CN104928351A - 一种硼酸介导的聚合酶链反应检测dna中5-羟甲基胞嘧啶的方法和试剂盒 - Google Patents
一种硼酸介导的聚合酶链反应检测dna中5-羟甲基胞嘧啶的方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明一种硼酸介导的聚合酶链反应检测DNA中5-羟甲基胞嘧啶的方法和试剂盒。本发明结合葡萄糖基化反应，利用硼酸及其衍生物试剂可与葡萄糖基化5-羟甲基胞嘧啶中的邻二醇发生的共价作用，显著增加被复制碱基单元的体积，有效抑制聚合酶扩增反应的特点，提出硼酸介导的DNA聚合酶链扩增反应，可特异性地识别特定基因/片段中的5-羟甲基胞嘧啶。在此基础上，发展了一种快速、灵敏测定5-羟甲基胞嘧啶的试剂盒，可应用于各种细胞分析；与传统的检测试剂盒相比，该方法不受酶切位点限制，可适用于各种序列中5-羟甲基胞嘧啶的分析鉴定。本试剂盒具有广阔的应用前景，对于进一步阐明5-羟甲基胞嘧啶的生物学功能具有十分重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体是一种快速、准确、高效检测和定位特定基因/片段中5-羟甲基胞嘧啶的方法和试剂盒。
背景技术
5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）是继5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）之后发现的第六种碱基，已在多种哺乳动物组织和细胞中检出。与5mC相比，5hmC的含量更低（2009年，Heintz研究组利用薄层色谱和质谱等分析方法，在人、小鼠大脑以及胚胎干细胞中检测到5hmC，皮质和脑干区5hmC表达丰富，浦肯野细胞中5hmC的含量约占总核苷酸的0.6%，在颗粒细胞中约占0.2%；S.Kriaucionis，N.Heintz，Science，2009，324：929-930），但5hmC也同样具有非常重要的生物学功能。
现有的研究已经表明5hmC和TETs参与了基因组重新编程、基因表达的转录调控，并在DNA去甲基化过程中发挥重要作用。2011年，研究发现TET蛋白可将5hmC转变成5-甲酰胞嘧啶（5-formylcytosine，5fC）和5-羧基胞嘧啶（5-carboxylcytosine，5caC）。此两种碱基修饰产物都可以在基因组DNA中检测到，并且5hmC、5fC和5caC的基因组含量与TET蛋白的表达量有关。5fC和5caC的发现提示了一种新的主动去甲基化通路（5mC→5hmC→5caC→C），为研究DNA去甲基化作用及生理功能指明了方向。5mC首先氧化为5hmC，并进一步氧化为5fC和5caC（S.Ito，L.Shen，Q.Dai，S.C.Wu，L.B.Collins，J.A.Swenberg，C.He，Y.Zhang，Science，2011，333：1300-1303）。而5fC和5caC可被一种重要的胸腺嘧啶DNA糖基化酶（Thymine DNA Glycosylase，TDG）识别并切除，形成非碱基位点，最后通过碱基切除修复通路将非碱基位点修复为正常的胞嘧啶。令人感到意外的是，DNA修复通路不仅负责细胞内的DNA损伤的消除而且参与DNA主动去甲基化。再次证明了DNA修复的重要性（Y.F.He，B.Z.Li，Z.Li，P.Liu，Y.Wang，C.He，G.L.Xu，et al.，Science，2011，333：1303-1307）。另外，Xu研究组发现TETs蛋白家族中的TET3在卵细胞重新编程过程中也起到了重要作用（T.P.Gu，F.Guo，H.Yang，G.L.Xu，Nature，2011，477：606-U136）；目前，大量的研究显示5hmC是5mC在去甲基化过程中的一种重要的中间体，实际上，基因组中5hmC含量较低，与推断其是一种短暂产生的中间体是相一致的。另外，5hmC在基因 调控元件区具有独特的分布特点，研究发现5hmC和5mC都高度富集于基因内部，尤其是外显子区，只有5hmC在转录起始位点、5’非编码区富集，在其他基因转录调控元件区如增强子、启动子区域等5hmC表达水平较5mC相对高。综上，5hmC的生物学功能还不是很明确，但是可以确定的是5hmC和TETs在全基因组的表观遗传重组和组织特异性基因表达的调控中起到了非常重要的作用。另外，5hmC可能与特定肿瘤的发生密切相关，有可能成为肿瘤早期诊断的生物标志物。
对5hmC生物学功能的研究离不开高灵敏度、高特异性、高通量的检测方法。相对于基因组中含量较高的5mC，5hmC含量较低，且两者结构相似，导致传统的用于5mC的检测方法不能应用于5hmC的检测分析。例如，经典的重亚硫酸盐测序法。基因组DNA经重亚硫酸盐处理后，未甲基化的胞嘧啶可通过脱氨基和脱磺酸基作用转化为尿嘧啶（U），再经聚合酶链反应（PCR）扩增转变成胸腺嘧啶（T），而5mC经处理后不能转化为胞嘧啶（C），PCR扩增后仍为C，从而可将5mC与未修饰的C区分。但是，5hmC由于不能脱氨基而形成5-亚甲基磺酸胞嘧啶，在重亚硫酸盐测序中5hmC和5mC都不能脱氨基，从而PCR扩增后二者不能产生序列差异，即5mC和5hmC不能被区分。
基因水平5hmC的检测方法更是多种多样，以目前已经发展成为5hmC检测试剂盒的限制性内切酶酶解结合PCR技术为例，首先采用T4噬菌体β-葡萄糖转移酶（T4β-GT），在葡萄糖供体底物尿核苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glu）存在下，将葡萄糖基团转移至羟基位置，从而生成葡萄糖基化5-羟甲基胞嘧啶（5ghmC），使5hmC与胞嘧啶（C）、5mC完全区分开。在此基础上，进行限制性内切酶MspI酶解，由于葡萄糖基化反应后改变了此种限制性内切酶的酶切特性，使得含有5ghmC位点的序列在酶解之后得以保留，不含有5hmC位点的序列被酶解掉；通过PCR技术将保留序列进行扩增，从而达到特定基因水平检测5hmC的目的。该检测试剂盒受到了酶切位点的限制，即5ghmC位点必须位于酶切位点上才能够被检测，且不能区分多位点的基因序列。
综上，发展5hmC的特异性检测方法以及相关的快速、准确检测试剂盒成了目前亟须解决的问题，对于5hmC在基因组中分布特点研究，以及对其生理学功能的深入探讨具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的更有效和简便的检测特定基因/片段中5hmC的方法和试剂盒。其检测结果为5hmC生物学功能研究，以及相关癌症发病机理研究提供科学依据。
在本发明的第一方面，提供一种检测特定基因/片段中5hmC的方法，包括下列步骤：
1.利用葡萄糖基化反应，将基因组DNA中5hmC转化成5ghmC，从而与5mC以及C相区分；
2.利用硼酸或其衍生物试剂和葡萄糖基邻位二醇之间的反应，引入阻碍DNA复制的基团，从而来抑制特定基因序列片段正常的PCR扩增，使PCR产率降低；另外，在葡萄糖基化反应基础上，不添加硼酸或其衍生物试剂，则特定基因/片段是正常的PCR扩增，从而在基因水平实现了对5ghmC的选择性识别；此过程采用实时荧光定量PCR技术检测硼酸或其衍生物试剂对DNA复制过程的影响（附图1）。
在一个优选例中，所述的基因组DNA需经过紫外分光光度计测定浓度（OD260/280比值在1.8-2.0范围内）和电泳检测（一条清晰的电泳条带，无明显拖尾）完整性。
在另一个优选例中，所述的实时荧光定量PCR反应程序包括：起始95℃预变性2分钟；循环程序：95℃变性15秒，57℃退火15秒，25℃延伸60秒，共40个循环。
在本发明的第二方面，提供一种检测特定基因/片段中5hmC的试剂盒，包括葡萄糖基化反应试剂、硼酸试剂、实时荧光定量PCR反应试剂、阳性对照探针和阴性对照探针。
在另一个优选例中，所述的葡糖糖基化反应试剂包括：T4噬菌体β-葡萄糖转移酶、葡萄糖供体底物尿核苷二磷酸葡萄糖、缓冲溶液。
在另一个优选例中，所述的硼酸试剂包括硼酸、苯硼酸、3-氯苯基硼酸、2-（2’-氯苄氧基）苯基硼酸、3-（单磺酰胺）苯硼酸以及其他可与邻二醇作用的硼酸类衍生物试剂。
在另一个优选例中，所述的实时荧光定量PCR反应试剂包括：Mix，其中含有热启动DNA聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷、氯化镁、反应缓冲液、荧光染料
在另一个优选例中，所述的阳性对照探针是在距离5’端第58位含有一个5ghmC位点长度为100个核苷酸的寡核苷酸双链（5ghmC-ds100mer）。
在另一个优选例中，所述的阴性对照探针是无任何修饰位点或在距离5’端第58位含有一个5mC或5hmC位点长度为100个核苷酸的寡核苷酸双链（C/5mC/5hmC-ds100mer）。
在本发明的第三方面，提供一种特异性识别5hmC的方法及试剂盒的用途。与传统的检测试剂盒相比，该方法不受酶切位点限制，可适用于各种细胞或组织的DNA或RNA不同序列基因5hmC的分析鉴定；进一步应用于阐明5hmC在基因组重新编程、基因表达的转录调控、DNA去甲基化、肿瘤形成以及诸多未知领域的生物学功能研究。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1为硼酸介导的聚合酶链反应检测5hmC技术原理图（灰色小球代表硼酸衍生物试剂的不同取代基团）；
图2为阳性对照探针（5ghmC-ds100mer）和阴性对照探针（5hmC-ds100mer）的UHPLC-MS/MS分析质谱图（检测5hmdC和5ghmdC的特征离子对分别为m/z258.2→142.1（a）和m/z420.2→304.1（b））；
图3为在阳性对照探针（5ghmC-ds100mer）扩增中，硼酸可特异性抑制DNA聚合酶的扩增活性（a，对照探针序列，其中修饰位点X表示C、5mC、5hmC或5ghmC，且距序列5’端第58位；下划线部分是PCR扩增所需上下游引物；b，硼酸对阳性对照探针PCR扩增过程中DNA聚合酶复制行为的影响，加入硼酸前（实线）后（虚线）PCR扩增曲线；c，无硼酸体系的PCR扩增情况；d，硼酸对阴性对照探针（C/5mC/5hmC-ds100mer）PCR扩增过程中DNA聚合酶复制行为的影响；其中ΔCt=Ct-Cto=加入硼酸反应后的Ct值-未加入硼酸的Ct值，下同；图中BA代表硼酸）；
图4为在阳性对照探针（5ghmC-ds100mer）扩增中，四种硼酸衍生物试剂可特异性抑制DNA聚合酶的扩增活性（a，硼酸前（实线）后（虚线）PCR扩增曲线；b，四种硼酸衍生物试剂所引起的抑制DNA聚合酶复制行为底物专一性考察，底物包括C、5mC、5hmC和5ghmC）；图5为检测阳性对照探针中5ghmC的定量分析（以硼酸衍生物试剂2-（2’-氯苄氧基）苯基硼酸（2-CB-PBA）处理后的样品为例：a和b，不同摩尔浓度比的阳性对照探针（5ghmC-ds100mer）和阴性对照探针（5hmC-ds100mer）混合模板与所产生的ΔCt值之间的线性关系；c，不同摩尔浓度比混合模板的PCR扩增产物凝胶电泳图，16%聚丙烯酰胺凝胶电泳）；
图6为采用硼酸介导的聚合酶链反应试剂盒检测小鼠胚胎干细胞基因组DNA中INTRON-PAX5基因三个扩增区域的5hmC水平（以2-CB-PBA为例；a，PAX5基因三个区域的ΔCt值变化，UTR-5_SRR作为定量PCR的内部参考基因；b，硼酸介导的聚合酶链法和化学标记-高通量5hmC测序法的相关性分析；c，MspI酶切法检测小鼠胚胎干细胞基因组DNA中INTRON-PAX5基因三个扩增区域的5hmC水平；“mESc”表示小鼠胚胎干细胞；“Glu”表示基因组DNA经过葡萄糖基化反应处理；Tet-KO表示双敲除Tet1和Tet2的小鼠胚胎干细胞基因组DNA）；
图7为采用硼酸介导的聚合酶链反应试剂盒检测小鼠胚胎干细胞基因组DNA中特异性基因扩增区域5hmC水平（以2-CB-PBA为例；UTR-5_SRR作为实时荧光定量PCR的内部参考基因；“mESc”表示小鼠胚胎干细胞；“Glu”表示基因组DNA经过葡萄糖基化反应处理；Tet-KO表示双敲除Tet1和Tet2的小鼠胚胎干细胞基因组DNA）。
具体实施方式
本试剂盒内设有：葡萄糖基化试剂、硼酸试剂、荧光定量PCR反应试剂。
为了方便使用和进行对比，本试剂盒内还设有阳性对照探针和阴性对照探针，这样可以准确地进行质量控制，方便快捷的得到检测结果。
以下实施例使用的葡萄糖基化试剂购自New England Biolabs公司，硼酸试剂购自Sigma公司，荧光定量PCR试剂和DNA提取试剂盒均购自Promega公司。
本发明所述的检测基因水平5hmC的具体方法如下（其中，未注明具体条件的实验方法按照常规的实验条件和方法，或按照制造厂商所建议的条件）：
葡萄糖基化反应及其葡萄糖转化效率检测：
基因组DNA的葡萄糖基化反应体系100μL，包括小鼠胚胎干细胞基因组DNA5.0μg，10×NEB缓冲溶液10.0μL，80.0μM葡萄糖供体底物4.0μL，40U T4噬菌体β-葡萄糖转移酶4.0μL，86.0μL无核酸酶水。37℃孵育18h。糖基化后，加入20mg/mL蛋白酶K1.0μL40℃孵育30分钟进行葡萄糖转移酶的失活，95℃加热10分钟失活蛋白酶K。接下来进行糖基化反应溶液的纯化，继续加入2倍反应液体积的冰乙醇，0.3倍反应液体积MgCl2，置于-20℃1.5h。采用4℃离心机12,000rpm离心20分钟，70%乙醇进行洗涤，晾干DNA，重溶于100mM磷酸盐缓冲溶液，最后采用Nano Drop2000进行浓度测定。
反应产物的葡萄糖转化效率检测。首先对DNA进行酶解处理：分别取DNA（以阳性对照探针为例，约2.0μg，400nmol/L）、DNase I（1U）、CIP（2U）和SVP（0.005U）于37℃反应24h；酶解后，产生的单核苷酶解产物经截留分子量为3000D的超滤管离心处理。鉴定工作主要采用Agilent6410B三重四极杆质谱仪（电喷雾离子源）完成。其中，主要的色谱条件为：流速：0.3mL/分钟；流动相：0.1%甲酸水：甲醇=95：5；色谱柱：Zorbax Eclipse PlusC18（2.1×100mm，1.8μm）；柱温：室温；酶解液进样10μL，分析时间10分钟；质谱条件：电离源温度300℃；电喷雾电压3500V；干燥气流速：9L/分钟；雾化气和干燥气均为高纯氮气；采用正离子电离模式；MRM多反应检测扫描。用于UHPLC-MS/MS分析的特征离子对有5hmC：m/z258.2→142.1和5ghmC：m/z420.2→304.1。
附图2显示，以阴性对照探针（5hmC-ds100mer）为例，葡萄糖基化反应前，在5hmC 特征离子对m/z258.2→142.1条件下，只观察到5hmC-ds100mer的色谱峰，对应保留时间为1.41分钟，葡萄糖基化反应后，得到的阳性对照探针5ghmC-ds100mer没有任何色谱峰出现；同样，在5ghmC特征离子对m/z420.2→304.1条件下，只有阳性对照探针5ghmC-ds100mer有色谱峰出现，对应保留时间为2.16分钟。可以推断5hmC已经转化为5ghmC，且转化效率接近100%。这对于接下来采用硼酸或其衍生物试剂识别5ghmC意义重大。
采用硼酸介导的聚合酶链反应试剂盒检测特定基因序列的5hmC：
本试剂盒的检测过程采用实时荧光定量PCR技术来完成。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过加入硼酸或其衍生物试剂之后Ct值和正常扩增Ct值之间的差值ΔCt来反应硼酸或其衍生物试剂对DNA聚合酶扩增活性的抑制作用，从而达到基因水平5hmC的检测分析。
下述实例中采用25.0μL PCR反应体系，其中包括终浓度10ng的纯化处理后糖基化基因组DNA，40mM硼酸或其衍生物试剂3.1μL，Master Mix12.5μL，10μM上下游引物各0.5μL，200mM磷酸盐缓冲液5.0μL，400mM NaCl溶液3.0μL，用无核酸酶水补齐至25.0μL。所用的PCR反应程序：起始95℃预变性2分钟；循环程序：95℃变性15秒，57℃退火15秒，25℃延伸60秒，共40个循环。
在阳性对照探针（5ghmC-ds100mer）扩增中，硼酸的加入可特异性抑制DNA聚合酶的扩增活性，加入硼酸导致Ct值增加（ΔCt=2.3），即荧光达到阈值的循环数增多，模板DNA量越少，说明了硼酸能够有效抑制DNA聚合酶的扩增活性，同时改变了DNA聚合酶的复制行为。这种硼酸介导的聚合酶链反应，可以通过观察实时荧光定量PCR过程Ct值的变化来考察扩增区域5ghmC的情况（附图3b）。另外，硼酸的加入只对阳性对照探针的PCR扩增产生影响（附图3b和3d）。
由于硼酸试剂的种类显著影响DNA聚合酶的扩增活性，本发明选取了四种含有不同取代基团的苯硼酸类试剂，都具有抑制DNA聚合酶扩增活性的效果，使得加入硼酸衍生物试剂前后PCR扩增曲线Ct值显著增加，ΔCt值变化范围是2.3-6.0（附图4a）。其中，加入2-（2’-氯苄氧基）苯基硼酸（2-CB-PBA）后，Ct值从最初的18.0增加到24.0，即ΔCt=6.0，表明与其他四种硼酸衍生物试剂相比，2-CB-PBA与5ghmC之间的相互作用最强，抑制效果最为显著，更适合于基因/片段中5hmC的定性鉴定。更为重要的是，这四种不同的硼酸衍生物试剂引起的ΔCt值变化有所不同，但是都只能对含有5ghmC的序列产生特异性识别，表明本试剂盒具有较强的底物专一性（附图4b）。
实施例1.采用硼酸介导的聚合酶链反应试剂盒检测基因组DNA特定基因序列的5hmC
本发明采用硼酸介导的聚合酶链反应试剂盒对富含5hmC的小鼠胚胎干细胞基因组DNA（5hmC含量为800个/106C）特定基因序列5hmC进行了鉴定分析。
采用本试剂盒检测到了一个5hmC高度富集的基因区域。在小鼠胚胎干细胞基因组DNA高通量测序（Illumina ChIP-Seq，GSE43262）结果中挑选B细胞转录因子相关基因PAX5的三个PCR扩增区域（INTRON_PAX5_1,INTRON_PAX5_2，INTRON_PAX5_3），同时选取UTR-5_SRR作为定量PCR的内部参考基因，针对不同的基因序列设计特异性引物，然后将该基因组DNA依次进行葡萄糖基化和2-CB-PBA处理，采用设计的特异性引物进行PCR扩增考察选取区域5hmC含量情况。PAX5基因是调控成熟B细胞功能的转录因子，并在人类肿瘤尤其是血液系统肿瘤中存在染色体异位、异常高频突变、异常甲基化等形式的异常表达。从检测结果上看（附图6a），PAX5基因中存在大量5hmC，其中5hmC的生物学功能还不是十分清楚。附图6b，化学标记-高通量测序结果显示选取的PAX5三个扩增区域的Peak值分别是246，798和1534，表明了5hmC在PAX5基因不同区域富集具有显著性差异；选取的内部参考基因UTR-5_SRR的Peak值是13。附图6a和图6b，硼酸介导的聚合酶链反应结果显示选取的PAX5三个扩增区域的ΔCt分别是1.5，3.6和7.5，5hmC的富集具有显著性差异；选取的内部参考基因UTR-5_SRR的ΔCt值是0.1。Tet1和Tet2双敲除和非糖基化样品ΔCt值保持不变。附图6b，对于小鼠胚胎干细胞基因组DNA的PAX5基因5hmC的检测，硼酸介导的聚合酶链法与化学标记-高通量测序法显著性相关（P=0.002＜0.01），相关性系数0.998。其中，采用硼酸介导的聚合酶链反应检测INTRON_PAX5_3区域，此扩增区域的PCR扩增曲线、熔解度曲线和PCR终产物的凝胶电泳谱图均表明2-CB-PBA的加入能够有效的抑制DNA聚合酶扩增活性。
在小鼠胚胎干细胞基因组DNA的高通量测序（Illumina ChIP-Seq，GSE43262）结果中挑选20个5hmC的Peak区域，共包含9种基因（包括多潜能性相关基因NANOG、SMAD5、SOX5和SOX6、基因组印记区域相关基因DLK1、GLI3和神经营养因子相关基因ALK、NTRK2）；在确定扩增区域之后，针对不同的基因设计特异性引物，然后将小鼠胚胎干细胞基因组DNA依次进行葡萄糖基化和2-CB-PBA处理，采用设计的特异性引物进行PCR扩增。附图7显示，经过葡萄糖基化和2-CB-PBA处理后的选定基因区域Ct值变化显著，ΔCt值变化范围是1.0-7.5，且未葡萄糖基化处理的对照组，ΔCt值变化范围是-0.6-0.4，再次可以推断Ct值的变化是2-CB-PBA处理和葡萄糖基化共同作用的结果，即通过检测5ghmC，实 现了5hmC的鉴定分析。
实施例2.5hmC的定量分析
以2-CB-PBA处理后的样品为例，将阴性对照探针（5hmC-ds100mer）和阳性对照探针（5ghmC-ds100mer）按照不同的比例进行混合，选择5ghmC：5hmC摩尔浓度比分别为：0:1、1:16、1:8、1:4、1:2、1:1、2:1、4:1和1:0，混合模板浓度保持在5.0nM。然后将此混合液作为PCR扩增模板，考察5ghmC-ds100mer浓度与ΔCt值之间的关系，从而能够通过PCR扩增曲线Ct值的变化来对5ghmC进行定量分析。附图5a和图5b所示，随着5ghmC浓度增加，ΔCt值从0增加到6.0，且两者之间满足线性关系：ΔCt=6.14+4.87log[5ghmC/ds100mer]（R2=0.97）。虽然ΔCt值增加，PCR扩增产物量却在逐渐减少（附图5c），这也说明了2-CB-PBA能够有效的抑制DNA聚合酶的复制。
实施例3.硼酸介导的聚合酶链反应试剂盒与限制性内切酶结合PCR检测试剂盒（即MspI酶解法）的比较
限制性内切酶MspI识别CCGG序列，通过葡萄糖基化处理，导致其酶切特异性发生改变：MspI识别并切割5mC和5hmC，但不能切割5ghmC；当5ghmC位点处于CCGG序列上，即将此前可以切割的5hmC位点转变为不可切割的5ghmC位点，从而通过PCR扩增使序列得以保留。因此，限制性内切酶法受到了酶切位点等多种条件的限制。
首先，以阳性对照探针（5ghmC-ds100mer）为PCR扩增模板，考察分别经过2-CB-PBA处理和MspI酶解后PCR扩增情况。探针在经过MspI酶解后，Ct值没有发生明显变化，即酶解处理不影响PCR扩增，这与合成探针中无CCGG位点不满足酶切条件的情况相符合；但是，模板经过2-CB-PBA处理后，Ct值显著增加，从而可以断定5ghmC位点的存在。综上，实验结果表明硼酸介导的聚合酶链反应试剂盒，除了具有较强的底物专一性之外，还不受酶切位点的限制，可以应用于任何序列5hmC的检测分析。
本发明在小鼠胚胎干细胞基因组DNA高通量测序（Illumina ChIP-Seq，GSE43262）结果中挑选B细胞转录因子相关基因PAX5的三个PCR扩增区域（INTRON_PAX5_1,INTRON_PAX5_2，INTRON_PAX5_3），同时选取UTR-5_SRR作为定量PCR的内部参考基因，针对不同的基因序列设计特异性引物，然后分别采用硼酸介导的聚合酶链反应和MspI酶解法考察选取区域5hmC含量情况。附图6c显示，选取的PAX5序列不含有CCGG特异性序列，在MspI酶解后，ΔCt没有发生明显变化（ΔCt＜0.7）；但是，扩增模板经过2-CB-PBA处理后，选取的PAX5三个区域的Ct值发生显著变化（ΔCt=1.5-7.5），表明了5ghmC位点的存在（与化学标记-高通量测序的结果是相一致的，见附图6b），再次证明了 MspI酶解法在检测基因水平5hmC的局限性。
通过以上的实例证明了本发明利用加入的硼酸或其衍生物试剂与葡萄糖邻位二醇之间的反应，来抑制DNA聚合酶的扩增活性，从而实现对不同基因序列中5hmC的特异性分析，该方法和相关试剂盒具有不受序列位点限制、准确、快速、灵敏度高等优点，具有广阔的应用前景。
Claims (7)
1.一种聚合酶链反应方法和一种试剂盒，可准确检测DNA中5-羟甲基胞嘧啶，其特征在于：
1）DNA片段中的5-羟甲基胞嘧啶可被葡萄糖基化；
2）非5-羟甲基胞嘧啶的DNA碱基不能被葡萄糖基化；
3）硼酸类化合物可与葡萄糖基化5-羟甲基胞嘧啶中的顺式邻二醇发生共价作用，并通过这种作用显著抑制含葡萄糖基化5-羟甲基胞嘧啶DNA片段的复制与扩增；
4）DNA的复制与扩增是通过聚合酶链反应；
5）如果DNA不含5-羟甲基胞嘧啶，其复制与扩增则不受硼酸类化合物的影响；
6）含5-羟甲基胞嘧啶DNA与不含5-羟甲基胞嘧啶DNA的检测分析。
2.基于权利要求1所述的方法与试剂盒，其检测依次包括以下步骤：
1）利用葡萄糖基化反应，将基因组DNA中5-羟甲基胞嘧啶转化成葡萄糖基化5-羟甲基胞嘧啶，从而与5-甲基胞嘧啶以及胞嘧啶相区分；
2）利用硼酸或其衍生物试剂和葡萄糖基邻位二醇之间的反应，引入阻碍DNA复制的基团，从而来抑制特定基因序列片段正常的聚合酶链反应，使反应产率降低；另外，在葡萄糖基化反应基础上，不添加硼酸或其衍生物试剂，则特定基因/片段是正常的聚合酶链反应，从而在基因水平实现了对5-羟甲基胞嘧啶的选择性识别；此过程可采用实时荧光定量聚合酶链反应检测硼酸或其衍生物试剂对DNA复制过程的影响。
3.基于权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，所述的聚合酶链反应方法与试剂盒需要硼酸或其衍生物试剂：硼酸、苯硼酸、3-氯苯基硼酸、2-（2’-氯苄氧基）苯基硼酸、3-（单磺酰胺）苯硼酸或其他可与邻二醇作用的硼酸类衍生物试剂。
4.基于权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒使用聚合酶链反应程序是：起始95℃预变性2分钟；循环程序：95℃变性15秒，57℃退火15秒，25℃延伸60秒，共40个循环。
5.基于权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括阳性对照探针和阴性对照探针。
6.基于权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，待测样品包括：
1）各种生物DNA；
2）同一种生物不同的组织或不同细胞DNA；
3)各种生物的线粒体DNA。
7.一种聚合酶链反应试剂盒的用途，其特征在于，所述的试剂盒可应用于各种生物、细胞、组织、各种序列中5-羟甲基胞嘧啶的检测分析；应用于阐明5-羟甲基胞嘧啶在基因组重新编程、基因表达的转录调控、DNA去甲基化、肿瘤形成以及诸多未知领域的生物学功能研究；应用于各种疾病诊断。
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