et al., J. Pathol. 178:
398-401, 1996). L528S (ID. SEC. nº 105) está muy
sobreexpresada en dos tumores escamosos de pulmón, con una expresión
moderada en otros dos tumores escamosos, un adenocarcinoma de
pulmón y algunos tejidos normales, incluyendo piel, ganglios
linfáticos, corazón, estómago y pulmón. Codifica el gen NMB, que es
similar al precursor del gen PmeI17 específico de melanocitos, del
que se ha comunicado que se expresa preferentemente en potenciales
líneas celulares de melanoma poco metastásicas. Esto sugiere que
L528S puede ser un antígeno compartido por el melanoma y el
carcinoma de células escamosas de pulmón. L526S (ID. SEC. nº 103)
está sobreexpresada en todos los tejidos tumorales de células
escamosas de pulmón examinados, y se ha mostrado que comparte
homología con un gen (ATM) en que una mutación causa ataxia
telangiectasia, un trastorno genético que causa en seres humanos una
predisposición al cáncer, entre otros síntomas. ATM codifica una
proteína que activa un punto de control del ciclo celular, mediado
por p53, a través de la unión directa y la fosforilación de la
molécula de p53. Aproximadamente el 40% del cáncer de pulmón está
asociado con mutaciones de p53, y se especula que la sobreexpresión
de ATM es un resultado de la compensación de la pérdida de función
de p53, aunque se desconoce si la sobreexpresión es la causa del
resultado del carcinoma de células escamosas de pulmón. Además,
también se detecta expresión de L526S (ATM) en un adenocarcinoma
metastásico pero no pulmonar, lo que sugiere un papel en la
metástasis.
También se examinó la expresión de L523S (ID.
SEC. nº 175) mediante RT-PCR en tiempo real, como se
describió anteriormente. En un primer estudio en que se utilizaba
un conjunto de tumores escamosos de pulmón, se halló que L523S se
expresaba en 4/7 tumores escamosos de pulmón, 2/3 tumores escamosos
de cabeza y cuello y 2/2 adenocarcinomas de pulmón, observándose
una expresión de bajo nivel en músculo esquelético, velo del paladar
y amígdala. En un segundo estudio en que se utilizaba un conjunto
de adenocarcinomas de pulmón, se observó la expresión de L523S en
4/9 adenocarcinomas primarios, 2/2 derrames pleurales de pulmón, 1/1
adenocarcinomas pulmonares metastásicos y 2/2 tumores escamosos de
pulmón, observándose poca expresión en tejidos normales.
También se examinó la expresión de L523S en
tumores pulmonares y en diversos tejidos normales mediante análisis
por transferencia Northern usando técnicas estándares. En un primer
estudio, se halló que L523S se expresaba en diversos
adenocarcinomas pulmonares y carcinomas de células escamosas, así
como en amígdala normal. No se observó expresión alguna en pulmón
normal. En un segundo estudio en que se utilizaba una transferencia
de tejido normal (HB-12) de Clontech, no se observó
expresión alguna en cerebro, músculo esquelético, colon, timo,
bazo, riñón, hígado, intestino delgado, pulmón ni PBMC, aunque hubo
una intensa expresión en placenta.
Se obtuvieron ochocientos cincuenta y siete
clones de un banco de sustracción de cDNA, que contenían cDNA de
una colección de dos tumores escamosos de pulmón humanos sustraídos
de ocho cDNAs de tejido humano normal que incluían pulmón, PBMC,
cerebro, corazón, riñón, hígado, páncreas y piel (Clontech, Palo
Alto, California, EE.UU.), y se sometieron a un primer ciclo de
multiplicación por PCR. Este banco fue sometido a un segundo ciclo
de multiplicación por PCR siguiendo el protocolo del fabricante. Los
fragmentos de cDNA resultantes fueron subclonados en el vector
P7-Adv (Clontech, Palo Alto, California, EE.UU.) y
usados para transformar E. coli DH5\alpha (Gibco, BRL). Se
aisló DNA de clones independientes y se secuenció usando el
secuenciador automatizado Modelo 373A de Perkin Elmer/Applied
Biosystems Division.
Se secuenciaron ciento sesenta y dos clones
positivos. La comparación de las secuencias de DNA de estos clones
con las de las bases de datos EMBL y GenBank, como se describió
anteriormente, no reveló homologías significativas con 13 de estos
clones, a los que aquí se hace referencia como cóntigos 13, 16, 17,
19, 22, 24, 29, 47, 49 y 56-59. En las ID. SEC.
números 125, 127-129, 131-133, 142,
144, 148-150 y 157, respectivamente, se proporcionan
las determinadas secuencias de cDNA para estos clones. Se halló que
los cóntigos 1, 3-5, 7-10, 11, 12,
15, 20, 31, 33, 38, 39, 41, 43, 44, 45, 48, 50, 53 y 54 (ID. SEC.
números 115-124, 126, 130, 134-141,
143 y 145-147, respectivamente) muestran cierto
grado de homología con secuencias de DNA previamente identificadas.
Se halló que el cóntigo 57 (ID. SEC. nº 149) representa el clon
L519S (ID. SEC. nº 94) descrito en la Solicitud de Patente de
EE.UU. nº 09/123.912, presentada el 27 de Julio de 1998. Que sepan
los inventores, no se ha mostrado previamente que alguna de estas
secuencias se sobreexprese diferencialmente en tumores de
pulmón.
Se determinaron por RT-PCR, del
modo anteriormente descrito, los niveles de expresión de mRNA para
clones representativos en tejidos tumorales de pulmón, tejidos
normales de pulmón (n = 4), PBMC en reposo, glándula salival,
corazón, estómago, ganglios linfáticos, músculo esquelético, velo
del paladar, intestino delgado, intestino grueso, bronquio, vejiga,
amígdala, riñón, esófago, médula ósea, colon, glándula suprarrenal,
páncreas y piel (todos procedentes de ser humano). A menos que se
indique otra cosa, se examinaron los niveles de expresión en una
muestra de cada tipo tisular utilizando la tecnología de
micromatrices, como se describió anteriormente.
Se halló que el cóntigo 3 (ID. SEC. nº 116)
estaba muy expresado en todos los tumores de células escamosas de
cabeza y cuello examinados (17/17) y expresado en la mayoría (8/12)
de los tumores escamosos de pulmón (elevada expresión en 7/12,
moderada en 2/12 y baja en 2/12), mientras que mostraba una
expresión negativa en 2/4 tejidos normales de pulmón y una baja
expresión en las dos muestras restantes. El cóntigo 3 presentaba
una expresión moderada en piel y velo del paladar y unos niveles de
expresión reducidos en PBMC en reposo, intestino grueso, glándula
salival, amígdala, páncreas, esófago y colon. Se halló que el
cóntigo 11 (ID. SEC. nº 124) estaba expresado en todos los tumores
de células escamosas de cabeza y cuello examinados (17/17): muy
expresado en 14/17 y moderadamente expresado en 3/17. Además, la
expresión en tumores escamosos pulmonares era elevada en 3/12 y
moderada en 4/12. El cóntigo 11 fue negativo en 3/4 muestras de
pulmón normal, teniendo la muestra restante sólo una baja
expresión. El cóntigo 11 presentaba una reactividad de baja a
moderada en glándula salival, velo del paladar, vejiga, amígdala,
piel, esófago e intestino grueso. Se halló que el cóntigo 13 (ID.
SEC. nº 125) estaba expresado en todos los tumores de células
escamosas de cabeza y cuello examinados (17/17): muy expresado en
12/17 y moderadamente expresado en 5/17. El cóntigo 13 se expresaba
en 7/12 tumores escamosos de pulmón, con una elevada expresión en
4/12 y una expresión moderada en tres muestras. El análisis de las
muestras de pulmón normal mostró una expresión negativa en 2/4 y una
expresión de baja a moderada en las dos muestras restantes. El
cóntigo 13 mostró una reactividad de baja a moderada con respecto a
PBMC en reposo, glándula salival, vejiga, páncreas, amígdala, piel,
esófago e intestino grueso, así como una elevada expresión en velo
del paladar. Se halló que el cóntigo 16 (ID. SEC. nº 127) se
expresaba moderadamente en algunos tumores de células escamosas de
cabeza y cuello (6/17) y en un tumor escamoso de pulmón, mientras
que no mostraba expresión alguna en las muestras de pulmón normal
examinadas. El cóntigo 16 mostró una baja reactividad con respecto
a PBMC en reposo, intestino grueso, piel, glándula salival y velo
del paladar. Se mostró que el cóntigo 17 (ID. SEC. nº 128) se
expresaba en todos los tumores de células escamosas de cabeza y
cuello examinados (17/17): muy expresado en 5/17 y moderadamente
expresado en 12/17. Los niveles de expresión en tumores escamosos
de pulmón mostraron una muestra tumoral con elevada expresión y 3/12
con niveles moderados. El cóntigo 17 fue negativo en 2/4 muestras
de pulmón normal, teniendo las muestras restantes sólo una baja
expresión. Además, se halló una expresión de bajo nivel en esófago y
velo del paladar. Se halló que el cóntigo 19 (ID. SEC. nº 129) se
expresaba en la mayoría de los tumores de células escamosas de
cabeza y cuello examinados (11/17), teniendo dos muestras unos
niveles elevados, mostrando 6/17 una expresión moderada y hallándose
una baja expresión en 3/17. El examen en tumores escamosos de
pulmón reveló sólo una expresión moderada en 3/12 muestras. Los
niveles de expresión en 2/4 de las muestras de pulmón normal fueron
negativos, teniendo las otras dos muestras sólo una expresión baja.
El cóntigo 19 mostraba niveles de expresión bajos en esófago, PBMC
en reposo, glándula salival, vejiga, velo del paladar y
páncreas.
Se mostró que el cóntigo 22 (ID. SEC. nº 131) se
expresaba en la mayoría de los tumores de células escamosas de
cabeza y cuello examinados (13/17), con una expresión elevada en
cuatro de estas muestras, una expresión moderada en 6/17 y una
expresión baja en 3/17. Se halló que los niveles de expresión en
tumores escamosos de pulmón eran de moderados a elevados en 3/12
tejidos examinados, con una expresión negativa en dos muestras de
pulmón normal y una baja expresión en otras dos muestras (n = 4). El
cóntigo 22 mostraba baja expresión en piel, glándula salival y velo
del paladar. Similarmente, se halló que el cóntigo 24 (ID. SEC. nº
132) se expresaba en la mayoría de los tumores de células escamosas
de cabeza y cuello examinados (13/17), con una elevada expresión en
tres de estas muestras, una expresión moderada en 6/17 y una
expresión baja en 4/17. Se halló que los niveles de expresión en
tumores escamosos de pulmón eran de moderados a elevados en 3/12
tejidos examinados, con expresión negativa en tres muestras de
pulmón normal y expresión baja en una muestra (n = 4). El cóntigo
24 mostraba baja expresión en piel, glándula salival y velo del
paladar. El cóntigo 29 (ID. SEC. nº 133) se expresaba en casi todos
los tumores de células escamosas de cabeza y cuello examinados
(16/17): muy expresado en 4/17, moderadamente expresado en 11/17 y
con baja expresión en una muestra. Además, se expresaba
moderadamente en 3/12 tumores escamosos de pulmón, mientras que era
negativo en 2/4 muestras de pulmón normal. El cóntigo 29 mostraba
una expresión de baja a moderada en intestino grueso, piel, glándula
salival, páncreas, amígdala, corazón y velo del paladar. El cóntigo
47 (ID. SEC. nº 142) se expresaba en la mayoría de los tumores de
células escamosas de cabeza y cuello examinados (12/17): expresión
moderada en 10/17 y expresión baja en dos muestras. En tumores
escamosos de pulmón, se expresaba mucho en una muestra y se
expresaba moderadamente en otras dos (n = 13). El cóntigo 47 era
negativo en 2/4 muestras de pulmón normal, teniendo una expresión
moderada en las dos muestras restantes. Además, el cóntigo 47
mostraba una expresión moderada en intestino grueso y páncreas, y
una expresión baja en piel, glándula salival, velo del paladar,
estómago, vejiga, PBMC en reposo y amígdala.
El cóntigo 48 (ID. SEC. nº 143) se expresaba en
todos los tumores de células escamosas de cabeza y cuello
examinados (17/17): muy expresado en 8/17 y moderadamente expresado
en 7/17, con baja expresión en dos muestras. Los niveles de
expresión en tumores escamosos de pulmón eran de elevados a
moderados en tres muestras (n = 13). El cóntigo 48 era negativo en
una de las cuatro muestras de pulmón normal, mostrando las restantes
una expresión baja o moderada. El cóntigo 48 mostraba una expresión
moderada en velo del paladar, intestino grueso, páncreas y vejiga,
y una expresión baja en esófago, glándula salival, PBMC en reposo y
corazón. El cóntigo 49 (ID. SEC. nº 144) se expresaba con niveles
de bajos a moderados en 6/17 tumores de células escamosas de cabeza
y cuello examinados. Los niveles de expresión en tumores escamosos
de pulmón eran moderados en tres muestras (n = 13). El cóntigo 49
era negativo en 2/4 muestras de pulmón normal, mostrando las
muestras restantes una expresión baja. Se mostraron niveles de
expresión moderados en piel, glándula salival, intestino grueso,
páncreas, vejiga y PBMC en reposo, así como una expresión baja en
velo del paladar, ganglios linfáticos y amígdala. El cóntigo 56
(ID. SEC. nº 148) se expresaba con niveles de bajos a moderados en
3/17 tumores de células escamosas de cabeza y cuello examinados, y
en tumores escamosos de pulmón, mostrando unos niveles de bajos a
moderados en tres de trece muestras. Notablemente, se detectaron
bajos niveles de expresión en una muestra de adenocarcinoma de
pulmón (n = 2). El cóntigo 56 era negativo en 3/4 muestras de pulmón
normal y sólo mostraba unos niveles de expresión moderados en
intestino grueso, y baja expresión en glándula salival, velo del
paladar, páncreas, vejiga y PBMC en reposo. El cóntigo 58, también
conocido como L769P (ID. SEC. nº 150), se expresaba con niveles
moderados en 11/17 tumores de células escamosas de cabeza y cuello
examinados y con baja expresión en una muestra adicional. La
expresión en tumores escamosos de pulmón mostraba unos niveles de
bajos a moderados en tres de trece muestras. El cóntigo 58 era
negativo en 3/4 muestras de pulmón normal, teniendo una muestra una
baja expresión. Se encontraron unos niveles de expresión moderados
en piel, intestino grueso y PBMC en reposo, así como una baja
expresión en glándula salival, velo del paladar, páncreas y vejiga.
El cóntigo 59 (ID. SEC. nº 157) se expresaba en algunos tumores
escamosos de cabeza, cuello y pulmón. También se detectó una
expresión de bajo nivel del cóntigo 59 en glándula salival e
intestino grueso.
En la ID. SEC. nº 158 se proporciona la
secuencia de cDNA de longitud completa para el cóntigo 22, también
referida como L763P, proporcionándose en la ID. SEC. nº 159 la
prevista secuencia de aminoácidos correspondiente. Un análisis de
L763P por RT-PCR en tiempo real reveló que se
expresaba mucho en 3/4 tumores escamosos de pulmón así como en 4/4
tumores escamosos de cabeza y cuello, observándose una expresión de
bajo nivel en cerebro, piel, velo del paladar y traquea normales.
Subsiguientes búsquedas en bases de datos revelaron que la secuencia
de ID. SEC. nº 158 contiene una mutación, la cual da lugar a un
desplazamiento de marco en la correspondiente secuencia proteica.
En la ID. SEC. nº 345 se proporciona una segunda secuencia de cDNA
para L763P, proporcionándose en la ID. SEC. nº 346 la
correspondiente secuencia de aminoácidos. Las secuencias de ID. SEC.
números 159 y 346 son idénticas salvo por los 33 aminoácidos
C-terminales de la ID. SEC. nº 159.
En la ID. SEC. nº 160 se proporciona la
secuencia de cDNA de longitud completa que incorpora los cóntigos
17, 19 y 24, también referida como L762P, proporcionándose en la ID.
SEC. nº 161 la prevista secuencia de aminoácidos correspondiente.
Un análisis ulterior de L762P ha determinado que es una proteína de
membrana de tipo I, y se han secuenciado dos variantes adicionales.
La variante 1 (ID. SEC. nº 167, con la correspondiente secuencia de
aminoácidos en la ID. SEC. nº 169) es una forma alternativamente
cortada y empalmada de la ID. SEC. nº 160 que da lugar a la
deleción de 503 nucleótidos, así como a la deleción de un segmento
corto de la proteína expresada. La variante 2 (ID. SEC. nº 168, con
la correspondiente secuencia de aminoácidos en la ID. SEC. nº 170)
tiene una deleción de dos nucleótidos en la región de codificación
3' con respecto a la ID. SEC. nº 160, lo que da lugar a una forma
secretada de la proteína expresada. Un análisis de L762P por
RT-PCR en tiempo real reveló que está sobreexpresada
en 3/4 tumores escamosos de pulmón y 4/4 tumores de cabeza y
cuello, observándose una expresión de bajo nivel en piel, velo del
paladar y traquea normales.
En la ID. SEC. nº 171 se proporciona la
secuencia de cDNA de longitud completa para el cóntigo 56 (ID. SEC.
nº 148), también referida como L773P, con la prevista secuencia de
aminoácidos en la ID. SEC. nº 172. Se halló que L773P era idéntica
a la dihidroxilo deshidrogenasa en la porción 3' del gen, con una
secuencia 5' divergente. Como resultado, los 69 aminoácidos
N-terminales son únicos. La secuencia de cDNA que
codifica los 69 aminoácidos N-terminales se
proporciona en la ID. SEC. nº 349, proporcionándose la secuencia de
aminoácidos N-terminales en la ID. SEC. nº 350. Una
PCR en tiempo real reveló que L773P está muy expresada en el tumor
escamoso de pulmón y el adenocarcinoma de pulmón, con una expresión
indetectable en tejidos normales. Un subsiguiente análisis de L773P
por transferencia Northern demostró que este transcrito se
sobreexpresa diferencialmente en tumores escamosos y se detecta con
aproximadamente 1,6 kb en tejido de tumor primario de pulmón y con
aproximadamente 1,3 kb en tejido de tumor primario de cabeza y
cuello.
Un subsiguiente análisis por micromatriz ha
mostrado que el cóntigo 58, también referido como L769S (ID. SEC.
nº 150), está sobreexpresado en tumores de mama además de en tumores
escamosos de pulmón.
Se pueden sintetizar polipéptidos en un
sintetizador peptídico Perkin Elmer/Applied Biosystems Division 430A
usando la química del FMOC con activación por HPTU
(hexafluorofosfato de
O-benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametiluronio).
Se puede fijar una secuencia
Gly-Cys-Gly al extremo amínico del
péptido para obtener un método de conjugación, unión a una
superficie inmovilizada, o marcación del péptido. La escisión de los
péptidos del soporte sólido se puede llevar a cabo usando la
siguiente mezcla de escisión: ácido
trifluoroacético:etanoditiol:tioanisol:agua:fenol (40:1:2:2:3).
Después de una escisión durante 2 horas, los péptidos pueden ser
precipitados en metil-t-butil-éter
frío. Los sedimentos peptídicos de precipitación pueden ser luego
disueltos en agua que contiene ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%
y ser liofilizados antes de una purificación por HPLC en fase
inversa C18. Para eluir los péptidos, se puede utilizar un
gradiente de acetonitrilo al 0%-60% (que contiene TFA al 0,1%) en
agua (que contiene TFA al 0,1%). Después de la liofilización de las
fracciones puras, los péptidos pueden ser caracterizados utilizando
espectrometría de masas por electropulverización o de otros tipos, y
mediante análisis de aminoácidos.
Se prepararon anticuerpos policlonales contra
los antígenos L514S, L528S y L531S (ID. SEC. números 155, 225 y
112, respectivamente) de cáncer de pulmón del modo siguiente.
Se inmunizaron conejos con la proteína
recombinante expresada en E. coli y purificada de E.
coli del modo anteriormente descrito. Para la inmunización
inicial, se inyectaron subcutáneamente (s.c.) 400 \mug de
antígeno combinados con muramil-dipéptido (MDP). Los
animales se reforzaron s.c. 4 semanas más tarde con 200 \mug de
antígeno mezclados con adyuvante incompleto de Freund (AIF). Se
inyectaron s.c. subsiguientes refuerzos de 100 \mug de antígeno
mezclados con AIF, según fuera necesario, para inducir respuestas
con elevados títulos de anticuerpos. Se examinaron sangrías séricas
de los ratones inmunizados, en cuanto a una reactividad específica
de antígeno, utilizando ensayos ELISA con la proteína purificada. Se
purificaron anticuerpos policlonales contra L514S, L528S y L531S,
por afinidad, a partir de sueros policlonales de títulos elevados
usando la proteína purificada fijada a un soporte sólido.
Se llevó a cabo un análisis inmunohistoquímico,
utilizando anticuerpos policlonales contra L514S, sobre un conjunto
de 5 muestras de tumor de pulmón, 5 muestras de tejido pulmonar
normal, y colon, riñón, hígado, cerebro y médula ósea normales.
Específicamente, las muestras tisulares fueron fijadas en una
disolución de formol durante 24 horas y fueron embebidas en
parafina antes de ser cortadas en secciones de 10 \mum. Se
permeabilizaron las secciones tisulares y se incubaron con el
anticuerpo durante 1 hora. Para visualizar la inmunorreactividad de
L514S, se usó suero anti-ratón, marcado con
peroxidasa de rábano picante (HRP), lo que fue seguido de una
incubación con el cromógeno diaminobencidina (DAB). Se halló que
L514S está muy expresada en tejido tumoral de pulmón, observándose
poca o ninguna expresión en pulmón, cerebro y médula ósea normales.
Se observó tinción lumínica en colon y riñón. Se vio tinción en
hígado normal pero no se ha detectado mRNA en este tejido, lo que
hace sospechar de este resultado.
Se identificaron péptidos inmunogénicos del
antígeno L762P de cáncer de pulmón (ID. SEC. nº 161) para células T
CD8+ restringidas por HLA-A2/K^{b}, de la manera
siguiente.
Se pronosticó la posición de péptidos ligantes
de HLA-A2 en el antígeno L762P de cáncer de pulmón
(ID. SEC. nº 161) usando un programa informático que pronostica
secuencias de péptidos que es probable que sean para
HLA-A*0201 por ajuste al conocido motivo ligante
peptídico para HLA-A*0201 [Rupert et al.
(1993), Cell 74: 929; Rammensee et al. (1995),
Immunogenetics 41: 178-228]. Se preparó del modo
anteriormente descrito una serie de 19 péptidos sintéticos que
correspondían a un subgrupo seleccionado de los péptidos ligantes de
HLA-2*0201 pronosticados.
Ratones que expresan el transgén para HLA
A2/K^{b} humano (proporcionados por el Dr. L. Sherman, The Scripps
Research Institute, La Jolla, California, EE.UU.) fueron
inmunizados con los péptidos sintéticos del modo descrito por
Theobald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:
11.993-11.997, 1995, con las modificaciones
siguientes. Se inmunizaron ratones con 50 \mug de péptido L726P y
120 \mug de un péptido ligante de I-A^{b},
derivado de proteína de virus de la hepatitis B, emulsionados en
adyuvante incompleto de Freund. Tres semanas más tarde, se
sacrificaron estos ratones y se prepararon suspensiones celulares
individuales. Luego se resuspendieron las células hasta 7 x
10^{6} células/ml en medio completo (RPMI-1640;
Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland, EE.UU.) que contenía suero de
ternera fetal (FCS) al 10%, glutamina (Gibco BRL) 2 mM, piruvato
sódico (Gibco BRL), aminoácidos no esenciales (Gibco BRL),
2-mercaptoetanol 2 x 10^{-5} M, y 50 U/ml de
penicilina y estreptomicina, y se cultivaron en presencia de
blastos de LPS (células de bazos transgénicos A2 cultivadas en
presencia de 7 \mug/ml de sulfato de dextrano y 25 \mug/ml de
LPS durante 3 días) impulsados con péptido L762P (5 \mug/ml) y 10
mg/ml de \beta_{2}-microglobulina (3 \mug/ml)
e irradiados (30 Gy). Después de seis días, las células (5 x
10^{5}/ml) fueron vueltas a estimular con 2,5 x 10^{6} células
EL4A2Kb/ml impulsadas con péptido e irradiadas (200 Gy) (Sherman
et al., Science 258: 815-818, 1992) y 5 x
10^{6} células esplénicas transgénicas A2/K^{b} de soporte/ml
irradiadas (30 Gy). Se cultivaron las células en presencia de 10
U/ml de IL-2. Se volvieron a estimular las células
sobre una base semanal del modo descrito, como preparación para
clonar la línea.
Las líneas celulares específicas del péptido
fueron clonadas, mediante análisis por dilución limitante, con
células tumorales EL4 A2Kb (1 x 10^{4} células/pocillo) impulsadas
con péptido L762P e irradiadas (200 Gy) como células estimuladoras,
y con células esplénicas transgénicas A2/K^{b} (5 x 10^{5}
células/pocillo) irradiadas (30 Gy) como células de soporte,
cultivadas en presencia de 10 U/ml de IL-2. El día
7, las células fueron vueltas a estimular como antes. El día 14,
los clones que estaban creciendo fueron aislados y fueron
mantenidos en cultivo.
Las líneas celulares específicas para
L762P-87 (ID. SEC. nº 226, que corresponde a los
aminoácidos 87-95 de la ID. SEC. nº 161),
L762P-145 (ID. SEC. nº 227, que corresponde a los
aminoácidos 145-153 de la ID. SEC. nº 161),
L762P-585 (ID. SEC. nº 228, que corresponde a los
aminoácidos 585-593 de la ID. SEC. nº 161),
L762P-425 (ID. SEC. nº 229, que corresponde a los
aminoácidos 425-433 de la ID. SEC. nº 161),
L762P(10)-424 (ID. SEC. nº 230, que
corresponde a los aminoácidos 424-433 de la ID. SEC.
nº 161) y L762P(10)-458 (ID. SEC. nº 231,
que corresponde a los aminoácidos 458-467 de la ID.
SEC. nº 161) mostraron una reactividad significativamente mayor
(según se mide por el porcentaje de lisis específica) frente a las
células diana tumorales EL4-A2/K^{b} impulsadas
con péptido L762P que frente a las células diana tumorales
EL4-A2/K^{b} impulsadas con péptido testigo.
Se generaron líneas de células T CD4+
específicas para el antígeno L762P (ID. SEC. nº 161) de la manera
siguiente.
Se sintetizó una serie de 28 péptidos solapantes
que abarcaban aproximadamente el 50% de la secuencia de L762P. Para
el cebado, se combinaron los péptidos en grupos de
4-5 péptidos, y con ellos en concentraciones de 20
microgramos/ml se impulsaron células dendríticas durante 24 horas.
Las células dendríticas fueron luego lavadas y fueron mezcladas, en
placas de 96 pocillos con fondo en forma de U, con células T CD4+
positivamente seleccionadas. Se generaron 40 cultivos para cada
grupo peptídico. Los cultivos fueron vueltos a estimular
semanalmente con células dendríticas frescas cargadas con grupos
peptídicos. Después de un total de 3 ciclos de estimulación, las
células fueron dejadas en reposo durante una semana más y fueron
examinadas en cuanto a la especificidad para células presentadoras
de antígeno (APC) impulsadas con grupos peptídicos, utilizando
ensayos ELISA para interferón gamma y de proliferación. Para estos
ensayos, como APCs, se usaron monocitos adherentes cargados con el
grupo peptídico relevante o con un péptido irrelevante. Para cada
grupo, mediante proliferación y liberación de citocinas, se
identificaron líneas de células T que parecía que reconocían
específicamente grupos del péptido L762P. Se puso énfasis en
identificar células T con respuestas proliferativas. Las líneas de
células T que presentaban tanto proliferación como secreción de
citocinas específicas de L762P, o sólo una intensa proliferación,
fueron adicionalmente propagadas para ser analizadas en cuanto al
reconocimiento de péptidos individuales de los grupos, así como en
cuanto al reconocimiento de L762P recombinante. La fuente de L762P
recombinante era E. coli, y el material fue parcialmente
purificado y positivo para endotoxina. En estos estudios se
emplearon 10 microgramos de péptidos individuales, 10 ó 2
microgramos de un péptido irrelevante, y 2 ó 0,5 microgramos de
proteína L762P o de una proteína recombinante generada en E.
coli, irrelevante e igualmente impura. Mediante un número de
péptidos derivados de L762P de cada grupo, se indujeron una
producción de interferón gamma y una proliferación de células T
CD4+ significativas. Las secuencias de aminoácidos de estos péptidos
se proporcionan en las ID. SEC. números 232-251.
Estos péptidos corresponden a los aminoácidos
661-680, 676-696,
526-545, 874-893,
811-830, 871-891,
856-875, 826-845,
795-815, 736-755,
706-725, 706-725,
691-710, 601-620,
571-590, 556-575,
616-635, 646-665,
631-650, 541-560 y
586-605, respectivamente, de la ID. SEC. nº 161.
Las líneas de células T CD4+ que presentaron
especificidad para péptidos individuales derivados de L762P fueron
adicionalmente propagadas mediante estimulación con el péptido
relevante en una concentración de 10 microgramos/ml. Dos semanas
después de la estimulación, se examinaron las líneas de células T
usando ensayos tanto de proliferación como ELISA para
IFN-gamma, para el reconocimiento del péptido
específico. Un número de células T previamente identificadas
continuaba presentando actividad específica del péptido L762P. Cada
una de estas líneas fue adicionalmente propagada sobre el péptido
relevante y, después de dos semanas de propagación, fue examinada
en cuanto al reconocimiento específico del péptido L762P en
experimentos de titulación así como en cuanto al reconocimiento de
la proteína L762P recombinante derivada de E. coli. Para
estos experimentos, se impulsaron monocitos adherentes autólogos
con el péptido relevante derivado de L762P, un péptido irrelevante
derivado de mamaglobina, L762P recombinante derivada de E.
coli (aproximadamente un 50% puro) o una proteína irrelevante
derivada de E. coli. Se halló que la mayoría de las líneas de
células T muestran baja afinidad por el péptido relevante ya que
los índices de IFN-gamma y de proliferación
específicos disminuyeron drásticamente cuando se diluyó el péptido
L762P. Sin embargo, se identificaron cuatro líneas que presentaban
una actividad significativa incluso con 0,1 microgramos de
péptido/ml. También parecía que cada una de estas líneas (referidas
como A/D5, D/F5, E/A7 y E/B6) proliferaba específicamente en
respuesta a la preparación de proteína L762P derivada de E.
coli pero no en respuesta a la preparación de proteína
irrelevante. Las secuencias de aminoácidos de los péptidos
derivados de L762P reconocidos por estas líneas se proporcionan en
las ID. SEC. números 234, 249, 236 y 245, respectivamente. No se
detectó IFN-gamma especifico de proteína con ninguna
de las líneas. Se clonaron las líneas A/D5, E/A7 y E/B6 en
monocitos adherentes autólogos impulsados con el péptido relevante
en concentración de 0,1 (A/D5 y E/A7) o 1 (D/F5) microgramos/ml.
Después del crecimiento, se examinaron los clones en cuanto a la
especificidad para el péptido relevante. Con las líneas AD/5 y E/A7,
se identificaron numerosos clones específicos para el péptido
relevante.
El antígeno L514S (ID. SEC. nº 89) de tumor de
pulmón fue subclonado en el vector de expresión pE32b, en los
sitios NcoI y NotI, y usado para transformar E. coli mediante
técnicas estándares. La proteína era la expresión de los restos
3-153 de la ID. SEC. nº 89. En las ID. SEC. números
252 y 253, respectivamente, se proporcionan la secuencia de
aminoácidos expresada y la correspondiente secuencia de DNA.
Los aminoácidos 32-944 del
antígeno L762P (ID. SEC. nº 161) de tumor pulmonar, con una etiqueta
6xHis, fueron subclonados en un vector de expresión pET28
modificado, usando resistencia a la kanamicina, y utilizados para
transformar células BL21 CodonPlus mediante técnicas estándares. Se
observaron niveles de expresión de bajos a moderados. En la ID.
SEC. nº 254 se proporciona la determinada secuencia de DNA de la
construcción de expresión de L762P.
<110> Corixa Corporation et al.
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<120> COMPUESTOS Y MÉTODOS PARA LA TERAPIA
Y EL DIAGNÓSTICO DEL CÁNCER DE PULMÓN
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<130> 210121.45501PC
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<140> PCT
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<141>
03-04-2000
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<160> 350
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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
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<213> Homo sapien
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<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
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<223> n = A,T,C o G
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
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\vskip0.400000\baselineskip
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<223> n = A,T,C o G
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 673
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
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<222> (1)...(673)
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(614)
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<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(686)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<211> 681
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(681)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<211> 687
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(687)
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<223> n = A,T,C o G
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<211> 695
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
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<222> (1)...(695)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (674)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<211> 657
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
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<212> DNA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(731)
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<223> n = A,T,C o G
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(420)
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<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 551
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(551)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 396
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(396)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 536
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(536)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(865)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 560
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(560)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 379
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(379)
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<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 437
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Homo sapien
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Homo sapien
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
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<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
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<220>
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> característica_misc
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(671)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(217)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 323
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 771
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(771)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(628)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 518
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(518)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1844
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 523
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(523)
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<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 604
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(604)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 858
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(858)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 585
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(585)
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<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(567)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 620
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(620)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 470
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(470)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(660)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(441)
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<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (600)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(667)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 583
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(583)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 592
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(592)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 587
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(587)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 496
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(496)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 575
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(575)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 619
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> n = A,T,C o G
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 471
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 511
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> poco fiable
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<222> (27)
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<222> (63)
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<223> n=A,T,C o G
\vskip0.400000\baselineskip
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<222> (337)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip0.400000\baselineskip
<221> poco fiable
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<222> (442)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 521
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 214
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<210> 215
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 381
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> poco fiable
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<222> (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip0.400000\baselineskip
<221> poco fiable
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip0.400000\baselineskip
<221> poco fiable
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip0.400000\baselineskip
<221> poco fiable
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip0.400000\baselineskip
<221> poco fiable
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (365)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 216
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 405
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 219
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 216
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> poco fiable
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (207)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip0.400000\baselineskip
<221> poco fiable
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (210)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 380
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 398
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 222
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 301
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> poco fiable
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (49)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip0.400000\baselineskip
<221> poco fiable
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (64)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
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<223> n = A,T,C o G
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<221> característica_misc
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<222> (1)...(401)
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<223> n = A,T,C o G
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (391)
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(321)
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<223> n = A,T,C o G
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> característica_misc
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> característica_misc
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
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<400> 301
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<210> 302
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<211> 341
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<212> DNA
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<213> Homo sapien
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
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<223> n = A,T,C o G
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<213> Homo sapien
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<223> n = A,T,C o G
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<211> 1800
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<210> 347
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<211> 1740
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<210> 348
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<211> 579
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<211> 207
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<210> 350
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 350
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. Un método para detectar la presencia de un
cáncer de pulmón en un paciente, que comprende las operaciones
de:
- (a)
- poner una muestra biológica obtenida del paciente en contacto con un anticuerpo, o un fragmento del mismo que se une a antígenos, que se une al polipéptido expuesto en la ID. SEC. nº 176;
- (b)
- detectar en la muestra una cantidad del polipéptido que se une al agente ligante; y
- (c)
- comparar la cantidad del polipéptido con un valor de corte predeterminado, y determinar la presencia de cáncer de pulmón en el paciente a partir de dicha comparación.
2. El método de la Reivindicación 1, en que el
anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
3. El uso de un anticuerpo, o de un fragmento
del mismo que se une a antígenos, en un método in vitro para
detectar la presencia de un cáncer de pulmón en una muestra
biológica, en el que el anticuerpo puede detectar la presencia del
polipéptido expuesto en la ID. SEC. nº 176 en la muestra
biológica.
4. El uso de la Reivindicación 3, en que el
anticuerpo está inmovilizado sobre un soporte sólido para que se
una al polipéptido y lo separe del resto de la muestra
biológica.
5. El uso de la Reivindicación 3, en que el
anticuerpo está inmovilizado sobre una membrana.
6. El uso del polipéptido expuesto en la ID.
SEC. nº 176 en un método in vitro para detectar la presencia
de cáncer de pulmón en una muestra biológica, en el que el
polipéptido se utiliza para detectar en la muestra biológica la
presencia de células T que reaccionan específicamente con él.
7. Un método para detectar la presencia de
cáncer de pulmón en un paciente, método que comprende las
operaciones de:
- a)
- incubar una muestra biológica aislada que comprende células T CD4+ y/o CD8+ con el polipéptido expuesto en la ID. SEC. nº 176 o con un polinucleótido que codifica el mismo; y
- b)
- detectar la presencia o ausencia de activación específica de las células T.
8. El método de la Reivindicación 7, en que el
polinucleótido tiene la secuencia expuesta en la ID. SEC. nº
175.
9. El método de la Reivindicación 7 u 8, en el
que se incuban el polipéptido y la muestra biológica durante
2-9 días, preferiblemente 4 días, a 37ºC.
10. El método de la Reivindicación 7, 8 ó 9, en
el que se detecta la activación de las células T CD4+ evaluando la
proliferación de las células T.
11. El método de la Reivindicación 7, 8 ó 9, en
el que se detecta la activación de las células T CD8+ evaluando la
actividad citolítica.
12. El uso del polipéptido expuesto en la ID.
SEC. nº 176, o de un polinucleótido que codifica el mismo, en el
método de cualquiera de las Reivindicaciones 7 a 11.
13. El uso de la Reivindicación 12, en que el
polinucleótido tiene la secuencia expuesta en la ID. SEC. nº
175.
14. El uso de cebadores oligonucleotídicos en un
ensayo basado en la reacción en cadena de la polimerasa, que
comprenden al menos 15 nucleótidos contiguos de una molécula de DNA
expuesta en la ID. SEC. nº 175, para detectar la presencia de
cáncer de pulmón en una muestra biológica.
15. Un sistema diagnóstico para el cáncer de
pulmón que comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento del
mismo que se une a antígenos, que se une específicamente al
polipéptido expuesto en la ID. SEC. nº 176, y un reactivo de
detección, en el que el reactivo de detección comprende un grupo
informador.
16. Un sistema diagnóstico para el cáncer de
pulmón que comprende al menos un oligonucleótido que comprende
15-40 nucleótidos contiguos del polinucleótido
expuesto en la ID. SEC. nº 175, y un reactivo diagnóstico, para uso
en una reacción en cadena de la polimerasa.
\newpage
17. Un método para determinar la presencia de un
cáncer de pulmón en un paciente, que comprende las operaciones
de:
- (a)
- poner una muestra biológica obtenida del paciente en contacto con un oligonucleótido que se hibrida con la secuencia expuesta en la ID. SEC. nº 175;
- (b)
- detectar en la muestra una cantidad de un polinucleótido que se hibrida con el oligonucleótido; y
- (c)
- comparar la cantidad del polinucleótido que se hibrida con el oligonucleótido con un valor de corte predeterminado y determinar la presencia del cáncer de pulmón en el paciente a partir de dicha comparación.
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