CN114774399B

CN114774399B - 一种人工改造脱氨酶辅助的dna中5-羟甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法

Info

Publication number: CN114774399B
Application number: CN202210304239.2A
Authority: CN
Inventors: 袁必锋; 谢能彬
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2022-03-25
Filing date: 2022-03-25
Publication date: 2024-01-30
Anticipated expiration: 2042-03-25
Also published as: CN114774399A

Abstract

本发明公开了人工改造脱氨酶辅助的DNA中5‑羟甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法，属于生物技术领域。本发明利用人工改造的胞嘧啶脱氨酶eA3A‑1及eA3A‑2蛋白分别对DNA中不同序列特征的胞嘧啶和5‑甲基胞嘧啶有效的脱氨基，而其对不同序列特征的5‑羟甲基胞嘧啶不脱氨基的策略，随后进行聚合酶链式反应扩增进而测序获得5‑羟甲基胞嘧啶的位点信息。该方法灵敏度高、选择性高、操作简便，无需亚硫酸氢盐的处理，亦无须对5‑羟甲基胞嘧啶进行糖基化保护，就可以直接获得DNA中5‑羟甲基胞嘧啶的单碱基分辨率定位。

Description

一种人工改造脱氨酶辅助的DNA中5-羟甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是指一种人工改造脱氨酶辅助的DNA中5-羟甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法。

背景技术

在哺乳动物的DNA中，胞嘧啶5位会在DNA甲基转移酶的作用下发生甲基化修饰，形成5-甲基胞嘧啶(5mC)。5mC参与许多重要生物学过程，如基因组印迹、基因表达调控等，是一种重要的表观遗传学修饰。5-甲基胞嘧啶可以被TET蛋白进一步地连续氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-醛基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)，形成新的修饰。这些新发现的修饰成分与多种重要生理功能密切相关，例如细胞分化、细胞重编程、神经系统发育、疾病的发生与发展等等。正常人的DNA修饰水平是稳定的，而异常的DNA修饰水平会导致一系列疾病的发生，比如癌症、老年痴呆症、糖尿病等需要。

研究这些DNA修饰的生物学功能需要对其进行准确的定位分析，然而这些DNA修饰的丰度较低，并且DNA中其它大量的未修饰成分(胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤)化学结构与修饰成分类似，在检测这些修饰成分时会对其造成严重干扰。所以上述两点是导致单碱基分辨定位分析需要高灵敏度、高选择性且准确检测的原因。

传统的亚硫酸氢盐测序方法是通过利用亚硫酸氢盐对未修饰的胞嘧啶(C)进行脱氨基而5mC及5hmC不能脱氨基的原理对DNA进行处理；同样的，在处理过程中，5fC和5caC也会被亚硫酸氢盐脱氨基。在后续的测序过程中C被读作胸腺嘧啶(T)，这种由C到T的转化可以直接获得5mC和5hmC的定位信息总和。

目前可以对全基因组5-羟甲基胞嘧啶的直接进行单碱基分辨率测序的方法主要有两种，一种是衍生的亚硫酸氢盐测序方法，另一种为脱氨酶介导的测序方法。衍生的亚硫酸氢盐测序方法主要依靠β-糖基转移酶将5hmC转化成糖基化的5hmC(β-glucosyl-5-hydroxymethyl-2′-deoxycytidine，5gmC)，再利用TET蛋白将5mC转化成5caC，经亚硫酸氢盐处理，C、5fC及5caC被脱氨基形成尿嘧啶，而糖基化的5hmC不会脱氨基，在测序中读作C的位点就是测得的5hmC位点。而脱氨酶介导的测序方法亦需要β-糖基转移酶将5hmC转化成5gmC，经脱氨酶APOBEC3A(人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A，A3A)处理后，C及5mC可以转变成尿嘧啶或胸腺嘧啶，在测序过程中读作C的位点就是测得的5hmC位点。目前的方法基本都需要对5hmC进行糖基化保护，使得操作比较繁琐。

A3A蛋白是一种胞嘧啶脱氨酶，可使单链DNA的序列中的C、5mC及5hmC有效地脱氨基成为尿嘧啶或者胸腺嘧啶，但相对于其对C和5mC的脱氨基能力而言，A3A蛋白对5hmC的脱氨基能力要小得多。如果对A3A蛋白进行改造使其保留对C及5mC的良好脱氨基能力但不能对5hmC脱氨基，则可以对所有位点的5hmC进行定位分析且不需要将5hmC转化成5gmC。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人工改造的脱氨酶辅助的DNA中5-羟甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法，即一种能应用于DNA修饰测序领域中，无需亚硫酸氢盐处理的、具有高灵敏度、高选择性且操作简便的单碱基分辨率的5hmC定位测序方法。本发明的目的还在于提供所述人工改造的脱氨酶。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种人工改造的胞嘧啶脱氨酶，其为氨基酸序列如SEQ ID NO.2、3所示的eA3A-1、eA3A-2。将DNA中的所有胞嘧啶位点分为GC、AC、TC及CC四种类型，可利用eA3A-1对GC和AC位点的5hmC进行检测，利用eA3A-2对TC和CC位点的5hmC进行检测。

一种人工改造脱氨酶辅助的DNA中5-羟甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法，包含如下步骤：

(1)对待检DNA进行变性处理使其形成单链DNA。

(2)分别用人工改造的脱氨酶eA3A-1、eA3A-2对单链DNA进行脱氨基处理，以检测待检DNA中处于不同序列特征中的5hmC(eA3A-1对GC和AC位点的5hmC进行检测，eA3A-2对TC和CC位点的5hmC进行检测)。

(3)脱氨后的样品进行PCR扩增。

(4)将PCR产物进行测序，经eA3A-1处理的待检DNA中的GC和AC位点、G5mC和A5mC位点在测序中被读为GT和AT，而G5hmC和A5hmC位点在测序中被读为GC和AC；经eA3A-2处理的待检DNA中的TC和CC位点、T5mC和C5mC位点在测序中被读为TT和TT，而T5hmC和C5hmC位点在测序中被读为TC和TC。

上述脱氨基处理是指具有脱氨基作用的eA3A-1或eA3A-2与含胞嘧啶的化合物之间的脱氨基反应。

步骤(1)中，DNA变性处理的方法优选为：将DNA在90℃-95℃高温下孵育10-20分钟后立即转入冰浴2-5分钟使双链DNA变性成单链DNA。

步骤(2)中，单链DNA进行脱氨基处理所使用的脱氨基反应缓冲液为20-30mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH为5.5-6.5；脱氨基反应的温度为35℃-37℃、反应时间为2-4小时。

本发明原理见图1，改造的eA3A-1对GC和AC、G5mC和A5mC进行脱氨基成为GU和AU、GT和AT，随后通过PCR扩增和测序读为GT和AT、GT和AT，而G5hmC和A5hmC中的5hmC能够抵抗eA3A-1的脱氨基作用，因此通过PCR扩增和测序仍读为GC和AC。改造的eA3A-2对TC和CC、T5mC和C5mC进行脱氨基成为TU和UU、TT和UT，随后通过PCR扩增和测序读为TT和TT、TT和TT，而T5hmC和C5hmC中的5hmC能够抵抗eA3A-2的脱氨基作用，因此通过PCR扩增和测序读为TC和TC。将两者结合，进而实现对所有位点的5hmC进行定位分析的目的。

本发明不需要将5hmC转化成5gmC进行保护，亦无需亚硫酸氢盐处理，就可以直接获得DNA中5hmC的单碱基分辨率定位，相对于目前的主流方法而言，操作更简单，更利于推广使用。

本发明的优点及有益效果如下：

1)本发明中，方法操作简便，无需繁琐的样品前处理，脱氨基处理后可直接进行PCR扩增反应。

2)本发明无需亚硫酸氢盐处理以及随后的纯化处理。

3)本发明无需利用试剂氧化或衍生化试剂标记，极大的缩短了实验的时间。

4)本发明涉及的脱氨基反应具有较高的脱氨基效率(99％)，利于定位分析。

附图说明

图1为本发明中eA3A-1或eA3A-2对胞嘧啶及其氧化衍生物的脱氨基所用示意图。

图2为本发明中人工改造的脱氨酶与野生型A3A蛋白序列对比图。

图3为AC-C及GC-C、AC-5mC及GC-5mC和AC-5hmC及GC-5hmC经eA3A-1处理前后的质谱图。处理后C、5mC的质谱信号低于检测限，故而可以认为eA3A-1几乎可以完全脱去处于AC及GC位点的C和5mC的氨基。而5hmC的质谱信号强度并未明显减少，故而可以认为eA3A-1几乎不能脱去处于AC及GC位点的5hmC的氨基。

图4为TC-C及CC-C、TC-5mC及CC-5mC和TC-5hmC及CC-5hmC经eA3A-2处理前后的质谱图，处理后C、5mC的质谱信号低于检测限，故而可以认为eA3A-2几乎可以完全脱去处于TC及CC位点的C和5mC的氨基。而5hmC的质谱信号强度并未明显减少，故而可以认为eA3A-2几乎不能脱去处于TC及CC位点的5hmC的氨基。

图5为本发明中人工合成的分别含有C、5mC及5hmC的DNA链(DNA-C、DNA-5mC及DNA-5hmC)经eA3A-1脱氨基处理前后测序效果对比图。

图6人工合成的分别含有C、5mC及5hmC的DNA链(DNA-C、DNA-5mC及DNA-5hmC)经eA3A-2脱氨基处理前后测序效果对比图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明，但不应理解为对本发明的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

实施例1人工改造的胞嘧啶脱氨酶的筛选与表达

野生型胞嘧啶脱氨酶wtA3A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，对其进行随机突变筛选对C及5mC的良好脱氨基能力但不能对5hmC脱氨基的蛋白，最后得到氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、3所示eA3A-1、eA3A-2蛋白。

eA3A-1与wtA3A相比有5处不同(图2)，包括25位氨基酸从甘氨酸(G，wtA3A)更改为天冬酰胺(N，eA3A-1)、29位氨基酸从组氨酸(H，wtA3A)改为精氨酸(R，eA3A-1)、30位氨基酸从赖氨酸(K，wtA3A)改为谷氨酰胺(Q，eA3A-1)、134位氨基酸从脯氨酸(P，wtA3A)改为苏氨酸(T，eA3A-1)及135位氨基酸从亮氨酸(L，wtA3A)改为天冬氨酸(D，eA3A-1)。

eA3A-2与wtA3A相比有6处不同(图2)，包括25位氨基酸从甘氨酸(G，wtA3A)更改为天冬酰胺(N，eA3A-2)、26位氨基酸从异亮氨酸(I，wtA3A)改变为天冬酰胺(N，eA3A-2)、29位氨基酸组氨酸(H，wtA3A)改变成精氨酸(R，eA3A-2)、30位氨基酸从赖氨酸(K，wtA3A)改为谷氨酰胺(Q，eA3A-2)、134位氨基酸从脯氨酸(P，wtA3A)改为苏氨酸(T，eA3A-2)及135位氨基酸从亮氨酸(L，wtA3A)改为天冬氨酸(D，eA3A-2)。

各胞嘧啶脱氨酶表达纯化的过程如下：将各胞嘧啶脱氨酶的表达框架DNA(wtA3A、eA3A-1、eA3A-2的表达框架DNA序列分别如SEQ ID NO.4-6所示)克隆到pET-41a(+)质粒中以构成可以表达蛋白的重组质粒。随后，重组质粒被转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株中。转化后的大肠杆菌细胞在LB培养基(LB培养基配方：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)中生长，培养条件为37℃、180rpm。培养基中需要添加终浓度均为10μg/mL的卡那霉素和氯霉素以抑制杂菌的生长和防止转化后的细菌丢失重组质粒。当大肠杆菌细胞悬液的OD₆₀₀值达到0.6时，向培养基中加入终浓度为0.5mM的IPTG，同时降低培养温度至25℃，在180rpm下震荡培养20个小时以充分诱导大肠杆菌合成目标蛋白。培养结束后的大肠杆菌细胞经10000g离心后沉淀收集在50mL的离心管中，使用30mL的PBS溶液洗涤两次沉淀，每次均需离心收集沉淀。沉淀的大肠杆菌细胞经30mL的PBS溶液重悬后，使用超声破碎仪将大肠杆菌细胞破碎，破碎后的菌液经12000g低温离心后获得的上层含目标蛋白的清液，将上层清液与谷胱甘肽琼脂糖吸附珠(购自生工科技有限公司)孵育2个小时后，2000rpm离心去除上清保留琼脂糖珠，将琼脂糖珠重悬在HRV 3C蛋白酶的反应缓冲溶液中，加入10UHRV 3C切去GST标签并使胞嘧啶脱氨酶蛋白从琼脂糖珠上释放出来，释放后的蛋白利用10kDa的浓缩离心柱(购自Millipore公司)离心收集，浓缩收集的蛋白使用含有50mM Tris-HCl(pH7.5)、50mM NaCl、0.01mM EDTA、0.5mM二硫苏糖醇和0.01％Tween-20的蛋白存储液平衡。

商品化合成表1中的寡核苷酸链，其中三种不同的DNA组合(GC-C与AC-C；GC-5mC与AC-5mC；GC-5hmC与AC-5hmC)分别取60ng，并利用终浓度为20μM的eA3A-1进行脱氨基(在20mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(pH为5.5-6.5)反应缓冲液中，35℃-37℃反应2-4小时)；另外三种不同的DNA组合(TC-C与CC-C；TC-5mC与CC-5mC；TC-5hmC与CC-5hmC)分别取60ng，并利用终浓度为20μM的eA3A-2进行脱氨基(在20mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(pH为5.5-6.5)反应缓冲液中，35℃-37℃反应2-4小时)；脱氨基后的DNA酶解后利用LC-MS/MS技术分析不同碱基的变化，结果如图3、4所示。结果表明人工改造的胞嘧啶脱氨酶eA3A-1可以将GC-C与AC-C上的C及GC-5mC与AC-5mC上的5mC完全脱氨基，而不能对GC-5hmC与AC-5hmC上的5hmC脱氨基；人工改造的胞嘧啶脱氨酶eA3A-2可以将TC-C与CC-C上的C及TC-5mC与CC-5mC上的5mC完全脱氨基，而不能对TC-5hmC与CC-5hmC上的5hmC脱氨基。将DNA中的所有胞嘧啶位点可以分为GC、AC、TC及CC四种类型，就可利用eA3A-1对GC和AC位点的5hmC进行检测，利用eA3A-2对TC和CC位点的5hmC进行检测。

表1寡核苷酸链的序列

实施例2人工改造脱氨酶辅助的DNA中5-羟甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法

具体步骤如下：

(1)首先配制工作溶液：将4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶解于去离子水中，浓度为200mM，并调节其pH至5.5-6.5。

(2)取10-30μg从生物样品组织或细胞中提取的DNA，用RNase酶将DNA中的RNA除干净。

(3)利用商品化的dsDNA fragmentase对DNA进行片段化处理；片段化DNA进行变性处理，在90℃-95℃水浴中孵育10-20分钟，随后立即转移至冰盒中猝火2-5分钟。

(4)取步骤(3)中所得的变性DNA样品100ng，分别加入一定量的eA3A-1或eA3A-2(蛋白的用量需要根据实验过程中表达的脱氨酶蛋白的具体活性进行调整，以保证脱氨基蛋白的用量可以使反应体系中DNA上的胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶完全脱氨基)，2μL步骤(1)配制的4-羟乙基哌嗪乙磺酸反应缓冲液(pH 5.5-6.5)，加去离子水至反应体系为20μL。用小型加热水浴锅在35℃-37℃下反应2-4个小时；反应结束后，将样品在90℃-95℃下孵育10-30分钟。

(5)随后进行聚合酶链式反应(PCR)对步骤(4)脱氨基的DNA进行扩增，扩增使用的引物视所需检测的DNA序列而定，扩增后的产物使用测序手段来检测。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段包括核酸的提取、酶解以及聚合酶链式反应为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例3标准DNA的分析

商品化合成的分别含有C、5mC及5hmC的DNA，DNA序列下表2。分别取各DNA 60ng，加入一定量的eA3A-1或eA3A-2(根据所使用的eA3A-1或eA3A-2的实际活性确定最合适的脱氨基浓度)，2μL 200mM HEPES(pH 5.5-6.5)，加去离子水至反应体系为20μL，在35-37℃水浴中温育2-4个小时。随后在90-95℃水浴中温育10-30分钟。

取上述反应后的DNA进行聚合酶链式扩增反应。反应体系：10×扩增缓冲液5μL，10μmol/L正反向引物(GAGTGATGTTGAGTTTGATGTTGTGT及CTCCAACATTCCACTAACA ATTACTCTCT)各2μL，模板DNA 5ng，Hot Start Taq DNA聚合酶用量10U，补加去离子水至体系为50μL。扩增反应的退火温度根据不同区域选出不同的退火温度；扩增循环时间程序：(1)95℃变性5min；(2)95℃变性30sec；(3)50-68℃退火30sec；(4)68℃延伸30sec；(2)-(4)步重复25次；68℃延伸10min，放置4℃进行贮存。样品进行桑格(Sanger)测序。

结果见图5和6，eA3A-1可以将DNA-C中的C完全脱氨基，亦可以对DNA-5mC中的5mC完全脱氨基，在测序过程中读作T，但仅能使DNA-5hmC中处于CC及TC位点的5hmC部分脱氨基，在测序过程中部分被读作C并且部分被读作T，并且eA3A-1不能对DNA-5hmC中处于AC及GC位点的5hmC脱氨基，在测序过程中读作C；eA3A-2可以将DNA-C中的C完全脱氨基，亦可以对DNA-5mC中处于TC及CC位点的5mC完全脱氨基，在测序过程中读作T，但仅能使DNA-5mC中处于GC及AC位点的5mC部分脱氨基，在测序过程中部分被读作C并且部分被读作T，并且eA3A-2不能对DNA-5hmC中的5hmC脱氨基，在测序过程中读作C。该结果表明eA3A-1可以用于对处于AC及GC位点的5hmC进行定位分析，而eA3A-2可以用于对处于TC及CC位点的5hmC进行定位分析。

表2标准DNA的序列

序列表

<110> 武汉大学

<120> 一种人工改造脱氨酶辅助的DNA中5-羟甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 199

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Glu Ala Ser Pro Ala Ser Gly Pro Arg His Leu Met Asp Pro His

1 5 10 15

Ile Phe Thr Ser Asn Phe Asn Asn Gly Ile Gly Arg His Lys Thr Tyr

20 25 30

Leu Cys Tyr Glu Val Glu Arg Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Lys Met

35 40 45

Asp Gln His Arg Gly Phe Leu His Asn Gln Ala Lys Asn Leu Leu Cys

50 55 60

Gly Phe Tyr Gly Arg His Ala Glu Leu Arg Phe Leu Asp Leu Val Pro

65 70 75 80

Ser Leu Gln Leu Asp Pro Ala Gln Ile Tyr Arg Val Thr Trp Phe Ile

85 90 95

Ser Trp Ser Pro Cys Phe Ser Trp Gly Cys Ala Gly Glu Val Arg Ala

100 105 110

Phe Leu Gln Glu Asn Thr His Val Arg Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg

115 120 125

Ile Tyr Asp Tyr Asp Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Met Leu Arg

130 135 140

Asp Ala Gly Ala Gln Val Ser Ile Met Thr Tyr Asp Glu Phe Lys His

145 150 155 160

Cys Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp

165 170 175

Asp Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala

180 185 190

Ile Leu Gln Asn Gln Gly Asn

195

<210> 2

<211> 199

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Ala Ser Pro Ala Ser Gly Pro Arg His Leu Met Asp Pro His

1 5 10 15

Ile Phe Thr Ser Asn Phe Asn Asn Asn Ile Gly Arg Arg Gln Thr Tyr

20 25 30

Leu Cys Tyr Glu Val Glu Arg Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Lys Met

35 40 45

Asp Gln His Arg Gly Phe Leu His Asn Gln Ala Lys Asn Leu Leu Cys

50 55 60

Gly Phe Tyr Gly Arg His Ala Glu Leu Arg Phe Leu Asp Leu Val Pro

65 70 75 80

Ser Leu Gln Leu Asp Pro Ala Gln Ile Tyr Arg Val Thr Trp Phe Ile

85 90 95

Ser Trp Ser Pro Cys Phe Ser Trp Gly Cys Ala Gly Glu Val Arg Ala

100 105 110

Phe Leu Gln Glu Asn Thr His Val Arg Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg

115 120 125

Ile Tyr Asp Tyr Asp Thr Asp Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Met Leu Arg

130 135 140

Asp Ala Gly Ala Gln Val Ser Ile Met Thr Tyr Asp Glu Phe Lys His

145 150 155 160

Cys Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp

165 170 175

Asp Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala

180 185 190

Ile Leu Gln Asn Gln Gly Asn

195

<210> 3

<211> 199

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Glu Ala Ser Pro Ala Ser Gly Pro Arg His Leu Met Asp Pro His

1 5 10 15

Ile Phe Thr Ser Asn Phe Asn Asn Asn Asn Gly Arg Arg Gln Thr Tyr

20 25 30

Leu Cys Tyr Glu Val Glu Arg Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Lys Met

35 40 45

Asp Gln His Arg Gly Phe Leu His Asn Gln Ala Lys Asn Leu Leu Cys

50 55 60

Gly Phe Tyr Gly Arg His Ala Glu Leu Arg Phe Leu Asp Leu Val Pro

65 70 75 80

Ser Leu Gln Leu Asp Pro Ala Gln Ile Tyr Arg Val Thr Trp Phe Ile

85 90 95

Ser Trp Ser Pro Cys Phe Ser Trp Gly Cys Ala Gly Glu Val Arg Ala

100 105 110

Phe Leu Gln Glu Asn Thr His Val Arg Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg

115 120 125

Ile Tyr Asp Tyr Asp Thr Asp Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Met Leu Arg

130 135 140

Asp Ala Gly Ala Gln Val Ser Ile Met Thr Tyr Asp Glu Phe Lys His

145 150 155 160

Cys Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp

165 170 175

Asp Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala

180 185 190

Ile Leu Gln Asn Gln Gly Asn

195

<210> 4

<211> 1562

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta gaaataattt 60

tgtttaactt taagaaggag atatacatat gtcccctata ctaggttatt ggaaaattaa 120

gggccttgtg caacccactc gacttctttt ggaatatctt gaagaaaaat atgaagagca 180

tttgtatgag cgcgatgaag gtgataaatg gcgaaacaaa aagtttgaat tgggtttgga 240

gtttcccaat cttccttatt atattgatgg tgatgttaaa ttaacacagt ctatggccat 300

catacgttat atagctgaca agcacaacat gttgggtggt tgtccaaaag agcgtgcaga 360

gatttcaatg cttgaaggag cggttttgga tattagatac ggtgtttcga gaattgcata 420

tagtaaagac tttgaaactc tcaaagttga ttttcttagc aagctacctg aaatgctgaa 480

aatgttcgaa gatcgtttat gtcataaaac atatttaaat ggtgatcatg taacccatcc 540

tgacttcatg ttgtatgacg ctcttgatgt tgttttatac atggacccaa tgtgcctgga 600

tgcgttccca aaattagttt gttttaaaaa acgtattgaa gctatcccac aaattgataa 660

gtacttgaaa tccagcaagt atatagcatg gcctttgcag ggctggcaag ccacgtttgg 720

tggtggcgac catcctccaa aatcggatgg ttcaactagt ctggaagttc tgttccaggg 780

gcccatggaa gccagcccag catccgggcc cagacacttg atggatccac acatattcac 840

ttccaacttt aacaatggca ttggaaggca taagacctac ctgtgctacg aagtggagcg 900

cctggacaat ggcacctcgg tcaagatgga ccagcacagg ggctttctac acaaccaggc 960

taagaatctt ctctgtggct tttacggccg ccatgcggag ctgcgcttct tggacctggt 1020

tccttctttg cagttggacc cggcccagat ctacagggtc acttggttca tctcctggag 1080

cccctgcttc tcctggggct gtgccgggga agtgcgtgcg ttccttcagg agaacacaca 1140

cgtgagactg cgtatcttcg ctgcccgcat ctatgattac gaccccctat ataaggaggc 1200

actgcaaatg ctgcgggatg ctggggccca agtctccatc atgacctacg atgaatttaa 1260

gcactgctgg gacacctttg tggaccacca gggatgtccc ttccagccct gggatggact 1320

agatgagcac agccaagccc tgagtgggag gctgcgggcc attctccaga atcagggaaa 1380

cctggaagtt ctgttccagg ggcccactcg aggacaccac caccaccacc accaccacta 1440

attgattaat acctaggctg ctaaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca 1500

ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt 1560

tg 1562

<210> 5

<211> 1559

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta gaaataattt 60

tgtttaactt taagaaggag atatacatat gtcccctata ctaggttatt ggaaaattaa 120

gggccttgtg caacccactc gacttctttt ggaatatctt gaagaaaaat atgaagagca 180

tttgtatgag cgcgatgaag gtgataaatg gcgaaacaaa aagtttgaat tgggtttgga 240

gtttcccaat cttccttatt atattgatgg tgatgttaaa ttaacacagt ctatggccat 300

catacgttat atagctgaca agcacaacat gttgggtggt tgtccaaaag agcgtgcaga 360

gatttcaatg cttgaaggag cggttttgga tattagatac ggtgtttcga gaattgcata 420

tagtaaagac tttgaaactc tcaaagttga ttttcttagc aagctacctg aaatgctgaa 480

aatgttcgaa gatcgtttat gtcataaaac atatttaaat ggtgatcatg taacccatcc 540

tgacttcatg ttgtatgacg ctcttgatgt tgttttatac atggacccaa tgtgcctgga 600

tgcgttccca aaattagttt gttttaaaaa acgtattgaa gctatcccac aaattgataa 660

gtacttgaaa tccagcaagt atatagcatg gcctttgcag ggctggcaag ccacgtttgg 720

tggtggcgac catcctccaa aatcggatgg ttcaactagt ctggaagttc tgttccaggg 780

gcccatggaa gccagcccag catccgggcc ccgccacttg atggatccac acatcttcac 840

ttccaacttt aacaataata ttggacgccg ccagacctac ctgtgctacg aagtggagcg 900

cctggacaat ggcacctcgg tcaagatgga ccagcaccgg ggctttcttc acaaccaggc 960

taagaatctt ctctgtggct tttacggccg ccatgcggag ctgcgcttct tggacctggt 1020

tccttctttg cagttggacc cggcccagat ctaccgggtc acttggttca tctcctggag 1080

cccctgcttc tcctggggct gtgccgggga agtgcgtgcg ttccttcagg agaacacaca 1140

cgtgcgtctg cgtatcttcg ctgcccgcat ctatgattac gacaccgatt ataaggaggc 1200

actgcaaatg ctgcgggatg ctggggccca agtctccatc atgacctacg atgaatttaa 1260

gcactgctgg gacacctttg tggaccacca gggatgtccc ttccagccct gggatggact 1320

ggatgagcac agccaagccc tgagtgggcg tctgcgggcc attctccaga atcagggaaa 1380

cctggaagtt ctgttccagg ggcccctcga gcaccaccac caccaccacc accactaatt 1440

gattaatacc taggctgcta aacaaagccc gaaaggaagc tgagttggct gctgccaccg 1500

ctgagcaata actagcataa ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttg 1559

<210> 6

<211> 1559

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta gaaataattt 60

tgtttaactt taagaaggag atatacatat gtcccctata ctaggttatt ggaaaattaa 120

gggccttgtg caacccactc gacttctttt ggaatatctt gaagaaaaat atgaagagca 180

tttgtatgag cgcgatgaag gtgataaatg gcgaaacaaa aagtttgaat tgggtttgga 240

gtttcccaat cttccttatt atattgatgg tgatgttaaa ttaacacagt ctatggccat 300

catacgttat atagctgaca agcacaacat gttgggtggt tgtccaaaag agcgtgcaga 360

gatttcaatg cttgaaggag cggttttgga tattagatac ggtgtttcga gaattgcata 420

tagtaaagac tttgaaactc tcaaagttga ttttcttagc aagctacctg aaatgctgaa 480

aatgttcgaa gatcgtttat gtcataaaac atatttaaat ggtgatcatg taacccatcc 540

tgacttcatg ttgtatgacg ctcttgatgt tgttttatac atggacccaa tgtgcctgga 600

tgcgttccca aaattagttt gttttaaaaa acgtattgaa gctatcccac aaattgataa 660

gtacttgaaa tccagcaagt atatagcatg gcctttgcag ggctggcaag ccacgtttgg 720

tggtggcgac catcctccaa aatcggatgg ttcaactagt ctggaagttc tgttccaggg 780

gcccatggaa gccagcccag catccgggcc ccgccacttg atggatccac acatcttcac 840

ttccaacttt aacaataata acggacgccg ccagacctac ctgtgctacg aagtggagcg 900

cctggacaat ggcacctcgg tcaagatgga ccagcaccgg ggctttcttc acaaccaggc 960

taagaatctt ctctgtggct tttacggccg ccatgcggag ctgcgcttct tggacctggt 1020

tccttctttg cagttggacc cggcccagat ctaccgggtc acttggttca tctcctggag 1080

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actgcaaatg ctgcgggatg ctggggccca agtctccatc atgacctacg atgaatttaa 1260

gcactgctgg gacacctttg tggaccacca gggatgtccc ttccagccct gggatggact 1320

ggatgagcac agccaagccc tgagtgggcg tctgcgggcc attctccaga atcagggaaa 1380

cctggaagtt ctgttccagg ggcccctcga gcaccaccac caccaccacc accactaatt 1440

gattaatacc taggctgcta aacaaagccc gaaaggaagc tgagttggct gctgccaccg 1500

ctgagcaata actagcataa ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttg 1559

Claims

1. 一种人工改造的胞嘧啶脱氨酶，其特征在于：所述的胞嘧啶脱氨酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.2、3所示的eA3A-1、eA3A-2。

2.一种脱氨酶辅助的DNA中5-羟甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法，其特征在于：包含如下步骤：

（1）对待检DNA进行变性处理使其形成单链DNA；

（2）分别用权利要求1中所述的胞嘧啶脱氨酶eA3A-1、eA3A-2对单链DNA进行脱氨基处理；

（3）脱氨后的样品进行PCR扩增；

（4）将PCR产物进行测序；

所述的方法用于非疾病诊断的目的。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，DNA变性处理的方法为：将DNA在90℃-95℃高温下孵育10-20分钟后转入冰浴2-5分钟。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，单链DNA进行脱氨基处理所使用的脱氨基反应缓冲液为20-30mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH为5.5-6.5；脱氨基反应的温度为35℃-37℃、反应时间为2-4小时。