JPH11506332A - 全長ｃＤＮＡ配列を獲得する改良された方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 より長いｃＤＮＡ配列を獲得する方法が開示されている。この方法は、ＧｅｎＢａｎｋの部分的なｃＤＮＡから得られるような、公知の遺伝子ＤＮＡ配列もしくは部分的なｃＤＮＡ配列を用いるものである。２つのＰＣＲプライマーが、既知の部分的な配列の両端に対応かつｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡをアニールして、既知のｃＤＮＡ及びその他のプライマーから遠ざかる拡張を開始するように設計されている。このプライマーは、適切な酵素によってｃＤＮＡライブラリーに加えられ、追加的なＤＮＡ配列を通って拡張し、ＰＣＲ生成物を生み出し、この生成物が次に精製され配列されて、新たな配列を生み出す。この新たな配列は次に重なり合った領域で既知のｃＤＮＡ配列と比較され、その配列は重なり合った領域を越えて拡張し、より長いＤＮＡ配列を形成する。

Description

【発明の詳細な説明】 全長ｃＤＮＡ配列を獲得する改良された方法技術分野 本発明は、分子生物学の分野に関し、より詳しくは、組み換ＤＮＡ技術の分野 に関する。背景技術 ＰＣＲは、「Ｃｏｌｄ Ｓｐｉｒｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｎ（ Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ らによる（１９８６年）「Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ ｂｏｒ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ ５１：２６３−２７３」）に於いて 「Ｋａｒｙ Ｍｕｌｌｉｓ」によって最初に発表されて以来、幅広く用いられる ようになった核酸増殖技術である。このＰＣＲでは、既知の配列から一対のプラ イマーが形成されなければならない。しかしながら、多くの場合では、配列は、 ＤＮＡセグメントの一方の端部のみから得ることができる。いくつかの方法が、 初めに部分的なヌクレオチド配列を得てから全体の遺伝子を配列するために開発 されてきた。部分的なｃＤＮＡ配列が世界的な遺伝子データバンクから入手でき るようになるにつれて、完全な遺伝子を獲得するための、効率が良くかつ経済的 な方法が、必要とされてきた。 ＰＣＲは、部分的な配列がすでに知られている場合に、遺伝子を完成させるた めの技術として広く用いられてきた。ｃＤＮＡがクローン化されているベクター 内に配置された遺伝子特定プライマーが、この目的のために用いられる。しかし ながら、この方法は、ライブラリー内の全てのクローンに対して共通のベクター 配列に対して相補的なプライマーを用いることに限定されている。その結果、ク ローン化されかつ配列されなければならない大量の非特定ＰＣＲ生成物がもたら される。入れ子状にされたプライマーを伴う複数回の増殖が必要となることもあ る。この ような追加的な操作によって、失敗の生ずる可能性が高まる。 「Ｇｏｂｉｎｄａ」、「Ｔｕｒｎｅｒ」、及び「Ｂｏｌａｎｄｅｒ」（１９９３年） は、「ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ２：３１ ８−２２」に於いて、「ｒｅｓｔｉｒｃｔｉｏｎ−ｓｉｔｅ ＰＣＲ」を、ユニ バーサルプライマーを用いて既知の遺伝子座に隣接する未知の配列を回収する直 接的な方法として開示した。初めに、遺伝子ＤＮＡが、制限部位オリゴヌクレオ チド及び既知の領域に対して特定されるプライマの存在のもとで増殖される。次 に、これらの生成物が、同じ制限部位オリゴヌクレオチドと、初めのプライマー の内部の他の特定プライマーとによって、第２回目のＰＣＲを施される。結局、 最後の回のＰＣＲの生成物が、適切なＲＮＡポリメラーゼによって転写され、逆 転写酵素及び２番目の特定ＰＣＲプライマーの内部にある端部の標識化された特 定プライマーと共に配列される。「Ｇｏｂｉｎｄａ」らは、遺伝子の３′非コー ド領域内の２０ヌクレオチドの保存されたストレッチを特定する「Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ」に関するデータを提供した。 逆ＰＣＲは、既知の領域に基づくプライマーから開始される未知の配列を獲得 することのできる最初に報告された方法である(ＲＴｒｉｇｌｉａ ＴＰｅｔｅ ｒｓｏｎ ＭＧ，及びＫｅｍｐ ＤＪ（１９９８年）核酸登録番号１６：８１８ ６)。逆ＰＣＲは、いくつかの制限酵素を用いて、既知の領域内に適切なフラグ メントを形成する戦略を用いている。次に、分子内連鎖反応によってセグメント が環状化され、既知の領域から形成された分岐プライマーと共にＰＣＲテンプレ ートとして用いられる。しかしながら、ＰＣＲが開始される前でさえも、複数の 制限酵素の消化が必要なこと、及びその後の複数の連鎖反応が必要なことによっ て、この方法が低速度なかつ高価なものになる（Ｇｏｂｉｎａｄらによる。 Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ Ｍ、Ｐａｒｉｋ Ｊ、Ｍａｌｍｇｒｅｎ Ｈ、Ｓｔｅ ｗａｒｔ Ｊ、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ Ｕ、及びＬａｎｄｅｇｒｅｎ Ｕ（１９９ １年）によって「ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．１：１１９−１９」 に初めて開示されたキャプチャ（Ｃａｐｔｕｒｅ）ＰＣＲは、ヒト及び酵母人工 染色体ＤＮＡ内の既知のシーケンスに隣接するＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増殖 を行う方法である。上述したようにＧｏｂｉｎｄａらによって指摘されたように 、この方法は、また、ＰＣＲの前に開発された２本鎖プライマの連鎖反応及び複 数の制限酵素の消化を必要とする。この方法では、制限酵素と連鎖反応が同時に 実行されるにもかかわらず、拡張反応が必要なこと、拡張された生成物の固定化 、及び、シーケンシングに先立つ２回のＰＣＲ及びテンプレートの精製、が必要 なことにより、この方法は煩わしく、かつ十分時間を浪費するものとなっている 。 Ｐａｒｋｅｒ ＪＤ、Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ ＰＳ、及びＢｕｒｍｅｒ き Ｃ（１９９１年）による核酸登録番号９１：３０５５−６０によって開示された ウォーキング（ｗａｌｋｉｎｇ）ＰＣＲは、ＰＣＲを通って移動する（Ｗａｌｋ ｉｎｇ）目標とされた遺伝子に対する方法を示している。この方法もまた未知の 配列の回収を可能にするが、Ｇｏｂｉｎｄａらは、この方法が、オリゴマ拡張ア セイ（ｏｌｉｇｏｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｅｓｓａｙ）と、それに続く、 配列に先立つ同定及び所望のバンドのゲル生成とを、必要とすることを記載して いる。そのような特別な過程によって、さらに、その方法の用途が限定される。 ＰＣＲで独自に用いられる酵素は、３ｋｂに亘る長い核酸を高い信頼度で拡張 するという能力が限定されている。この限定の１つの例は、それらの酵素がしば しば拡張に失敗する塩基対合ミスマッチをもたらすヌクレオチドの誤った結合で ある。 ２つの酵素の混合物、即ちｒＴ番目のＤＮＡポリメラーゼとＶｅｎｔＤＮＡポ リメラーゼとの混合物(後者は、「プルーフリーディング」能力を有するとされ ている)、及び拡張条件の最適化のみが、この制限を克服し、４０ｋｂまでのＤ ＮＡの拡張を行う。 ある時刻におけるある組織内で発現された遺伝子を同定する最も一般的な方法 が、その特定の組織のｍＲＮＡを分離し、このｍＲＮＡをｃＤＮＡ（相補的ＤＮ Ａ）に変換するものである。このｃＤＮＡは、次に、ベクター（プラスミド若し くはラムダクローニングベクター）にクローン化され、トランスフェクションに よって大腸菌細胞内で増殖され、その結果ｃＤＮＡライブラリーがもたらされる 。完全な遺伝子を獲得することを試みている研究者にとって最初のそして最も重 要なことは、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換するために用いられる酵素が、既存のｍ ＲＮＡの完全なコピーを形成するその能力が限定されているということである。 このことにより、研究者は、特定のプローブを用いて対象となる遺伝子の複数の ｃＤＮＡクローンを分離し、それら分離されたものの各々を対象となっている遺 伝子の完全なｃＤＮＡに対して分析しなければならない。この方法は、ｃＤＮＡ ライブラリーのスクリーニングと呼ばれる。 分子生物学者が直面している主要な問題は、部分的な配列から全長のｃＤＮＡ を獲得するために用いることのできる最も効果的な方法を見いだすことである。 そのような配列は、ＧｅｎＢａｎｋの頻度の増加に伴って、市販されているｃＤ ＮＡライブラリー及び個人所有のライブラリーから明らかとなりつつある。本発 明の方法は、その分野に貢献するものである。発明の開示 ＤＮＡ配列の既知のフラグメントのＤＮＡ配列を延ばすための改良された方法 が開示されている。この方法は、遺伝子若しくはｃＤＮＡの元 の既知のＤＮＡ配列を拡張するために用いられてもよい。この方法は、ポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用い、以下の過程を含む。 （ａ）ｃＤＮＡライブラリーからの、若しくは分的なｃＤＮＡ又はすでに拡張 された部分的なｃＤＮＡを含むことが予測されるｃＤＮＡライブラリーのプール からの、核酸に、第１及び第２のＰＣＲプライマーを、前記第１及び第２のプラ イマーからの核酸ＰＣＲ生成物の合成に適した条件の下で連結する過程であって 、前記第１及び第２のプライマーは、部分的なｃＤＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの 反対側の鎖（ストランド）をアニールし、外向きに核酸の合成を開始する能力を 有し、前記第１のプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによってアンチセンス方向 に拡張でき、前記第２のプライマーは、センス方向に拡張することができる、前 記連結する過程と、 （ｂ）ＰＣＲ生成物を精製する過程と、 （ｃ）前記部分的なｃＤＮＡ若しくは前記遺伝子ＤＮＡから求められた拡張さ れたヌクレオチド配列を同定する過程とを含む。本発明のある実施例では、拡張 されたヌクレオチド配列を同定する方法は、核酸を配列する過程を有する。本発 明の他の実施例では、本発明の方法は、過程６ｃによって同定されたヌクレオチ ド配列に対して過程６ａから過程６ｃを繰り返すことによって行われる。 本発明の他の実施例では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて部分的な 相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のヌクレオチド配列を拡張する方法が提供され、この 方法は、（ａ）ｃＤＮＡライブラリーからの、若しくは前記部分的なｃＤＮＡま たは既に拡張された部分的なｃＤＮＡを含むと予測されるｃＤＮＡライブラリー のプールからの、核酸と、第１及び第２のＰＣＲプライマーとを、前記第１及び 第２のプライマーからの核酸ＰＣＲ生成物を合成するのに適した条件の下で、連 結する過程であっ て、前記第１及び第２のプライマーは、部分的なｃＤＮＡの反対側のストランド をアニールしかつ外側に向けて核酸の合成を開始する能力を有し、前記第１のプ ライマーはアンチセンス方向にＤＮＡポリメラーゼによって拡張され、前記第２ のプライマーは、センス方向に拡張される、前記連結する過程と、 （ｂ）ＰＣＲ生成物を精製する過程と、 （ｃ）前記精製されたＰＣＲ生成物を、環状の閉じた核酸を形成するのに適し た条件の下で、連鎖反応させる過程と、 （ｄ）宿主細胞を環状の閉じた核酸と共に形質転換し、成長に適した条件の下 で形質転換された宿主細胞を培養する過程と、 （ｅ）前記環状の閉じた核酸を、培養された形質転換された宿主細胞から回収 する過程と、 （ｆ）前記部分的なｃＤＮＡ若しくは前記遺伝子ＤＮＡから求められた拡張さ れたヌクレオチド配列を同定する過程とを有する。 本発明は、また、５′の翻訳されていないヌクレオチド配列及び／若しくはプ ロモータ配列の検出及び増幅のために用いることのできる既知の遺伝子ＤＮＡ配 列の拡張方法を提供する。 更に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１を有する、新規のヒトプリンＰ２Ｕ受容体に 対するものである、分離されたＤＮＡ分子を提供する。 更に、新規なヒトＣ５ａ類似の７回貫通型受容体に対する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：１２を有する分離されたＤＮＡ分子が提供される。 本発明の上述された及びその他の目的、利点、及び特徴は、当業者には、添付 の図面を参照しながら行われる以下の説明から、及び構造、合成、公式、及び利 用からより明らかとなる。図面の簡単な説明 第１図は、本発明の方法の過程を表す流れ図である。 第２図は、ラムダＺＡＰ ｃＤＮＡライブラリーの除去過程から得られた通常 のプラスミドを表す。通常は、２５０から３００ベースの配列対が、スループッ トの高い配列操作によって得られる。クローンは、シーケンスプライマーとして のＴ３を伴った５′−端部から部分的に配列されている。 第３図は、次の過程を表したものであり、この過程では、ｃＤＮＡライブラリ 内のｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫプラスミドが、テンプレート（鋳型）として 用いられており、２つの特別に設計されたプライマ（ＸＬＲ及びＸＬＳ）が、対 象とされている遺伝子を含むプラスミドを増殖している。ＸＬ−ＰＣＲプライマ ーと、対象とされている遺伝子との、両方に対するプライミング部位を含むプラ スミドのみが、ＸＬ−ＰＣＲ反応の間に増殖される。 第４図は、ＸＬ−ＰＣＲ反応中に得られかつ次にアガロースゲルの上で生成物 を分離した後に生成される増殖されたＤＮＡセグメントを表している。もっとも 良好な結果を得るために、テンプレートとして用いられるｃＤＮＡライブラリー は、ベクター内のＸＬＳプライミング部位とＴ７プライミング部位との間の異な る増殖された長さのＤＮＡ（３′−端部）がこの過程の間に獲得できることを確 実にするべく、ランダムなプライミングによって合成されなければならない。ベ クターの５′−端部（ＸＬＲプライミング部位とＴ３プライミング部位との間） の長さは、対象とされている遺伝子のｎＲＮＡがどのくらいｃＤＮＡライブラリ ーの合成の間にｃＤＮＡに変換されたかに応じて変わる。 第５図は、プラスミド及び対象とされている遺伝子を含む精製されたＤＮＡセ グメントが配列されて、環状のプラスミドを形成し、増幅のためのバクテリア内 に形質転換された様子を表している。ここで化学的な構成要素である大腸菌の細 胞は、形質転換されて、かつ抗生物質の選択 のためのＬＢ寒天及び２５ｍｇ／ｌのカーベニシリンを含むペトリ皿で成長させ られる。 第６図は、クローンの純粋な標本が、第５図に例示された手順によって成長し た異なる大腸菌コロニーから得られる様子（第６図の過程１の精製、過程２の再 結合、過程３の形質転換）を表している。これらのクローンは、５′−端部に於 ける対象とされている遺伝子の追加的な配列に対する過程４に於けるスクリーニ ングが施される。この目的のために、クローンは、ＸＬＲプライマー及びＴ３ベ クタプライマーを用いるＰＣＲ反応によって分析される。結果的に得られた生成 物の寸法は、各クローンが、ＸＬＲプライミング部位の上流の追加的な配列をど れだけ含むかを表している。 第７Ａ図から第７Ｈ図は、本発明の方法によって得られた結果を表しており、 熱衝撃タンパク質９０と同様な、インサイト社クローン１４７７０からの部分的 な配列が、良好に配列されて、全長のｃＤＮＡが得られた。 第８Ａ図から第８Ｆ図は、本発明の方法によって得られた結果を表しており、 カテプシンと同様のインサイト社クローン８７０５８からの部分的な配列が、順 調に配列され、ｃＤＮＡの拡張が得られた。 特に断らない限り、本明細書中で用いられる技術用語及び化学的用語は、本発 明に関連する当業者によって共通して理解されたものと同じ意味を表す。本明細 書中で言及された特許明細書及び出版物は、本明細書で参照することによって本 出願の一部とされる。 本明細書中で述べられる化合物、変形、公式及びそれらを形成する用いるため の方法が述べられる前に、本発明は、本明細書中で述べられた特定の化合物、変 形、公式、及び方法に限定されるものではなく、酵素、公式、及び方法に、異な るものが用いられてもよい。本明細書中で用い られている専門用語は、特定の実施例を説明する目的のためのみであり、且つ限 定を意図するものではなく、本出願の保護範囲は添付の請求の範囲によってのみ 限定される。 明細書及び請求の範囲において、特に言及されない限り、単数形で表された単 語は、複数形をも含めた意味として用いられている。即ち、例えば、「高い忠実 性のＰＣＲ酵素」は、そのような酵素の混合物、及びその他の宣言された基準に 適合した酵素をも含め、ある特定の方法は、当業者にはよく知られた若しくは本 明細書の記載から当業者には明らかな、全長ｃＤＮＡシーケンスを得るための１ つの若しくは複数の方法をも意味する。 本出願の発明の方法は、より長いＤＮＡ、及び或る場合には、部分的に知られ たＤＮＡ配列の完全な遺伝子を得るためのソース（ｓｏｕｒｃｅ）としての、ｃ ＤＮＡを配列するめたに用いられてきた遺伝子ＤＮＡライブラリー若しくはプラ スミドｃＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡを直接プラスミドベクター内にクローニ ングするか、公知の方法、例えば、ラムダＺａｐ除去若しくはラムダＺＩＰＬＯ ＣＫ変換によってラムダライブラリーをプラスミドライブラリーへ変換すること によって得られる）を用いる方法が提供される。本明細書中で開示される過程は 、ｃＤＮＡライブラリーに基づくものであるが、遺伝子ＤＮＡライブラリーにも 同じように当てはめることができる。 この新しい方法は、長いピースのＤＮＡを増幅するために研究者によって用い られるＰＣＲキットを用いる。ＸＬ−ＰＣＲ増幅キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍ ｅｒ）が用いられた。しかしながら、等価な製品が、他の主要な供給者から入手 されてもよい。この新規な方法によって、同時に複数の遺伝子（９６遺伝子まで の）を処理し、６から１２日内に、対象とされているｃＤＮＡの拡張された若し くは完全な（可能性として は全長の）配列を得ることができる。この方法は、一人の作業者によって約３か ら５の遺伝子のみを処理しそして１４日から４０日内に初めの結果が得られる、 ラベルされたプローブによってスクリーンを行う現在の競合する方法に、勝ると も劣らないものである。この方法によって、スループットが少なくとも１０００ ％増加される。 この高められた効率は、フローチャート（第１図）に例示された過程の新規な 組み合わせによって可能とされている。初めに、既知の部分的な配列に基づいた プライマーの設計と合成が、約２日間に亘って行われる。ＰＣＲ増殖が、６から ８時間に亘って実行される。複数のライブラリーがプールされ、従って、同時に スクリーンされる。次の精製及び連鎖反応の過程が約一日間行われる。次にバク テリアの形質転換と成長が一日間行われる。次に対象とされている遺伝子の追加 的な配列を伴ったクローンのスクリーニングが、ＰＣＲによって約５時間行われ る。次に、ＤＮＡの調製と選択されたクローンの配列過程が約一日間行われる。 以上の過程が全体で６日から７日間となる。以上の過程の終了時に、より長いｃ ＤＮＡ配列が、通常得られており、最初に配列されていたものよりも長いｃＤＮ Ａがライブラリー内に存在する。この新たな配列が完全な遺伝子である場合、目 標地点に到達したことになる。完全な配列が得られていない場合には、依然より も長い配列が得られており、このより長い配列がプライマーを設計するために用 いられ、同じライブラリー若しくは他のライブラリーに対して同様な手順が繰り 返される。ライブラリーの選択は研究者に任されるが、より好ましいライブラリ ーは、より長いｃＤＮＡのみを含むように寸法が選択されたものである。 この方法では、既に部分的なｃＤＮＡ配列が、公開されたデータベースから、 若しくはそのｃＤＮＡが既に部分的に配列されたｃＤＮＡライブラリーの以前の 調製を含む（しかし限定されるものではない）研究者 自身の依然のリサーチから、既に得られていることを仮定している。ｃＤＮＡラ イブラリは、オリゴｄＴ若しくはランダムなプライマーと共に調製されていても よい。オリゴｄＴとランダムにプライムされたライブラリーとの間の相違点は、 ランダムにプライムされたライブラリーが、５'端部のｃＤＮＡを含むシーケン スを余分に含んでいるという点である。ランダムにプライムされたライブラリー は、オリゴｄＴライブラリーが完全な遺伝子を得ることができない時に、より作 業を行うために特に有効である。ライブラリーのランダムなプライミングはまた 異なる長さのｃＤＮＡ配列を更に得る場合の助けとなる。こうして、より長いイ ンサートの寸法を生み出すライブラリーの調製技術は、より完全なｃＤＮＡ配列 を可能とする。明らかに、タンパク質が長くなるほど、完全なｃＤＮＡからより 相違したタンパク質が、単一のプラスミド内で見いだされる。 第２図は、Ｔ３をプライマーとして備えた５'端部から部分的に配列されたｃ ＤＮＡを含む典型的なプラスミドを表している。上部の灰色の部分は、対象とさ れている遺伝子を含むインサートを表している。ステップ１：対象となっている遺伝子を含むｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増殖 本発明の第１の過程では、既知の配列に基づく２個のプライマーの設計が必要 とされる。この既知の配列は、当業者には、海中実験法によって、若しくは様々 な公開されているＤＮＡデータベースから得ることができる。一方のプライマー は、アンチセンス方向（ＸＬＲ）に拡張するように合成され、もう一方のプライ マーはセンス方向（ＸＬＳ若しくはＸＬＦ）に拡張するように合成されている。 実際、プライマーは、既知の配列の何れかの端部にアニール化され、且つその端 部から「外向きに」拡張して、対象とされている遺伝子の未知の新たな配列を含 むアンプリ コン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）を形成するように設計されている。これは、プライマ ーが互いに「内向きに」既知の配列で増幅されるように設計されている通常のＰ ＣＲと異なる。 プライマーは、非常に長いＰＣＲに対する最適な基準を表すように設計されて いなければならない。Ｏｌｉｇｏ４．ｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎ ｃｅｓ，Ｉｎｃ.、Ｐｌｙｎｏｕｔｈ ＭＮ）のようなプログラムがこの目的の ために用いられる。一般的なプライマーは、５０％以上のＧＣコンテントからな る２２から３０の核酸でなければならず、且つターゲットに対して６８℃から７ ２℃でアニール化される。ヘヤピン型酵素及びプライマー対プライマーの２量体 化（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）が回避されなければならない。 上述された条件とは異なるプライマーも、調節された拡張条件をもたらす所望 のターゲットの増殖を達成することがある。 第３図は、次の過程を表しており、この過程ではｃＤＮＡライブラリーがテン プレートとして用いられ、２つのプライマー（ＸＬＲ及びＸＬＳ）が、対象とさ れている遺伝子を含むプラスミドを増殖する。この過程では、高い忠実性を達成 し且つ長い配列をコピーするＰＣＲ酵素（ＸＬ−ＰＣＲキット（カリフォルニア 州フォスターシティのＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰｅｒＫｉｎ ＥｌｍｅｒのＮ８０８−１８２）で提供されているような）を用いることが有益 である。一般的に、様々な試薬の濃度を最適化する支持をも含めて、キットの指 示には従わなければならない。以下の説明で開示されている例では、２５ｐモル の各プライマーが良好に働く。テンプレート（プラスミドライブラリー）の濃度 は、変更することができる(詳しくは以下の説明の例を参照のこと)。使用する前 に液体の酵素をゆっくりと再び懸濁することが、特にその液体が−２０℃で保存 されていた場合には大切である。酵素が適切 に再度懸濁されていない場合、その効果は損なわれる。好ましいシステムは、Ａ ｍｐｌｉｗａｘ ＰＣＲ Ｇｅｍｓを用いて、２つの層に最初に設定されている 。しかしながら、効果は、これらのＧｅｍを用いずに、８２℃での増殖において 重要なマグネシウムを加えることによって、「ホットスタート」技術を用いるこ とにより、増幅を開始することで高められる。 以下の具体例において様々な循環条件（Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ）が説明されているが、次の循環条件は、Ｍｊ ＰＣＴ２００温度循環器（マサ チューセッツ州ウォータタウンのＭｊリサーチ）に最適であることが見いだされ ている。時間及び温度は、温度循環器に応じて最適化されるように変更されても よい。 ステップ１ ６０秒間の９４度（最初の変性化） ステップ２ １５秒間の９４度 ステップ３ １分間の９５度 ステップ４ ７分間の６８度 ステップ５ ステップ２からステップ４を更に１５回繰り返す ステップ６ １５秒間の９４度 ステップ７ １分間の６５度 ステップ８ （７分間＋１５秒間）／サイクルの６８度 ステップ９ ステップ６からステップ８を更に１１回繰り返す ステップ１０ ８分間の７２度 ステップ１１ ０．００秒間の４度（４度に保持） 以上の２８サイクルの終了時に、反応混合物５０μｌが取り除かれる。残りの 反応混合物に対して、更に１５サイクルが行われ、それが以下のものとなってい る。 ステップ１ １５秒間の９４度 ステップ２ １分間の６５度 ステップ３ （１０分間＋１５秒間）／サイクルの６８度 ステップ４ ステップ１からステップ３を更に９回繰り返す ステップ５ １０分間の７２度 次に、反応混合物の５から１０μｌのアリコットが、ミニゲル（ｍｉｍｉ−ｇ ｅｌ）の上で分析され、反応が成功したか否かが判定される。過程２： 対象とされている遺伝子を含むアンプリコンの精製 第４図は、アガロースゲル上に分離された増殖されたｃＤＮＡセグメントを表 す図である。様々な長さのｃＤＮＡがあることが注目される。この方法の残りの 部分は全ての拡張されたｃＤＮＡ種を用いて実行されるが、この方法は、最も大 きい（全長の遺伝子の残りの部分を提供するほどに大きな）生成物を選択した後 に行われてもよい。実際、それらのより大きな種のあるものは、ｃＤＮＡライブ ラリー構造の間の不調の結果としての２個のｃＤＮＡインサートを含むハイブリ ッドクローンであることがあり、それはｃＤＮＡの合成の終了時に制限酵素によ って不完全に消化されたことを表している。そのような増殖されたハイブリッド クローンは、キメラとも呼ばれ、正しい目標とされている拡張をオーバールッキ ング（ｏｖｅｒｌｏｏｋｉｎｇ）することがある。 成功した反応の生成物は、アガロースゲル（好ましくは０．６から０．８％の 低濃度のアガロースが用いられる）で精製されるか、他の適切な方法によって精 製されなければならない。適切な堆積の反応混合物が付加されて、精製物を良好 に分離し、依然として反応混合物内にあるプラスミドライブラリー（テンプレー ト）から、生成物を分離する。テンプレートｃＤＮＡライブラリーの混入により 、所望の遺伝子を含まない形質転換が生じ、多くのクローンの大量のスクリーニ ングが必要となる。対象とされている遺伝子を表すバンドが、次に、ゲルから切 断され、Ｑ ＩＡＱｕｉｃｋゲル抽出キット（カリフォルニア州キャットスオースのＱｉａｇ ｎｅ，Ｉｎｃ.）のような方法を用いて精製される。過程３：対象になっている遺伝子を含むアンプリコンのクローニング 原材料の過剰分は、ブラントエンド（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）に変換され、生成 物の再結合及びクローニングを容易にする。この目的のために、クレノウ酵素（ ３ユニット／反応混合物）及びｄＮＴＰ（０．２ｍＭの最終的な濃度）が加えら れ、反応が３０分間に亘って室温でインキユベートされる。このクレノウ酵素は 、次に、１５分間に亘って７５度に反応をインキュベートすることによって不活 性化される。 生成物は、次にエタノールで沈殿され、１ｍＭのＡＴＰを含む連鎖反応緩衝液 １３μｌ内に溶解される。１ｍｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５６ユニット）及 びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（５ユニット）が加えられ、反応が２時間に亘 って室温で、若しくは一晩に亘って１６℃で、インキュベートされる。 連鎖反応混合物（３μｌ）が、４０ｍｌのコンポーネント大腸菌細胞（標準的 な手順で調製された）に形質転換される。８０μｌのＳＯＣ媒体が、加えられ、 次に３７℃での細胞の１時間の回復の後に、全体の形質転換された混合物が、Ｌ Ｂ−寒天２ＸＣａｒｂを含むペトリ皿に塗布される。過程４：クローニングされた精製物のスクリーニング 翌日、８若しくは１２のコロニーが、各ペトリ皿からランダムに抽出され、無 菌の９６−ウェルマイクロチタープレート（例えば、９６Ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ（マサチューセッツ州０２１４０ケ ンブリッジの「Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐ」カタログ番号３７９９）の各々のウェ ル内で成長させられる。各々のウェルには、１５ｍｌのＬＢ／２ＸＣａｒｂ媒体 が含まれている。即ち、マ イクロチタープレートの各行は、同じ拡張反応からの１２個のクローンを含んで いる。細胞が、３７度で一晩に亘って成長される。 翌日、これら一晩の経過した培養の５μｌが、非無菌の９６ウェルプレート（ カリフォルニア州オックスナードの「Ｂｅｃｔｏｎ Ｂｉｃｋｉｎｆｏｎ」のＦ ａｌｃｏｎ３９１１ＭｉｃｒｏｔｅｓｔＩＩＩ（商標）Ｆｌｅｘｉｂｌｒ Ａｓ ｓａｙ Ｐｌａｔｅ）へ転移され、水によって１対１０に希釈される。各希釈液 ５μｌが、次に、ＰＣＲアレイ（例えば、カリフォルニアサニーベイルの「Ｒｏ ｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ.」のＣｙｃｌｅｐｌａｐｅ）に 転移される。１Ｘの最終的な濃度のＰｃｒの試薬を得るために、１．３３Ｘに濃 縮されたＰｃｒ混合物１５μｌが各ウェルに加えられる。拡張生成物の効率のよ いスクリーニングのための他の方法は、マルチプレクスＰＣＲ法であり、この方 法では、複数の特定のプライマがプールされ、同じ反応に用いられ、従って、ス クリーニング混合物の効率よいセットアップができる。ＰＣＲテンプレート（各 々の培養）の追加は、９６ピンツールを用いて改善され、このピンツールによっ て、上述されたように成長された全ての９６培養のアリコットが、約１分から２ 分の間でＰＣＲスクリーニング混合物内へ転移される。 ＰＣＲ増殖のために、最終的な濃度は、ＰＣＲ混合物に対して１Ｘであり、５ μｌの各ベクタープライマーと、元々の拡張反応のために用いられた遺伝子特定 プライマー及びＴａｑポリメラーゼの０．７５ユニットの一方若しくは両方とが 、各ウェルに加えられる。 通常、増殖は、以下の条件を用いて行われる。 ステップ１ ６０秒間の９４℃ ステップ２ ２０秒間の９４℃ ステップ３ ３０秒間の５５℃ ステップ４ ９０秒間の７２℃ ステップ５ 更に２９回ステップ２から４を繰り返す。 ステップ６ １８０秒間の７２℃ ステップ７ ４℃の保持 これらのＰＣＲ反応のアリコットは、分子量マーカと共にアガロースゲルの上 に放置される。結果として得られたＰＣＲ生成物の大きさは、初めの部分的なｃ ＤＮＡと比較して、選択されたクローンが含む部分的な配列がどの位であるかを 決定する。この方法の効率は、結果として得られたＰＣＲ生成物をシーケンシン グのために直接用いることにより、即ちプラスミドの調製の必要性を除去するこ とにより更に改善される。 適切なクローンが選択され、プラスミドの調製及びシーケンシングのために成 長される。 プラスミドの調製は、当業者にはよく知られた標準的なキットを用いて行われ る。そのキットの例としては、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｇｉｃ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキ ット、及びＡｇｂｃアルカリ溶解キットがある。 シーケンシングは、標準的な自動化されたＡＢＩシーケンシング装置及び第プ ライマ若しくは第ターミネータキットの何れかを用いたプロトコルによって実行 される。 シーケンスプロセス及びシーケンシングデータの組立が、ＩＮＨＥＲＩＴ（商 標）分析及びＰｏｗｅｒアセンブラを含む標準的なＡＢＩソフトウェアを用いて 実行される。産業上の利用可能性 例１ 最初の方法の評価を行うために、既知の遺伝子が選択される。ヒト９０−のｋ Ｄａ熱衝撃タンパク質遺伝子の部分的な配列（ＨＵＭＨＳＰ９０、受け入れ番号 Ｍ１６６６０）が、ＰＨＰ−１ライブラリ内で同定さ れた。この部分的な配列は、受け入れ番号Ｍ１６６６０の配列のベース１１２７ で開始される。 １．プライマーの設計 ２つのプライマーが、本発明において説明された方法を実行するために設計さ れた。 プライマー１（ＸＬＲ） ５' ＡＧＣ ＴＧＴ ＣＣＡ ＴＧＡ ＴＧＡ Ａ ＣＡ ＣＡＣ Ｇ ３' （１１８０−１１５９） プライマー２（ＸＬＳ） ５' ＡＡＴ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＡＣ ＡＣＣ Ａ ＡＣ ＴＧＡ Ｇ３' （２０１１−２０３２） １．２テンプレートの調製 ラムダＺＡＰベクター（ストラタ遺伝子(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)）内に構成さ れたＴＨＰ−１ ｃＤＮＡライブラリーは、質量除去（ｍａｓｓ ｅｘｃｓｉｏ ｎ）手続きに従って、プラスミドライブラリーに変換された。除去されたライブ ラリーのプラスミドは、Ｑｕｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ プラスミド精製キットを用 いて調製された。 １．３ＸＬ−ＰＣＲ反応セットアップ 拡張反応が、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒからのＧｅｎｅＡｍｐ ＸＬＰＣＲキ ット（パート番号第Ｎ８０８−０１８２）によって提供された命令に従って行わ れた。２つの層のシステムが以下のようにセットアップされた。 下の試薬の混合物は、以下の成分を０．２ｍｌのＭｉｃｒｏＡｍｐ反応試験管 内にピペットを用いて加えることによって調製された。 下方の試薬の混合物の調製 水 １３．６μｌ ３．３Ｘ緩衝液 １２．０μｌ ｄＡＴＰ（１０ｍＭ） ２．０μｌ ｃＣＴＰ（１０ｍＭ） ２．０μｌ ｄＧＴＰ（１０ｍＭ） ２．０ｎｌ プライマーＸＬＳ（５０μＭ） １．０μｌ プライマーＸＬＲ（５０μＭ） １．０μｌ Ｍｇ（ＯＡｃ）２ （２５ｍＭ） ４．４μｌ 全体の下方の試薬の混合物 ４０．０μｌ １つのＡｍｐｌｉｗａｘ（商標）ｇｅｍが試験管に加えられる。このワックス が、５分間に亘って７５℃で反応試験管をインキュベートすることによって溶融 された。次に、試験管が４℃まで冷却された。 上方の試薬の混合物の調製 ３．３Ｘの緩衝液 １８．０ｍｌ ｒＴ番目のＤＮＡポリメラーゼ ２．０ｍｌ 全体の上方の酵素の混合物 ２０．０μｌ ２０μｌの酵素／緩衝液の混合物は、各試験管に加えられ、ワックスの層によ って下方の混合物から分離されて保たれた。 テンプレートの追加 テンプレートＤＮＡ（除去されたライブラリー）が、水内で適切な濃度に希釈 され、次に上側の混合物に加えられた。構成要素の混ぜ合わせは必要ない。 テンプレート（６．２５ｎｇ／ｍｌ） ４０．０μｌ 最終的な体積 １００．０μｌ １．４ ＸＬ−ＰＣＲ増殖 増幅のために、以下の手順が行われた。 ステップ１ ６０秒間の９４度（最初の変性） ステップ２ １５秒間の９４度 ステップ３ １分間の６５度 ステップ４ ７分間の６８度 ステップ５ 更に１５回、ステップ２からステップ４を繰り返す ステップ６ １５秒間の９４度 ステップ７ １分間の６５度 ステップ８ （７分＋１５秒）／サイクルの６８度 ステップ９ 更に１１回、ステップ９からステップ８を繰り返す ステップ１０ ８分間の７２度 ステップ１１ ０．０秒間の４度（４度に保つ） １．５ 増殖された生成物の精製 ３０μｌの増殖された生成物が、１６時間に亘って０．７％のアガロースゲル の上に放置される。目に見えるＤＮＡバンドが、次に、切断され、ＱＩＡｑｕｉ ｃｋゲル精製キットを用いて精製された。 １．６ 増幅された生成物のクローニング クレノウ酵素（３ユニット／反応）と、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭの最終的な濃度 ）が、加えられ、反応が、室温で３０分間に亘ってインキュベートされ、次に、 １５分間に亘って７５℃でインキュベートされた。生成物は、次に、エタノール で沈殿され、１ｍＭのＡＴＰを含む連鎖反応緩衝液１３μｌで再び溶解された。 Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ(１５ユニット)、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（５ユニ ット）が加えられ、反応が、短時間に亘って室温でインキュベートされた。 ３μｌの連鎖反応混合物が、４０μｌのコンポーネント大腸菌細胞に転移され た。４５秒間の４２℃での細胞の熱衝撃の後に、８０μｌのＳＯＣ媒体が加えら れ、細胞が１時間に亘って７５℃で修復された。次に、全体の転移混合物が、Ｌ Ｂ−アガー／２ＸＣａｒｂを含むペトリ皿上に塗布された。 １．７ クローンされた生成物のスクリーニング 翌日、１０個のコロニーがランダムに取り出され、一晩に亘って、２ＸＣａｒ ｂを伴った３ｍｌのＬＢ−ｂｒｏｔｈを含むＦａｌｃｏｎ２０５９試験管（カリ フォルニア州オックスナードのＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）内で成長さ せられた。 ５μｌの培養が、水によって１対１０に希釈され、この希釈液５μｌが、Ｍｉ ｃｒｏＡｍｐ（商標）ＰＣＲ試験管（カリフォルニア州フォスターシティのＰｅ ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）内に転移さ れた。 １５μｌの１．３３Ｘ濃縮されたＰＣＲ混合物が、各ウェルに加えられた。 １．３３Ｘの濃縮化されたＰＣＲ混合物が、以下の成分を含んでいた。 １０Ｘ ＰＣＲ緩衝液 ２．０μｌ ２ｍＭ ｄＮＴＰ ２．０ μｌ Ｍ１３ ｒｅｖ プライマ（０．０１ｍＭ） １．０μｌ プライマ２ （ＸＬＲ、０．０１ｍＭ） １．０μｌ Ｔａｑ ポリメラーゼ ０．１５μｌ 水 ８．８５μｌ 最終的な体積 １５．０μｌ ＰＣＲ循環条件は、以下のように設定された。 ステップ１ ６０秒間の９５℃ ステップ２ ２０秒間の９４℃ ステップ３ ３０秒間の５５℃ ステップ４ ９０秒間の７２℃ ステップ５ 更に２９回、ステップ２からステップ４を繰り返す ステップ６ １８０秒間の７２℃ ステップ７ 継続的な４℃ 増殖された生成物のアリコットが、１ｋｂのＤＮＡのラダー（メリーランド州 ２０８９７ゲイザースブルクのＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と平行に ０．８％のアガロースゲル上に放置された。異なる寸法のインサートを含む適切 なプラスミドが、次の分析のために選択された。 １．８ クローンされた生成物の配列分析 選択されたクローンのＤＮＡが、製造業者の指示に従って、ＷｉｚａｒｄＴＭ ｍｉｎｐｒｅｐｓ ＤＮＡ 精製システム（ウィスコンシン州マジソンのＰｒ ｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて調製された。配列反応が、ＰＲ ＩＳＭＴＭ Ｒｅａｄｙ ＲｅａｃｔｉｏｎＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａ ｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（カリフォルニア州フォス タシティのＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍの パート第４０１６２８）を用いて実行された。 １．９ 配列された生成物の分析 ３個のクローンが、配列のために選択された(１４２０１．３、１４２０１． ５、及び１４２０１．１３)。得られた配列（ＳＥＱ ＩＤ：３−５、各々）が 、ＤＮＡＳＩＳ Ｍｕｌｔｉｐｌｅシーケンス整合プログラムを用いて整合され た。クローン１４２０１．３は、公開された配列（ＨＵＭＨＳＰ９０）のベース ２４で開始され、クローン１４２０１．５は、公開された配列のベース１３で開 始され、クローン１４２０１．１３は、公開された配列のベース５３８で開始さ れ、元々のクローン（１４２０１）は、公開された配列のベース１１２７で開始 された。 第７Ａ図から第７Ｈ図は、公開されたヒトＨｓｐ９０ヌクレオチド配列と共に 得られた配列の整合を表している。クローン１４２０１．３及び１４２０１．５ は、５'の翻訳されていない領域の部分を含み、従って 遺伝子の全てのコード領域が得られた。例２ 更にこの方法を評価するために、第２の既知の遺伝子が選択された。肝臓ライ ブラリーからの部分的な配列が、ヒトカテプシンＢ遺伝子（受け入れ番号Ｌ１６ ５１０、ＨＵＭＣＡＴＨＢ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）に関連するものであるこ とが見いだされた。この部分的な配列（インサイト社クローン８７０５８，ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：７）が、受け入れ番号Ｌ１６５１０の配列のベース１０６６か ら開始された。 ２．１ プライマの設計 ２個のプライマが、本発明の上述された方法が実行されるように、設計された 。 プライマー１（ＸＬＲ） ５' ＡＡＧ ＣＣＡ ＴＴＧ ＴＣＡ ＣＣＣ Ｃ ＡＧ ＴＣＡ Ｇ ３' （１１０３−１０８２） プライマー２（ＸＬＳ） ５' ＧＧＴ ＴＣＡ ＣＴＧ ＴＧＧ ＡＡＴ Ｃ ＧＡ ＡＴＣ ３' （１１２５−１１４５） ２．２ テンプレートの調整。 ラムダＺＡＰベクター内で構成された肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ストラタ遺 伝子(Ｓｔｒａｔａｇｅｎ)）が、質量除去手順に基づいてプラスミドライブラリ ー内に変換された。除去されたライブラリーのプラスミドが、Ｑｕｙａｇｅｎ Ｍｉｄｉプラスミド生成キットを用いて調製された。 ２．３ ＸＬ−ＰＣＲ反応セットアップ 拡張反応が、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒからのＧｅｎｅＡＭＰ ＸＬＰＣＲキ ット（パート番号Ｎ８０８−０１８２）に備え付けられた命令に基づいて調製さ れた。２つの層のシステムが、以下に説明されるようにセットアップされた。下 方の試薬の混合物が、以下の成分によって、 ０．２ｍｌのＭｉｃｒｏＡｍｐ反応試験管内に加えられて調製された。 下方の試薬の混合物の調製。 水 １３．６μｌ ３．３Ｘの緩衝液 １２．０μｌ ｄＡＴＰ（１０ｍＭ） ２．０μｌ ｄＣＴＰ（１０ｍＭ） ２．０μｌ ｄＧＴＰ（１０ｍＭ） ２．０μｌ ｄＴＴＰ（１０ｍＭ） ２．０μｌ プライマーＸＬＳ（５０μＭ） １．０μｌ プライマーＸＬＲ（５０μＭ） １．０μｌ Ｍｇ（ＯＡｃ）２（２５μＭ） ４．４μｌ 全体の下方の試薬の混合物 ４０．０μｌ １つのＡｍｐｌｉＷａｘが試験管に加えられた。このワックスは、反応試験管 後５分間に亘って７５℃でインキュベートすることによって溶解された。次に、 この試験管が、４℃まで冷却された。 上側の試薬混合物の調製 ３．３Ｘ緩衝液 １８．０μｌ ｒＴ番目のＤＮＡポリメラーゼ ２．０μｌ 全体の上方の酵素混合物 ２０．０μｌ ２０μｌの酵素／緩衝液混合物が、各試験管に加えられ、ワックスの層によっ て下方の混合物と分離されて保たれた。 テンプレートの追加 テンプレートＤＮＡ（除去されたライブラリー）が、水の中で適切な濃度に希 釈され、次に、上方の混合物に加えられた。成分の混ぜあわせは必要ではない。 テンプレート（６．２５ｎｇ／μｌ） ４０．０μｌ 最終的な体積 １００．０μｌ ２．４ ＸＬ−ＰＣＲ増殖 増幅のために、以下の手順が実行された。 ステップ１ ６０秒間の９４℃（最初の変性） ステップ２ １５秒間の９４℃ ステップ３ １分間の６５℃ ステップ４ ７分間の６８℃ ステップ５ 更に１５回、ステップ２からステップ４を繰り返す ステップ６ １５秒間の９４℃ ステップ７ １分間の６５℃ ステップ８ （７分間＋１５秒間）／サイクルの６８℃ ステップ９ 更に１１回、ステップ６からステップ８を繰り返す ステップ１０ ８分間の７２℃ ステップ１１ ０．００秒間の４℃（４℃に保つ） ２．５ 増殖された生成物の精製 ３０μｌの増幅された生成物が、１６時間に亘って０．７％のアガロースゲル の上に放置された。目に見えるＤＮＡバンドが、次に切断され、ＱＩＡＱｕｉｃ ｋゲル精製キットを用いて精製された。 ２．６ 増殖された生成物のクローン化 クレノウ酵素（３ユニット／反応）と、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭの最終的な濃度 ）とが加えられ、反応が、３０分間に亘って室温でインキュベートされ、次に、 １５分間に亘って７５℃でインキュベートされた。 生成物が、次に、エタノールで沈殿され、１ｍＭのＡＴＰを含む連鎖反応緩衝 液１３μｌ内で再び溶解された。Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（１５ユニット）と、Ｔ ４ポリヌクレオチドキナーゼ（５ユニット）とが加えられ、反応が、３時間に亘 って室温でインキュベートされた。 ３μｌの連鎖反応混合物が、４０μｌのコンポーネント大腸菌細胞内に転移さ れた。４５秒間に亘る４２℃での細胞の熱衝撃の後に、８０μｌのＳＯＣ媒体が 加えられ、細胞が、１時間の間に３７℃で修復された。全体の転移混合物が、次 に、ＬＰ−アガー ２Ｘ Ｃａｒｂを含むペトリ皿の上に塗布された。 ２．７ クローン化された生成物のスクリーニング 翌日、１０個のコロニーが、ランダムに取り出され、一晩に亘って、２ＸＣａ ｒｐを伴った３ｍｌのＬＰ−ｂｒｏｄｈを含むＦａｌｃｏｎ２０５９試験管（カ リフォルニア州９３０３０のオックスナードのＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ ｎ）内で成長させられた。 ５μｌの培養が、水で１対１０に希釈され、５μｌのこの希釈液が、Ｍｉｃｒ ｏＡｍｐＴＮ ＰＣＲ試験管（カリフォルニア州フォスターシティのＰｅｒｋｉ ｎ Ｅｌｍｅｒ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）内に転移された。 １５μｌの１．３３Ｘの濃縮されたＰＣＲ混合物が、各試験管に加えられた。 １．３３Ｘの濃縮されたＰＣＲ混合物は、以下の成分を含む。 １０ＸのＰＣＲ緩衝液 ２．０μｌ ２ｍＭのｄＮＴＰ ２．０μｌ Ｍ１３のｒｅｖプライマー（０．０１ｍＭ） １．０μｌ プライマー２（ＸＬＲ、０．０１ｍＭ） １．０μｌ Ｔａｋポリメラーゼ ０．１５μｌ 水 ８．８５μｌ 最終的な体積 １５．０μｌ ＰＣＲサイクル条件は以下のようなものであった。 ステップ１ ６０秒間の９４℃ ステップ２ ２０秒間の９４℃ ステップ３ ３０秒間の５５℃ ステップ４ ９０秒間の７２℃ ステップ５ 更に２９回、ステップ２からステップ４を繰り返す ステップ６ １８０秒間の７２℃ ステップ７ ４℃の保持 増殖された生成物のアリコットが、１ｋｂ ＤＮＡラダー（メリーランド州２ ０８９７のゲイザーバーグのＬｉｆｅ Ｄｅｃｈｎｏｌｏｇｉａｓ）と平行に０ ．８％のアガロースゲル上に放置された。異なる寸法のインサートを含む適切な クローンが、配列分析を行うために選択された。 ２．８ クローン化された生成物の配列分析 選択されたクローンのＤＮＡが、製造業者の命令に基づいてＷｉｚａｒｄＴＭ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｆ ＤＮＡ精製システム（ウィスコンシン州マジソンのＰｒ ｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて調製された。配列反応が、ＰＲＳ ＭＴＭ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔ ｏｒ Ｃｙｃｌｅ ｓ．ｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（カリフォルニア州フォスタ ーシティのＰｅｒｋｉｎ Ｅ． ｌｍｅｒ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓのパート第４０１６２８）を用いて行われた。 ２．９ 配列された生成物の分析 ３個のクローンが選択されて、シーケンシングが行われた。(８７０５８．６ 、８７０５８．８、及び８７０５８．１６)。得られた配列（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎ ｏｓ：８−１０、各々）が、ＤＮＡＳＩＳ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ シーケンス整合 プログラムを用いて整合され、第８Ａ図から第８Ｆ図に例示されている。クロー ン８０７５８．６は、公開された配列 （ＨＵＭＣＡＴＨＢ， ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６）のベース６４４から開始され 、クローン８７０５８．８は、公開されたシーケンスのベース３５３から開始さ れ、クローン８７０５８．１６は、公開されたシーケンスベース５８から開始さ れ、元々のクローン（８７０５８，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７）は、公開されたシ ーケンスのベース１０５８から開始された。第８Ａ図第８Ｆ図は、公開されたヒ トＨｓｐ９０ヌクレオチドシーケンスと共に得られたシーケンスの整合を表して いる。クローン８７０５８：１６は、５−ＵＴの一部を含み、従って、遺伝子の 全体のコード領域が得られた。例３ 例３では、新規なＰ２Ｕプリンレセプターホモログの全長のｃＤＮＡ（Ｓｅｑ Ｄｉ Ｎｏ１）が、本発明の方法によって得られ、これは、１９９５年６月２ 日に出願された米国特許出願第０８／４５９，０４６号の目的となっており、こ こでこの特許出願明細書は言及したことによって本出願の一部とされる。Ｉｎｈ ｅｒｉｔ（商標）及びＢＬＡＳＴサーチ及び整合ツールが、プレイセンタル（ｐ ｌａｃｅｎｔａｌ）ｃＤＮＡライブラリーからのインサイト社クローン１７９６ ９６で見いだされた部分的な配列を、ＧｅｎＢａｎｋ配列のＲＮＵ０９４０２で ある、ラットからの表面レセプター（Ｒｉｃｅ Ｗｒらによる(１９９５年)、Ａ ｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ １２：２７−３２） に連結されたＧタンパク質と関連付けるために用いられた。 インサイト社１７９６９６のｃＤＮＡは、変形されたＸＬ−ＰＣＲ(Ｐｅｒｋ ｉｎ Ｅｌｍｅｒ)手順を用いて、全長まで拡張された。プライマーは、既知の 配列に基づいて設計され、１つのプライマーは、アンチセンス方向（ＸＬＲ）で 拡張を開始するように合成され、他のプライマーは、センス方向（ＸＬＦ）で拡 張を開始するように合成された。これ らのプライマーによって、既知の配列から「外向きに」配列が拡張され、従って 、対象とされている遺伝子を含む新たな、未知のヌクレオチド配列を含むアンプ リコンが形成された。これらのプライマーは、オリゴ４．０（ミネソタ州プリマ ウスのＮａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ Ｉｎｃ.）を用いて、２２ から３０のヌクレオチドの長さを有し、５０％以上のＧＣを有し、かつ約６８℃ から７２℃の温度で目標の配列をアニールするように設計された。ヘパリン構造 及びプライマーとプライマーのディメリゼーション（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ）を結果としてもたらすようなヌクレオチドのストレッチが開始された。 ｃＤＮＡライブラリーが、テンプレートとして用いられ、ＸＬＲ（ベース２７ ８−２９８）とＸＬＦ（ベース５８７−６１０）プライマーが、１７９６９６配 列を拡張させ増殖させるために用いられた。ＸＬ−ＰＣＲキットに対する命令に 基づくことにより、かつ酵素をゆっくり混ぜ合わせることにより、非常に高い忠 実性の増殖が得られた。各プライマーの２５ｐＭｏｌから始め、キットのその他 全ての構成要素の推薦された濃度から始めることにより、ＰＣＲは、ＭＪ ＰＣ Ｔ２００サーモサイクラー（マサチューセッツ州ウォータータウンのＭＪ Ｒｅ ｓｅａｒｃｈ）を用いて、以下のパラメータを用いて実行された。 ステップ１ ６０秒間の９４℃（初めの変性） ステップ２ １５秒間の９４℃ ステップ３ １分間の６５℃ ステップ４ ７分間の６８℃ ステップ５ 更に１５サイクル、ステップ２からステップ４を繰り返す ステップ６ １５秒間の９４℃ ステップ７ １分間の６５℃ ステップ８ （７分間＋５秒間）／サイクルの６８℃ ステップ９ 更に１５サイクル、ステップ６からステップ８を繰り返す ステップ１０ ８分間の７２℃ ステップ１１ ４℃（この温度に保持する） ２８サイクルが終了したときに、５０μｌの反応混合物が除去され、残りの反 応混合物が、以下に表された更に１０サイクルに亘って放置された。 ステップ１ １５秒間の９４℃ ステップ２ １分間の６５℃ ステップ３ （１０分間＋１５分間）／サイクルの６８℃ ステップ４ 更に９サイクル、ステップ１からステップ３を繰り返す。 ステップ５ １０分間の７２℃ 反応混合物の５から１０μｌのアリコットが、低濃度の（約０．６から０．８ ％）のアガロースミニゲル上での電気泳動法によって分析され、どの反応が配列 を拡張することに成功したかが求められる。全ての拡張が、潜在的に１つの全長 の遺伝子を含む可能性はあるが、いくつかの最も長い生成物若しくはバンドが、 選択され、ゲルから切断される。更に、精製が、ＱＩＡＱｕｉｃｋ（商標）（カ リフォルニア州チャッツワースのＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ.）のような市販されて いるゲル抽出方法を用いて行われる。ＤＮＡが修復された後に、クレノウ酵素が 、再結合及びクローニングが容易となるブラントエンドを形成する一本鎖ヌクレ オチドオーバーハングを形成するために用いられた。 エタノールでの沈殿の後に、この生成物は、１３μｌの連鎖反応緩衝液内で再 び溶解された。次に、１μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５ユニット）と、１μ ｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼが加えられて、この混合物が２時間から３時 間に亘って室温で、若しくは一晩に亘って１６℃で、インキュベートされた。コ ンポーネント大腸菌細胞（４０μｌ の適切な媒体）が、結合媒体（３μｌ）と共に形質転換されて、８０μｌのＳＯ Ｃ媒体（上述されたＳａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．らによる）内で培養された。１時間 に亘る３７℃でのインキュベートの後に、全体の形質転換混合物が、２５ｍｇ／ ｌのカーベニシリンを含むＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）−アガー（上述され た、Ｓａｎｂｒｏｏｋ Ｊ．らによる）に塗布された。翌日、１２個のコロニー が各プレートからランダムに取り出され、適切な市販されている無菌の９６ウェ ルマイクロチタープレートの各々のウェル内に配置された１５０μｌの液体ＬＢ ／カーベニシリン媒体内で培養された。翌日、各々の媒体の５μｌが、非無菌の ９６ウェルプレート内に転移され、水による１対１０の希釈の後に、５μｌの各 標本が、ＰＣＲアレイ内に転移させられた。 ＰＣＲ増幅のために、０．７５ユニットのＴａｑポリメラーゼを含む１５μｌ の濃縮されたＰＣＲ反応混合物（１．３３Ｘ）と、ベクタープライマーと、１つ 若しくは両方の拡張反応に用いられた遺伝子同定プライマーとが、各ウェルに加 えられた。増殖が、以下の条件を用いて行われた。 ステップ１ ６０秒間の９４℃ ステップ２ ２０秒間の９４℃ ステップ３ ３０秒間の５５℃ ステップ４ ９０秒間の７２℃ ステップ５ 更に２９サイクル、ステップ２からステップ４を繰り返す ステップ６ １８０秒間の７２℃ ステップ７ ４℃（この温度に保持する） ＰＣＲ反応物のアリコットが、分子量マーカーと共にアガロースゲルの上に放 置された。ＰＣＲ生成物の寸法が、初めの部分的なｃＤＮＡと比較され、適切な クローンが選択されて、プラスミドに結合され、及び 配列された。 例４ この例では、本発明の方法が、インサイト社クローン０８１１８で見いだされ た部分的な配列から、新規な全長のｃＤＮＡを得るために用いられ、この全長の ｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋの配列であるＣ５ａアナフィラトキシンレセプタで ある、Ｇタンパク質（犬からの表面受容体に結合された(Ｐｅｒｒｅｔ Ｊらに よる（１９９５年）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２２８：９１１−１７)）と相同（Ｈ ｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）であることが見いだされている。部分的なｃＤＮＡシーケ ンスに基づいて、プライマー（ＸＬＲ＝ＧＡＡＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡ ＣＣＡＣＧ、及びＸＬＦ＝ＡＧＡＡＡＧＣＡＡＧＧＣＡＧＴＣＣＡＴＴＣＡＧＧ ）が設計された。上述された例３において説明された物と本質的に等しい方法が 用いられて、部分的な配列８１１８が拡張され、新規なＣＡａ類似の受容体の全 長の配列（Ｓｅｑ ＤＩ ＮＯ：１２）へ、この全長のシーケンスは、米国特許 出願第０８／４６２，３５５号（１９９５年６月５日に出願された）の目的と相 同であり、この米国特許出願はここで言及されたことによって本出願の一部とさ れたい。 これまで、本出願の発明が、特定の酵素及びその配列、特に、ＰＣＲ酵素とそ の酵素を含む公式に関して説明させたが、当業者には、本発明の技術的支店を逸 脱せずに様々な変更が可能であり、かつ等価物が交換できることが明らかである 。更に、様々な変更が、ある特定の状況、物質、酵素、方法、方法の過程に適合 するように行われ、本発明の目的、技術的視点を逸脱しないことは明らかである 。そのような変形及び変更は、添付の請求の範囲内に包含される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／４８７，１１２ (32)優先日 1995年６月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／００６，８０９ (32)優先日 1995年11月15日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／５６６，３３４ (32)優先日 1995年12月１日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、部分的な相補的ＤＮＡ（ｃＤＮ Ａ）の配列を拡張する方法であって、 （ａ）第１及び第２のＰＣＲプライマーを、前記第１及び第２のプライマーか ら核酸ＰＣＲ生成物を合成するのに適した条件の下で、前記部分的なｃＤＮＡが 得られることの期待されるｃＤＮＡライブラリーから、若しくは遺伝子ライブラ リーからの核酸と組み合わせる過程であって、前記第１及び第２のプライマーは 、前記部分的なｃＤＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの向かい合うストランド（ｓｔｒ ａｎｄ）をアニーリングし、核酸の合成を外向きに開始させることができ、前記 第１のプライマーが、アンチセンス方向でＤＮＡポリメラーゼによって拡張され 、前記第２のプライマーがセンス方向で拡張される、前記組み合わせる過程と、 （ｂ）前記ＰＣＲ生成物を精製する過程と、 （ｃ）前記部分的なｃＤＮＡ若しくは前記遺伝子ＤＮＡから導かれる拡張され た核酸配列を同定する過程とを有することを特徴とする配列を拡張する方法。 ２．前記拡張した配列を同定する過程が、核酸を配列する過程を有することを特 徴とする請求項１に記載の方法。 ３．過程６ｃによって同定された前記核酸の配列に対して過程６ａから過程６ｃ を繰り返すことによって、過程６ｃの前記核酸配列を拡張する過程を更に有する ことを特徴とする請求項２に記載の方法。 ４．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、部分的な相補的なＤＮＡ（ｃＤ ＮＡ）の核酸配列を拡張する方法であって、 （ａ）第１及び第２のＰＣＲプライマーを、前記第１及び第２のプライマーか ら核酸ＰＣＲ生成物を合成するのに適した条件の下で、前記部分的なｃＤＮＡを 含むことが期待されるｃＤＮＡライブラリーからの、 若しくは遺伝子ライブラリーの、核酸と組み合わせる過程であって、前記第１及 び第２のプライマーが、前記部分的なｃＤＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの向かい合 うストランドをアニールし、核酸の合成を外向きに開始させることができ、前記 第１のプライマーが、ＤＮＡポリメラーゼによってアンチセンス方向に拡張され 、前記第２のプライマーがセンス方向に拡張される、前記組み合わせる過程と、 （ｂ）前記ＰＣＲ生成物を精製する過程と、 （ｃ）円形の閉じた核酸を形成するのに適した条件の下で前記生成されたＰＣ Ｒ生成物を結合する過程と、 （ｄ）宿主細胞を前記環状の閉じた核酸で形質転換し、前記形質転換された宿 主細胞を成長に適した条件の下で培養する過程と、 （ｅ）前記円形の閉じた核酸を、前記培養された形質転換された宿主細胞から 回収する過程と、 （ｆ）前記部分的なｃＤＮＡ若しくは前記遺伝子ＤＮＡから導かれた拡張され たヌクレオチド配列を同定する過程とを有することを特徴とする核酸配列を拡張 する方法。 ５．前記同定する過程が、核酸を配列する過程を有することを特徴とする請求項 ４に記載の方法。 ６．成長に適した条件の下で形質転換された宿主細胞を培養する前記過程が、選 択的な抗体の条件が存在する状態で培養を行う過程を有することを特徴とする請 求項４に記載の方法。 ７．前記宿主細胞が大腸菌細胞であることを特徴とする請求項４に記載の方法。 ８．前記過程４ｂの後に、かつ前記過程４ｃの前に、前記生成されたＰＣＲ生成 物が、核酸オーバーハングをブラントエンドに変換するのに適した条件の下で処 理されることを特徴とする請求項４に記載の方法。