CN112004942A - 利用了rna修饰的分析、诊断方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供用于分析生物学状态或医学状态的新方法。本发明基于可以将RNA的修饰信息用于生物学状态或医学状态的分析中的发现，提供一种用于分析生物学状态或医学状态的新方法。本发明可以分析包括疾病在内的各种生物学状态或医学状态，可以充分预测早期癌症(例如胰腺癌、大肠癌、胃癌等)等。

Description

利用了RNA修饰的分析、诊断方法
技术领域
本发明涉及生物学对象的特征分析方法及分类。更详细而言，本发明涉及基于RNA上的修饰信息的生物学对象的分类及特征分析方法。
背景技术
核糖核酸(RNA)与脱氧核糖核酸(DNA)同样地为携带生物所具有的信息的分子。众所周知，DNA接受甲基化等修饰而控制其功能，近年来报道了在RNA上也发生修饰的例子。
为了分析包括疾病在内的各种生物学状态，尝试将DNA变异、mRNA表达量、蛋白质表达量等信息与生物学状态建立关联，但是，即使使用这些信息也不能充分预测早期癌症等的情况也较多。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Pagliarini DJ,Cell Metab.2016Jul 12；24(1):13-4.doi:10.1016/j.cmet.2016.06.018.
发明内容
用于解决问题的方案
本发明基于可以将RNA的修饰信息用于生物学状态或医学状态的分析中的发现，提供一种用于分析生物学状态或医学状态的新方法。
因此，本发明提供以下方案。
(诊断方法)
(项目A1)一种对对象的状态进行分析的方法，其包括：取得对象中的至少一种RNA上的修饰信息＜RNA mod＞的取得步骤；和基于该修饰信息分析该对象的状态的步骤。
(项目A2)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述RNA包括微小RNA。
(项目A3)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述修饰包括甲基化。
(项目A3-1)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述修饰包括核苷上的甲基化。
(项目A3-2)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述修饰包括核酸碱基上的甲基化。
(项目A4)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述RNA上的修饰包括微小RNA的甲基化。
(项目A4-1)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述RNA上的修饰信息包括微小RNA的核苷上的甲基化。
(项目A4-2)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述RNA上的修饰信息包括微小RNA的核酸碱基上的甲基化。
(项目A5)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述修饰为m6A。
(项目A6)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述修饰信息包括修饰位置信息。
(项目A7)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述修饰信息包括经修饰的RNA的量的信息。
(状态)
(项目A8)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述状态为医学状态或生物学状态。
(项目A9)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述状态为上述对象中的微生物(例如肠内细菌、表皮细菌)的状态。
(项目A10)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述生物学状态为老化或细胞的分化状态。
(项目A11)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述医学状态包括癌症、炎症性肠病或肠道免疫。
(项目A12)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述癌症包括胰腺癌(例如早期胰腺癌)、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、胃癌及结肠癌中的至少一种。
(项目A13)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述状态为上述对象对药剂或处置的反应性。
(药剂、处置)
(项目A14)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述处置为放射线处置或手术。
(项目A15)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述处置为利用重粒子射线(例如Carbon/HIMAC)或X射线的处置。
(项目A16)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述药剂为抗癌剂、分子靶向药、抗体药物、生物制剂(例如核酸、蛋白质)、或抗生素。
(项目A17)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述药剂为Lonsurf(TAS102)、吉西他滨、CDDP、5-FU、西妥昔单抗、核酸药物或组蛋白脱甲基化酶抑制剂。
(项目A18)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述药剂为抗癌剂，上述反应性包括上述对象是否具有对该抗癌剂的抗性的反应性。
(项目A19)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，基于上述反应性，示出用于处置上述对象的药剂和/或对上述对象的处置。
(项目A20)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，基于关于多个药剂的上述反应性，从该多个药剂中示出用于处置上述状态的药剂。
(项目A21)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述分析基于上述药剂的给药或上述处置的前后的、上述对象的上述修饰信息的比较。
(周边信息)
(项目A22)根据上述项目中任一项所述的方法，其包括还基于选自由下述信息组成的组中的至少一种信息分析上述对象的上述状态的步骤，所述信息为上述对象的年龄、性别、人种、血统信息、病史、治疗史、吸烟状态、饮酒状态、职业信息、生活环境信息、疾病标志物信息、核酸信息(包括上述对象中的细菌的核酸信息)、代谢物信息、蛋白质信息、肠内细菌信息、表皮细菌信息及这些中的任意者的组合。
(项目A23)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述核酸信息选自由基因组信息、表观遗传信息、转录组的表达量信息、RIP测序信息、微小RNA的表达量信息及这些中的任意者的组合组成的组。
(项目A24)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述RIP测序信息包括抗药泵P-糖蛋白的RIP测序信息。
(项目A25)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述RIP测序信息包括上述对象的粪便的RIP测序信息。
(项目A26)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述RIP测序信息包括上述对象的粪便中的大肠杆菌的RIP测序信息。
(关于修饰信息的附加信息)
(项目A27-1)根据上述项目中任一项所述的方法，其包括下述步骤：还基于耐受药剂或处置的抗性株、或该抗性株与该抗性株所来源的细胞株的组合中的上述RNA上的修饰信息分析上述对象的上述状态。
(项目A27-2)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述药剂或处置包括利用Lonsurf(TAS102)、吉西他滨、CDDP、5-FU、西妥昔单抗、核酸药物、组蛋白脱甲基化酶抑制剂、或重粒子射线(例如Carbon/HIMAC)或X射线的处置。
(项目A28)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，对至少2000种RNA上的修饰信息进行分析。
(项目A29)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，包括基于多个上述修饰信息计算上述状态的概率的步骤。
(项目A30)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述修饰信息包括包含相同序列的RNA上的多个修饰信息。
(项目A31)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，包括还基于RNA的结构信息分析上述对象的上述状态的步骤。
(项目A32-1)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，包括还基于生物中的RNA的修饰信息分析上述对象的上述状态的步骤，所述生物被敲除了甲基化酶(例如Mettl3、Mettl14、Wtap)、脱甲基化酶(例如FTO、AlkBH5)及甲基化识别酶(例如YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3等具有YTH结构域的家族分子)中的至少一种。
(项目A32-2)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，包括还基于甲基化酶(例如Mettl3、Mettl14、Wtap)、脱甲基化酶(例如FTO、AlkBH5)及甲基化识别酶(例如YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3等具有YTH结构域的家族分子)中的至少一个识别基序信息分析上述对象的上述状态的步骤。
(项目A33)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，包括进行主成分分析的步骤。
(试样)
(项目A34)＜用市售试剂盒得到的试样分析服务＞
根据上述项目中任一项所述的方法，其中，由交付的上述对象来源的试样取得上述修饰信息。
(项目A35)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述试样是被冷冻运输的。
(项目A36)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，将在现场从上述对象取得的试样在现场进行分析。
(项目A37-1)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述试样包括血液、活组织检查试样(例如液体活组织检查试样)、口腔粘膜、唾液、汗、泪液、尿、粪便或皮肤表皮中的至少一种。
(项目A37-2)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述RNA包括上述对象中的微生物来源的RNA。
(纯化)
(项目A38)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，包括利用纯化手段纯化上述RNA的步骤。
(项目A39)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，包括对修饰RNA进行纯化的步骤。
(项目A40)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述纯化手段包含与上述RNA至少部分互补的核酸。
(项目A41)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述纯化手段包括抗体。
(项目A42)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述抗体对上述修饰为特异性的。
(项目A43)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述抗体对上述RNA为特异性的。
(项目A44)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述抗体对经修饰的上述RNA为特异性的。
(项目A45)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述纯化手段配置在平板的规定位置。
(项目A46)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述平板的规定位置通过蒙特卡罗法(Monte Carlo method)来决定。
(测定手段)
(项目A47)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，通过PCR取得上述修饰信息。
(项目A48)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，通过质谱取得上述修饰信息。
(项目A49)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，通过MALDI-MS取得上述修饰信息。
(测定的预处理)
(项目A50)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，包括用溴乙醛或氯乙醛处理上述RNA的步骤。
(项目A51)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，使用包含3-羟基吡啶甲酸的涂布剂。
(食品的检查方法)
(项目B1)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述对象为食品。
(项目B2)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述食品为肉。
(项目B3)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述对象的状态为食品的品质。
(项目B4)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述食品的品质为食品的产地、年龄、加工后经过时间、加工后变性、味道品质、活性氧状态、脂肪酸状态或成熟度。
(项目B5)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，包括还基于代谢物的信息分析上述对象的上述状态的步骤。
(种属分类方法)
(项目C1)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述状态为种属分类。
(项目C2)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述状态为微生物种群中的至少一种微生物的种属分类。
(项目C3)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述状态为曲酵母的种属分类。
(系统)
(项目D1)一种系统，其为用于基于RNA的修饰信息判定对象的状态的系统，其包括：
测定RNA的修饰状态的测定部；
基于该测定的结果计算RNA上的修饰状态的计算部；和
基于该修饰状态对该对象的状态进行分析、判定的分析/判定部。
(项目D2)根据上述项目中任一项所述的系统，其中，上述测定部为质谱仪。
(项目D3)根据上述项目中任一项所述的系统，其中，上述测定部为MALDI-MS。
(项目D4)根据上述项目中任一项所述的系统，其包含项目A2～A12中任一项所述的特征。
(测定设备(平板))
(项目E1)一种设备，其为用于基于RNA的修饰信息判定对象的状态的设备，
该设备包括配置部，其用于配置由来自该对象的试样纯化出的至少一种RNA，
该配置部以通过检测器进行读取的方式提供该至少一种RNA上的修饰信息的方式而构成，
基于该修饰信息判定该对象的该状态。
(项目E2)根据上述项目中任一项所述的设备，其用于质谱。
(项目E3)根据上述项目中任一项所述的设备，其用于MALDI-MS。
(浓缩用珠)
(项目F1)一种组合物，其为用于纯化RNA以基于RNA的修饰信息判定对象的状态的组合物，
该组合物包含用于捕捉该对象中的至少一种RNA的手段，
所捕捉的该RNA的特征在于，通过被检测器读取而提供该RNA上的修饰信息，
基于该修饰信息判定该对象的状态。
(项目F2)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述手段包含与上述RNA至少部分互补的核酸。
(项目F3)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述手段为用于捕捉经修饰的RNA的手段。
(项目F4)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述手段包含对经修饰的RNA为特异性的分子。
(项目F5)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述手段包含对经修饰的上述RNA为特异性的分子。
(项目F6)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述分子包含抗体。
(项目F7)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述手段包含有磁性的载体。
(试剂盒)
(项目H1)一种试剂盒，其为用于基于RNA的修饰信息判定对象的状态的试剂盒，
该试剂盒包含上述项目中任一项所述的组合物及用于由该对象取得试样的仪器中的至少一者、以及使用该组合物及仪器中的至少一者的说明书。
(项目H2)根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其还包括上述项目中任一项所述的设备。
(项目H3)根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其还包括用于涂布在RNA上的涂布剂，所述RNA配置于上述设备。
(项目H4)根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其中，上述涂布剂包含3-羟基吡啶甲酸。
(项目H5)根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其示出上述试样的交付地址。
(项目H6)根据上述项目中任一项所述的试剂盒，其中，上述试样包括血液、液体活组织检查试样等活组织检查试样、口腔粘膜、唾液、汗、泪液、尿、粪便或皮肤表皮中的至少一种。
(程序)
(项目I1)一种程序，其为用于基于RNA的修饰信息判定对象的状态的程序，该程序以执行下述步骤的方式构成，所述步骤为：将该对象的至少一种RNA上的修饰信息与该RNA的参照修饰信息进行比较的步骤；和基于该进行比较的步骤的输出结果判定该对象的该状态的步骤。
(项目I2)根据上述项目中任一项所述的程序，其中，上述参照修饰信息基于不同于上述对象的对象中的上述RNA上的修饰信息而构成。
(项目I3)根据上述项目中任一项所述的程序，其中，上述参照修饰信息为在与上述修饰信息不同的时刻取得的上述对象的上述RNA上的修饰信息。
(抗性株的利用方法)
(项目J1)一种用于确定与对药剂的抗性相关的RNA的修饰信息的方法，该方法包括取得对该药剂具有抗性的细胞株来源的至少一种RNA上的修饰信息的步骤，所述方法在比较具有该抗性的细胞株与来自具有该抗性的细胞株的细胞株之间的上述RNA上的修饰信息、观察差异时，确定该RNA上的该修饰信息与对该药剂的抗性有关。
(项目J2)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，确定多个RNA上的多个修饰信息的差异的组合与对上述药剂的抗性有关。
本发明中，意图在上述一个或多个特征的明示的组合的基础上可提供进一步的组合。若根据需要阅读并理解以下的详细说明，则本领域技术人员可获知本发明的进一步的实施方式及优点。
发明的效果
根据本发明，可以基于RNA的修饰信息通过不同于以往的方法分析、预测对象的状态(生物学状态或医学状态)。
附图说明
图1为示出合成微小RNA200-c-5p的MALDI-TOF/TOF测定的结果的图。观察到3’末端片段及5’末端片段两者的系列。
图2为示出合成寡聚DNA与其反义的合成DNA的DNA双链的MALDI-TOF/TOF测定的结果的图，所述合成寡聚DNA具有与微小RNA-369-3p互补的序列。
图3为示出双链的合成miR-369的MALDI-TOF/TOF测定的结果的图。
图4为选择培养细胞的RNA中与miR-369相当的前体并通过ISD片段化的MALDI-TOF/TOF测定的结果的图。
图5为对于正常组织及肿瘤组织示出表示甲基化的miR-21-5p(上)及let-7a-5p(下)的MS信号的强度的图。箭头位置的m/z为来自甲基化RNA的片段的信号。纵轴表示质谱仪所测定的信号强度。
图6为对于正常组织及肿瘤组织示出表示甲基化的miR-200c-3p(上)及miR-200c-5p(下)的MS信号的强度的图。箭头位置的m/z为来自甲基化RNA的片段的信号。纵轴表示质谱仪所测定的信号强度。
图7为对于正常组织及肿瘤组织示出表示甲基化的miR-17c-5p的MS信号的强度的图。箭头的位置的m/z为来自甲基化RNA的片段的信号。纵轴表示质谱仪所测定的信号强度。
图8为关于miR-200c-3p、miR-21-5p、miR-let7a-5p及miR-17-5p的、在大肠的正常组织与肿瘤组织之间比较对象的序列的RNA中的甲基化RNA的比例(％)(上)及RNA表达量(下)而得的图。N.S.表示没有显著性差异。
图9为示出表示存在甲基化的miR-200c-5p的MS信号的图。为了确认内部序列而进行了氨处理。两箭头所示的宽度表示检测到的、对应的核苷酸的质量差。
图10表示原发肿瘤切除后1至2年间发现转移的人大肠癌患者来源的原发肿瘤切除前的样品(Before)及发现转移时取得的样品(After)、以及炎症性肠病(IBD)及克隆病(Crohn)患者来源的血清样品中的miR-21-5p、miR-17-5p、let7a-5p、miR-200c-5p的甲基化率的比较。纵轴表示通过质谱测定的对象miRNA的甲基化率。
图11表示成熟miRNA中的甲基化碱基的检测例。(c)表示由胰腺癌患者来源组织得到的miR-17及let-7a的质谱，表明检测到了甲基化体及非甲基化体两者的峰。(d)表示各miRNA中的修饰核苷的位置。
图12为利用MALDI-TOF-MS/MS进行的、由胰腺癌患者的血清试样浓缩而得的let-17a的甲基化分析。上段示出母离子的分析结果(MS分析)，表明检测到了甲基化体及非甲基化体两者的峰。下段示出碎片离子(12～19个碱基)的分析结果(MS/MS分析)，表明在第19位的腺嘌呤处发生了甲基化。
图13为利用MALDI-TOF-MS/MS进行的、由胰腺癌患者的血清试样浓缩而得的miR-17的甲基化分析。上段示出母离子的分析结果(MS分析)，表明检测到了甲基化体及非甲基化体两者的峰。下段示出碎片离子(11～20个碱基)的分析结果(MS/MS分析)，表明在第13位的腺嘌呤处发生了甲基化。
图14为利用MALDI-TOF-MS/MS进行的、由胰腺癌患者的血清试样浓缩而得的miR-21的甲基化分析。上段示出母离子的分析结果(MS分析)，表明检测到了甲基化体及非甲基化体两者的峰。下段示出碎片离子(5～11个碱基)的分析结果(MS/MS分析)，表明在第9位的胞嘧啶处发生了甲基化。
图15为利用MALDI-TOF-MS/MS进行的、由胰腺癌患者的血清试样浓缩而得的miR-200c的甲基化分析。上段示出母离子的分析结果(MS分析)，表明检测到了甲基化体及非甲基化体两者的峰。下段示出碎片离子(4～10的碱基)的分析结果(MS/MS分析)，表明在第9位的胞嘧啶处发生了甲基化。
图16示出胰腺癌组织中miRNA甲基化水平上调。(a、b)示出胰腺癌患者的正常组织(n＝12、左)及胰腺癌组织(n＝12、右)中的miR-17(a)及let-7a(b)的甲基化水平的比较。*P＜0.01(t检验)。(c、d)示出由健康的对照(n＝5、左)及胰腺癌患者(n＝5、右)取得的血清中的miR-17(c)及let-7a(d)的甲基化水平的比较。健康的对照的血清是由经内窥镜检查、CT及几种肿瘤标志物的检测而确认没有肿瘤的肝移植供体得到的。＊P＜0.01(t检验)。(e、f)示出胰腺癌患者的手术前(n＝21、左)及手术后(n＝21、右)的血清中的miR-17(e)及let-7a(f)的甲基化水平的比较。健康的对照的血清是由经内窥镜检查、CT及几种肿瘤标志物的检测而确认没有肿瘤的肝移植供体得到的。*P＜0.01(t检验)。
图17从左侧起示出关于miR-21、miR-17、let-17a及miR-200c的、胰腺癌患者的手术前及手术后的血清中的miRNA的甲基化水平的比较。在手术前后，将同一患者建立关联。
图18为示出关于miR-200c-3p及miR-let7a-5p的、在胃中的正常组织与肿瘤组织之间比较对象的序列的RNA中的甲基化RNA的比例(％)而得的图。
图19示出结肠直肠癌患者的结直肠癌组织(实心柱)及正常组织(网线柱)中的各miRNA的特定位置的甲基化率。图下部的数字表示患者编号，患者1～6为I期的结直肠癌患者，患者7～12表示IV期的结直肠癌患者。*P＜0.05(t检验)。
图20示出基于5-FU抗性株、FTD抗性株以及其来源母株的RIP测序信息及RNA表达信息进行二维的主成分分析的结果。
图21为示出由肿瘤基因组图谱(TCGA)取得的胰腺癌(PAAD、n＝4)患者的正常组织(N)及肿瘤组织(T)中的各miRNA的表达量的图。纵轴表示测序数据的全部读数中的对象miRNA的计数的比例(计数/100万读数)。
图22为示出由肿瘤基因组图谱(TCGA)取得的直肠腺癌(READ、n＝3)患者的正常组织(N)及肿瘤组织(T)中的各miRNA的表达量的图。纵轴表示测序数据的全部读数中的对象miRNA的计数的比例(计数/100万读数)。
图23为表示由肿瘤基因组图谱(TCGA)取得的胆管癌(CHOL、n＝9)患者的正常组织(N)及肿瘤组织(T)中的各miRNA的表达量的图。纵轴表示测序数据的全部读数中的对象miRNA的计数的比例(计数/100万读数)。
图24为示出由肿瘤基因组图谱(TCGA)取得的结肠腺癌(COAD、n＝8)患者的正常组织(N)及肿瘤组织(T)中的各miRNA的表达量的图。纵轴表示测序数据的全部读数中的对象miRNA的计数的比例(计数/100万读数)。
图25为利用分子动力学分析进行的、miR-200c与AGO2蛋白的结合预测。(a)表示通过能量最小化进行推测时的、非甲基化miR-200c(橙)及甲基化miR-200c(蓝)各自的复合体的稳定构象的重叠。最前边的6个碱基基本重叠。另一方面，在甲基化部位的周边发现了结合相互作用的变化。(b)表示甲基与AGO2蛋白之间的范德华力增强，因此甲基周围的空间减少。(c)表示取向由于甲基的存在而发生变化。(d)表示非甲基化miR-200c的复合体与甲基化miR-200c的复合体相比，自由空间更大。
图26为利用分子动力学分析进行的、let-7a与AGO2蛋白的结合预测。(a)表示通过能量最小化进行推测时的、非甲基化let-7a(橙)及甲基化let-7a(蓝)各自的复合体的稳定构象的重叠。虽然骨架的排列相似，但是在非甲基化let-7a与甲基化let-7a之间各碱基的取向显著不同。let-7a的腺嘌呤甲基化导致复合体整体的结构变化(b)及RNA识别部位的空间大小发生变化(c、d)。
图27：利用分子动力学分析进行的、miR-17与AGO2蛋白的结合预测。(a)表示通过能量最小化进行推测时的、非甲基化miR-17(橙)及甲基化miR-17(蓝)各自的复合体的稳定构象的重叠。骨架及碱基侧链的取向在非甲基化miR-17与甲基化miR-17之间显著不同。miR-17的腺嘌呤甲基化导致复合体整体的结构变化(b)及RNA识别部位的空间大小发生变化(c、d)。
图28示出通过基因浓缩分析确定非修饰miR-200c(蓝)、m5C修饰miR-200c(红)及m6A修饰miR-200c(绿)所带来的基因抑制效果的结果。非修饰miR-200c及m5C修饰miR-200c显示出强的基因抑制效果(分别为P＜0.005及P＜0.001；t检验)，m6A修饰miR-200c的基因表达抑制效果弱。
图29示出通过基因浓缩分析确定非修饰let-7(水色)及m6A修饰let-7(红)所带来的基因抑制效果的结果。非修饰let-7a抑制靶基因表达(P＝0.05、t检验)，甲基化let-7a则不抑制(P＝0.07、t检验)。
图30为在胰脏的P53和RB失活的EL1-SV40小鼠(上方的折线)与由该小鼠及过度表达Mettl3基因的小鼠制作的双转基因小鼠(下方的折线)之间比较生存率而得的图。纵轴表示生存率，横轴表示周龄。
图31为在胰脏的P53和RB失活的EL1-SV40小鼠(左)与由该小鼠及过度表达Mettl3基因的小鼠制作的双转基因小鼠(右)之间比较20周龄时刻摘出的肿瘤而得的图。纵轴表示生存率，横轴表示周龄。上段为肿瘤的照片，下段为组织切片的苏木精-伊红染色。
图32为使用磁珠纯化目标RNA的方法的概要图。
图33为进行外来体浓缩的RNA纯化法的概要图。
图34为系统的构成的概要图。
具体实施方式
以下在示出最佳方式的同时对本发明进行说明。在本说明书的全文中，除非特别声明，否则单数形式的表述应理解为也包含其复数形式的概念。因此，除非特别声明，否则单数形式的冠词(例如英语情况下的“a”、“an”、“the”等)应理解为也包含其复数形式的概念。另外，除非特别声明，否则本说明书中使用的术语应理解为以该领域中通常使用的意思来使用。因此，只要没有另外进行定义，则本说明书中使用的所有专业术语及技术术语具有与本发明所属的领域的本领域技术人员通常所理解的意思相同的意思。在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
以下，对本说明书中特别使用的术语的定义和/或基本的技术内容进行适宜说明。
(定义等)
本说明书中，“核糖核酸(RNA)”是指：包含至少1个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”是指：在β-D-呋喃核糖部分的2’位具有羟基的核苷酸。RNA包括例如mRNA、tRNA、rRNA、lncRNA、miRNA。
本说明书中，“信使RNA(mRNA)”是指：使用DNA模板制作的、与编码肽或多肽的转录物有关的RNA。典型地，mRNA包括5’-UTR、蛋白质编码区及3’-UTR。mRNA的具体信息(序列等)例如可通过参照NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)来利用。例如，人成熟微小RNA可列举下表中的序列。
本说明书中，“微小RNA(miRNA)”是指：被基因组编码的、经由多个阶段的生成过程而最终形成20至25碱基长的微小RNA的功能性核酸。miRNA的具体的信息(序列等)例如可通过参照mirbase(http://mirbase.org)来利用。例如，人成熟微小RNA可列举下表中的序列。
[表1-1]
人成熟微小RNA的列表
Figure BDA0002735305390000171
[表1-2]
Figure BDA0002735305390000181
[表1-3]
Figure BDA0002735305390000191
[表1-4]
Figure BDA0002735305390000201
[表1-5]
Figure BDA0002735305390000211
[表1-6]
Figure BDA0002735305390000221
[表1-7]
Figure BDA0002735305390000231
[表1-8]
Figure BDA0002735305390000241
[表1-9]
Figure BDA0002735305390000251
[表1-10]
Figure BDA0002735305390000261
[表1-11]
Figure BDA0002735305390000271
[表1-12]
Figure BDA0002735305390000281
[表1-13]
Figure BDA0002735305390000291
[表1-14]
Figure BDA0002735305390000301
[表1-15]
Figure BDA0002735305390000311
[表1-16]
Figure BDA0002735305390000321
[表1-17]
Figure BDA0002735305390000331
[表1-18]
Figure BDA0002735305390000341
[表1-19]
Figure BDA0002735305390000351
[表1-20]
Figure BDA0002735305390000361
[表1-21]
Figure BDA0002735305390000371
[表1-22]
Figure BDA0002735305390000381
[表1-23]
Figure BDA0002735305390000391
[表1-24]
Figure BDA0002735305390000401
[表1-25]
Figure BDA0002735305390000411
[表1-26]
Figure BDA0002735305390000421
[表1-27]
Figure BDA0002735305390000431
[表1-28]
Figure BDA0002735305390000441
[表1-29]
Figure BDA0002735305390000451
[表1-30]
Figure BDA0002735305390000461
[表1-31]
Figure BDA0002735305390000471
[表1-32]
Figure BDA0002735305390000481
[表1-33]
Figure BDA0002735305390000491
[表1-34]
Figure BDA0002735305390000501
[表1-35]
Figure BDA0002735305390000511
[表1-36]
Figure BDA0002735305390000521
[表1-37]
Figure BDA0002735305390000522
本说明书中，“长非编码RNA(lncRNA)”是指不翻译为蛋白质的而起作用的200nt以上的RNA。lncRNA的具体的信息(序列等)例如可通过参照RNAcentral(http://rnacentral.org/)来利用。例如，人成熟微小RNA可列举下表中的序列。
本说明书中，“核糖体RNA(rRNA)”是指：构成核糖体的RNA。rRNA的具体的信息(序列等)例如可通过参照NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)来利用。例如，人成熟微小RNA可列举下表中的序列。
本说明书中，“转运RNA(tRNA)”是指：公知通过氨酰tRNA合成酶而氨基酰基化的tRNA。tRNA的具体的信息(序列等)例如可参照NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)来利用。例如，人成熟微小RNA可列举下表中的序列。
本说明书中，核酸的上下文中使用的“修饰”是指：核酸的构成单元或其末端的一部分或全部被其它原子团取代或添加了官能团的状态。RNA的修饰的集合有时称为“RNAModomics”、“RNA Mod”等，有时也由于RNA为转录物而将这些称为表观转录组，本说明书中以相同的含义来使用。
作为RNA的修饰，可列举下表所示的类型，但不限于这些，可以理解的是只要是与修饰相当的改变则可以利用任意的类型。
[表2-1]
名称 缩写
1,2'-O-二甲基腺苷 m1Am
1,2'-O-二甲基鸟苷 m1Gm
1,2'-O-二甲基肌苷 m1Im
1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷 m1acp3Y
1-甲基腺苷 m1A
1-甲基鸟苷 m1G
1-甲基肌苷 m1I
1-甲基假尿苷 m1Y
2,8-二甲基腺苷 m2,8A
2-胍基硫尿苷 ges2U
2-赖胞苷(lysidine) k2C
2-甲基腺苷 m2A
2-甲基硫代环状N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷 ms2ct6A
2-甲基硫代-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷 ms2io6A
2-甲基硫代-N6-羟基正缬氨酰氨甲酰基腺苷 ms2hn6A
2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺苷 ms2i6A
2-甲基硫代-N6-甲基腺苷 ms2m6A
2-甲基硫代-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷 ms2t6A
2-硒尿苷 se2U
2-硫代-2'-O-甲基尿苷 s2Um
2-硫代胞苷 s2C
2-硫代尿苷 s2U
2'-O-甲基腺苷 Am
2'-O-甲基胞苷 Cm
2'-O-甲基鸟苷 Gm
2'-O-甲基肌苷 Im
2'-O-甲基假尿苷 Ym
2'-O-甲基尿苷 Um
2'-O-甲基尿苷5-羟乙酸甲酯 mcmo5Um
2'-O-核糖基腺苷(磷酸) Ar(p)
2'-O-核糖基鸟苷(磷酸) Gr(p)
2'3'-环磷酸末端 (pN)2′3′>p
3,2'-O-二甲基尿苷 m3Um
[表2-2]
3-(3-氨基-3-羧基丙基)-5,6-二氢尿苷 acp3D
3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷 acp3Y
3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷 acp3U
3-甲基胞苷 m3C
3-甲基假尿苷 m3Y
3-甲基尿苷 m3U
4-二甲基怀俄苷 imG-14
4-硫代尿苷 s4U
5,2'-O-二甲基胞苷 m5Cm
5,2'-O-二甲基尿苷 m5Um
5-(羧基羟基甲基)-2'-O-甲基尿苷甲酯 mchm5Um
5-(羧基羟基甲基)尿苷甲酯 mchm5U
5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫尿苷 inm5s2U
5-(异戊烯基氨基甲基)-2'-O-甲基尿苷 inm5Um
5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷 inm5U
5-氨基甲基-2胍基硫尿苷 nm5ges2U
5-氨基甲基-2-硒尿苷 nm5se2U
5-氨基甲基-2-硫代尿苷 nm5s2U
5-氨基甲基尿苷 nm5U
5-氨甲酰基羟基甲基尿苷 nchm5U
5-氨甲酰基甲基-2-硫代尿苷 ncm5s2U
5-氨甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷 ncm5Um
5-氨甲酰基甲基尿苷 ncm5U
5-羧基羟基甲基尿苷 chm5U
5-羧基甲基-2-硫尿苷 cm5s2U
5-羧基甲基氨基甲基-2胍基硫尿苷 cmnm5ges2U
5-羧基甲基氨基甲基-2-硒尿苷 cmnm5se2U
5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷 cmnm5s2U
5-羧基甲基氨基甲基-2'-O-甲基尿苷 cmnm5Um
5-羧基甲基氨基甲基尿苷 cmnm5U
5-羧基甲基尿苷 cm5U
5-氰基甲基尿苷 cnm5U
5-甲酰基-2'-O-甲基胞苷 f5Cm
5-甲酰基胞苷 f5C
5-羟基胞苷 ho5C
[表2-3]
Figure BDA0002735305390000561
[表2-4]
N2,7-二甲基鸟苷 m2,7G
N2,7-二甲基鸟苷帽(cap DMG) m2,7Gpp(pN)
N2,N2,2'-O-三甲基鸟苷 m2,2Gm
N2,N2,7-三甲基鸟苷 m2,2,7G
N2,N2,7-三甲基鸟苷帽(cap TMG) m2,2,7Gpp(pN)
N2,N2-二甲基鸟苷 m2,2G
N2-甲基鸟苷 m2G
N4,2'-O-二甲基胞苷 m4Cm
N4,N4,2'-O-三甲基胞苷 m4,4Cm
N4,N4-二甲基胞苷 m4,4C
N4-乙酰-2'-O-甲基胞苷 ac4Cm
N4-乙酰胞苷 ac4C
N4-甲基胞苷 m4C
N6,2'-O-二甲基腺苷 m6Am
N6,N6-2'-O-三甲基腺苷 m6,6Am
N6,N6-二甲基腺苷 m6,6A
N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷 io6A
N6-乙酰腺苷 ac6A
N6-甲酰基腺苷 f6A
N6-甘氨酸氨甲酰基腺苷 g6A
N6-羟基甲基腺苷 hm6A
N6-羟基正缬氨酰氨甲酰基腺苷 hn6A
N6-异戊烯基腺苷 i6A
N6-甲基-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷 m6t6A
N6-甲基腺苷 m6A
N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷 t6A
Q碱基 Qbase
腺苷 A
Agmatidine C+
α-二甲基单磷酸帽 mm(pN)
α-甲基单磷酸帽 m(pN)
Archaeosine G+
环状N6苏氨酰氨甲酰基腺苷 ct6A
胞苷 C
二氢尿苷 D
[表2-5]
环氧辫苷 oQtRNA
半乳糖基辫苷 galQtRNA
γ-甲基三磷酸帽 mpp(pN)
谷氨酰基辫苷 gluQtRNA
鸟苷 G
加成了任意核苷酸的鸟苷 pG(pN)
胍基化5'末端(cap G) Gpp(pN)
羟基-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷 ht6A
羟基怀丁苷 OHyW
肌苷 I
异怀俄苷 imG2
甘露糖基辫苷 manQtRNA
甲基化修饰的羟基怀丁苷 OHyWy
甲基怀俄苷 mimG
过氧怀丁苷 o2yW
前Q0碱基 preQ0base
前Q1碱基 preQ1base
假尿苷 Y
辫苷 QtRNA
修饰的羟基怀丁苷 OHyWx
尿苷 U
尿苷5-羟乙酸 cmo5U
尿苷5-羟乙酸甲酯 mcmo5U
怀丁苷 yW
怀俄苷 imG
例如，可以通过质谱、特异性化学反应、与标准合成品进行比较(例如比较LC中的保留时间)等该领域中公知的任意方法，并根据需要利用以往积累的信息来区分这些修饰。
本说明书中，核酸的上下文中使用的“甲基化”是指：任意种类的核苷酸的任意位置的甲基化，代表性的为腺嘌呤的甲基化(例如6位；m6A、1位；m1A)、胞嘧啶的甲基化(例如5位；m5C、3位；m3C)。可以使用该领域中公知的方法来确定所检测的修饰部位。例如，对于m1A和m6A、m3C和m5C而言，分别可通过化学修饰来确定。例如，可以利用成为标准的合成RNA，确定化学修饰及MALDI测定中的行为是否正确。
此外，例如在tRNA、rRNA、mRNA等中发现的RNA修饰中，很多种类可以以质量数的差异来识别。例如，化学修饰会产生质量数的差异，理论上可以识别。其中，对于质量数相同者，可以使用该领域中公知的其它方法进行识别。
本说明书中，“测定”以该领域中使用的常用含义来使用，是指对某一对象测定、求出量达到何种程度。本说明书中，“检测”以该领域中使用的常用含义来使用，是指对物质、成分等进行检查、寻找，“鉴定”是指：对于某一对象，从与相关的现有分类中找到其的归属的行为，在用于化学领域时，是指确定作为对象物质的化学物质的相同性(例如确定化学结构)，“定量”是指：确定对象物质的存在量。
在本说明书中使用时，试样中的分析物的“量”一般是指：反映了可检测的分析物在试样的体积中的质量的绝对值。但是，还意图使量为相对于其它分析物量而言的相对量。例如，试样中的分析物的量可以为大于试样中通常存在的分析物的对照水平或正常水平的量。
术语“约”与不包括离子质量测定的定量测定有关，在用于本说明书时，是指所示的值的正负10％。需要说明的是，在未明确示出“约”时，也能够以有“约”时相同的含义来解释。就质谱仪而言，在给定分析物的质量确定中可稍有不同。在与离子的质量或离子的质量/电荷比相关的术语中的“约”是指+/-0.5原子质量单位。
本说明书中，“对象”是指成为本发明的分析、诊断或检测等的对象的对象(例如食品、微生物、人等生物或从生物中取出的细胞、血液、血清等)。
本说明书中，可能使用到的“器官”也称为“脏器”，为生物中的构成动物、植物等多细胞生物的生物体的单位，形态上有别于周围且整体地行使一揽子功能。例如，代表性的器官可列举肝脏、脾脏及淋巴结，此外可列举肾脏、肺、肾上腺、胰脏、心脏等其它脏器等，但不限于这些。
本说明书中，“生物标志物”为某一对象的状态或作用的评价指标。本说明书中，另有声明时除外，有时也将“生物标志物”称为“标志物”。
本发明的检测剂或检测手段可以为使其它物质(例如标记物等)结合于能被检测的部分(例如抗体等)而成的复合体或复合分子。在用于本说明书时，“复合体”或“复合分子”是指包含两个以上的部分的任意的构成体。例如，在一个部分为多肽时，另一部分可以为多肽，也可以为多肽以外的物质(例如基材、糖、脂质、核酸、其他的碳水化合物等)。本说明书中，构成复合体的两个以上的部分可以通过共价键结合，也可以通过其以外的键(例如氢键、离子键、疏水性相互作用、范德华力等)结合。在两个以上的部分为多肽时，也可称为杂多肽。因此，本说明书中，“复合体”包括多肽、多核苷酸、脂质、糖、低分子等分子多种连接而成的分子。
关于本说明书中的多核苷酸表达的“检测”或“定量”，例如可以使用包含与标志物检测剂的结合或相互作用的、包括mRNA测定及免疫学测定方法在内的合适方法来实现，本发明中，可以基于PCR产物的量进行测定。作为分子生物学测定方法，可例示例如RNA印迹法、斑点印迹法或PCR法等。作为免疫学测定方法，例如，作为方法，可例示使用微滴定板的ELISA法、RIA法、荧光抗体法、发光免疫检测(LIA)、免疫沉降法(IP)、免疫扩散法(SRID)、免疫比浊法(TIA)、蛋白质印迹法、免疫组织染色法等。另外，作为定量方法，可例示ELISA法或RIA法等。也可利用使用阵列(例如DNA阵列、蛋白质阵列)的基因分析方法来进行。关于DNA阵列，(秀润社编、细胞工学增刊“DNA微阵列和最新PCR法”)中有广泛的概述。关于蛋白质阵列，在Nat Genet.2002Dec；32Suppl：526-32中有详细说明。作为基因表达的分析法，除了上述以外还可列举RT-PCR、RACE法、SSCP法、免疫沉降法、two-hybrid系统、体外翻译等，但不限于这些。这类进一步的分析方法例如在基因组分析实验法·中村祐辅实验手册、编集·中村祐辅羊土社(2002)等中有记载，本说明书中，这些记载均作为参考而引用。
本说明书中，“手段”是指：可成为达到某种目的(例如检测、诊断、治疗)的任意道具的事物，特别地，本说明书中“选择性识别(检测)的手段”是指：可以将某一对象与其它物质区分开地进行识别(检测)的手段。
本说明书中，“(核酸)引物”是指：在高分子合成酶反应中，引发所要合成的高分子化合物的反应所必须的物质。核酸分子的合成反应中，可使用与要合成的高分子化合物的部分序列互补的核酸分子(例如DNA或RNA等)。本说明书中，引物可作为标志物检测手段来使用。
通常，作为引物使用的核酸分子可列举具有与目标多核苷酸(例如微小RNA)的核酸序列互补的、至少连续8个核苷酸长度的核酸序列的物质。这类核酸序列可以为优选至少连续9个核苷酸长度的、更优选至少连续10个核苷酸长度的、进一步优选至少连续11个核苷酸长度的、至少连续12个核苷酸长度的、至少连续13个核苷酸长度的、至少连续14个核苷酸长度的、至少连续15个核苷酸长度的、至少连续16个核苷酸长度的、至少连续17个核苷酸长度的、至少连续18个核苷酸长度的、至少连续19个核苷酸长度的、至少连续20个核苷酸长度的、至少连续25个核苷酸长度的、至少连续30个核苷酸长度的、至少连续40个核苷酸长度的、至少连续50个核苷酸长度的核酸序列。作为探针使用的核酸序列包含与上述序列至少70％同源、更优选至少80％同源、进一步优选至少90％同源、至少95％同源的核酸序列。可根据意图合成(扩增)的序列的性质而改变适合作为引物的序列，本领域技术人员可根据期望的序列适宜地设计引物。这类引物的设计在该领域中是周知的，可以手动进行，也可以使用计算机程序(例如LASERGENE，PrimerSelect，DNAStar)进行。
本说明书中，“探针”是指：用于体外和/或体内等的筛选等生物学实验的、可成为检索手段的物质，可列举例如包含特定碱基序列的核酸分子或包含特定氨基酸序列的肽、特异性抗体或其片段等，但不限于此。本说明书中，探针可以作为标志物检测手段使用。
本说明书中，“质谱”或“MS”以该领域中使用的常用含义来使用，是指用于根据其质量来鉴定化合物的分析方法，是指将原子、分子、簇等粒子通过某种方法制成气体状的离子(电离)并使其在真空中运动、依据质核比使用电磁力等或根据飞行时间差等分离、检测这些离子的技术。MS是指：基于该质核比、即“m/z”过滤离子并进行检测及测定的方法。随着近年检测灵敏度、质量分辨率的跨越式提高，其应用范围日益拓宽，已被活用于多种领域。代表性地，可以使用Clark J et al.，Nat Methods.2011March；8(3):267-272.doi:10.1038/nmeth.1564.中例示的方法。MS技术通常包括：(1)将化合物电离而形成带电化合物的步骤：及(2)检测带电化合物的分子量并计算质核比的步骤。可利用合适的手段将化合物电离及进行检测。“质谱仪”通常包括电离装置、质谱仪及离子检测器。通常，作为目标的一个或多个分子被电离，之后离子被导入质谱仪，在这里，离子沿着由于为磁性及电场的组合而依赖于质量(“m”)及电荷(“z”)的空间中的途径前进。关于质谱仪的综述可参照例如Jurgen H、“Mass Spectrometry”、丸善出版(2014)。质谱仪可列举例如磁性型、电场型、四极杆型、飞行时间型等。关于定量性离子检测，可列举仅选择性地对目标离子进行检测的选择性离子检测、以及选择第一个质谱部中纯化的离子种中的1个作为前体离子且在第二个质谱部检测由该前体离子的裂解而产生的产物离子的选择性反应检测(SRM)等。SRM的选择性增强，噪音降低，因此信噪比提高。
用于本说明书时，术语“分辨率”或“resolution(FWHM)”(在本技术领域中，也作为“m/Δm50％”而公知)是指：所观察到的质核比除以最大高度的50％处的质量峰宽(半峰宽、“FWHM”)。分辨率越高则定性性及定量性变得越好。
本说明书中，“标记”是指：用于由其它识别成为目标的分子或物质的存在(例如物质、能量、电磁波等)。作为这类标记方法，可列举RI(放射性同位素)法、稳定同位素标记法、荧光法、生物素法、利用了拉曼散射的光学方法、化学发光法等。在利用荧光法标记多个本发明的标志物或捕捉标记物的因子或手段时，利用荧光发光极大波长彼此不同的荧光物质来进行标记。在通过利用拉曼散的光学方法射标记多个本发明的标志物或捕捉标记物的因子或手段时，利用拉曼散射彼此不同的物质来进行标记。本发明中，利用这样的标记来改变作为目标的对象，使得能够利用所用的检测手段进行检测。这种改变在该领域中是公知的，本领域技术人员可以根据标记及作为目标的对象来适宜地实施这种方法。
本说明书中，“诊断”是指：鉴定与被检体的状态(例如疾病、障碍)等相关的各种参数，来判定这类状态的现状或未来。通过使用本发明的方法、装置、系统可调查体内的状态，可以使用这类信息来选择被检体的状态、应进行给药的处置或用于预防的处方物或方法等各种参数。本说明书中，“诊断”在狭义上是指对现状进行诊断，在广义上包括“早期诊断”、“预测诊断”、“事前诊断”等。本发明的诊断方法原则上可以用于身体所出现的变化，可以脱离医生等医疗从业者而实施，因此在产业上有用。本说明书中，为了明确可脱离医生等医疗从业者而实施这一点，有时将“预测诊断、事前诊断或诊断”特别称为“支援”。本发明的技术能够用于这样的诊断技术。
本说明书中，“治疗”是指：对于某种状态(例如疾病或障碍)，在已形成这类状态的情况下防止这种状态的进展、优选维持现状、更优选减轻、进一步优选消除，包括能够发挥患者的状态或状态所伴随的1种以上症状的、症状改善效果或预防效果。有时，将事前进行诊断并进行合适的治疗的方式称为“伴随治疗”、将用于此的诊断药称为“伴随诊断药”。使用本发明的技术确定RNA的修饰则可与特定状态建立相关，因此在这样的伴随治疗或伴随诊断中可能有用。
本说明书中，“预后”这一术语是指：预测发生起因于癌症等疾病或障碍等的死亡或进展的可能性。预后因子是指：与疾病或障碍的自然经过有关的变量，这些会对已经发生疾病或障碍的患者的复发率等造成影响。作为与预后变差相关的临床指标，包括例如本发明中使用的任意的细胞指标。预后因子经常被用于将患者归类到显示不同病情的亚组中。若可以使用本发明的技术确定RNA的修饰，则能够与特定的疾病状态建立相关，因此作为提供预后因子的技术可能有用。
本说明书中，“检测仪器(仪)(器)”广义上是指可以对目标对象进行检测或检查的所有仪器。本说明书中，“诊断药”广义上是指可以对目标状态(例如癌、种属分类、老化等)进行诊断的所有药剂。
本说明书中，“试剂盒”是指：通常分成两部分以上来提供应提供的部分(例如检查药、诊断药、治疗药、试剂、标记、说明书等)的单元。当目的在于提供处于稳定性等而不应混合提供、而是优选在即将使用前混合使用的组合物时，优选该试剂盒的方式。有利的是，这类试剂盒优选具备记载有应如何使用或如何处理所提供的部分(例如检查药、诊断药、治疗药、试剂、标记等)的指示书或说明书。本说明书中，在以药剂试剂盒形式使用试剂盒时，试剂盒中包含记载了检查药、诊断药、治疗药、试剂、标记等的使用方法等的指示书等。在组合有检查仪器、诊断仪器等的情况下，可以以“系统”形式来提供“试剂盒”。
本说明书中,“指示书”为记载有向医生或其它使用者说明使用本发明的方法的物品。该指示书记载有指导本发明的检测方法、诊断药的使用方法、或药物等的给药的语句。另外，指示书中可以记载有指导经口给药、向食道给药(例如通过注射等进行)作为给药部位的语句。该指示书可以按照实施本发明的国家的监督机构(例如，若为日本则为厚生劳动省、若为美国作为食品药品局(FDA)等)所规定的样式来制作，并明确记载得到了该监督机构认可的主旨。指示书为所谓的附加文件(package insert)，通常以纸介质来提供，但不限于此，例如也可以以电子介质(例如通过因特网而提供的主页、电子邮件)之类的方式来提供。
本说明书中，“程序”以该领域中使用的常规含义来使用，其按照顺序记载了计算机所应进行的处理，在法律上作为“物”来对待。全部计算机均根据程序而动作。现代的计算机中，程序表现为数据，且容纳在记录介质或存储装置中。
本说明书中，“记录介质”为容纳执行本发明的程序的记录介质，记录介质只要可记录程序即可，可为任一物质。例如，可为能够在内部进行容纳的ROM、HDD、磁盘、USB存储器等闪存器等外部存储装置，但不限于这些。
本说明书中，“系统”是指执行本发明的方法或程序的构成，本来是指用于达到目的的体系、组织，是多个要素以体系化的方式构成的、相互影响的物品，在计算机领域，是指硬件、软件、OS、网络等整体构成。
(本发明的方法的概要)
(RNA修饰)
本发明提供基于RNA上的修饰信息来对对象的状态进行分析的方法。RNA(例如微小RNA)上的修饰(例如甲基化)信息与各种对象(人等哺乳动物、大肠杆菌等微生物)的状态(例如疾病及抗性等后天状态)密切相关，通过分析RNA上、特别是微小RNA上的修饰信息能够高精度地对对象的状态进行分析，这一点很令人惊讶。特别是能够区分出早期胰腺癌等难以诊断的状态，这一点表明本发明在医疗及产业上非常显著义。一实施方式中，修饰信息包括微小RNA上的修饰信息。一实施方式中，修饰信息包括甲基化信息。一实施方式中，修饰信息包括微小RNA上的甲基化信息。
(直接连接珠浓缩分析)
在一个方面，本发明提供使用质谱仪分析RNA上的修饰的方法，该方法包括：
(A)使用通过共价键连接有与目标RNA互补的核酸的珠纯化目标RNA的步骤；和
(B)利用MALDI使所纯化的RNA电离且用质谱仪进行测定的步骤。
我们发现，通过将捕捉核酸和珠直接结合珠，与通过生物素-链霉亲和素结合使捕捉核酸和珠间接结合时相比，可以在更苛刻的条件下进行洗涤，从个人MALDI-MS测定的强度大幅提高。
该方法的有利之处在于，以以往未曾设想过的RNA为对象，以往不能确认内部序列、修饰碱基的位置，但是本发明通过优化源内衰变的设定而可以改善。通过组合使用利用氨的碱水解而能够观察内部序列及修饰碱基的位置，这也可以称为本发明的特征。另外，在新的“向起始材料(匀浆、细胞裂解液、血清等)中加入变性剂、直接进行杂交来纯化特定序列的miRNA”的流程中组合将捕捉核酸和珠直接结合珠的技术和J.Engberg等的方法(J.Engberg等、Eur.J.Biochem,41,321-328(1974))，从而可以提高效率，这也可称为一实施方式的重要方面。
(外来体浓缩分析)
在一个方面中，本发明提供使用质谱仪分析RNA上的修饰的方法，该方法包括：
(A-1)通过细胞分级法纯化外来体的步骤；
(A-2)使用抗CD63抗体纯化外来体的步骤；
(B)使用与目标RNA互补的核酸纯化目标RNA的步骤；和
(C)通过电离法(例如MALDI)将纯化后的RNA电离，用质谱仪进行测定的步骤。
我们发现，在用互补核酸纯化目标核酸时，通过事前进行纯化外来体的工序，质谱(例如MALDI-MS)测定的强度大幅提高。
并非期望用理论来约束该发明，但是我们发现，通过步骤(A)与步骤(B)的组合、或步骤(A)与步骤(C)的组合可改善纯化或大幅提高质谱(例如MALDI-MS)测定的强度。另外，在进行(A-1)及(A-2)两者时，MALDI-MS信号的强度达到约2.5倍，这一效果可以说是以往无法预测的效果。
以下说明用于实施本发明的方法的具体步骤。
(试样)
本发明的方法可以使用包含RNA的任意试样来实施，优选临床上容易入手的试样。一实施方式中，试样来自对象，在此，作为对象，可列举哺乳动物(例如人、黑猩猩、猴子、小鼠、大鼠、兔、狗、马、猪、猫等)、微生物(例如病原菌、用于发酵的微生物、大肠杆菌等细菌、寄生虫、真菌、病毒等)、可食用生物(禽类、鱼类、爬行类、菌类、植物等)、观赏生物/宠物、环境指示生物，但不限于这些。一实施方式中，试样来自处于特定状态或可能处于特定状态的对象。一实施方式中，作为特定状态，可列举疾病、年龄、性别、人种、血统、病史、治疗史、吸烟状态、饮酒状态、职业、生活环境信息等，但不限于这些。一实施方式中，试样为由对象得到的器官、组织、细胞(例如循环肿瘤细胞(CTC)等)、血液(例如血浆、血清等)、粘膜表皮(例如口腔、鼻腔、耳腔、阴道等中的表皮)、皮肤表皮、生物分泌液(例如唾液、鼻涕、汗液、泪液、尿液、胆汁等)、粪便、表皮微生物或其的部分。一实施方式中，试样为由培养细胞(例如基于由对象得到的细胞的类器官、特定的细胞株等)。一实施方式中，试样为食品或其一部分、或者食品微生物。
(RNA纯化方法)
一实施方式中，为了分析RNA修饰，可以在事前对RNA进行纯化，也可以不进行纯化。本说明书中，“经纯化的”物质或生物学因子(例如基因标志物等RNA或蛋白质等)是指已除去了与该生物学因子天然随伴的因子中的至少一部分的物质。因此，通常经纯化的生物学因子的、该生物学因子的纯度高于该生物学因子的通常存在状态的纯度(即，被浓缩)。本说明书中使用的术语“纯化”是指：存在优选为至少75重量％、更优选为至少85重量％、更进一步优选为至少95重量％、并且最优选为至少98重量％的同型的生物学因子。本发明中使用的物质优选为“经纯化的”物质。本说明书中，“分离”是指：除去了天然存在的状态下所伴随的任意物质中的至少一种的操作，例如，从全部RNA序列中取出特定的微小RNA序列的情况也可以称为分离。因此，本说明书中使用的RNA可以为经分离RNA。一实施方式中，可以不做区分地将全部种类的RNA从其它成分中纯化出来。一实施方式中，可以使用多聚A将RNA从其它成分中纯化出来。一实施方式中，可以将全部微小RNA从其它成分中纯化出来。一实施方式中，可以将具有目标序列(单独一种或多种)的RNA从其它成分中纯化出来。一实施方式中，可以将多种具有目标序列的RNA按照序列分别进行纯化。一实施方式中，可以将具有修饰(单独一种或多种)的RNA从其它成分中纯化出来。一实施方式中，可以将具有甲基化修饰的RNA从其它成分中纯化出来。一实施方式中，可以将具有目标序列(单独一种或多种)且具有修饰(单独一种或多种)的RNA从其它成分中纯化出来。
一实施方式中，目标RNA包含选自由序列号1～5组成的组中的序列中的至少一种。
CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG(序列号1)
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(序列号2)
CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG(序列号3)
UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA(序列号4)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU(序列号5)
RNA的纯化中可以使用任意的公知的方法。一实施方式中，可以使用RNA特异性分子纯化总RNA。一实施方式中，可以使DNA分解酶进行作用后纯化核酸分子、从而纯化目标RNA。对于多种RNA，可以分别进行纯化也可以平行地进行纯化，还可以以混合状态进行纯化。一实施方式中，可以平行地纯化1、2、3、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、300、400、500、750、1000、1500、2000、2500或3000种RNA(例如，使用结合在载体上的序列特异性的RNA捕捉分子)。一实施方式中，可以使用与目标序列至少部分互补的核酸分子(例如DNA及RNA)纯化具有目标序列的RNA，在此，该互补的核酸分子可以包含用于纯化的任意部分。例如，作为用于纯化的任意部分的例子，可列举珠等载体(根据需要可以有磁性)、生物素及链霉亲和素等相互结合的成对分子中的一者、用于结合可相互结合的成对分子的部分(例如点击化学中的炔部分)、抗体识别部分等，但不限于这些。一实施方式中，可以使用特异性的结合分子(例如抗体)纯化目标RNA。一实施方式中，可以使用RNA修饰(例如甲基化)的特异性的结合分子(例如抗体)纯化目标RNA。一实施方式中，可以使用特定种类的RNA(例如微小RNA)的特异性的结合分子(例如抗体)纯化目标RNA。一实施方式中，可以使用特定序列的特异性的结合分子(例如抗体)纯化目标RNA。一实施方式中，可以使用特定的修饰及特定的序列的特异性的结合分子(例如抗体)纯化目标RNA。
一实施方式中，使用包含选自由序列号6～10组成的组中的序列的至少一部分的DNA来纯化RNA。
CTACCTGCACTGTAAGCACTTTG(序列号6)
TCAACATCAGTCTGATAAGCTA(序列号7)
CCAAACACTGCTGGGTAAGACG(序列号8)
TCCATCATTACCCGGCAGTATTA(序列号9)
AACTATACAACCTACTACCTCA(序列号10)
一实施方式中，修饰RNA(某些情况下为DNA)中的修饰为人工导入的修饰。例如，人工导入的修饰中包括通过化学合成而导入的修饰，但不限于此，还包括在用药剂处理生物(包括病毒)时该药剂与生物中的RNA结合而产生的修饰。例如，若用对生物体内的核酸直接进行化学相互作用的药剂(例如抗癌剂)处置生物，则可能会产生导入了来自该药剂的部分的修饰RNA(根据情况为DNA)。根据本发明的方法，可以容易地确定这样的很可能导入了人工修饰的核酸(种类、位置等)，这样的很可能导入了人工修饰的核酸能够有效地作为用于药物研究开发的指标或生物标志物等使用。另外，可以与RNA的修饰信息组合而使用核酸(RNA或DNA)中的人工导入的修饰信息。
一实施方式中，为了检测具有人工导入的修饰的核酸，可以使用质谱法、放射性同位素标记等，也可以基于修饰部分的化学结构而设计与该化学结构特异性结合的分子(例如抗体(BrdU抗体等)、针对导入了生物素部分的修饰部分的链霉亲和素等)，因此可以使用利用这样的特异性结合分子的检测法(例如纯化后的测序、荧光检测等)。
一实施方式中，可以通过纯化细胞器(例如外泌体)来纯化目标RNA。一实施方式中，可以通过离心分离来纯化细胞器(例如外泌体)。一实施方式中，可以通过使用与存在于细胞器的分子结合的分子(例如抗体)来纯化目标RNA(例如，使用抗CD63抗体纯化外来体)。
目标RNA的纯化可以通过一个阶段来实施，也可以通过多个阶段来实施。例如，对于具有目标序列的RNA的纯化而言，可以从试样中直接纯化具有目标序列的RNA，也可以从试样中纯化总RNA后再纯化具有目标序列的RNA。
一实施方式中，在纯化多种目标RNA时，可以以混合有该目标RNA中的至少两种的状态进行纯化，也可以对各目标RNA分别进行纯化。例如，在分别纯化多个具有目标序列的RNA时，可以将试样分为多份并从各份试样中分别纯化具有不同序列的目标核酸，也可以将试样用于在多个彼此分开的位置配置有与各目标序列互补的核酸分子的载体，从而纯化目标核酸。
(修饰的检测及鉴定)
可以试样任意的公知的方法进行RNA上的修饰的检测及鉴定。例如，作为这样的RNA上的修饰的检测及鉴定的方法，可列举利用对修饰为特异性的抗体的荧光检测、通过对修饰和/或RNA为特异性的蛋白质(抗体等)而发生了免疫沉降的RNA的测序、经纯化的RNA的质谱、实施亚硫酸氢盐测序等化学处理后的RNA的测序(根据需要与PCR组合)、纳米孔测序(例如Oxford Nanopore Technologies的产品)、隧道电流测序(Scientific Reports 2,doi:10.1038/srep00501(2012))。
一实施方式中，可以与RNA的序列信息的确定平行地实施RNA上的修饰的检测及鉴定。本发明中，可以鉴定任意的RNA修饰信息。一实施方式中，可以根据需要与该RNA的量一起鉴定目标RNA上的修饰的种类(包括导入到1个核苷酸上的不同位置的、同种官能团所进行的修饰的种类)、经修饰的目标RNA的量及比例、目标RNA上的修饰的量及比例、及目标RNA上的修饰的位置中的至少1个位置。一实施方式中，目标RNA上的修饰状态可包括其修饰状态的可靠度(例如真阳性的概率)。一实施方式中，鉴定RNA上的甲基化。一实施方式中，鉴定核苷上的甲基化。一实施方式中，鉴定RNA的核酸碱基上的甲基化。一实施方式中，鉴定核苷上的甲基化。一实施方式中，鉴定RNA的m6A。一实施方式中，基于添加修饰的酶的识别基序信息、除去修饰的酶的识别基序信息、及与修饰结合的蛋白质的识别基序信息中的至少一种来鉴定RNA的修饰状态(例如修饰的位置、修饰状态的可靠度等)。
一实施方式中，鉴定包含选自由下述序列组成的组中的修饰的修饰。
CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG序列号1的第13位的A的甲基化(序列号15)
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA序列号2的第9位的C的甲基化(序列号16)
CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG序列号3的第13位的C的甲基化(序列号17)
UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA序列号4的第9位的C的甲基化(序列号18)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU序列号5的第19位的A的甲基化(序列号19)
一实施方式中，能够通过构成其修饰的部分(例如甲基部分)所含的放射性原子所放出的放射线来检测及鉴定RNA上的修饰。一实施方式中，能够通过检测与修饰特异性结合的分子(例如修饰特异性抗体)的结合(例如检测荧光)或检测与和修饰特异性反应的分子发生反应而生成的反应物(例如，检测作为反应物的光、利用链霉亲和素检测发生反应而生成的生物素衍生物等)来确定RNA上的修饰。
一实施方式中，可以在亚硫酸氢盐测序、用修饰特异性抗体浓缩后的RNA的测序(RIP测序)等核酸测序法中鉴定RNA上的修饰。可以根据本发明使用任意的合适的测序法。优选下一代测序(NGS)技术。本说明书中，“下一代测序”或“NGS”的术语是指：相对于作为桑格化学而公知的“以往”测序法而言的、将各种核酸整体分割为小片段而沿着核酸整体平行地随机地读取核酸模板的、所有的新的高通量测序技术。NGS技术(也称为大规模并行测序技术)可以在非常短的时间内、例如1～2周以内、优选1～7天以内、或最优选不满24小时内传输全基因组、外显子、转录组(基因组的全部转录序列)或甲基化组(基因组的全部甲基化序列)的核酸序列信息，原理上能够接近单细胞测序。可以将市售或文献中言及的任意的NGS平台用于实施本发明。一实施方式中，可以通过对用PCR扩增出的核酸进行测序来鉴定RNA上的修饰。
一实施方式中，基于通过修饰特异性的结合分子(例如抗m6A抗体等抗体)得到纯化这一点，将RNA鉴定为修饰RNA。可以通过任意的分析法处理测序中得到的数据，而将其变换为RNA修饰信息。例如，作为这样的分析法的例子，可列举MetPeak(参照Cui等、Bioinformatics(2016)32(12):i378-i385)，但不限于这些。
一实施方式中，可以利用质谱仪鉴定RNA上的修饰。作为本发明中可使用的质谱仪，可列举磁性型、电场型、四极杆型、飞行时间型(TOF)等。一实施方式中，可以利用质谱仪对单链RNA进行测定，也可以对与DNA或RNA一起形成了双链的RNA进行测定。
质谱可以与任意的电离法组合。作为本发明中可使用的电离法，可列举例如电子电离法(EI)、化学电离法(CI)、快速原子轰击法(FAB)、基质辅助激光解析电离法(MALDI)、电喷雾电离法(ESI)，但不限于这些。ESI可以与液相色谱法、超临界色谱法等组合，利用色谱法，能够对多种RNA边进行分离边进行测定。作为色谱法中可使用的色谱柱，可列举例如亲水性相互作用色谱法(HILIC)色谱柱、反相(RP)色谱法色谱柱等。
MALDI中，将试样与作为基质的容易通过激光束电离的物质(涂布剂)预先混合，并配置在靶平板上的点(锚定位置)上，对其照射激光束而引起电离。作为本发明中可以使用的涂布剂，可列举3-HPA(3-羟基吡啶甲酸)、DHC(柠檬酸二铵)、CHCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)等，但不限于这些。一实施方式中，配置在靶平板上的1个点(锚定位置)处的RNA可以包含具有多个序列的RNA，优选配置在靶平板上的1个点处的RNA为共用相同序列的一组RNA。随着存在于1个锚定位置上的RNA序列的种类的增加，序列的确认和/或修饰位置的确认可能会变困难。
一实施方式中，可以基于未片段化的离子(母离子)和/或片段化的离子(子离子)的测定值鉴定RNA的修饰状态(例如有无修饰、修饰的位置、修饰的数量、修饰的可靠度等)。一实施方式中，可以通过与对照分子(例如稳定同位素标记的核酸、非修饰核酸、可形成互补双链的一对核酸中的另一核酸等)的比较来鉴定RNA的修饰状态(例如修饰的量等)。一实施方式中，可以基于参照信息(例如标准试样的测定结果、已知的修饰信息等)鉴定RNA的修饰状态。可以利用任意软件来处理质谱数据而使其变换为RNA修饰状态。例如，作为这样的软件的例子，可列举DNA甲基化分析系统MassARRAY(注册商标)EpiTYPER(Sequenom)，但不限于这些。
(事前处理)
一实施方式中，可以在测定前通过物理、化学或生物方式对目标RNA进行事前处理。通过进行事前处理，能够得到例如目标RNA的测定中的灵敏度、准确度和/或精度的提高、对不同种类的修饰加以区分、试样间比较的定量性的提高、测定仪器中的分离的提高等效果。作为这样的事前处理，可列举例如硫酸二甲酯处理、卤素化合物处理、碱水解处理、稳定同位素标记导入处理、检测提高剂(例如荧光色素等、包含在MALDI中良好地吸收激光的部分的化合物)处理，但不限于这些。一实施方式中，可对负载有RNA的基材(珠等)来实施事前处理。一实施方式中，可以对事前处理中使用的药剂进行设计，以向RNA的碱基上的胺部分、末端的磷酸基或羟基导入基团。
硫酸二甲酯处理可以将RNA的腺嘌呤的嘌呤环的1位的氮原子选择性甲基化，从而赋予+14Da的质量，但是当嘌呤环的1位的氮原子已经全部甲基化时，该反应无法进行，从而能够区分1-mA和N6-mA。同样地，也可以使用三氟甲磺酸甲酯。卤素化合物处理中，可以使用例如卤化乙醛使RNA的胞嘧啶的3位的氮原子与4位的氨基之间交联而形成新的5元环，从而使质量数改变，在胞嘧啶的3位的氮原子已被甲基化时，该反应无法进行。作为卤化乙醛，可列举溴乙醛及氯乙醛，这些化合物的沸点为约60℃，因此不会使RNA分解且能够通过真空干燥而除去。关于碱水解，例如通过用氨来处理RNA而将RNA片段化。
(分析)
可以使用取得的RNA修饰信息分析各种状态。一实施方式中，使用取得的RNA修饰信息来对对象的医学状态或生物学状态进行分析。作为对象的医学状态或生物学状态，可列举例如疾病、老化、免疫状态(例如肠道免疫、全身免疫等)、细胞分化状态、对药剂或处置的反应性、对象微生物(例如肠内细菌、表皮细菌)的状态，但不限于这些。作为本发明可分析的疾病，可列举例如脑神经疾病、污染疾病、小儿外科疾病、真菌症、特定疾病、感染症、癌症(恶性肿瘤)、消化系统病(包括炎症性肠病)、神经退行性疾病、过敏疾病、寄生虫病、动物感染症、泌尿系统肿瘤、各种综合征、呼吸系统疾病、乳腺肿瘤、人格障碍、皮肤疾病、性传播疾病、牙科疾病、精神疾病、肾泌尿系统疾病、眼疾病、食物中毒、褐斑病中间宿主、肝炎、心血管系统病、罕见病、结缔组织病、症状、人畜共患病、性偏好障碍、免疫病(包括肠道免疫)、先天性疾病、发育障碍、皮疹、先天性心脏病、地域性疾病、恐惧症、病毒感染症、男性生殖系统疾病、动物疾病、鱼类疾病、增生疾病、息肉、牙周疾病、乳腺疾病、遗传疾病、血液疾病、内分泌代谢疾病、妇科病、引起发热和疹子的疾病、软组织肿瘤、植物疾病等，单不限于这些。作为本发明特别适合分析的疾病，可列举例如癌症、炎症性肠病、阿尔茨海默型或血管病性痴呆、边缘性精神病、扩张型心肌病、肥大型心肌病、心力衰竭(包括隐形心力衰竭)、心脏病(例如，包括致死性的、诱发由心律不齐导致的猝死的心脏病)等，但不限于这些，这些疾病可介由细胞的特异性代谢而影响到RNA的修饰状态。作为对象微生物的状态，可列举例如对热处理及消毒药等的抗性状态(例如未熟透食品上寄生的戊型肝炎病毒等的形成了芽胞的状态)等可能导致公共卫生上的偶发事件的状态、感染了宿主的病毒(例如肝炎RNA病毒、乳头瘤DNA病毒)的核酸的修饰状态(甲基化等)等，但不限于这些。
本发明也能够以胰腺癌(例如早期胰腺癌)、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、胃癌、结肠癌(直肠癌、结肠癌)、膀胱癌、肾癌、乳癌、肺癌、脑瘤、皮肤癌等癌症为对象，从而在医学角度上很显著义。另外，根据本发明，能够对癌症(例如胰腺癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、胃癌、大肠癌、膀胱癌、肾癌、乳癌、肺癌、脑瘤、皮肤癌)的进展程度(分期)进行分析。一实施方式中，可以基于miR-21、miR-17、let-17a及miR-200c中的至少一种的甲基化来分析癌症(例如胰腺癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、胃癌、大肠癌、膀胱癌、肾癌、乳癌、肺癌、脑瘤、皮肤癌)的状态。一实施方式中，可以基于miR-21、miR-17、let-17a及miR-200c中的至少一种的甲基化来分析癌症(例如胰腺癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、胃癌、大肠癌、膀胱癌、肾癌、乳癌、肺癌、脑瘤、皮肤癌)的状态。可以基于let-7、miR-21、miR-100、miR-222、miR-92a、miR-10a、miR-99b、miR-30d、miR-26a、miR-320a、miR-148a、miR-125a、miR-423、miR-182、miR-7641、miR-378a、miR-1307、miR-221、miR-183、miR-25、miR-24、miR-30a、miR-128、miR-941、miR-1246、miR-92b、miR-122、miR-5100、miR-106b、miR-181a、miR-27b、miR-29a、miR-224、miR-191、miR-146b、miR-27a、miR-3182、miR-532、miR-3184、miR-30c、miR-181b、miR-744、miR-7706、miR-148b、miR-629、miR-103b、miR-103a、miR-98、miR-23a、miR-425、miR-192、miR-22、miR-3615、miR-5701、miR-155、miR-149、miR-7704、miR-1180、miR-1275、miR-769、miR-1273g、miR-484、及miR-17中的至少一种的甲基化来分析(例如胰腺癌)的状态。
本发明还可以分析对象生物对药剂(例如抗癌剂、分子靶向药、抗体药物、生物制剂(例如核酸、蛋白质)、抗生素等)或处置的反应性。例如还可以分析抗性等，例如还可以用于抗癌剂的反应性、合适的治疗剂的选择、抗生素抗性的分析等。本发明的分析还可以用于利用重粒子射线(例如Carbon/HIMAC)或X射线的处置等手术或放射线处置等的经过、预后的分析。可理解的是，使用本发明能够分析Lonsurf(TAS102)、吉西他滨、CDDP、5-FU、西妥昔单抗、核酸药物或组蛋白脱甲基化酶抑制剂等各种药物，可作为治疗策略的基础信息而有效利用。例如，在药剂为抗癌剂时，通过本发明可以达成通过检测对象对该抗癌剂是否具有抗性这一反应性、来建立治疗策略。因此，通过使用本发明，可以基于对药剂等处置的反应性来选择用于处置对象的药剂和/或对上述对象的进一步处置等。在研究多个药剂的反应性时，使用本发明的情况下，可以从多个药剂中示出用于处置上述状态的药剂。进行分析时，可以基于药剂的给药或上述处置的前后的、上述对象中的本发明的RNA的修饰信息(例如甲基化)的比较来进行分析。
本发明的一实施方式中，可以进一步考虑关于生物学状态或医学状态的分析的对象的、选自由其年龄、性别、人种、血统信息、病史、治疗史、吸烟状态、饮酒状态、职业信息、生活环境信息、疾病标志物信息、核酸信息(包括对象中的细菌的核酸信息)、代谢物信息、蛋白质信息(例如表达量信息、结构信息)、肠内细菌信息、表皮细菌信息及这些中的任意者的组合组成的组中的至少一种信息来进行分析。作为本发明的方法中可利用的核酸信息，可列举选自由基因组信息、表观遗传信息、转录组的表达量信息、RIP测序信息、微小RNA的表达量信息及这些中的任意者的组合。作为可分别利用的RIP测序信息，可包括抗药泵P-糖蛋白的RIP测序信息、粪便的RIP测序信息、粪便中的大肠杆菌的RIP测序信息等。
本发明中，可以还基于耐受药剂或处置的抗性株、或该抗性株与源自该抗性株的细胞株的组合中的上述RNA上的修饰信息来分析上述对象的上述状态。作为这类药剂或处置，可列举例如Lonsurf(TAS102)、吉西他滨、CDDP、5-FU、西妥昔单抗、核酸药物、组蛋白脱甲基化酶抑制剂、或者利用重粒子射线(例如Carbon/HIMAC)或X射线的处置，但不限于这些。
可以根据分析目的而增减作为本发明的分析对象的RNA的种类，例如，可以对至少5种、至少10种、至少20种、至少30种、至少50种、至少100种、至少200种、至少300种、至少500种、至少1000种、至少1500种、至少2000种RNA上的修饰信息进行分析。或者，在以微小RNA为对象时，可以以能够利用的全部微小RNA为对象。RNA的种类没有特别限定，可以使用mRNA、tRNA、rRNA、lncRNA、miRNA等中的单独一种、或将其中的多种组合使用。一实施方式中，可以分析包含相同序列的RNA上的多种修饰信息。另一实施方式中，可以还基于RNA的结构信息来对对象的状态进行分析。
一实施方式中，可以包括下述步骤：还基于敲除了甲基化酶(例如Mettl3、Mettl14、Wtap)、脱甲基化酶(例如FTO、AlkBH5)及甲基化识别酶(例如YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3等具有YTH结构域的家族分子)中的至少一种的生物中的RNA的修饰信息和/或甲基化酶(例如Mettl3、Mettl14、Wtap)、脱甲基化酶(例如FTO、AlkBH5)及甲基化识别酶(例如YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3等具有YTH结构域的家族分子)中的至少一种的识别基序信息来分析上述对象的上述状态。
一实施方式中，可以实施下述工序：基于多个修饰信息计算状态的概率。作为计算工序，可以实施任意的统计学方法，例如，可以实施主成分分析等。
一实施方式中，可以研究已积累了临床证据的抗癌剂(例如Lonsurf(TAS102)、吉西他滨、CDDP、5-FU、西妥昔单抗、核酸药物或组蛋白脱甲基化酶抑制剂)对肿瘤组织的药效并建立治疗策略。
一实施方式中，可以阐明各种药剂的新的作用机制，开发可用于进一步的治疗策略的中分子化合物，例如，可以用于建立攻克难治性晚期癌症的策略。
一实施方式中，通过用本发明的方法分析微小RNA，可以进一步阐明作用机制。即，可以使用本发明的方法分析对抗癌剂等药剂为特异性的微小RNA，并使用其设计伴随诊断药。
一实施方式中，可以使用通过微创液体活组织检查得到的末梢血中的miRNA实施伴随诊断。例如，将使用了药剂(例如Lonsurf(TAS102)、吉西他滨、CDDP、5-FU、西妥昔单抗、核酸药物或组蛋白脱甲基化酶抑制剂)的临床信息与末梢血中的miRNA的数据进行对比，再与抵抗该药剂的抗性细胞中的机制分析进行对比，将对该药剂暴露进行应答、从而由染色质转录的miRNA和作为外来体而分泌到末梢血中的miRNA制成60个面板并进行鉴定。本发明提供对这样的面板微小RNA进行鉴定、进一步对其进行分析的技术。
一实施方式中，本发明可以进行关于癌干细胞或癌起源细胞(Cancer InitiatingCell，CIC)的分析。
一实施方式中，本发明的分析还可以用于经修饰的RNA本身成为药物的靶分子的场合。即，通过使用本发明的分析技术检测RNA的修饰或无修饰，可以进行新药的筛选。特别地，以往并不知晓将微小RNA等RNA的修饰(例如甲基化)用于这样的新药筛选的技术，本发明可提供基于新的作用机制的药剂。
另一实施方式中，在经修饰的RNA本身成为药物的成分分子时，也可以应用本发明的分析。例如，通过用本发明的分析技术检测RNA的修饰或无修饰、从而分析作为对象的RNA修饰物或负责该修饰的酶等外部因子能否作为药剂来使用，由此可以进行新药筛选。
可理解的是，除了进行RNA修饰的分析以外，本发明还可以组合RNA修饰以外的其它核酸信息、例如核酸(DNA、RNA等)的碱基取代和/或修饰的信息进行分析。关于多种组学分析，可以与Sijia Huang et al.,Front Genet.2017；8:84、Yehudit Hasin et al.,Genome Biol.2017；18:83等RNA修饰(表观转录组)以外的组学的多种组学分析技术进行组合。
关于其它核酸信息，例如可以利用质谱等进行分析，例如可以对RNA应用RIP-seq，对DNA应用DIP-seq，在FDNA中用BrdU等进行FDIP-seq、从而进行分析。
一实施方式中，本发明的分析技术可以基于临床证据阐明新的机制。
另一实施方式中，本发明可以进行药物开发靶点的研究。例如，可以开发以多个分子的复合体与靶点之间的相互作用为靶标的、低或中分子化合物的新药，在进行文库筛选、使用类器官或动物个体进行表型筛选时，可以使用本发明的RNA mod的分析技术。
一实施方式中，本发明可以用于应对肿瘤多样性的药物开发中。除了本发明的RNAmod(例如微小RNA的甲基化信息)以外，还可以组合ChIP-seq、结合有FTD的修饰DNA的单分子计测、以及肿瘤组织的间质的CAF(Cancer Associated Fibroblasts，肿瘤相关成纤维细胞)、淋巴细胞的单细胞分析(C1)等而应用。在向患者给药药剂时，可以不仅把握癌细胞的应答、还综合把握包括肿瘤间质等宿主侧的应答在内的应答。若可以有效利用RNA mod的信息而对抑制剂进行分类，则可以研发出差别化对待癌细胞侧或间质侧的革新性药品。
一实施方式中，对于某种药剂，本发明可以用于(1)将适应症扩大到其它疾病、(2)显示相对于其它现有药剂的优效性，并且使其进入二线治疗以前、(3)阐明新的作用机制，检验与治疗药关联的可能性等。
一实施方式中，例如，可以准备作为癌症患者等患者的液体活组织检查的、血清外来体内miRNA的表达信息，对于作为分析对象的、治疗后的患者的血清外来体内miRNA的表达信息、本发明的修饰信息进行分析。因此，例如，若为结肠癌，则可以使用例如总共1000例的数据库(肿瘤基因组图谱-癌基因组；TCCA)分析晚期大肠癌患者的血清外来体内mi RNA的表达信息、修饰信息。
另外，可以分析治疗后的大肠癌患者的血清外来体内miRNA的表达信息、修饰信息。
一实施方式中，本发明可以基于分析结果提基于RNA修饰信息的下一代RNA生物标志物，可以将其用于临床。本发明例如可以通过微小RNA分子组学把握组织的动态，可以使用其并用于临床。
在使用本发明的RNA的信息的分析中，关键点可能在于，靶点为转录因子、即成为(多种情况下精确地)控制靶基因表达的关键诱导因子。这种情况下，可以通过严格筛选独立的转录因子来逐步缩减数量。例如，值得一提的是，若使用本发明的方法，在癌症诊断中可以在很早时发现具有癌基因作用的“c-myc”的释放。可理解的是，若存在癌基因则转录因子会丧失有限的独立性，在细胞背景下逐渐产生各种作用，因此无法准确地求出最小数值。可知，在这种情况下“c-myc”存在在横向上作用较多的对多作用，因此成为噪音。
本发明的优选实施方式中使用miRNA(micro R)，这种情况下，特征为多对多。即，1个micro R对于多个起多种作用，且在作为不同分子的微小RNA间共享共通的靶点，这也可以称为关键点之一。在这样的“多对多”的控制系统中，存在诱导某种事件的重要集合、且其不是单个分子，这并不令人吃惊。不如说，其为限定性的集合、或可以用表示其在该集合中的层次的权重值来示出，者也是本发明所提供的分析的特征。
一实施方式中，设想用微小RNA的RNA分子组学来诊断癌症，但不限于此，还可设想抗药性(不仅是抗癌剂，也可以是分子靶向药、抗体药品、或核酸等生物制剂、进一步扩展为微生物来源的抗生素等)、种群的分类、炎症性肠病、大肠杆菌、食品分类(产地、年龄、味道、品质、最佳食用期、口味)等。可以食用RNA分子组学来选择曲酵母。
一实施方式中，例如5-FU与CDDP等其它药剂的IC50分布明显不同，已知5-FU在有效时则非常有效、在无效时则可以说根本没效果，通过表观转录组也可以获知这一点。例如我们获知，若观察微小RNA，则与观察表达时相比观察表观转录组的方式能够通过主成分分析(PCA)而明显地差别化、精确地会指出分类线(参照实施例)。
已知RNA甲基化与昼夜节律有关(Sanchez等、Nature.2010 Nov 4；468(7320):112-6及Jean-Michel等、Cell Vol.155,Issue 4,pp.793-806 7 November 2013等)。一实施方式中，可以使用RNA修饰信息，来分析与时差有关的睡眠活动(时差紊乱等)。例如，可以基于这样的分析来确定对象的睡眠活动是否会受时差的影响、以及实施与此相关的人事或医疗管理、飞行员或空乘人员的管理、是否建议服用褪黑素的层次化等。一实施方式中，可以使用RNA修饰信息来分析航天方面的时差紊乱。
一实施方式中，可以使用RNA修饰信息来对对象的睡眠是否充分进行分析。隐藏的睡眠不足会成为问题，通常本人没有自觉症状。因此，可以使用RNA修饰信息来纠正该问题。一实施方式中，与睡眠生活疗法保持一致。一实施方式中，可以使用RNA修饰信息进行长途公交驾驶员的健康管理。一实施方式中，可以使用RNA修饰信息进行福利管理。一实施方式中，可以使用RNA修饰信息进行夜班工人(钢铁厂、核电站、医院、医疗从业者、安保人员、物业公司等)的健康管理。
一实施方式中，可以使用血液试样的RNA修饰信息对于对象年龄(根据需要，不使用核酸的碱基序列信息)进行分析，供犯罪调查中使用。
一实施方式中，可以使用RNA修饰信息分析有无掺杂。
(生物标志物筛选)
一实施方式中，可以使用取得的RNA修饰信息来寻找新的生物标志物。一实施方式中，可以将由处于某状态的对象取得的RNA修饰信息与由不处于该状态的对象取得的RNA修饰信息进行对比，将在RNA修饰状态(例如量、修饰位置等)方面观察到差异(例如统计学上的显著差异)的RNA或RNA组作为用于预测该状态的生物标志物。
一实施方式中，可以将由实施了药物和/或处置的对象取得的RNA修饰信息与由未实施该药物和/或处置的对象取得的RNA修饰信息进行对比，将在RNA修饰状态(例如量、修饰位置等)方面观察到差异(例如统计学上的显著差异)的RNA或RNA组作为用于预测对该药物和/或处置的反应性和/或抗性的生物标志物。
(抗性株)
一实施方式中，可以将由对药物和/或处置有抗性的抗性株取得的RNA修饰信息与由作为该抗性株的来源的野生株取得的RNA修饰信息进行对比，将在RNA修饰状态(例如量、修饰位置等)方面观察到差异(例如统计学上的显著差异)的RNA或RNA组作为用于预测对该药物和/或处置的反应性和/或抗性的生物标志物。
这样的抗性株例如可以通过在药物和/或处置的存在下进行野生株的维持培养来制作，一个方面中，本发明提供这样的抗性株的制作方法。一个方面中，可基于针对该药物和/或处置的IC50来评价针对药物和/或处置的抗性株是否为抗性株。一个方面中，本发明提供对三氟尿苷(FTD)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、顺铂、西妥昔单抗、Carbon/HIMAC(重粒子射线)及X射线分别具有抗性的抗性株。
(药物筛选)
一实施方式中，可以使用取得的RNA修饰信息对新药进行评价。一实施方式中，可以通过将由用某药物处置后的对象取得的RNA修饰信息与由用其它药物处置后的对象取得的RNA修饰信息进行对比，由此基于通过各药物的处置而改变的RNA对药物进行分类。
(种属分类)
一实施方式中，可以使用取得的RNA修饰信息对生物种属进行分类。一实施方式中，可以使用取得的RNA修饰信息对微生物(例如大肠杆菌)进行分类。一实施方式中，可以使用取得的RNA修饰信息对微生物(例如大肠杆菌)进行分类。一实施方式中，可以使用编码抗药泵P-糖蛋白的RNA上的修饰信息对微生物(例如大肠杆菌)进行分类。一实施方式中，可以基于微生物(例如大肠杆菌)的分类结果对取得该微生物的对象(例如人等哺乳动物、食品等)进行分析。
(食品)
一实施方式中，可以使用取得的RNA修饰信息分析食品的品质。作为食品的品质，可列举例如产地、年龄、加工后经过时间、鲜度、加工后变性、味道品质、活性氧状态、微生物污染(大肠杆菌、沙门氏菌、肉毒梭菌、病毒、寄生虫等)、发酵状态(包括与发酵有关的微生物的状态)、化学因素(例如农药、添加剂等)、物理因素(例如异物、放射线等)、脂肪酸状态或后熟度等，但不限于这些。一实施方式中，可使用取得的RNA修饰信息来分析食品的品质，以便行政机关等公共机构进行食品的品质管理。一实施方式中，可以使用取得的RNA修饰信息来分析食品的品质，以便向消费者提供用于判断制品品质的指标(客观地表示由味道、气味来表现的情况)。
另外，通过使用本发明，可以提供将视角从DNA、RNA、蛋白质变为RNA修饰(例如甲基化)时的新的拓展。例如，DNA、RNA会随着分解而丧失连续的碱基序列的信息(逐渐变短、片段化)，而甲基化是表现其本质的，只要靶位点存在就可以以甲基化率表现出来，因此在可以监测“原本存在的因素在经时变化中如何逐渐地衰减、其是否残留”这一点上是独一无二的。蛋白质不仅介于两者之间、而且在本申请中靶点不固定，因此在作为追踪工具、示踪剂方面有局限性，因此可以说与DNA、RNA、蛋白质不同、可发挥特别优异的效果。
(追加信息的利用)
一实施方式中，可以在由对象取得的RNA修饰信息的基础上使用其它信息、例如在其它时刻由对象取得的RNA修饰信息(例如处置的前后)、关于该对象的信息、与修饰有关的蛋白质的基序信息、由其它对象取得的关于RNA修饰的信息、关于可结合RNA的物质(蛋白质、脂质等)与RNA的复合体的信息(根据需要，与RNA修饰状态有关的状态)等来对对象的状态进行分析。
作为可追加使用的关于对象的信息，可列举例如对象的年龄、性别、人种、血统信息、病史、治疗史、吸烟状态、饮酒状态、职业信息、生活环境信息、疾病标志物信息、核酸信息(包括对象中的微生物的核酸信息)、代谢物信息、蛋白质信息、肠内细菌信息、表皮细菌信息等。作为核酸信息，可列举例如基因组信息、基因组修饰信息、转录组信息(包括表达量及序列的信息)、RIP测序信息、微小RNA的信息(包括表达量及序列的信息)。作为可分别使用的RIP测序信息，可列举抗药泵P-糖蛋白的RIP测序信息、粪便的RIP测序信息、粪便中的大肠杆菌的RIP测序信息等。
作为可追加使用的与修饰有关的蛋白质的基序信息，可列举添加修饰的酶的识别基序信息、除去修饰的酶的识别基序信息、及与修饰结合的蛋白质的识别基序信息，具体可列举甲基化酶(例如Mettl3、Mettl14、Wtap)、脱甲基化酶(例如FTO、AlkBH5)及甲基化识别酶(例如YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3等具有YTH结构域的家族分子)等的基序信息。
作为可追加使用的由其它对象取得的关于RNA修饰的信息，可列举例如处于某状态的对象的RNA修饰信息、对与修饰相关的蛋白质的表达进行了基因操作的生物的RNA修饰信息、对药物和/或处置有抗性的抗性株的RNA修饰信息、实施了药物和/或处置的对象的RNA修饰信息、关于可结合RNA的物质(蛋白质、脂质等)与RNA的复合体的信息(根据需要，与RNA修饰状态有关的状态)，但不限于这些。
本发明中，可以还基于耐受药剂或处置的抗性株或该抗性株与源自该抗性株的细胞株的组合的上述RNA上的修饰信息来分析上述对象的上述状态。作为这类药剂或处置，可列举例如Lonsurf(TAS102)、吉西他滨、CDDP、5-FU、西妥昔单抗、核酸药物、组蛋白脱甲基化酶抑制剂、或利用重粒子射线(例如Carbon/HIMAC)或X射线的处置，但不限于这些。
(对象状态分析方法)
一实施方式中，本发明提供一种对对象的状态进行分析的方法，其包括：取得对象中的至少一种RNA(例如微小RNA)上的修饰(例如甲基化)信息的取得步骤；和基于该修饰信息分析该对象的状态的步骤。修饰信息可以通过对来自对象的试样进行测定而取得。一实施方式中，分析为在取得试样后的短时间内(例如1天以内、10小时以内、5小时以内、2小时以内、1小时以内、30分钟以内、15分钟以内等)进行测定的现场分析。一实施方式中，在取得试样起的短时间内(例如1天以内、10小时以内、5小时以内、2小时以内、1小时以内、30分钟以内、15分钟以内等)输出现场分析的分析结果。一实施方式中，在取得试样后将试样送至有测定器和/或分析器的场所，中此处实施分析。试样的取得可由对象自身来进行。一实施方式中，取得的试样可以冷冻后送达。可以将分析结果传送给送样者，也可以通过访问因特网上的网站而使用分析结果。
例如，在医院等医疗机构中实施本发明的方法时，由对象(例如患者或有患病等风险的被检者等)取得试样(例如血液、摘出器官、粪便等)，对该试样进行处理而纯化出目标RNA(例如微小RNA)，鉴定该目标RNA的修饰信息。可以基于由此而鉴定的RNA的修饰信息来对对象的状态(例如罹患癌症及癌症复发的可能性、对特定的药物治疗获得抗性的可能性等)进行分析。一次中取得的RNA的修饰信息可以用于其它对象的状态分析，也可以用于同一对象的不同时刻的状态的分析，还可以积累成数据库。
例如，在制药公司等研究机构中实施本发明的方法时，对由对象取得的试样(例如实验动物的组织或器官、临床试样、培养细胞等)进行处理而纯化出目标RNA(例如微小RNA)，鉴定该目标RNA的修饰信息。可以将由此而鉴定出的RNA的修饰信息与通过其它分析确认的同一对象的状态(例如癌症的状态、获得了抗性的状态、药物发挥治疗效果的状态等)建立相关并积累信息。可以基于由此取得的RNA的修饰信息来确定适宜用于对象(患者或有患病等风险的被检者等)的状态的药物。
(程序)
1个方面中，本发明提供将基于RNA的修饰信息对对象的状态进行分析的方法安装于计算机的程序。该程序所安装的方法包括：(a)将对象中的至少一种RNA上的修饰信息与该RNA的参照修饰信息进行比较的步骤；及(b)基于该进行比较的步骤的输出结果对该对象的该状态进行判定的步骤。一实施方式中，参照修饰信息包括不同于上述对象的对象的上述RNA上的修饰信息。一实施方式中，参照修饰信息包括与上述修饰信息在不同的时刻取得的、上述对象的上述RNA上的修饰信息。
1个方面中，本发明提供一种容纳有程序的记录介质，所述程序将基于RNA的修饰信息对对象的状态进行分析的方法安装于计算机。该记录介质所容纳的程序所执行的方法包括：(a)将对象中的至少一种RNA上的修饰信息与该RNA的参照修饰信息进行比较的步骤；及(b)基于该进行比较的步骤的输出结果对该对象的该状态进行判定的步骤。一实施方式中，参照修饰信息包括不同于上述对象的对象的上述RNA上的修饰信息。一实施方式中，参照修饰信息包括与上述修饰信息在不同时刻取得的、上述对象的上述RNA上的修饰信息。
(系统)
1个方面中，本发明提供基于RNA的修饰信息对对象的状态进行分析的系统。系统包含：(a)对RNA进行测定的测定部；(b)基于该测定的结果计算RNA上的修饰状态的计算部；及(c)基于该修饰状态分析该对象的状态的分析部。一实施方式中，系统还包含对试样进行处理而纯化出目标RNA的试样处理部。
测定部只要基于提供RNA的修饰信息的功能及配置则可以采取任意的构成。可以以与计算部、分析部相同或不同的结构来提供。一实施方式中，测定部为质谱仪(例如MALDI-MS)。一实施方式中，测定部为测序装置。
计算部基于测定数据鉴定RNA上的修饰状态(例如修饰位置、修饰的量等)。
分析部基于得到的RNA修饰信息来对对象的状态进行分析。一实施方式中，可以进一步参照上述的追加信息来实施分析。
参照图34的功能框图来说明本发明的系统的构成。需要说明的是，本图中示出了以单一系统来实现的情况，但是应理解以多个系统来实现的情况也包括在本发明的范围内。该系统中所实现的方法可以记载为程序。这样的程序可以记录在记录介质中并可以作为方法来实现。
本发明的系统1000构成为：在内置于计算机系统的CPU1001上，介由系统总线1020连接有RAM1003、ROM、SSD、HDD、磁盘、USB存储器等闪存存储器等外部存储装置1005及输入输出接口(I/F)1025。输入输出I/F1025上分别连接有键盘、鼠标等输入装置1009、显示器等输出装置1007、及调制解调器等通信设备1011。外部存储装置1005具备信息数据库容纳部1030和程序容纳部1040。均为保持于外部存储装置1005内的物理存储区域。
这样的硬件构成中，介由输入装置1009输入各种指令(命令)，或者介由通信I/F、通信设备1011等接收命令，从而安装在该存储装置1005中的软件程序被CPU1001调用至RAM1003上、并扩展和执行，由此与OS(操作系统)协同地执行本发明的功能。当然，也能通过这样的协同情况以外的机制来实现本发明。
在实现本发明时，在进行RNA试样的测定(例如质谱和/或测序)得到RNA修饰数据的情况下，进行该测定而得到的RNA修饰数据或与其同等的信息(例如进行模拟而得到的数据)可介由输入装置1009而输入、或介由通信I/F、通信设备1011等而输入、或已容纳在数据库容纳部1030中。进行该RNA试样的测定(例如质谱和/或测序)而得到RNA修饰数据、对该RNA修饰数据进行分析的步骤可以通过容纳于程序容纳部1040的程序或介由输入装置1009输入各种指令(命令)、或者通过介由通信I/F或通信设备1011等接收命令、或者通过该外部存储装置1005中安装的软件程序来执行。进行这样的分析的软件可以使用实施例中例示的软件，但不限于此，可以使用该领域中公知的任意软件。进行了分析的数据可以通过输出装置1007而输出或容纳于信息数据库容纳部1030等外部存储装置1005。
数据库容纳部1030中随时写入、更新这些数据、计算结果或介由通信设备1011等取得的信息。通过各主表来管理各输入序列集合中的各序列、参照数据库的各RNA信息ID等信息，从而能够通过各主表中定义的ID来管理成为积累对象的归属于试样的信息。
数据库容纳部1030可以将上述计算结果与由同一试样得到的其它的核酸信息等各种信息、生物体信息等已知的信息建立关联并容纳。可以将能够通过网络(因特网、内部网等)获取的数据直接建立这样的关联或作为网络的链接而建立这样的关联。
另外，容纳于程序容纳部1040的计算机程序作为上述处理系统、例如实施提供数据、分析修饰状态、与参照数据进行比较、分类、聚类、其它处理等的系统而构成计算机。上述各功能分别为独立的计算机程序、其模块、例程等，通过由上述CPU1001执行，从而作为各系统、装置来构成计算机。
(试剂)
一实施方式中，本发明提供一种组合物，其用于为了基于RNA的修饰信息判定对象的状态、而纯化其修饰与状态相关的RNA，所述组合物包含用于捕捉该对象中的至少一种RNA的手段。一实施方式中，用于进行捕捉的手段包含与目标RNA至少部分互补的核酸。一实施方式中，用于进行捕捉的手段包含用于捕捉经修饰的RNA的手段(例如修饰特异性抗体等)。一实施方式中，用于进行捕捉的手段包含对经修饰的目标RNA为特异性的分子。一实施方式中，用于进行捕捉的手段包含用于进行纯化的部分(例如可带磁性的载体、能相互结合的成对物质中的一方(例如生物素及链霉亲和素))。一实施方式中，用于进行捕捉的手段包含连接于用于进行纯化的部分的接头。
(平板、芯片)
一实施方式中，本发明提供用于基于至少一种RNA的修饰信息来判定对象的状态的平板或芯片，在平板或芯片的表面配置有用于捕捉该RNA的手段。一实施方式中，该平板或芯片用于MALDI测定。一实施方式中，该平板或芯片具有多个点，在各点处分别配置有捕捉具有不同序列的RNA的手段。一实施方式中，各点的大小可以是例如直径10μm～100μm。一实施方式中，1个平板或芯片上可形成有1、2、3、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、300、400、500、750、1000、1500、2000、2500或3000个点。一实施方式中，在各点处可配置10 7以上的进行捕捉的手段。一实施方式中，进行捕捉的手段为与目标RNA至少部分互补的核酸。作为平板或芯片的基材，没有限定，可列举例如赋予了导电性的玻璃及塑料(聚乙烯)等。
当不同的点彼此相互靠近时，在为了通过MALDI等将点所含的RNA电离而对点照射激光时，处于目标点周围的其它点也可能被激光照射。其结果是，在利用质谱的片段化测定中，产生来自靠近的点的信号的干扰，可能影响目标点的计测值。因此，一实施方式中，可以以使信号间的干扰的影响降低或最小化的方式来配置平板或芯片上的点。一实施方式中，可以基于配置于各点的各RNA的片段化(可以基于实测结果，也可以基于理论)所产生的m/z值之间的重叠和/或差异，来评价信号间的干扰的影响。此时，各RNA的片段化所产生的m/z值可以考虑或不考虑由存在修饰而导致的质量数增减。一实施方式中，基于蒙特卡罗法等的数理统计方法来配置平板或芯片上的点。
(试剂盒)
一实施方式中，本发明提供一种试剂盒，其为用于基于RNA的修饰信息来判定对象的状态的试剂盒，其包含用于纯化目标RNA的组合物、配置有捕捉目标RNA的手段的平板或芯片、及至少一种用于由该对象取得试样的设备、以及如何使用试剂盒的说明书。一实施方式中，试剂盒包含用于从试样纯化RNA的手段。
一实施方式中，试剂盒为以适合于MALDI测定的方式处理试样的类型。一实施方式中，试剂盒还包含MALDI测定中使用的涂布剂(例如，包含3-羟基吡啶甲酸)。
一实施方式中，试剂盒用于从对象取得试样。一实施方式中，包含用于从对象取得试样的设备的试剂盒中包含记载了试样的交付地址的说明书。一实施方式中，试剂盒包含用于冷冻保存所采集的试样的手段。一实施方式中，试剂盒包含用于从对象取得血液、粘膜表皮(例如口腔、鼻腔、耳腔、阴道等的粘膜表皮)、皮肤表皮、生物体分泌液(例如唾液、鼻水、汗液、泪液、尿液、胆汁等)、粪便、表皮上微生物的设备。
(一般技术)
本说明书中使用的分子生物学方法、生化方法、微生物学方法为该领域中公知惯用的方法，例如记载于Current Protocols in Molecular Biology(http://onlinelibrary.wiley.com/book/10.1002/0471142727)及Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Fourth Edition)(http://www.molecularcloning.com)等，这些中的相关部分(可以是全部)作为参考而引用到本说明书中。
本说明书中，在可以采用文章中列挙的事项中的“至少1个以上”时，使用“或”。“或者”也同样。本说明书中，在明确记载为“2个值”的“范围内”的情况下，该范围中也包括2个值本身。
关于本说明书中引用的科技文献、专利、专利申请等参考文献，与分别且具体地记载其整体时同等程度地作为参考而引用到本说明书中。
以上，为了便于理解本发明而示出、说明了优选的实施方式。以下基于实施例说明本发明，但是上述的说明及以下的实施例仅处于例示目的而提供，不是出于限定本发明的目的而提供。因此，本发明的范围不受本说明书中具体记载的实施方式以及实施例限定，仅受权利要求书限定。
实施例
以下记载实施例。
关于试剂类，使用了实施例中具体记载的制品，也可以用其它厂商(Sigma-Aldrich,Wako Pure Chemical、Nacalai Tesque、R&D Systems、USCN Life Science INC等)的同等产品代替。
(缩写)
除了本说明书中已说明的简称以外，还使用以下简称。
3-HPA(3-羟基吡啶甲酸)
DHC(柠檬酸二铵)
在以下的实施例中，使用以下的微小RNA上的甲基化作为例子来实施RNA的甲基化的检测(表中的下划线表示甲基化。)。本领域技术人员可理解，对于这些以外的RNA的修饰，也能够同样地分析。
[表3]
Figure BDA0002735305390000901
·通用规程
以下例示出本说明书中使用的标准规程。
(RNA提取)
从试样提取总RNA时，按照说明书来使用TRIzol(Invitrogen)。
(目标RNA的纯化)
在纯化特定的RNA时，使用与各RNA互补的寡聚DNA。
本说明书中，对于下表的人miRNA，分别设计了互补的寡聚DNA。
[表4]
靶RNA的序列
Figure BDA0002735305390000911
＊左侧为5’末端，右侧为3’末端。
合成了与这些靶RNA互补的DNA(捕捉寡聚DNA)。
[表5]
用于捕捉靶RNA的寡DNA序列
名称 序列
捕捉17-5p CTACCTGCACTGTAAGCACTTTG(序列号6)
捕捉21-5p TCAACATCAGTCTGATAAGCTA(序列号7)
捕捉200c-5p CCAAACACTGCTGGGTAAGACG(序列号8)
捕捉200c-3p TCCATCATTACCCGGCAGTATTA(序列号9)
捕捉let7a-5p AACTATACAACCTACTACCTCA(序列号10)
通过与公知的序列数据库对照，确认这些捕捉寡聚DNA与目标RNA以外的RNA发生杂交的可能性低。
(直接结合珠)
如下制作了直接结合珠。向上述捕捉寡聚DNA的5’端的磷酸部分导入6-氨基己基。用2价的氨基交联接头(BS3、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯)，将各捕捉修饰的寡聚DNA与表面共价连接有氨基的磁珠(Dynabeads M270 Amine、Thermo Fisher Scientific、东京)连接。
[化1]
Figure BDA0002735305390000921
(链霉亲和素结合珠)
也制作了其它类型的珠。向上述捕捉寡聚DNA的5’端的磷酸部分导入生物素。将表面共价结合有链霉亲和素的磁珠(Dynabeads M270 Streptoavidin、Thermo FisherScientific)与上述的生物素化的捕捉寡聚DNA混合而产生亲和素-生物素结合，将捕捉寡聚DNA固定在磁珠上。
另外，还使用了使生物素化的捕捉寡聚DNA与目标RNA杂交后、用磁珠进行纯化的规程。
(用于直接结合珠的纯化规程)
该规程是对J.Engberg等、Eur.J.Biochem,41,321-328(1974)的方法的改进。
在使用多种捕捉寡聚DNA的情况下，将试样分成份，对各份试样使用一种捕捉寡聚DNA。
具体如下。
1.向试样中添加上述捕捉寡聚DNA结合珠中的一种和6xSSPE(0.9M NaCl、60mMNaH2PO4、7.5mM EDTA、pH7.4)10mL。
2.加入变性液D(4M硫氰酸胍、25mM柠檬酸(pH7.0)、0.5％肌氨酸、0.1M 2-巯基乙醇)5mL(硫氰酸胍的终浓度为1.25M)。
3.60℃下加热10分钟后，室温下涡旋45分钟。
4.使用磁力架除去上清，将珠用BW Buffer(10mM Tris-HCl、pH7.5、1mM EDTA、2.0M NaCl)1mL洗涤4次，用Volatile Rinse Buffer(10mM乙酸铵、pH7.0)1mL洗涤2次。
5.完全除去洗涤液后，向珠加入100μL的RNase free SDW，70℃下加热3分钟后，在冰上骤冷，回收上清。
6.浓度低的情况下，对上清进行冷冻干燥。
(用于链霉亲和素结合珠的纯化规程)
使用多种捕捉寡聚DNA的情况下，将试样分成份，对各份试样使用一种捕捉寡聚DNA。
1.向纯化RNA中加入盐类溶液及上述生物素化捕捉寡聚DNA，使终浓度为10mM磷酸缓冲液(pH7.0)、50mM KCl。
2.将混合物设置于PCR装置，90℃下变性1分钟，缓慢冷却到45℃而使其退火。
3.添加亲和素磁珠(Dynabeads M-280Streptavidin)。
4.在磁力架上弃掉非吸附级分(上清)。
5.使用10mM磷酸缓冲液pH7.0、50mM KCl在磁力架上将珠洗涤3次。
6.使用10mM乙酸铵(pH7.0)，在磁力架上将珠洗涤3次后，用RNase free water洗脱。
7.在浓度低的情况下，对上清进行冷冻干燥。
(硫酸二甲酯处理)
关于硫酸二甲酯处理，按照以下所示的步骤进行反应。以使纯化RNA达到100μM的方式分别单独溶解于10mM的磷酸缓冲液(pH7.5)，以终浓度0.5％的方式添加用时调整的15％硫酸二甲酯的乙醇溶液，25℃下处理1分钟。以终浓度达到2％的方式添加β巯基乙醇，充分搅拌而终止反应。
(氯乙醛处理)
关于氯乙醛处理，按照以下所示的步骤进行反应。以使纯化RNA达到100μM的方式分别单独溶解于10mM的磷酸钾(pH5)，以终浓度为1％的方式添加溴乙醛或氯乙醛，37℃下处理2小时。利用乙醚萃取而除去过量的溴乙醛或氯乙醛后，干燥掉水层，得到残渣。
(纯化RNA的质谱测定)
根据需要用Zip Tip C18(Millipore)对RNA试样进行纯化。
向乙腈：0.1％TFA水溶液＝1：1的溶液中添加3-HPA(3-羟基吡啶甲酸)，使其达到10mg/mL，将该溶液和10mg/mL的DHC(柠檬酸二铵)水溶液以1：1的比例混合而得的混合液1μL作为MALDI用基质(涂布剂)，涂布于靶平板(Target Plate MTP Anchor Chip 384(600micrometer)、Bruker Dalotnics)并干燥。在其相同位置重叠1μL的纯化RNA水溶液并干燥。确认完全干燥后，用MALDI型质谱仪(ultrafleXtreme-TOF/TOF质谱仪、BrukerDalotnics公司制)进行质谱。
MALDI的装置设定如下所述。
positive-mode(阳离子检测模式)
reflector-mode(反射模式)
Laser Power Max(能够设定的最大输出)
(质谱仪测定结果的分析)
如下进行MALDI中得到的测定结果的分析。
基于由miRBase(Release 21)(http://www.mirbase.org)取得的微小RNA的序列信息制作推测质量列表，与测定得到的质谱图对比，通过手册确定序列及修饰。
(RIP测序测定)
关于RIP测序，按照以下的规程来实施。
此为以3个15cm培养皿的亚融合细胞为1个样品时的规程。对一个15cm培养皿使用2ml的Trizol(Invitrogen)，从3个15cm培养皿可以回收500μg～700μg的RNA。另外，对于1ml血清，可以使用2ml的Trizol(Invitrogen)而回收RNA。
使用的试剂等
[表6]
Figure BDA0002735305390000951
(A)ployA RNA的纯化
按照Oligotex(注册商标)(宝生物)试剂盒的规程进行ployA纯化。
＊用75℃的DW 30μL进行3次提取，合计回收90μL。
＊由总RNA得到1～3％的polyA RNA。
＊1个样品需要polyA RNA 5μg。
(B)RNA片段化
[表7]
Figure BDA0002735305390000952
1.将RNA调节为750ng/18μL。
2.将RNA 750ng/18μL+10X裂解缓冲液2μL、即合计20μL分配到8连管的各孔中。
3. 90℃下孵育2分钟。
4.向20μL的反应液中快速地加入EDTA(0.5M)2μL而终止反应。
5.对于每个样品收集反应液，进行乙醇沉淀。
例：RNA 200μL
+3M乙酸钠(pH5.2)20μL(RNA的1/10量)
+糖原(20mg/ml储备液)3.6μL(200倍)
+100％乙醇500μL(RNA的2.5倍)
6.-80℃下孵育1小时。
7.离心分离(12000G、30分钟、4℃)
除去上清，加入75％乙醇1ml。
离心分离(12000G、15分钟、4℃)
除去上清，用200μL的RNAse free water溶解。
8.将各样品10μL作为INPUT，-80℃下保存。
(C)RNA抗体复合体的形成
[表8]
Figure BDA0002735305390000961
将以上混合，一边涡旋一边在4℃下孵育2小时。
(D)利用磁珠的免疫沉降
1.对于1个样品，使用Dynabeads ProteinG(Thermo Fisher Scientific)50μL，用1xIP缓冲液1ml洗涤2次。
2.向通过磁性而分离的珠加入1xIP缓冲液1ml+RVC 10μL+RNAse抑制剂1μL+BSA(10mg/ml)50μL，一边涡旋一边在4℃下孵育2小时(抑制珠的非特异性结合)。
3.将珠用1XIP缓冲液1ml+RVC 10μL+RNAse抑制剂1μL洗涤2次。
4.对于每一样品，分别向通过磁性而分离的珠中加入步骤(C)的反应液，一边涡旋一边在4℃下孵育2小时(或一晚)。
(E)洗脱
1.用洗涤缓冲液(1XIP缓冲液10ml+RVC 10μL+RNAse抑制剂5μL)将步骤(D)的珠洗涤3次。
[表9]
Figure BDA0002735305390000971
2.对于一个样品，加入100μL洗脱缓冲液，每15分钟涡旋一次，通过在4℃下孵育2小时。
3.将珠进行磁性分离，回收上清。
4.进一步从(1XIP缓冲液1ml+RVC 10μL+RNAse抑制剂1μL)中取100μL加入珠中，叩击，对珠进行磁性分离，回收上清。
5.重复上述5～7的步骤，回收上清，将2次的量合并。
6.将上清400μL+乙酸钠40μL+100％乙醇1000μL混合，进行乙醇沉淀。
(不加糖原等载体)
7.-80℃下静置一晚。
8.离心分离(12000G、30分钟、4℃)
除去上清，加入75％乙醇1ml。
离心分离(12000G、15分钟、4℃)
9.将颗粒用15μL的RNAse free water溶解。
与步骤(B)的8个INPUT一起供于测序。
使用Hi-seq(2000Ilumina)实施测序。
以下示出分析通过RIP测序而得到的数据的规程(Linux/R)。
(从fastq文件至峰的检测)
安装SRA Toolkit、bowtie、samtools、macs，下载hg19的注释文件(参照DRY分析脚本(秀润社)等)。
进行数据的质量确认，将IP、INPUT的数据汇总。例如当存在免疫沉降样品(IP1、IP2、IP3：3个重复)和其所对应的INPUT(INPUT1、INPUT2、INPUT3)时，如下所述。
[数1]
fastqc--nogroup＊.fastq
IP1.fastq IP2.fastq IP3.fastq＞IP.fastq
INPUT1.fastq INPUT2.fastq INPUT3.fastq＞Input.fastq
通过bowtie对fastq文件进行映射，制作sam文件，由sam文件制作bam文件。
[数2]
bowtie-m 1-p 4--sam～/chip/hg19-q IP.fastq IP.sam
bowtie-m 1-p 4--sam～/chip/hg19-q Input.fastq Input.sam
samtools view-S-b IP.sam＞IP.bam
samtools view-S-b Input.sam＞Input.bam
将数据按照染色体顺序排序，建立索引，通过macs检测峰。
[数3]
samtools sort IP.bam IP_sorted
samtools index IP_sorted.bam
samtools sort IP.bam Input_sorted
samtools index Input_sorted.bam
macs14-t IP_sorted.bam-c Input_sorted.bam--name＝IP_normalized-f BAM-g hs-S--wig＞macs.out
(利用R分析峰)
使用以下的软件包。
(Guitar)
(MeTPeak)
(openxlsx)
(ChIPpeakAnno)
(BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg19)
(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)
(rGADEM)
(ChIPseeker)
(1.基于macs输出的EXCEL文件的集合基因作图)
由g19仅取出转录组的信息，容纳于gc_txdb，删除EXCEL无法读入的上部，由xls转变为xlsx，保存。
[数4]
library(Guitar)
txdb＜-makeTxDbFromUCSC(genome＝″hg19″)
gc_txdb＜-makeGuitarCoordsFromTxDb(txdb，noBins＝100)
library(openxlsx)
IP＜-read.xlsx(″m6A_IP_peaks.xlsx″)
提取倍数变化为4倍以上且FDR为5％以下的峰，作为显著的峰，将文件变更为Granges文件。
[数5]
Figure BDA0002735305390001001
将Granges文件连接并创建列表，命名列表的各要素。
[数6]
GRs＜-list(IP.gr，IP.sig.gr)
names(GRs)＜-c(″IP″，″IP.sig″)
GuitarPlot(GRs，GuitarCoordsFromTxDb＝gc_txdb)
(2.基序检索)
从封顶起提取前后50个碱基、合计100个碱基，供于基序检索，从FDR低的一侧选择1000个。
[数7]
library(″ChlPpeakAnno″)
library(″BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg19″)
IP＜-read.xlsx(″m6A_IP_peaks.xlsx″)
summit＜-IP$start+IP$summit-1
tmp＜-cbind(IP$chr，summit-50，summit+49，IP[，c(6：9)])
tmp＜-head(tmp[order(tmp[，7])，]，1000)
将文件变更为Granges文件。
[数8]
Figure BDA0002735305390001002
用ChIPpeakAnno软件包取得序列。
[数9]
IP.peaksWithSeqs＜-getAllPeakSequence(IP.summit.gr，upstream＝0，downstream＝0，genome＝Hsapiens)
write2FASTA(IP.peaksWithSeqs，file＝″IP.fa″)
library(″rGADEM″)
seqs＜-readDNAStringSet(″IP.fa″，″fasta″)
motif＜-GADEM(seqs，verbose＝1，genome＝Hsapiens)
plot(motif)
[化2]
Figure BDA0002735305390001011
(3.得到有峰的基因的注释)
[数10]
Figure BDA0002735305390001012
(4.利用MetPeak(RIP测序中专用的分析软件包)进行分析)
(参照Cui等、Bioinformatics(2016)32(12)：i378-i385)
[数11]
Figure BDA0002735305390001013
(实施例1)微小RNA的甲基化分析
本实施例中进行微小RNA的甲基化分析。具体如下所述。
将按照包含甲基化腺嘌呤和甲基化胞嘧啶的方式合成的微小RNA200-c-5p(人序列、序列号11)溶解于RNase Free超纯水，通过吸光度测定确认浓度，调整为1pmol/μL。使用该微小RNA水溶液1μL，按照上述规程利用MALDI型质谱仪进行质谱。为了确认内部序列，通过氨处理来降解RNA(5’→3’)。另外，对观测到的前体离子，实施使用源内衰变(in sourcedecay、ISD)的测定(图1)。
将具有与微小RNA369-3p互补的序列的合成寡聚DNA(人369-3p的互补链、序列号12)和其反义的合成DNA(序列号13)以等摩尔数混合，加热后缓慢冷却而退火，形成DNA双链，将浓度调整为1pmol/μL。另外，分别同样地单独进行制备。与上述同样地进行质谱，观察DNA各链的前体离子而确认整体的质量，进行ISD。可确认：与DNA各链单独时同样地，在双链状态下也能够进行各链的识别及测序(图2)。
对于由合成微小RNA369-3p(人、序列号14)形成的双链，也进行同样的分析。确认也能够由RNA双链进行测序(图3)。
为了确认对于生物体内的RNA而言也同样能够通过质谱来测序，进行了以下实验。使用TRIzol(Invitrogen)由HEK293培养细胞取得小分子RNA级分。将得到的RNA级分溶解于RNase Free超纯水，通过吸光度测定确认浓度后，将浓度调整为100pmol/μL。与上述同样地进行质谱，观察前体离子而鉴定相对于miRNA369-3p(人)的质量数的母离子，对该前体离子应用ISD而确认内部序列，结果确认其为miRNA369-3p(图4)。从而，即使不纯化出特异性的序列也能够观察特定的RNA。
由以上可确认，将合适的质谱法与RNA纯化组合能够分析RNA修饰。
(实施例2)利用了RNA修饰的癌症分析
本实施例中分析癌症对RNA修饰的影响，对通过使用RNA修饰能够检测或诊断癌症这一点进行验证。
(实施例2-1：细胞株的RNA修饰分析)
从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas,VA,USA)获得人胰腺癌细胞株BxPC3、Panc10.5、PSN1及Capan2。对于这4株，分别使用抗m6A抗体通过RIP-Seq进行甲基化miRNA分析，作为4个胰腺癌细胞株中共通的甲基化miRNA，发现了下表所示的63种。
[表10]
Figure BDA0002735305390001031
这些miRNA的甲基化在癌症(例如胰腺癌)的判定中可能是有用的。
(实施例2-2：结肠癌)
由事前得到知情同意的人类患者中，在手术时采集分期为2～4的原发结肠癌(3名)的组织被检体。同时，作为健康组织，从离恶性肿瘤区域5cm以上的区域采集组织被检体。
将上述的捕捉17-5p、捕捉21-5p、捕捉200c-3p、捕捉200c-5p及捕捉let7a-5p制成链霉亲和素结合珠。用Trizol由上述组织被检体试样生成总RNA，然后用珠纯化靶miRNA，用ultrafleXtreme-TOF/TOF质谱仪(Bruker Dalotnics)进行测定。
其结果是，对于这些miRNA，观察到非甲基化RNA、并且观察到在表所示的位置处发生了甲基化的RNA。
[表11]
miRNA名称 序列 发现的甲基化位置
miR-17-5p 5’-CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3’ 5’起第13位mA(序列号15)
miR-21-5p 5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’ 5’起第9位mC(序列号16)
miR-200c-5p 5’-CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG-3’ 5’起第13位mC(序列号17)
miR-200c-3p 5’-UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA-3’ 5’起第9位mC(序列号18)
miR-let7a-5p 5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’ 5’起第19位mA(序列号19)
在正常组织与肿瘤组织之间，对成为上述各甲基化的依据的MS信号进行对比(图5～7)。其结果是，发现在正常组织与肿瘤组织之间RNA的甲基化状态存在差异。将基于这些信号强度计算对象序列的各RNA中的甲基化RNA的比例(％)的结果示于下表。
[表12]
Figure BDA0002735305390001041
另外，通过qRT-PCR进行RNA的表达量分析。qRT-PCR如下实施。按照制品规程使用TaqMan microRNA reverse transcription kit及TaqMan microRNA assays(AppliedBiosystem)。作为PCR预混液，使用THUNDERBIRD SYBR(注册商标)qPCRMix(东洋紡)。作为用于qRT-PCR的装置，使用LightCycler(注册商标)系统(Roche)。
通过qRT-PCR，在正常组织与肿瘤组织之间对比各自的上述miRNA的表达量。对于各miRNA，对比上述的甲基化率(MS)和表达量的结果(图8)。
其结果是，这些miRNA的表达量在正常组织与肿瘤组织之间几乎看不到差异，与此相对地，甲基化率(MS)的差异显著。由此表明，RNA的甲基化率(MS)可能是比表达量(RT-PCR)更有用的标志物。
进一步地，对于miR-200c-5p，为了确认内部序列而利用氨处理来降解RNA分解(5’→3’)，进行质谱(图9)。如图9所示，可确认利用质谱法能够准确地确定特定RNA的特定位置的修饰。
由人大肠癌患者取得样品，调查4种miRNA上的甲基化率。这些患者被诊断为结肠癌，在接受原发肿瘤切除手术后，在1至2年后发现了转移。发现了肝脏转移及淋巴结转移。Before为由原发肿瘤切除前的患者取得的血清样品。After为在切除原发后1至2年间发现转移时取得的血清样品。
对于上述Before及After的样品、以及炎症性肠病(IBD)及克隆病(Crohn)患者来源血清样品，按照相同的规程利用质谱分析甲基化水平(图10)。
与存在癌细胞的状态(Before)相比，体内不存在癌细胞的状态(After、IBD及Crohn)下甲基化下降。这些miRNA的甲基化程度高可能是癌症(例如结肠癌)的指标。
(实施例2-3：胰腺癌)
生物体甲基化检测
按照相同的规程，在胰腺癌组织中通过使用抗m6A抗体的RIP-Seq鉴定甲基化miRNA。对于检测到甲基化的miRNA中的Let-7a及miR-17，进一步进行分析。
对于胰腺癌组织试样，通过上述的用于Let-7a及miR-17的捕捉珠浓缩目标miRNA，利用MALDI-TOF-MS/MS检测甲基化(图11)。其结果是，确定了甲基化的位置，还能够定量甲基化量。
然后，对于let-17a、miR-17、miR-21、及miR-200c，将胰腺癌组织或胰腺癌患者血清中的甲基化水平与各种对照试样(正常组织、正常被检体、通过手术切除了肿瘤)的甲基化水平进行对比。需要说明的是，进行了定量逆转录PCR的结果是，未检测到miRNA表达水平的差异。通过用于各miRNA的捕捉珠浓缩目标miRNA，利用MALDI-TOF-MS/MS检测甲基化(图12～15)。胰腺癌组织中，能够检测let-17a、miR-17、miR-21、及miR-200c的甲基化水平及甲基化位置。
与正常组织、正常被检体、通过手术切除肿瘤后的被检体中的任一对照试样相比，胰腺癌试样中的这些miRNA的甲基化水平均上升(图16、17)。
这些miRNA的甲基化程度高可能是癌症(例如胰腺癌)的指标。
(实施例2-3A：早期胰腺癌)
本实施例中，使用由17名人胰腺癌患者采集的血清被检体调查RNA修饰状态。这些胰腺癌是被诊断为I期～II期的早期胰腺癌(4名为IA期、5名为IIA期、7名为IIB期)。作为正常被检体，使用健康人的血清被检体。
使用上述的捕捉17-5p、捕捉21-5p、捕捉200c-3p、捕捉200c-5p及捕捉let7a-5p的直接结合珠。用Trizol从上述血清被检体中纯化总RNA，然后使用珠纯化靶miRNA，用ultrafleXtreme-TOF/TOF质谱仪(Bruker Dalotnics)进行测定。
在全部胰腺癌的血清被检体中都检测到了miR-17-5p的甲基化，正常被检体中检测不到到该甲基化或甲基化的程度低。
另外，与利用现有的胰腺癌标志物CA19-9及CEA得到的判定结果相比表明，miR-17的甲基化程度可能是胰腺癌检测中更准确的指标。
mRNA的8成以上接受了m6A修饰，进一步地在Modomics(http://modomics.genesilico.pl/)中收录了大量的RNA修饰信息。在此基础上，根据本发明人们开发的包罗性高的RIP测序，认为至少一半以上、若不考虑频率则全部的结合有甲基化酶的腺嘌呤都有可能接受甲基化·脱甲基化。本发明人们调查了认为对消化系统癌症而言重要的微小RNA中的50种的甲基化状态，明确了4种微小RNA在包括胰腺癌在内的消化系统癌症的早期阶段是重要的。关于其它疾病，也同样地认为RNA的修饰信息会反映其状态。
由此，通过本实施获知，与健康人相比，早期胰腺癌患者中显著不同。
(实施例2-5：其它癌症试样)
本实施例中进行了其它癌症试样的分析。
使用与实施例2-2同样的方法，对于各种癌症试样在实施例2-3的RNA的范围内进行甲基化。由事前得到知情同意的人类患者，在手术时采集胃癌(4名)的组织被检体。同时，作为健康组织，从离恶性肿瘤区域5cm以上的区域采集组织被检体。
将上述的捕捉17-5p、捕捉21-5p、捕捉200c-3p、捕捉200c-5p及捕捉let7a-5p制成链霉亲和素结合珠。用Trizol由上述试样生成总RNA，然后使用珠纯化靶miRNA，用ultrafleXtreme-TOF/TOF质谱仪(Bruker Dalotnics)进行测定。
示出胃癌的结果(图18)。与实施例2-2同样地，显示对于胃癌而言微小RNA的甲基化率(MS)可能也是诊断胃癌的有用的标志物。
示出结直肠癌患者的结果(图19)。各患者如下所述。
结直肠癌患者的表征
[表13]
样品号 位置 肿瘤深度 淋巴结转移 远处转移 病理分型
No.1 直肠 T2 N0 - I
No.2 直肠 T2 N0 - I
No.3 结肠 T2 N0 - I
No.4 直肠 T2 N0 - I
No.5 结肠 T1 N0 - I
No.6 结肠 T2 N0 - I
No.7 直肠 T3 N3 肝转移 IV
No.8 结肠 T3 N2 肝转移 IV
No.9 直肠 T3 N1 肝转移 IV
No.10 直肠 T3 NA 肝转移 IV
No.11 结肠 T4a NA 肝转移 IV
No.12 直肠 NA NA 肝转移 IV
*肿瘤结节转移(TNM)分类按照TNM staging of the Union for InternationalCancer Control(https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/f_guidelines.asp)第7版。
在结直肠癌患者的结直肠癌组织与正常结肠直肠组织之间对比miRNA的甲基化。早期结肠癌(StageI)和晚期结肠癌(StageIV)与正常部相比，甲基化均亢进。
由此，通过观察RNA的修饰能够预测癌症(例如结肠癌)的进展程度。
另外，由事前得到知情同意的人类患者，对于肝癌、胆囊癌也进行了同样的实验，以足以进行统计分析的数量来进行，结果可以得到同样的结果。
(实施例2-7)
CTC(circulating tumor cells，循环肿瘤细胞)分析
对于CTC试样，使用与实施例2-3同样的方法对该CTC试样分析全部的微小RNA的甲基化。
(实施例3)使用RNA修饰的抗性株的分析
本实施例中，验证了使用RNA修饰可以分析抗性株。
(实施例3-1：抗性株的制作(ChmRcell))
本实施例中制作抗性株(ChmRcell)。
将由ATCC、RIKEN等细胞库获得的癌细胞株DLD-1在三氟尿苷(FTD)(Aldrich-Sigma)(约10mg/mL)存在下维持培养6个月以上。维持培养中，在塑料培养皿上，在添加了10％血清的DMEM培养基中，在37℃下每周进行约2次传代，使得维持60～80％融合的状态。对于该培养细胞，计测对三氟尿苷的IC50，结果得到IC50＝300μmol/L的结果，确认建立了三氟尿苷抗性株。
同样地，利用由ATCC、RIKEN等细胞库获得的癌细胞株HCT116、RKO等制作5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、顺铂、核酸药物、组蛋白脱甲基化酶抑制剂、西妥昔单抗(抗体药物)、Carbon/HIMAC(重粒子射线)、X射线的抗性株。上述药物购自Aldrich-Sigma，以约10mg/mL来使用。培养6个月以上而建立抗性株。对于各药物，得到IC50＝300μmol/L的结果，确认分别建立了抗性株。作为X射线源，使用线性Gammacell(注册商标)40Exactor(BestTheratronics Ltd.)，以约0～10Gy的剂量进行处理，Carbon/HIMAC的射线源，使用放射线医学总合研究所的HIMAC，以约0～10Gy的剂量进行处理(参照Katsutoshi Sato等、CancerSci.2017 Oct；108(10):2004-2010及Katsutoshi Sato等、Sci Rep.2018；8:1458)。
(实施例3-2：抗性株的RNA修饰分析)
本实施例中进行抗性株的RNA修饰分析。
对于原始的DLD-1细胞株及各抗性株(5-FU抗性株及FTD抗性株)，分别按照上述的RIP测序的规程进行RNA甲基化分析、及进行微阵列或与实施例2-2的qRT-PCR同样的mRNA表达分析。
测定的结果是，在合计1024种微小RNA上观察到甲基化。将代表性例子示于下表。
[表14]
Figure BDA0002735305390001101
另外，特别关注了下表的miRNA的甲基化。
[表15]
Figure BDA0002735305390001102
对于个别的微小RNA、例如miR-378a的甲基化而言，在三氟尿苷抗性株中减少、但在5-FU抗性株中增加。使用抗性株的这种RNA上的修饰信息，例如，在向患者给药某种药物时，可以预测此后是否可以不产生抗性地持续使用同一药物等(例如，当给药5-FU后miR-378a的甲基化增多时，预测对5-FU有可能产生抗性)。
基于RIP测序及RNA表达信息进行主成分分析(使用分散度最大的成分进行二维射影)。结果以基于3次独立实验的平均±标准偏差(SD)形式示出。通过使用Microsoft Excel(注册商标)软件(Microsoft Campus、Redmond、WA、USA)上的R版本号3.4.3(2017-11-30)的成对T-TEST来评价结果的统计学显著性。将P值＜0.05视为统计学上显著。其结果是，明确地区分了野生株及各抗性株，另外暗示，RNA修饰状态与RNA表达状态相比更能准确地表征抗性株的特征(图20)。
然后，基于甲基化部位及其周边序列进行基序分析，调查与甲基化相关酶的相关性(下表)。其结果是，暗示几种微小RNA与Mettl3、Mettl14及YTHDF1密切相关。可以基于这样的基序分析结果来阐明RNA修饰与其它生物体因子的相互关系、进行网络分析，可以用于对生物状态的演绎分析。
[表16]
·包含YTHDF1基序的miR
miR-378a miR-378e miR-378i
miR-378b miR-378f
miR-378d miR-378h
·包含METTL3基序的miR
miR-492 miR-4754
miR-611 miR-6861
miR-3690(CHOL的候补)
·包含METTL14基序的miR
miR-3122 miR-6847
miR-3131 miR-6887(PAAD的候补)
分析结果暗示，以下所示的miRNA上的甲基化特别适合用作用于评价FTD抗性的生物标志物。
[表17]
miRNA 总体ID 亲本株 表达 亲本株甲基化 抗性株 表达 抗性株甲基化 表达变动 甲基化变动
miR-3937 ENSG00000263730 0 2 33 182 ∞ 5.52
miR-4488 ENSG00000266006 0 3 g 175 ∞ 19.44
miR-3662 ENSG00000283409 0 1 26 53 ∞ 2.04
miR-3141 ENSG00000264760 2 0 2 19 1 ∞
miR-6734-5p ENSG00000283836 3 1 3 23 1 23
miR-1262 ENSG00000221203 15 50 20 272 1.33 4.08
(实施例4)利用RNA修饰分析处置的影响
本实施例中，分析手术、治疗、预防等处置对RNA修饰的影响，通过分析RNA修饰来分析手术、治疗、预防等处置所带来的效果。
(实施例4-1：使用RNA修饰分析手术的影响)
本实施例中调查手术对RNA修饰的影响。
按照Trizol(Invitrogen)的规程，从原始的DLD-1细胞株及各抗性株(5-FU抗性株及FTD抗性株)中纯化总RNA，然后，按照上述的RIP测序的规程进行RNA甲基化分析。在此，在除去rRNA时，使用Ribo-Zero rRNA Removal Kit(Illumina)。
由肿瘤基因组图谱(TCGA)(https://cancergenome.nih.gov/)取得miRNA的表达信息，选择手术后达到1/2以下的表达量者，其如下表所示。
[表18]
miR-16-1-3p miR-34b-5p miR369-5p
miR-431-5p miR-494-3p miR-519-d-5p
miR-3181 miR-4435 miR-4467
miR-5581-5p miR-5587-5p
对于这些术后有所减少的miRNA，将与抗性方面观察到变化的miRNA甲基化信息的关系示于下表。
[表19]
Figure BDA0002735305390001131
术后有所减少的miRNA中，观察到其甲基化状态随着抗性而明显变化者。
另外，调查了在这些术后有所减少的miRNA上是否可观察到通常的甲基化基序RRAC，结果发现以下部位可能发生甲基化。
[表20]
Figure BDA0002735305390001132
*表中，下划线表示与RRAC基序及基序存在单基碱基错配的序列中的腺嘌呤。
进一步地，从肿瘤基因组图谱(TCGA)(https://cancergenome.nih.gov/)取得胰腺癌(PAAD、n＝4、图21)、直肠腺癌(READ、n＝3、图22)、胆管癌(CHOL、n＝9、图23)及结肠腺癌(COAD、n＝8、图24)的miRNA表达数据，在正常部及癌部(同一患者)之间对比其中的术后有所减少的miRNA的表达。
如上所述，可以基于RNA修饰信息分析癌、手术及抗性的相关性。我们预测，通过这样的分析，可以基于RNA修饰信息决定手术的切除范围、术后的药物疗法、放射线疗法的强度(regimen)及从复发风险的观点出发决定出院后的随访。另外，预测能够基于RNA修饰信息选自需要进行处置的患者。
以上结果表明，作为甲基化miRNA，可特别优选使用miR-3131、miR-3690、miR-6887-5p、miR-6887-3p、miR-378a-3p、miR-4435及miR-4467。
(实施例4-2：其它处置的分析)
本实施例中分析其它处置对RNA修饰的影响，同样地分析了能否进行其它处置的分析。例如，可以对温度、低氧(例如1％、+19％氮气置换)、低营养(缺乏葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸)、温度(32度～42度的范围)等，若为低氧则是1％、+19％氮气置换等)进行分析。
可以在5-FU、吉西他滨、顺铂、上述的核酸药物、上述的组蛋白脱甲基化酶抑制剂、西妥昔单抗(抗体药物)、Carbon/HIMAC(重粒子射线)、及利用X射线进行处置的前后调查RNA修饰发生了何种变化。
(实施例5：RNA修饰所带来的影响)
(实施例5-1：RNA甲基化对RNA-蛋白质间相互作用的影响)
研究了RNA甲基化对RNA-蛋白质间相互作用的影响。
分子动力学模拟
为了预测甲基化及非甲基化miRNA(miR-200c、let-17a、miR-17)与人AGO2蛋白的结合，使用AGO2/RNA复合体的X射线结构作为指导(PDB ID：4OLB25及4W5N26)。首先将RNA结合碱基取代为各miRNA中的对应的碱基。对于各miRNA复合体结构，在1大气压及约37℃的条件下实施分子动力学模拟。热力学采样后，实施能量最小化以预测结构的对接。所有的计算均使用Amber12程序(http：//ambermd.org/)来进行。将结果示于图25～27。
图25中，miR-200c中，第9位的甲基化胞嘧啶靠近RNA的识别碱基。AGO复合体中的甲基化及非甲基化miR-200c中的最初的6个核苷酸之间没有大的差异，在甲基化部位的周边可观察到AGO与miRNA之间的结合相互作用的改变。由此，甲基化部位周围的空间减少。另外，第9位的胞嘧啶的甲基可能是由于位阻而妨碍与AGO的Ser220的氢键，导致了第8位的鸟嘌呤的位置移动。我们认为，这是由与AGO的Arg761的相互作用引起的。
图26、27中，miR-17及let-7a中，甲基化腺嘌呤位于远离RNA结合部位的位置。但是，腺嘌呤甲基化使包括RNA识别部位周边在内的、复合体整体发生了较大的结构变化，这可能会影响靶RNA识别效率。这些见解表明，通过发生m6A修饰，miRNA的靶mRNA翻译抑制能力可能下降。
(实施例5-2：RNA甲基化对生物体的影响)
研究了RNA甲基化对生物体的实际影响。
合成寡核苷酸的转染
委托GeneDesign(大阪、日本)合成甲基化及非甲基化双链RNA寡核苷酸(miR-200c、let-7a)。利用MALDI-TOF-MS/MS对这些合成RNA的序列进行确认。由miRBASE(release21；http：//www.mirbase.org/)获得miRNA序列。按照制造者的规程，使用Lipofectamine3000(Invitrogen)将甲基化或非甲基化合成miRNA转染到内源性miRNA的表达水平非常低的DICER外显子5被破坏的大肠癌细胞株HCT116(HCT116EX5)(Bert Vogelstein(JohnsHopkins University,Baltimore,MS,USA)惠赠)中。
表达数据分析
使用Tarbase14(http：//diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php？r＝tarbase/index)所报道的其mRNA与miR-200c或let-7a结合的基因作为靶基因。对于miR-200c，比较通过微阵列观察到的靶基因的表达水平(图28)。对于let-7a，同样地分析由序列推断的、每100万读数中的每一千个外显子的读数(图29)。
通过基因表达谱分析获知，非修饰miR-200c及m5C修饰miR-200c显示强的基因抑制效果，m6A修饰miR-200c的基因表达抑制效果弱，以非甲基化let-7a相比，m6A修饰let-7a不会减少靶mRNA的表达。
如上所述，确认RNA的修饰状态会影响生物体的状态，这支持了RNA的修饰状态反映生物体的状态、通过对其进行调查可预测生物体的状态这一点。
(实施例6：使用RNA修饰的基因敲除分析)
本实施例中分析使用RNA修饰能够分析基因敲除。
(实施例6-1)Mettl3敲除对RNA修饰的影响
本实施例中分析使用RNA修饰能否分析基因敲除。通过使用shRNA、siRNA的标准性方法处理人胰腺癌细胞株MIA PaCa-2细胞，制作Mettl3敲除细胞株(参照Kosuke Taketo等、Int J Oncol.2018Feb；52(2):621-629)。然后进行RIP测序。
(实施例6-2)Mettl3过度表达的影响
将小鼠的Mettl3基因整合到CAG表达载体中，将其注入BL6小鼠的受精卵并移植到寄母的子宫中，制作Mettl3基因过度表达小鼠。制作在小鼠的胰酶基因的下游连接有病毒蛋白SV的载体，将其注入BL6小鼠的受精卵并移植到寄母的子宫，制作胰脏的P53及RB失活的EL1-SV40小鼠。通过常规方法使由此制作的Mettl3基因过度表达小鼠与EL1-SV40小鼠交配而制作双转基因小鼠。然后，通过PCR等确认目标基因已整合到该双转基因小鼠中。在通常的动物实验施设中在SPF环境下进行小鼠的饲养。
这些小鼠中会自然地产生肿瘤，观察该双转基因小鼠(10只)和EL1-SV40小鼠(10只)的生存(图30)。照片(图31)示出在20周龄时刻从各小鼠摘出的肿瘤(左：EL1-SV40小鼠、右：双转基因小鼠)。双转基因小鼠中，肿瘤的生长更快，小鼠的生存率低。
Mettl3为RNA甲基化酶，上述结果表明了：1)RNA修饰(表观转录组)在癌症发病·进展中发挥了重要的作用、2)与以往认为会加剧癌症的基因(P53、RB)的变化相比，RNA修饰的变化对癌症的影响更大。需要说明的是，如上述实施例所示，RNA修饰不仅限于mRNA的修饰，同种酶也会修饰miRNA，因此可以通过监测miRNA(例如存在于血中)来监测身体深处的细胞的表观转录组。因此，该结果不仅支持RNA修饰本身作为生物标志物的重要性，还显示出微小RNA作为液体活组织检查的生物标志物的重要性。
(实施例7)疾病与RNA修饰的相关性
本实施例中对癌症、痴呆、心力衰竭、炎症性肠病、老化、肠道免疫的试样进行RNA修饰分析。其结果显示，RNA修饰信息在预测这些状态时有用。
为了进行这些分析，例如可以使用
(1)通过对代谢关键酶-蛋白激酶M(PKM)进行基因操作而制作的、基于脑内的氧化磷酸化反应的阿尔茨海默痴呆模型小鼠、
(2)在通过操作消化系统的抑癌基因而建立的模型中，使包括消化道在内的消化器官发生老化和炎症、从而由于与免疫的相互作用而产生的小鼠，由粪便中的菌群调查核糖体RNA等的甲基化，
(3)调查癌代谢相关基因改变的小鼠等的粪便等。
(实施例8)利用RNA修饰进行药剂筛选
本实施例中验证能够利用RNA修饰进行药剂筛选。
用任意的化合物文库处理细胞株。分析这些细胞的RNA修饰。基于RNA修饰信息将这些化合物分类，则可以使部分化合物形成1个簇并进行分析。该过程也可以参考上述实施例中各药剂的抗性株的考虑方式而用于化合物文库的筛选。例如，可以适当参考实施例4的记载，在此基础上根据活组织检查确定恶性度。从细胞诊断的角度来诊断癌症、判定恶性度、诊断和治疗原发灶不明的癌症。可以寻找新的药物靶点。
(实施例9)大肠杆菌的RNA修饰分析
本实施例中验证能否使用RNA修饰分析进行大肠杆菌的分类。
例如，对于某种大肠杆菌菌株分析RNA修饰。进行RIP-测序。另外，也可以一并使用抗药泵P-糖蛋白的基因信息。
发现通过利用RNA修饰信息能够非常容易地进行微生物的种属分类。
另外，可以对小鼠的粪便分析RNA修饰。
其结果是，可以分析所呈现的大肠杆菌种属的身份(identity)，可以暗示小鼠的状态与大肠杆菌的状态的相关性。
另外，可以对食品所含的大肠杆菌等的微生物信息分析RNA修饰。
其结果是，可以分析食品中的微生物种属(例如大肠杆菌种属)，可以暗示食品的品质与大肠杆菌的状态的相关性。
(实施例10)食品的RNA修饰分析
本实施例中示出使用RNA修饰信息的食品分析例。
例如，表明对于食品(例如精肉)而言能够基于RNA修饰信息对品质(例如，加工日起的天数)进行分类。
(实施例11-1)RNA上的各种修饰的分析
本实施例中验证使用其它RNA修饰的分析。
验证了RNA-mod的修饰种类涵盖了广泛的范围。对质谱数据进行再分析，可以分析微小RNA上的甲基化以外的修饰，使用这些信息可以进行RNA上的各种修饰的分析。
(实施例11-2)各种RNA上的修饰的分析
可以将微小RNA以外的RNA的修饰信息与已和某些状态建立关联的数据联系起来。例如，质谱中有多个峰，可以1个1个地手动代入，也可以通过机器学习来进行。另外，这些可以参考BURKA的Maldi标准。
(实施例12)将RNA修饰信息与其它数据组合的分析
本实施例中验证将RNA修饰信息与其它数据组合而进行的分析。
例如，转录组蛋白组关联分析(RNA；例如Pagliarini DJ,Cell Metab.2016Jul12；24(1):13-4.doi:10.1016/j.cmet.2016.06.018.)。可以参照甲基化组(甲基化结合蛋白；例如Shabalin AA.,Bioinformatics.2018Feb 12.doi:10.1093/bioinformatics/bty069.)、转录组(RNAseq；例如Jeong H，Front Neurosci.2018Feb 2；12:31.doi:10.3389/fnins.2018.00031.eCollection 2018)、本发明的表观转录组(此次、低密度或高密度)、代谢组学(质谱；例如Gupta Ret al.、Proteomics.2018Feb 19.doi:10.1002/pmic.201700366)等。这些例示的论文终究是例示，也可以使用这些之外的适宜的信息源来进行应用。
可以理解的是，将本发明的RNA修饰信息与其它信息组合而进一步提高分析精度的结果、或者可以由此提高分析精度。
例如，若将实施例4-1的“术后有所减少的miRNA的信息”与微小RNA以外的信息组合并加以参考，则可以说：这些微小RNA以外的信息通过与“术后有所减少的miRNA的信息”组合、从而有用性增加。
例如可知：若使用Gene Expression Omnibus(GEO)的数据集合(GDS4103)进行分析，则胰腺导管癌(PDAC)患者中可观察到作为RNA甲基化酶的METTL3及METTL14的RNA表达水平的上升。可以与这样的信息组合，进行例如将甲基化酶与检测到的甲基化RNA建立关联的分析。
(实施例13)高密度阵列设计
本实施例中验证使用甲基化RNA芯片的设计例的分析。
MALDI中，激光照射将基质分子迅速加热，并且使磷酸键部分断裂的多个RNA发生气化·电离。甲基化RNA芯片中，为了高效率而在1个平板上配置针对不同的多个RNA的捕捉核酸。若对配置有目标捕捉核酸的孔激照射光，则周围的孔也会被激光照射，有时会对目标RNA以外的RNA进行检测。因此，为了使来自周围的孔所捕捉的RNA的质量峰有别于由目标孔观测到的质量峰，期望对平板上的捕捉核酸的配置进行优化。因此按照以下的步骤确定捕捉核酸的配置。
1.对于各RNA，计算“要观测的部分RNA的理论质量”
2.用蒙特卡罗法在平板上随机地配置捕捉核酸
3.在相邻的孔之间，计算要观测的部分RNA的理论质量之差
4.(重复2次以后)
当理论质量之差超过前一次时：采用此次的配置
当理论质量之差降低时：放弃此次的配置
5.回到2，重复进行蒙特卡罗取样。
将上述步骤重复一定次数以上时，可期待所得到的捕捉核酸的配置的计测误差变得最小(相邻的孔之间所捕捉的RNA的部分RNA的质量差达到最大)、即为最佳配置。
以下示出能捕捉多种RNA的捕捉核酸的组合中的、认为即使相邻也没有问题的组合的例子。
[表21]
Figure BDA0002735305390001201
(实施例14)利用寡聚DNA进行的纯化的优化(图32)
本实施例中示出通过对利用寡聚DNA进行的纯化进行优化而改善了RNA修饰的分析效率的例子。
比较了使用上述直接结合珠及链霉亲和素结合珠时的修饰RNA的检测。
利用TRIzol(Invitrogen)由培养的HeLa细胞及人皮肤成纤维细胞纯化总RNA。将捕捉寡聚DNA制成上述的直接结合珠或制成链霉亲和素结合珠，按照上述的各自的规程从纯化出的总RNA中纯化靶miRNA，用ultrafleXtreme-TOF/TOF质谱仪(Bruker Dalotnics)进行测定。捕捉寡聚DNA使用了上述的捕捉17-5p、捕捉21-5p、捕捉200c及捕捉let7a-5p。
作为其结果，得到下表的强度的信号。
[表22]
Figure BDA0002735305390001211
与链霉亲和素结合珠时相比，直接结合珠得到了约2倍的RNA的MS信号强度。
MALDI中是通过激光将靶平板上的样品电离，因此若靶平板上除了测定对象和基质以外还存在可电离杂质，则激光的能量会浪费在杂质的电离上，信号强度可能下降。因此，减少杂质是有效的。
直接结合珠与链霉亲和素结合珠相比，珠与寡聚DNA的结合稳定，因此杂交后可以以更高的温度进行洗涤及洗脱。因此，可抑制非特异性结合在捕捉核酸及磁珠上的杂质，从而可实现高灵敏度化。
(实施例15)外来体浓缩
本实施例中示出通过进行外来体浓缩来改善RNA修饰的分析精度的例子(图33)。
调查了外来体浓缩所带来的修饰RNA的检测强度的变化。
使用血清·血浆(购自同仁化学研究所)作为试样。
将上述的捕捉17-5p、捕捉21-5p、捕捉200c及捕捉let7a-5p制成链霉亲和素结合珠，使用这些珠从以下的处理1及处理2的各试样中纯化靶miRNA。然后，用ultrafleXtreme-TOF/TOF质谱仪(Bruker Dalotnics)进行测定。
·处理1(无免疫沉降(IP)处理)
利用TRIzol进行miRNA的提取·纯化后，通过杂交来纯化各miRNA。
·处理2(有利用抗CD63抗体的IP处理)
向用ExoQuick(System Biosciences)进行了简易纯化的外来体级分中加入抗CD63抗体(Santa Cruz Biotechnology)，对达到的免疫沉降物进行基于杂交的各miRNA纯化。
其结果是，得到下表的强度的信号。
[表23]
Figure BDA0002735305390001221
通过以利用CD63抗体的免疫沉降进行纯化，由同一起始材料(血清血浆)得到的对象miRNA的MS信号强度达到约2.5倍。
MALDI中通过激光将靶平板上的样品电离，因此若靶平板上除了测定对象和基质以外还存在可电离的杂质，则激光的能量会浪费在杂质的电离上，信号强度可能下降。因此，减少杂质可能是有效的。
上述结果表明，通过用抗体仅筛选·浓缩外来体，可以除去起始材料中的杂质。
利用该方法可以得到更强的信号，因此可期待与以前的方法相比能够更可靠地测定甲基化率。
(实施例16)冷冻对RNA修饰的影响
本实施例中分析了冷冻试样的情况对分析RNA修饰的精度的影响。
使用市售的血清、采自人体的血清，调查修饰RNA相对于温度的稳定性。
目标RNA的纯化使用上述的let7a特异性捕捉寡聚DNA而实施。
委托GeneDesign公司合成200c。
用血清分离管从通过采血而取得的血液中分离血清。
将市售的血清及来自采血的血清按照表中的各条件进行处理后，用捕捉寡聚DNA结合珠纯化let7a，用ultrafleXtreme-TOF/TOF质谱仪(Bruker Dalotnics)进行测定。
[表24]
Figure BDA0002735305390001241
将合成200c按照表中的各条件进行处理后，用ultrafleXtreme-TOF/TOF质谱仪(Bruker Dalotnics)进行测定。
[表25]
Figure BDA0002735305390001251
采血后及血清分离后的情况下，4℃或25℃下的放置的影响较大。合成品的情况下，在4℃的纯水中稳定。
向用注射器采集的血液中添加EDTA或肝素，以3000rpm离心分离5分钟而得到上清。
将市售的血清及来自采血的血清按照表中的各条件进行处理后，用捕捉寡聚DNA结合珠纯化let7a，用ultrafleXtreme-TOF/TOF质谱仪(Bruker Dalotnics)进行进行测定。
[表26]
Figure BDA0002735305390001261
将合成200c按照表中的各条件进行处理后，用ultrafleXtreme-TOF/TOF质谱仪(Bruker Dalotnics)进行测定。
[表27]
Figure BDA0002735305390001262
观察到目标RNA的品质由于添加肝素而进一步下降。合成品的情况下，即使重复5次左右的冷冻融化也几乎观察不到分解。
(附记)
以上使用本发明的优选实施方式例示了本发明，但是可以理解，应仅根据权利要去书解释本发明的范围。关于本说明书中引用的专利、专利申请及其它文献，可以理解的是应与在本说明书中具体记载其内容时同样地将其内容作为本说明书的参考而引用。
产业上的可利用性
本发明几乎能够用于与生物有关的任何领域的分析中，特别医疗领域中的应用是不可估量的。
序列表的自由文本
以下示出本说明书中的序列的名称及其具体的序列。
miR-17-5p CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG(序列号1)
miR-21-5p UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(序列号2)
miR-200c-5p CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG(序列号3)
miR-200c-3p UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA(序列号4)
miR-let7a-5p UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU(序列号5)
捕捉17-5p CTACCTGCACTGTAAGCACTTTG(序列号6)
捕捉21-5p TCAACATCAGTCTGATAAGCTA(序列号7)
捕捉200c-5p CCAAACACTGCTGGGTAAGACG(序列号8)
捕捉200c-3p TCCATCATTACCCGGCAGTATTA(序列号9)
捕捉let7a-5p AACTATACAACCTACTACCTCA(序列号10)
合成miR-200c-5p CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG(#7,mA；#13,mC)(序列号11)
合成miR-369-3p AAUAAUACAUGGUUGAUCUUU(序列号12)
互补DNA 369-3p AATAATACATGGTTGATCTTT(序列号13)
反义互补DNA 369-3p AAAGATCAACCATGTATTATT(序列号14)
miR-21-5p UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(#9,mC)(序列号15)
miR-17-5p CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG(#13,mA)(序列号16)
let-7a-5p UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU(#19,mA)(序列号17)
miR-200c-3p UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA(#9,mC)(序列号18)
miR-200c-5p CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG(#13,mC)(序列号19)
miR378a-3p ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC(序列号20)
miR378d ACUGGACUUGGAGUCAGAAA(序列号21)
miR378e ACUGGACUUGGAGUCAGGA(序列号22)
miR378f ACUGGACUUGGAGCCAGAAG(序列号23)
miR378h ACUGGACUUGGUGUCAGAUGG(序列号24)
miR378i ACUGGACUAGGAGUCAGAAGG(序列号25)
miR492 AGGACCUGCGGGACAAGAUUCUU(序列号26)
miR3690 ACCUGGACCCAGCGUAGACAAAG(序列号27)
miR4754 AUGCGGACCUGGGUUAGCGGAGU(序列号28)
miR6861-5p ACUGGGUAGGUGGGGCUCCAGG(序列号29)
miR3122 GUUGGGACAAGAGGACGGUCUU(序列号30)
miR3131 UCGAGGACUGGUGGAAGGGCCUU(序列号31)
miR6847-3p GGCUCAUGUGUCUGUCCUCUUC(序列号32)
miR6887-3p UCCCCUCCACUUUCCUCCUAG(序列号33)
miR-6887-5p UGGGGGGACAGAUGGAGAGGACA(序列号34)
miR-16-1-3p CCAGUAUUAACUGUGCUGCUGA(序列号35)
miR-34b-5p UAGGCAGUGUCAUUAGCUGAUUG(序列号36)
miR369-5p AGAUCGACCGUGUUAUAUUCGC(序列号37)
miR-431-5p UGUCUUGCAGGCCGUCAUGCAG(序列号38)
miR-494-3p UGAAACAUACACGGGAAACCUC(序列号39)
miR-519-d-5p CCUCCAAAGGGAAGCGCUUUCUGUU(序列号40)
miR-3181AUCGGGCCCUCGGCGCCGG(序列号41)
miR-4435AUGGCCAGAGCUCACACAGAGG(序列号42)
miR-4467UGGCGGCGGUAGUUAUGGGCUU(序列号43)
miR-5581-5p AGCCUUCCAGGAGAAAUGGAGA(序列号44)
miR-5587-5p AUGGUCACCUCCGGGACU(序列号45)
miR-629-3p GUUCUCCCAACGUAAGCCCAGC(序列号46)
miR-16-5p UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG(序列号47)
miR-711GGGACCCAGGGAGAGACGUAAG(序列号48)
miR-3977GUGCUUCAUCGUAAUUAACCUUA(序列号49)
共通序列2GGGAGGUGUG(序列号50)
miR-6799-5p GGGGAGGUGUGCAGGGCUGG(序列号51)
miR-3689d GGGAGGUGUGAUCUCACACUCG(序列号52)
miR-3689a-3p CUGGGAGGUGUGAUAUCGUGGU(序列号53)
miR-3689c CUGGGAGGUGUGAUAUUGUGGU(序列号54)
miR-6825-5p UGGGGAGGUGUGGAGUCAGCAU(序列号55)
共通序列3CUCCCUGCCC(序列号56)
miR-6756-3p UCCCCUUCCUCCCUGCCCAG(序列号57)
miR-7113-3p CCUCCCUGCCCGCCUCUCUGCAG(序列号58)
miR-6743-3p AGCCGCUCUUCUCCCUGCCCACA(序列号59)
共通序列4GACUUGGAGUCA(序列号60)
miR-378c ACUGGACUUGGAGUCAGAAGAGUGG(序列号61)
共通序列5CCCUUUAGAGUGU(序列号62)
miR-521AACGCACUUCCCUUUAGAGUGU(序列号63)
miR-517a-3p AUCGUGCAUCCCUUUAGAGUGU(序列号64)
miR-522-3p AAAAUGGUUCCCUUUAGAGUGU(序列号65)
miR-520g-3p ACAAAGUGCUUCCCUUUAGAGUGU(序列号66)
序列表
<110> 利用了RNA修饰的分析、诊断方法
<120> 国立大学法人大阪大学(OSAKA UNIVERSITY）
<130> F518PCT157
<150> JP 2018-30099
<151> 2018-02-22
<160> 66
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
caaagugcuu acagugcagg uag 23
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
cgucuuaccc agcaguguuu gg 22
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
uaauacugcc ggguaaugau gga 23
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
ugagguagua gguuguauag uu 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 捕捉 17-5p
<400> 6
ctacctgcac tgtaagcact ttg 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 捕捉 21-5p
<400> 7
tcaacatcag tctgataagc ta 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 捕捉 200c-5p
<400> 8
ccaaacactg ctgggtaaga cg 22
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 捕捉 200c-3p
<400> 9
tccatcatta cccggcagta tta 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 捕捉 let7a-5p
<400> 10
aactatacaa cctactacct ca 22
<210> 11
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 合成 miR-200c-5p
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (7)..(7)
<223> 甲基化
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (13)..(13)
<223> 甲基化
<400> 11
cgucuuaccc agcaguguuu gg 22
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 互补DNA 369-3p
<400> 12
aataatacat ggttgatctt t 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 互补反义DNA 369-3p
<400> 13
aaagatcaac catgtattat t 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 合成 miR-369-3p
<400> 14
aauaauacau gguugaucuu u 21
<210> 15
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (9)..(9)
<223> 甲基化
<400> 15
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 16
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (13)..(13)
<223> 甲基化
<400> 16
caaagugcuu acagugcagg uag 23
<210> 17
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (19)..(19)
<223> 甲基化
<400> 17
ugagguagua gguuguauag uu 22
<210> 18
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (9)..(9)
<223> 甲基化
<400> 18
uaauacugcc ggguaaugau gga 23
<210> 19
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (13)..(13)
<223> 甲基化
<400> 19
cgucuuaccc agcaguguuu gg 22
<210> 20
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
acuggacuug gagucagaag gc 22
<210> 21
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
acuggacuug gagucagaaa 20
<210> 22
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
acuggacuug gagucagga 19
<210> 23
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
acuggacuug gagccagaag 20
<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
acuggacuug gugucagaug g 21
<210> 25
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
acuggacuag gagucagaag g 21
<210> 26
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
aggaccugcg ggacaagauu cuu 23
<210> 27
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
accuggaccc agcguagaca aag 23
<210> 28
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
augcggaccu ggguuagcgg agu 23
<210> 29
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
acuggguagg uggggcucca gg 22
<210> 30
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
guugggacaa gaggacgguc uu 22
<210> 31
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
ucgaggacug guggaagggc cuu 23
<210> 32
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
ggcucaugug ucuguccucu uc 22
<210> 33
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
uccccuccac uuuccuccua g 21
<210> 34
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
uggggggaca gauggagagg aca 23
<210> 35
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
ccaguauuaa cugugcugcu ga 22
<210> 36
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 36
uaggcagugu cauuagcuga uug 23
<210> 37
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
agaucgaccg uguuauauuc gc 22
<210> 38
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
ugucuugcag gccgucaugc ag 22
<210> 39
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
ugaaacauac acgggaaacc uc 22
<210> 40
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 40
ccuccaaagg gaagcgcuuu cuguu 25
<210> 41
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
aucgggcccu cggcgccgg 19
<210> 42
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
auggccagag cucacacaga gg 22
<210> 43
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
uggcggcggu aguuaugggc uu 22
<210> 44
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
agccuuccag gagaaaugga ga 22
<210> 45
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
auggucaccu ccgggacu 18
<210> 46
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 46
guucucccaa cguaagccca gc 22
<210> 47
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
uagcagcacg uaaauauugg cg 22
<210> 48
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
gggacccagg gagagacgua ag 22
<210> 49
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
gugcuucauc guaauuaacc uua 23
<210> 50
<211> 10
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
gggaggugug 10
<210> 51
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
ggggaggugu gcagggcugg 20
<210> 52
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 52
gggaggugug aucucacacu cg 22
<210> 53
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
cugggaggug ugauaucgug gu 22
<210> 54
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 54
cugggaggug ugauauugug gu 22
<210> 55
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 55
uggggaggug uggagucagc au 22
<210> 56
<211> 10
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 56
cucccugccc 10
<210> 57
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 57
uccccuuccu cccugcccag 20
<210> 58
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 58
ccucccugcc cgccucucug cag 23
<210> 59
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 59
agccgcucuu cucccugccc aca 23
<210> 60
<211> 12
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 60
gacuuggagu ca 12
<210> 61
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 61
acuggacuug gagucagaag agugg 25
<210> 62
<211> 13
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 62
cccuuuagag ugu 13
<210> 63
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 63
aacgcacuuc ccuuuagagu gu 22
<210> 64
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 64
aucgugcauc ccuuuagagu gu 22
<210> 65
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 65
aaaaugguuc ccuuuagagu gu 22
<210> 66
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 66
acaaagugcu ucccuuuaga gugu 24

Claims (15)

1.一种对对象的状态进行分析的方法，其包括：
取得对象中的至少一种RNA上的修饰信息的取得步骤；和
基于该修饰信息分析该对象的状态的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述RNA包括微小RNA。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述修饰包括微小RNA的甲基化。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述修饰为m6A。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述修饰信息包括修饰位置信息及经修饰的RNA的量的信息中的至少一种。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述状态包括癌症。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述癌症包括胰腺癌(例如早期胰腺癌)、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、胃癌及结肠癌中的至少一种。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述状态包括反应性，所述反应性是所述对象对抗癌剂是否具有抗性。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，基于所述反应性示出用于处置所述对象的药剂和/或对所述对象的处置。
10.一种系统，其为用于基于RNA的修饰信息判定对象的状态的系统，其包含：
测定RNA的修饰状态的测定部；
基于该测定的结果计算RNA上的修饰状态的计算部；和
基于该修饰状态对该对象的状态进行分析、判定的分析/判定部。
11.根据权利要求10所述的系统，其中，所述RNA包括微小RNA。
12.根据权利要求10或11所述的系统，其中，所述修饰包括微小RNA的甲基化。
13.根据权利要求10～12中任一项所述的系统，其中，所述修饰信息包括修饰位置信息及经修饰的RNA的量的信息中的至少一种。
14.根据权利要求10～13中任一项所述的系统，其中，所述状态包括癌症。
15.根据权利要求10～14中任一项所述的系统，其中，所述状态包括反应性，所述反应性是所述对象对抗癌剂是否具有抗性。
CN201980027322.6A 2018-02-22 2019-02-21 利用了rna修饰的分析、诊断方法 Pending CN112004942A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

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JP2018030099 2018-02-22
JP2018-030099 2018-02-22
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