CN108300719B - 能快速水解dna的脱氧核酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能快速水解DNA的脱氧核酶突变体，I‑R1a、I‑R1b和I‑R1c，所述突变体是基于I类脱氧核酶I‑R1和I‑R3的序列，设计一个“退化”的DNA文库，利用指数富集的配体系统进化技术，筛选分离获得的能够更快水解DNA的脱氧核酶突变体。

Description

能快速水解DNA的脱氧核酶突变体
技术领域
本发明属于生物化学与分子生物学领域，涉及能快速水解DNA的脱氧核酶突变体，尤其涉及Zn2+依赖的I类脱氧核酶突变体。
背景技术
脱氧核酶(deoxyribozyme)是一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力。自1994年首次发现脱氧核酶以来，迄今已发现了几十种脱氧核酶。脱氧核酶可以催化许多化学反应，包括DNA的磷酸化、腺苷化、去糖基化，DNA或RNA的连接反应，核肽间连接的形成等。近些年，也发现了能够水解DNA磷酸二酯键的脱氧核酶。已经有研究者筛选出了两类以Zn2+作为辅助因子、切割DNA片段的脱氧核酶。这两类脱氧核酶都能在特定位点水解DNA片段。
已有文献报道，Zn2+依赖的I类脱氧核酶是由含有15个保守序列的环状结构以及在它侧面的一个或二个茎干结构组成的，其催化核心区域中有15个保守碱基(1到15)，水解AA之间的磷酸二酯键，如图1所示。在37℃反应时，含有一个茎干结构和两个茎干结构的I-R1(SEQ NO.5)和I-R3(SEQ NO.6)，尽管它们的保守序列是一致的，但仍在速率方面有很大的差异，其kobs(速率常数)值分别为：0.059min-1和1.0min-1。
因此，本领域技术人员致力于研究产生上述差异的原因，从而开发出更多的I类脱氧核酶突变体以满足不同DNA水解反应的需求。
发明内容
本发明基于I类脱氧核酶I-R1(SEQ NO.5)和I-R3(SEQ NO.6)的序列，设计一个“退化”的DNA文库，利用指数富集的配体系统进化技术，筛选分离获得能够更快水解DNA的脱氧核酶突变体，该筛选流程如图2所示。
经过10轮的筛选(如图3所示)，在G8筛选后DNA文库中挑选30个克隆进行测序，发现了I-R1的三个突变体，分别命名为：I-R1a、I-R1b和I-R1c。
I-R1a(SEQ NO.1)：
5′-CATGTACAGCCATAGTTGAGCATTAAGTTGAAGTGGCTGTACATG-3′
I-R1b(SEQ NO.2)：
5′-CATGTACAGCCATAGTTGAGCACTAAGTTGAAGTGGCTGTACATG-3′
I-R1c(SEQ NO.3)：
5′-CATGTACAGCCATAGTTGAGCAAAAAGTTGAAGTGGCTGTACATG-3′
这三个突变体与野生型的I-R1相比，都是在5′-CAATTA-3′区域具有两个突变位点，如图4所示。
I-R1(SEQ NO.4)：
5′-CATGTACAGCCATAGTTGAGCAATTAGTTGAAGTGGCTGTACATG-3′
在37℃反应时，I-R1a，I-R1b和I-R1c的kobs值约在0.68-0.76min-1，比I-R1的反应速率快10倍以上，如图5所示。而I-R3通过测序发现已报道的序列已经是它的最优序列。
与此同时，从G7库中分离DNA进行克隆测序，本发明的发明人意外地发现，如图6所示，现有技术中通常认为的I类脱氧核酶环状结构的保守序列区域中的第4和第13碱基(对应于SEQ NO.11中的第16位和第31位碱基)并不是高度保守的，具有一定的可变性。保守序列区域中第4碱基大于90％都是嘧啶(胸腺嘧啶或胞嘧啶，Y)，而第13碱基大于97％都是嘌呤(鸟嘌呤或腺嘌呤，R)。将这两个位点以不同碱基进行组合，共有16种组合，如图7所示。通过测试发现：保守序列区域中Y4/R13组合的切割速率大于Y4/Y13，R4/R13和R4/Y13。而Y4/R13组合中速度最快的是T4/A13，这也正是I-R3和新筛选库中G8的克隆序列中的碱基组合。在37℃反应时，单位点突变从T4到C4，或者从A13到G13，kobs值从1min-1下降到0.5min-1或0.38min-1。对于双位点突变：T4到C4，A13到G13，催化速率进一步下降到0.25min-1。这表明尽管第4和第13碱基具有一定的可变性，但最优的还是在I-R1、I-R1a、I-R1b和I-R1c中T4/A13。
因此，在一方面，本发明涉及一种快速水解DNA的脱氧核酶，其具有如SEQ NO.11所示的核苷酸序列，且不是I-R1。
SEQ NO.11：
5′-CATGTACAGCCATAGYTGAGCAATTAGTTGRAGTGGCTGTACATG-3′
本发明的核苷酸序列中，A表示腺嘌呤，C表示胞嘧啶，G表示鸟嘌呤，T表示胸腺嘧啶，Y表示所述碱基是胞嘧啶或胸腺嘧啶，R表示所述碱基是腺嘌呤或鸟嘌呤。
进一步地，本发明涉及的脱氧核酶在第21-25位间，即在5′-CAATTA-3′区域存在一个或几个核苷酸的取代、添加或缺失。
进一步地，本发明涉及的脱氧核酶在第21-25位间存在两个核苷酸的取代。
进一步地，本发明涉及的脱氧核酶第16位为T，第31位为A。
更进一步地，本发明涉及的脱氧核酶具有如SEQ NO.1所示的核苷酸序列。
更进一步地，本发明涉及的脱氧核酶具有如SEQ NO.2所示的核苷酸序列。
更进一步地，本发明涉及的脱氧核酶具有如SEQ NO.3所示的核苷酸序列。
优选地，本发明涉及的脱氧核酶为I类脱氧核酶；更优选地，本发明涉及的脱氧核酶为Zn2+依赖的I类脱氧核酶；更优选地，本发明涉及的脱氧核酶能够在特定位点水解DNA片段。
本发明所述的I类脱氧核酶环状结构的15个保守序列区域的碱基编号如图6所示，其分别对应于SEQ NO.11中的第13-20位和第27-33位碱基。其中保守序列区域中的第4和第13碱基分别对应于SEQ NO.11中的第16位和第31位碱基。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是I-R1和I-R3的二级结构及保守序列示意图；
图2是本发明实施例的建库及筛选流程图；
图3是本发明实施例筛选过程信号示意图；
图4是本发明中I-R1的突变型分子中突变位点示意图；
图5是本发明实施例的反应速率测试结果示意图；
图6是本发明中I-R1和I-R3的可变位点示意图；
图7是本发明中I-R1和I-R3的可变位点不同碱基组合后反应速率测试结果示意图。
具体实施方式
1.DNA文库的构建
DNA文库合成时在I-R1和I-R3的基础上进行“退化”处理：将下划线部分的25个碱基进行部分随机化，I-R1/I-R3的其余序列保持不变。即各位点70％还保持原来的碱基，剩余的30％随机化。
I-R1序列(SEQ NO.5)：
5′-pGGTAGCATGTACAGCCATAGTTGAGCAATTAGTTGAAGTGGCTGTACATGGGAGTAATTTATCCTTCTAGACTGC-3′
I-R3序列(SEQ NO.6)：
5′-pGGTTGACAGTGTGCAGACGTTGAAGGATTATCCTGGAACAGGATAATCTAGTTGAGCTGTCTGCACACGATTAGC-3′
DNA序列在IDT合成，经过8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PolyacrylamideGelElectrophoresis，PAGE)纯化后，用荧光成像仪和割胶仪回收目标序列。将回收的序列进行成环反应。
第一次成环反应体系：
Figure BDA0001574908550000031
反应条件：60℃反应2小时
环化产物经离心沉降后用10％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，将环状DNA切胶回收。
2.筛选
回收的环状DNA在100μL筛选缓冲液中37℃下孵育10分钟。(筛选缓冲液体系：50mMHEPES pH 7.5，100mM NaCl，10mM MgCl2，2mM ZnCl2)。通过10％变性聚丙烯酰胺凝胶回收发生切割的线性DNA片段。
3.二次成环反应
将回收的线性DNA片段进行二次成环反应。
二次成环反应：
Figure BDA0001574908550000041
反应条件：60℃反应2小时。
环化产物经10％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，将环状DNA切胶回收。
4.PCR扩充DNA文库
回收的环状DNA利用PCR反应进行扩增，反应体系如下表所示。然后用0.25M NaOH在90℃反应5分钟，使含有核糖核苷的DNA链断裂，未断裂的75nt的单链DNA通过10％变性聚丙烯酰胺凝胶回收。进行下一轮筛选。
PCR反应体系：
Figure BDA0001574908550000042
引物序列为：
引物A：5′-pGGTAGCATGTACAGC-3′(SEQ NO.7)
引物B：5′-GCAGTCTAGAAGGATArA-3′(SEQ NO.8)
引物C：5′-pGGTTGACAGTGTGCA-3′(SEQ NO.9)
引物D：5′-GCTAATCGTGTGCArG-3′(SEQ NO.10)
注：在引物B/D的3′末端合成一个核糖核苷(rA或rG)，可以在PCR(聚合酶链式扩增反应)后通过NaOH处理，使含有核糖核苷的DNA链断裂，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化出目标DNA链(未断裂的DNA链)。
在筛选过程中为得到活性更高的脱氧核酶，需要不断的施加筛选压力。从G0到G2，筛选步骤中允许脱氧核酶反应的时间为10分钟；在G3和G4的筛选中，降低反应时间至2分钟；在G5和G6的筛选中，降低反应时间至30秒；在进行G7和G8筛选时，最终将反应时间降低至12秒。最终在G7和G8的筛选库中分离出DNA片段，并进行克隆测序。
5.脱氧核酶速率常数测试
将I-R1，I-R1a，I-R1b和I-R1c进行速率常数测试。
先将DNA片段进行32P标记，反应体系如下：
Figure BDA0001574908550000051
反应条件：37℃反应1小时。
标记后的DNA通过10％变性聚丙烯酰胺凝胶回收后，将1pmol 5′端进行32P标记的DNA加入50μL缓冲液1，加热到90℃保持5分钟，再冷却至室温，在37℃进行孵育，取4μL加入终止缓冲液中作为t＝0的样品，在剩余的46μL样品中加入等体积的缓冲液2，在t＝10秒，20秒，40秒…时，分别取8μL样品加入8μL终止缓冲液中。将反应进行了不同时间的样品通过10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
Figure BDA0001574908550000052
反应速率常数kobs可以用下列公式计算：
切割百分比＝FCmax(1－e－kt)(其中k＝kobs，FCmax＝最大的切割百分比)
在37℃反应时，I-R1a，I-R1b和I-R1c的kobs值约在0.68-0.76min-1，比I-R1的反应速率快10倍以上，如图5所示。
6.I-R1和I-R3的可变位点不同碱基组合后反应速率测试
将I-R1和I-R3的保守区域的第4和第13碱基(分别对应于SEQ NO.11中的第16位和第31位碱基)以不同碱基进行组合，共有16种组合，分别测试相关序列的反应速率。结果显示：Y4/R13组合的切割速率大于Y4/Y13，R4/R13和R4/Y13。而Y4/R13组合中速度最快的是T4/A13，这也正是I-R3和新筛选库中G8的克隆序列中的碱基组合。如图7所示，在37℃反应时，单位点突变从T4到C4，或者从A13到G13，kobs值从1min-1下降到0.5min-1或0.38min-1。对于双位点突变：T4到C4，A13到G13，催化速率进一步下降到0.25min-1。这表明尽管第4和第13碱基具有一定的可变性，但最优的还是在I-R1、I-R1a、I-R1b、I-R1c和I-R3中T4/A13。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 如东百奥百乐生物科技有限公司
<120> 能快速水解DNA的脱氧核酶突变体
<130> BABL445-181001A
<141> 2018-02-07
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
catgtacagc catagttgag cattaagttg aagtggctgt acatg 45
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
catgtacagc catagttgag cactaagttg aagtggctgt acatg 45
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
catgtacagc catagttgag caaaaagttg aagtggctgt acatg 45
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
catgtacagc catagttgag caattagttg aagtggctgt acatg 45
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<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
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atccttctag actgc 75
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<213> Artificial Sequence
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ggttgacagt gtgcagacgt tgaaggatta tcctggaaca ggataatcta gttgagctgt 60
ctgcacacga ttagc 75
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<400> 8
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<212> DNA
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catgtacagc catagytgag caattagttg ragtggctgt acatg 45

Claims (1)

1.一种脱氧核酶，其特征在于，所述脱氧核酶的核苷酸序列如SEQ NO.1所示、SEQ NO.2所示或者如SEQ NO.3所示。
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CN111870581B (zh) * 2020-08-04 2022-07-19 复旦大学附属肿瘤医院 一种利用单链dna纳米结构辅助分选脂质体的方法
CN112175954B (zh) * 2020-10-19 2022-09-09 复旦大学附属肿瘤医院 Iv类脱氧核酶突变体及其制备方法与应用
CN112301020B (zh) * 2020-10-19 2024-04-12 复旦大学附属肿瘤医院 Iii类脱氧核酶突变体及其制备方法与应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"I-R3脱氧核酶酶学性质与构效关系研究";姜莹;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）》;20160915(第09期);A006-78 *
"Large Scale Mutational and Kinetic Analysis of a Self-Hydrolyzing Deoxyribozyme";V. Dhamodharan 等;《American Chemical Society》;20171023;第12卷(第12期);第2940−2945页 *
"small, highly active DNAs that hydrolyze DNA";Hongzhou Gu等;《Journal of the American chemical society》;20130516;第135卷(第24期);第9121-9129页 *

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