CN117004717A - 一种特异性检测5hmC的方法 - Google Patents

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杨晓楠
黄建锋
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Abstract

本发明提供了一种特异性检测5hmC的方法，具体地，本发明的方法包括如下步骤：(a)提供一待测样本，将样本中的DNA打断，从而得到片段化DNA，所述片段化DNA含有碱基C、5mC和5hmC；(b)用β‑葡糖基转移酶处理所述片段化DNA，从而获得第一产物，所述第一产物包括带有β‑葡糖基的5hmC；(c)用胞嘧啶脱氨酶处理所述第一产物，将第一产物中的C与5mC脱氨基，转换为碱基U，从而获得第二产物，所述第二产物中的5hmC不转换为碱基U；(d)将所述第二产物进行扩增，碱基U转换为T之后对所述扩增产物进行检测；(e)分析步骤（d）获得的检测数据，从而特异性检测5hmC，非常具有应用前景。

Description

一种特异性检测5hmC的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种特异性检测5hmC的方法。
背景技术
DNA甲基化修饰是表观遗传研究的重点，DNA甲基化修饰主要是指基因组中的胞嘧啶的甲基化修饰。胞嘧啶呈以下五种状态：C，5mC, 5hmC, 5fC与5caC，其中C为未修饰状态，后面五种为甲基化修饰的不同状态。
目前业内将“DNA甲基化修饰”与“5mC”混为一谈，而目前研究5mC的金标准--BS技术其实不能分辨5mC与5hmC，得到的结果是5mC+5hmC之和。
因此，本领域迫切需要开发一种能够特异性检测5hmC的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够特异性检测5hmC的方法。
本发明第一方面提供了一种特异性检测5hmC的方法，所述方法包括步骤：
(a) 提供一待测样本，将样本中的DNA打断，从而得到片段化DNA，所述片段化DNA含有碱基C、5mC（5-甲基胞嘧啶-）和5hmC（5-羟甲基胞嘧啶）；
(b) 用β-葡糖基转移酶处理所述片段化DNA，从而获得第一产物，所述第一产物包括带有β-葡糖基的5hmC；
(c) 用胞嘧啶脱氨酶处理所述第一产物，将第一产物中的C与5mC脱氨基，转换为碱基U，从而获得第二产物，所述第二产物中的5hmC不转换为碱基U；
(d) 将所述第二产物进行扩增，碱基U转换为T之后对所述扩增产物进行检测；
(e) 分析步骤（d）获得的检测数据，从而特异性检测5hmC。
在另一优选例中，所述扩增包括全基因组线性扩增、利用随机引物的全基因组扩增、利用通用接头的全基因组扩增等。
在另一优选例中，所述步骤（d）中，还包括对所述第二产物进行扩增并标记荧光的步骤。
在另一优选例中，所述扩增产物带有荧光标记。
在另一优选例中，在步骤（e）中，通过分析所述的芯片检测数据，从而获得特异性检测5hmC的修饰水平结果。
在另一优选例中，所述步骤(b)和步骤(c)之间还包括DNA变性的步骤。
在另一优选例中，加入变性剂对DNA进行变性。
在另一优选例中，所述变性剂选自下组：甲酰胺（Formamide）、氢氧化钠（SodiumHydroxide）、或其组合。
在另一优选例中，所述DNA变性的步骤还包括对所述第一产物进行纯化的步骤。
在另一优选例中，所述纯化方法包括：磁珠纯化、纯化柱纯化、2％的琼脂糖胶电泳纯化。
在另一优选例中，所述第一产物还包括未带有β-葡糖基的C与5mC。
在另一优选例中，所述第二产物还包括转换为碱基T的C与5mC、以及未转换为碱基T的5hmC。
在另一优选例中，所述胞嘧啶脱氨酶选自下组：APOBEC3A、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3C 、APOBEC3E、或其组合，其中优选为APOBEC3A。
在另一优选例中，所述胞嘧啶脱氨酶选自下组：人类APOBEC3A、小鼠 APOBEC1、人类 APOBEC2、APOBEC3C 、APOBEC3E、或其组合，其中优选为人类APOBEC3A。
在另一优选例中，所述胞嘧啶脱氨酶来自NEB（NEBNext® Enzymatic Methyl-seqKit）试剂盒中的胞嘧啶脱氨酶。
在另一优选例中，所述方法不需要TET酶。
在另一优选例中，所述待测样本为基因组DNA样品或游离核酸（cfDNA）样品。
在另一优选例中，所述待测样品选自下组：细胞、组织、血液、尿液或其他体液样本。
在另一优选例中，在步骤(a)中，利用物理或化学或酶处理等方法将DNA片段化，优选超声波将样本中的DNA打断。
在另一优选例中，在步骤(a)中，利用超声波DNA破碎仪(covarisS220)将样本中的DNA打断。
在另一优选例中，所述片段化DNA的长度为200-1000bp，较佳地，300-700bp，更佳地，400-600bp。
在另一优选例中，所述甲基化芯片包括Illumina 850K甲基化芯片（Infinium®MethylationEPIC BeadChip）与Illumina 935K甲基化芯片（Infinium® MethylationEPICBeadChip v2）以及类似甲基化芯片产品。
在另一优选例中，在步骤（d）中，用选自下组的一种或多种技术进行检测：基因芯片、二代或三代等高通量测序。
在另一优选例中，所述基因芯片包括甲基化芯片、启动子基因芯片。
在另一优选例中，所述的检测方法是非诊断性和非治疗性的方法。
本发明第二方面提供了一种特异性检测5hmC的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i) β-葡糖基转移酶；
(ii) 胞嘧啶脱氨酶；
(iii) 基因芯片。
在另一优选例中，所述基因芯片包括甲基化芯片、启动子基因芯片。
在另一优选例中，所述甲基化芯片包括Illumina 850K甲基化芯片（Infinium®MethylationEPIC BeadChip）与Illumina 935K甲基化芯片（Infinium® MethylationEPICBeadChip v2）以及类似甲基化芯片产品。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书记载用本发明第一方面所述的方法进行检测。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明方法所得到的一对肿瘤及癌旁样本的5hmC修饰在一段染色体区域中的分布结果。如图可见，5hmC的修饰数据稳定而不杂乱，肿瘤样本中的5hmC水平普遍高于癌旁样本。
图2自上而下分别显示了本发明方法所得到的肿瘤及癌旁样本的5hmC、5mC（常规的亚硫酸盐方法数据减5hmC结果得到）的差异值。可见肿瘤中的5hmC基本上都处于丢失状态（负值），只有极少数的正值，而5mC的差异却有正有负。如果数据误差很大的话，相邻位点的数据值会出现较大的波动，而体现出参差不齐的表现。从以上数据分布可见，参差不齐的情况很少，数据结果很稳定。
图3显示了本发明利用芯片技术代替测序技术，从而在技术重复和稳定性上的优势。A分别为测序在10×和30×深度下的技术重复散点图，可见在10×深度下，技术重复性很差，很多误差超过20%的点。而30×深度下重复性也不好，也有很多误差超过20%的点。B为芯片平台的技术重复散点图，可见其重复性很好，大部分误差都在5%以内。C为直接将芯片与测序技术对比两都的重复性，可见在1~10，10~20×深度下，测序结果呈现出断点状态，20~30×深度下测序的误差也很大，直到50~300×深度下测序依然存在较大的误差。由此可见，芯片技术对于低深度的测序技术，在重复性和稳定性上有着很大的优势。
图4显示了利用甲基化芯片技术平台，对同一份样本进行5hmC检测的两次技术重复数据，在一段染色体上展示的结果。可见5hmC并不像之前所认为的那样，含量很低，而是虽然平均值低，但在不同的位点有着不同的含量值，也存在着个别位点有较高的5hmC值。在两次技术重复间，可见数据的一致性很好，也显示了芯片技术在重复性和稳定性上的优势。
图5显示了利用甲基化芯片技术平台，对同一份样本进行5hmC检测的两次技术重复数据，的散点图结果。每个点代表一个探针，其X轴与Y轴的数值分别代表两个技术重复。可见大部分的点都在对角线上，说明两次技术重复间的差异很小，本技术具有很好的稳定性与重复性。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，首次开发了一种能够特异性检测5hmC的高通量全基因组芯片分析方法，本发明通过先通过T4 β-葡糖基转移酶（βGT）将5hmC转化成5ghmC，从而保护起来。再用胞嘧啶脱氨酶（比如APOBEC3A (A3A)酶）将C与5mC脱氨基，而受保护的5ghmC不会被突变的胞嘧啶脱氨酶（比如APOBEC3A (A3A)酶）脱氨基，测序时C与5mC变成T，而5hmC仍为C。这样，可将5hmC与C及5mC区分开来，实现特异性检测5hmC，并且具有很高的灵敏度，基于芯片检测的特点，每次进入杂交的分子拷贝数可达上百万（>100μg扩增基因组DNA），而基于测序的WGBS技术受成本所限一般只能达到10-30×的深度，因为统计的分子数太少而经常会随机出现较大的误差。本发明将5hmC的APOBEC酶转化与芯片技术相结合，得到的甲基化检测结果具有很好的重复性，可达到误差小于5% 。在此基础上，本发明人完成了本发明。
特异性检测5hmC的方法
在本发明中，提供了一种特异性检测5hmC的方法，所述方法包括步骤：
(a) 提供一待测样本，将样本中的DNA打断，从而得到片段化DNA，所述片段化DNA含有碱基C、5mC（5-甲基胞嘧啶-）和5hmC（5-羟甲基胞嘧啶）；
(b) 用β-葡糖基转移酶处理所述片段化DNA，从而获得第一产物，所述第一产物包括带有β-葡糖基的5hmC；
(c) 用胞嘧啶脱氨酶处理所述第一产物，将第一产物中的C与5mC脱氨基，转换为碱基U，从而获得第二产物，所述第二产物中的5hmC不转换为碱基U；
(d) 将所述第二产物进行扩增，碱基U转换为T之后对所述扩增产物进行检测；
(e) 分析步骤（d）获得的检测数据，从而特异性检测5hmC。
在一优选实施方式中，本发明的方法包括如下步骤：
1.DNA随机打断
超声Covaris S220仪器将基因组DNA打断至300-700bp片段长度。
2.利用Beta-GT糖基化转移酶将5hmC转移上一个beta葡萄糖基。
3.DNA变性
将上述转移了beta葡萄糖基的DNA，用磁珠或过柱纯化后进行变性，可加入1/4体积的甲酰胺（Formamide） 或0.1 N 氢氧化钠（Sodium Hydroxide）变性。
4.APOBEC酶进行胞嘧啶脱氨基反应，将上述反应产物纯化后即得到5hmC转化后的DNA产物。
5.将上述产物按照Illumina 850K甲基化芯片（Infinium® MethylationEPICBeadChip）与Illumina 935K甲基化芯片（Infinium® MethylationEPIC BeadChip v2）以及类似甲基化芯片产品的标准操作流程，进行芯片实验。简而言之，是将上述反应产物依次进行如下步骤：碱变性，全基因组扩增，片断化，沉淀扩增产物，重悬与芯片杂交，洗涤，延伸，染色，扫描。最终得到芯片数据结果。
特异性检测5hmC的试剂盒
本发明还提供了一种特异性检测5hmC的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i) β-葡糖基转移酶；
(ii) 胞嘧啶脱氨酶；
(iii)基因芯片。
本发明的主要优点包括：
(1) 本发明首次公开了一种能够特异性检测5hmC的方法，本发明通过先通过T4β-葡糖基转移酶（βGT）将5hmC转化成5ghmC，从而保护起来。再用胞嘧啶脱氨酶（比如APOBEC3A (A3A)酶）将C与5mC脱氨基，而受保护的5ghmC不会被胞嘧啶脱氨酶（比如APOBEC3A (A3A)酶）脱氨基，测序时C与5mC变成T，而5hmC仍为C。这样，可将5hmC与C及5mC区分开来，实现特异性检测5hmC，并且具有很高的灵敏度，可达到误差<5%。
（2）本发明的方法不需要TET酶的应用。
（3）本发明的方法还可以用捕获测序或全基因组测序检测，也可以获得本发明的类似效果。
（4） 本发明所用的芯片会得到很好的数据稳定性。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非有特别说明，否则实施例所用的材料均为市售产品。
本发明的胞嘧啶脱氨酶是NEB（NEBNext® Enzymatic Methyl-seq Kit）的商品化酶：APOBEC。
通用方法
将基因组DNA（购自zymo resherch）片段化至200-700bp长度。用β-葡糖基转移酶处理所述片段化DNA，从而获得第一产物，将5hmC用β-葡糖基进行保护。再用胞嘧啶脱氨酶（APOBEC酶）进行处理，将DNA中的C与5mC脱氨基，转换为碱基U，从而获得第二产物，所述第二产物中的5hmC保持不变。再对上述产物进行全基因组线性扩增及荧光标记，用甲基化芯片对标记产物检测，其结果为特异性5hmC修饰。
1、DNA打断
取500ng~2ug基因组DNA（购自zymo resherch），按照以下条件（如表1所示）设置超声波破碎仪Covaris S220仪器，进行gDNA的片段化。目的片段大小范围：200-700bp
表1
2、β-葡糖基转移酶将糖基转移到5hmC的羟基上。
按照表2配制反应条件：37℃，过夜。
表2
3、纯化糖基化产物
利用QIAGEN的DNA回收柱纯化上述反应产物：QiaQuick PCR Purification Kit：（预先加入60ul 去离子水至上述反应结束的PCR管中，终体积为80ul）
3.1 吸取 5 倍体积（400 μL）Buffer PB 加入到上述终体积为80μl的糖基化反应产物 -中，涡旋震荡 6 次，每次 3 秒，瞬时离心将反应液收集至管底。
3.2 把 QIAquick column 放入 2 mL collection tube，将混合液转移至QIAquick column，13000 rpm 离心1 min，弃废液，将 QIAquick column 放回 collectiontube。
3.2 向 QIAquick column 加入 750 μL 已加入乙醇配制好的 Buffer PE，13000rpm 离心 1 min，弃废液， 将 QIAquick column 放回 collection tube。
3.4 13000 rpm 空转离心 1 min，弃废液。
3.5 将 QIAquick column 转移至新 1.5 mL EP 管中，打开 QIAquick column管盖，室温干燥 3 min，至QIAquick column 内外壁无液滴。
3.6 缓慢在 QIAquick column 滤膜中央加入 21 μL Buffer EB，静置 1 min，13000 rpm 离心 1 min，纯化后的连接产物即被收集在 1.5 mL EP 管中。
4、DNA的甲酰胺（Formamide）变性
4.1 PCR仪预热85℃。
4.2 加入4 ul的甲酰胺至16 ul的糖基化DNA中，涡旋混匀或吹吸10次，短暂离心。
4.3 上述反应液在PCR仪85 ℃孵育10 min。
4.4 反应结束立即置于冰上。
5、DNA的胞嘧啶脱氨基反应
将下列试剂直接加入20ul 变性DNA中，冰上操作，如表3所示：
表3
涡旋混匀，短暂离心。
PCR仪上37 ℃孵育 3 hour，4 ℃ hold。
6、纯化
充分涡旋重悬磁珠。每个样本加入100 ul 重悬的NEB Next SamplePurification Beads，吹吸10次混匀。室温下静置孵育至少5 min后，置于磁力架上静置至溶液澄清，约5min。小心去除上清液。PCR管保持在磁力架上，加入200 ul 的新鲜配制的80%的酒精洗两次，用10ul 枪头小心移除残余酒精。开盖，磁珠干燥约 3min后，将PCR管从磁力架取下，并加入16 ul 的Elution Buffer（white)洗脱磁珠。吹吸10次混匀，室温静置至少5min后，置于磁力架上3 min，至溶液澄清。吸取15 ul 的上清液至一个新的0.2 ml PCR管中。
得到5hmC转化产物，本产物DNA可按照Illumina 甲基化芯片的标准流程进行操作以得到甲基化芯片检测结果。
结果
1. 5hmC甲基化总表。
经850K或935K芯片检测后，实验结果被统计成表格，如表4所示，可得到各实验样本的全基因组中约85万个CpG位点的5hmC修饰甲基化值（β值）。为了方便理解，通过图1与图2展示一对肿瘤与癌旁样本的5hmC修饰的β值，以2号染色体的一段进行展示，纵坐标为5hmC的β值，横坐标为各CpG位点在染色体上的位置。
表4
2. 芯片会得到很好的数据稳定性。
由于本方法经酶处理得到5hmC转化的DNA后，采用芯片方法进行检测。而芯片方法具有上样量大的特点。一张杂交可上样80-100ug的标记产物，以每个拷贝的人类基因组6pg计算，进行杂交的基因组拷贝数超过10^7，虽然大部分并没有杂交到探针上，但真正产生信号的分子数量仍是非常大的。而测序每次测序的正常数据量下，拷贝数仅约10-30。由于β值的计算的准确度与纳入统计的分子数密切相关，甲基化测序的深度受到成本的影响，深度大多数仅10-30，所以得到的β值会因为随机纳入的分子比例变化而产生较大的误差。芯片数据则不受到纳入统计分子数量导致误差的影响（图3，A-C）。
对同一份样本的两次技术重复进行比较分析，统计两次技术重复间的差异值（Δβ值），在865919个探针中，Δβ>0.05的探针总数为43542个，占5.03%。可以近似的认为约95%的探针在两次技术重复中差异在0.05以内。
除了以上的数据统计外，也可通过图形展示直观地查看甲基化芯片技术平台的稳定性。将5hmC检测的两次技术重复数据，在一段染色体上展示的结果可见，在两次技术重复间的数据保持了很好的一致性，也显示了芯片技术在重复性和稳定性上的优势。（图4）
此外，还可通过散点图展示甲基化芯片技术平台两次技术重复数据的稳定性。在散点图中的每个点代表一个探针，其X轴与Y轴的数值分别代表两个技术重复。可见大部分的点都在对角线上，说明两次技术重复间的差异很小，本技术具有很好的稳定性与重复性。（图5）
3. 芯片方法可以方便的与配套数据进行研究。
因为芯片是固定的探针，所以每张芯片产出的数据都是一致的，所以非常适合将不同的数据进行比较分析。例如相同的样本可以同时做常规的甲基化分析，得到5mC+5hmC的结果，这个结果与5hmC相减则得到5mC的结果。同理5mC差异位点的结果也可以类似方法得到。芯片数据得到的不同甲基化修饰的结果很稳定可靠。
4. 芯片方法相比测序成本更低。
目前的WGBS测序方法常规测序90G数据量，深度约为20X，价格约为芯片的2倍，虽然能得到更多的甲基化位点，但数据重复性差，会有很多的假阳性位点干扰数据质量。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种特异性检测5hmC的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a) 提供一待测样本，将样本中的DNA打断，从而得到片段化DNA，所述片段化DNA含有碱基C、5mC（5-甲基胞嘧啶-）和5hmC（5-羟甲基胞嘧啶）；
(b) 用β-葡糖基转移酶处理所述片段化DNA，从而获得第一产物，所述第一产物包括带有β-葡糖基的5hmC；
(c) 用胞嘧啶脱氨酶处理所述第一产物，将第一产物中的C与5mC脱氨基，转换为碱基U，从而获得第二产物，所述第二产物中的5hmC不转换为碱基U；
(d) 将所述第二产物进行扩增，碱基U转换为T之后对所述扩增产物进行检测；
(e) 分析步骤（d）获得的检测数据，从而特异性检测5hmC；
所述胞嘧啶脱氨酶来自NEB（NEBNext® Enzymatic Methyl-seq Kit）试剂盒中的胞嘧啶脱氨酶，在步骤（d）中，用以下技术进行检测：基因芯片。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)和步骤(c)之间还包括DNA变性的步骤。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，加入变性剂对DNA进行变性。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述变性剂选自下组：甲酰胺（Formamide）、氢氧化钠（Sodium Hydroxide）、或其组合。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法不需要TET酶。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述片段化DNA的长度为200-1000bp。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述片段化DNA的长度为300-700bp。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述片段化DNA的长度为400-600bp。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因芯片包括甲基化芯片、启动子基因芯片。
10.一种特异性检测5hmC的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(i) β-葡糖基转移酶；
(ii) 胞嘧啶脱氨酶，所述胞嘧啶脱氨酶来自NEB（NEBNext® Enzymatic Methyl-seqKit）试剂盒中的胞嘧啶脱氨酶；
(iii) 基因芯片。
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