CN101001864A - 生物分子中甲基化的序列特异性检测 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测生物分子中序列特异性甲基化的方法，所述方法包括：(a)在S－腺苷－L－甲硫氨酸－依赖性甲基转移酶的可检测辅因子存在下将生物分子与所述甲基转移酶接触；和(b)检测所述甲基转移酶的识别序列是否经辅因子或其衍生物修饰，其中所述甲基转移酶的识别序列的修饰说明所述识别序列上没有甲基化。本发明也涉及S－腺苷－L－甲硫氨酸－依赖性甲基转移酶特异性辅因子，其中所述辅因子是N－腺苷氮丙啶衍生物，它具有连接于腺嘌呤环的6或7位或连接于氮丙啶环的报道基团。而且，本发明涉及本发明辅因子和通常采用S－腺苷－L－甲硫氨酸(AdoMet)作为辅因子的甲基转移酶的复合物。此外，本发明涉及包含本发明辅因子或本发明复合物的诊断组合物。最后，本发明涉及本发明辅因子或本发明复合物在检测DNA分子中序列特异性甲基化中的应用。

Description

生物分子中甲基化的序列特异性检测

本发明涉及一种检测生物分子中序列特异性甲基化的方法，其包括：(a)在所述甲基转移酶的可检测辅因子存在下将生物分子与S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶接触；和(b)检测所述甲基转移酶的识别序列是否经辅因子或其衍生物修饰，其中所述甲基转移酶的识别序列的修饰表明所述识别序列上没有甲基化。本发明也涉及S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶的特异性辅因子，其中所述辅因子是N-腺苷氮丙啶衍生物，它具有连接于腺嘌呤环的6或7位或连接于氮丙啶环的报道基团。而且，本发明涉及本发明辅因子和通常采用S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)作为辅因子的甲基转移酶的复合物。此外，本发明涉及包含本发明辅因子或本发明复合物的诊断组合物。最后，本发明涉及本发明辅因子或本发明复合物用于检测DNA分子中序列特异性甲基化的应用。

本说明书通篇引用了几篇文献。将本文引用的文献的公开内容(包括生产商说明、说明书等)纳入本文作参考。

本说明书通篇引用并在体外进行的任何步骤组合(包括仅单个步骤)也可用细胞提取物或体内进行。

用人中发现的DNA甲基化作为例子阐述了本发明。然而，本发明也可于检测其它生物中的DNA甲基化以及RNA甲基化和蛋白质甲基化。

几乎在所有生物中都发现了DNA甲基化(Jeltsch，(2002)ChemBioChem 3，275-293)。除胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和鸟嘌呤外，DNA可含有甲基化的核碱基5-甲基胞嘧啶(5-mCyt)、N4-甲基胞嘧啶(4-mCyt)或N6-甲基腺嘌呤(6-mAde)。由DNA甲基转移酶(MTase)形成这些甲基化核碱基，该酶能催化活化甲基从辅因子S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)转移到其DNA识别序列中的胞嘧啶的C5碳、胞嘧啶的N4氮或腺嘌呤的N6氮上(Cheng，(1995)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24，293-318)。由于具体核苷酸序列可以甲基化或非甲基化形式存在，所以可认为DNA甲基化是DNA信息量的增加，它负责各种生物功能。在原核生物中，DNA甲基化参与保护宿主基因组不受内源性限制性核酸内切酶、DNA错配修复、基因表达调控和DNA复制的影响。在真核生物中，DNA甲基化在重要的调控过程中起作用，这些调控过程如基因沉默(Bird，(2002)Gene Dev.16，6-21)、基因组印记(Feil和Khosla，(1999)Trends Genet.15，431-435)、X-染色体失活(Panning和Jaenisch，(1998)Cell 93，305-308)、基因组内寄生物的沉默(Yoder，(1997)Trends Genet.13，335-340)和癌发生(Baylin，(1998)Adv.Cancer Res.72，141-196；Jones和Laird，(1999)Nat.Genet.21，163-167)。通常，癌症治疗的成功大部分取决于肿瘤发生的早期诊断。因此，非常需要开发普通肿瘤发生的早期测定。

据认为许多具体癌症形式与基因表达调控的改变有关。在许多情况下，基因表达改变可追溯到染色体DNA的甲基化模式改变。很久以前就知道，DNA甲基化是改变基因表达而不改变基因的编码功能的机制。甲基化反应涉及转移酶DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶裂缝中的S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)上的甲基，形成5-甲基胞嘧啶(5-mCyt)。引起兴趣的是，5-甲基胞嘧啶在染色体DNA中并非均匀分布，而倾向于位于CpG二核苷酸。哺乳动物基因组含有数个分离的CpG二核苷酸，它们大部分是甲基化的(Larsen，等，(1992)Genomics 13，1095-1107)。更通常观察到的是CpG的二核苷酸簇或“CpG岛”(Gardiner-Garden和Frommer，(1987)J.Mol.Biol.196，261-282)，它们存在于约40％的哺乳动物基因的启动子和外显子区。CpG岛是基因组区域，长度一般为0.2-约1kb，相对于基因组，它富含胞嘧啶和鸟嘌呤。已证明CpG岛连接于所有持家基因和许多组织特异性基因的5′端，并连接于一些组织特异性基因的3′端。5′CpG岛可通过5′侧翼DNA、外显子和内含子延伸，而大多数3′CpG岛似乎连接于外显子。CpG岛通常的位置与不同种类中等效基因的转录单元相同，但有一些显然例外(Gardiner-Garden和Frommer，(1987)J.Mol.Biol.196，261-82)。

某些基因CpG岛所含胞嘧啶残基甲基化与基因活性负相关。可以想像，这会导致各种机制引起的基因表达降低，如染色质结构的局部凝聚、转录因子-DNA结合的抑制或征集与甲基化CpG特异性相互作用直接阻止转录因子结合的蛋白质。甲基化增加也可影响(如)肿瘤抑制基因的启动子区。此区域的甲基化增加可能导致正常基因表达逐渐降低，产生具有选择性生长优势的细胞群。

然而，癌症细胞中观察到的并不仅仅是DNA甲基化的增加。DNA甲基化模式的不同改变可能足以改变细胞的基因表达和诱导癌发生。实际上，已证明癌细胞与CpG-甲基化的特征性模式有关，该特征性模式有别于其健康祖细胞的甲基化模式。因此，可研究关于健康和病变细胞的染色体DNA的特定甲基化模式的知识，用于开发检测疾病如癌症用的标记物。

对DNA中甲基化区域的作图(Rein等，(1998)Nucleic Acid Res.26，2255-2264)主要依赖Southern杂交法，基于甲基化敏感性限制性酶不能切割含有一个或多个甲基化CpG序列的序列。此方法能够评价CpG岛的总体甲基化状态，包括一些定量分析，但相对不灵敏，需要大量样品并且仅可提供关于甲基化敏感型限制性酶识别序列内发现的CpG序列的信息。

更灵敏的方法是基于采用甲基化敏感性酶和聚合酶链反应(PCR)的组合检测甲基化模式。用该酶消化DNA后，只有当甲基化防止DNA切割时，PCR才能从侧接于限制性序列的引物扩增。正如基于Southern的方法那样，此方法仅可监测甲基化敏感性限制性位点中的CpG-甲基化。避免采用限制性核酸内切酶的另一方法采用亚硫酸氢盐处理DNA，以将所有未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。扩增改变的DNA并测序，以显示所有CpG序列的甲基化状态。或者，可在杂交实验中分析扩增的DNA。

现有领域的方法的主要缺点是对天然DNA的初步修饰不直接导致掺入可检测标记，这强烈限制了后续检测步骤的可应用方法。

近年来，提出了DNA序列特异性标记的新方法，它采用新设计的来自水生嗜热菌(Thermus aquaticus)的DNA(腺嘌呤-6)-甲基转移酶(M.TaqI)的荧光辅因子(Pljevaljcic等，(2003)J.Am.Chem.Soc.125，3486-3492)。天然情况下，M.TaqI能催化使双链5’-TCGA-3’DNA序列内腺嘌呤的环外氨基亲核攻击到辅因子S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)的甲基上，产生序列-和碱基-特异性甲基转移。最重要的是，正如其它DNA甲基转移酶(MTase)那样，M.TaqI仅可将一个甲基转移到其靶碱基上，含有完全甲基化识别序列的DNA不能被进一步修饰。

用氮丙啶基残基取代天然辅因子S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)的甲硫氨酸侧链导致M.TaqI-催化完整核苷的亲核环打开并偶联于DNA中的靶腺嘌呤。腺苷部分是辅因子结合的分子锚点。通过弹性接头将荧光团连接于腺苷部分的8-位不能阻断辅因子结合。可用新设计的辅因子8-氨基[1″-(N″-丹酰)-4″-氨基丁基]-5′-(1-氮丙啶基)-5′-脱氧腺苷序列-特异性地标记M.TaqI-催化反应中的DNA。

可将新设计的荧光辅因子用于具有含CpG岛CpG基序的识别序列的DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶催化的标记反应。由于胞嘧啶残基的甲基化应该阻断标记辅因子的酶偶联，所以成功的标记反应将说明非甲基化的CpG序列，而不能偶联标记辅因子则说明甲基化的CpG序列。因此，此反应可用于监测染色体DNA的甲基化状态。

溶血嗜血菌(Haemophilus haemolyticus)天然产生具有所需特异性的DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶M.HhaI，能使双链DNA序列5’-GCGC-3’中的第一个胞嘧啶甲基化。然而，本领域没有M.HhaI的可检测N-腺苷氮丙啶辅因子或其衍生物。因此，本申请内容的技术问题是提供M.HhaI和其它S-腺苷-L-甲硫氨酸-依赖性甲基转移酶的可检测辅因子，以及检测DNA甲基化状态改变的方法。

通过提供权利要求书中描述特征的实施方式解决此技术问题。

因此，本发明涉及检测生物分子中序列特异性甲基化的方法，其包括：(a)在所述甲基转移酶的可检测辅因子的存在下使生物分子与S-腺苷-L-甲硫氨酸-依赖性甲基转移酶接触；和(b)检测所述甲基转移酶的识别序列是否经辅因子或其衍生物修饰，其中所述甲基转移酶的识别序列的修饰表明在所述识别序列上没有甲基化，其中所述N-腺苷氮丙啶衍生物由式(I)代表，

式中

W选自N或CH，

X是N或CR¹，

Y是NH₂或NHR²，

Z是H、R³或CH₂CH(COOH)(NH₂)，

限制条件是：

如果X是CR¹，那么Y是NH₂且Z是H或CH₂CH(COOH)(NH₂)，

如果X是N且Y是NHR²，那么Z是H或CH₂CH(COOH)(NH₂)，

如果X是N且Y是NH₂，那么Z是R³，

R¹选自-(CH₂)_nR⁴、-(CH＝CH)_m(CH₂)_nR⁴、-(CH₂)_o(CH＝CH)_m(CH₂)_nR⁴、-(C≡C)_m(CH₂)_nR⁴、-(C≡C)_m(C₆H₄)_o(CH₂)_nR⁴、-(C₆H₄)_m(CH₂)_nR⁴、-CO(CH₂)_nR⁴或-S(CH₂)_nR⁴；

R²选自-(CH₂)_nR⁴、-(C₆H₄)_m(CH₂)_nR⁴、-CO(C₆H₄)_m(CH₂)_nR⁴或-CO(CH₂)_nR⁴；

R³选自-(CH₂)_nR⁴、-(CH＝CH)_m(CH₂)_nR⁴、-(C≡C)_m(CH₂)_nR⁴、-(C₆H₄)_m(CH₂)_nR⁴或-CONH(CH₂)_nR⁴；

R⁴选自-NHR⁵、-NHCO(CH₂)_pSR⁵、-SR⁵、-OR⁵、-O(C₂H₅O)_n(C₂H₅)NHR⁵、-CH₂NHNHR⁵、-NHCOCH(CH₂SH)NHR⁵或-CONHR⁵；

R⁵选自荧光团、亲和标记物、交联剂、生色团、蛋白质、肽、可任选修饰的氨基酸、核苷酸、核苷、核酸、糖、脂质、PEG、转染试剂、珠、嵌入剂、核酸切割试剂或纳米颗粒(例如金簇)；和

n、m、o和p独立地选自0或1-5000的整数。

本文通篇所用术语“检测序列特异性甲基化”指评价甲基转移酶(MTase)识别序列内的受体位点是否通过加入甲基而被修饰。所述受体位点优选为DNA甲基转移酶的识别序列的一部分。更优选地，所述DNA甲基转移酶选自M.HhaI和M.TaqI、M.BseCI和M.SssI。当DNA甲基转移酶是M.HhaI时，受体位点优选为嵌入M.HhaI较大5’-GCGC-3’识别序列中的5’-CG-3’序列的胞嘧啶。

术语“生物分子”指DNA、RNA或(多)肽。术语“(多)肽”指肽或多肽。肽通常是长达30个残基的共价连接的氨基酸，而多肽(也称为“蛋白质”)包含31和更多个氨基酸残基。生物分子优选为染色体或基因组DNA。

术语“使生物分子与甲基转移酶接触”指将生物分子与甲基转移酶置于接触状态中。通常，可通过将甲基转移酶加入含有生物分子的样品中完成此过程。或者，可将含有生物分子的样品加入含有甲基转移酶的溶液。本领域技术人员了解，可能需要特定的缓冲液条件来获得最佳酶活性。这些条件或者为本领域技术人员所了解，或者可通过在各种测定条件下研究酶活性获得。

附图说明：

图1：M.HhaI-催化的生物素化氮丙啶辅因子1(A)、2(B)和3(C)与双链体寡脱氧核苷酸I·II的偶联，在反应开始时(a)，反应3小时(A)、1.5小时(B)、6.25小时(C)后(b)，额外加热到65℃30分钟后(c)和再加入链霉抗生物素蛋白后(d)用阴离子交换HPLC进行分析。

图2：用氮丙啶辅因子1和M.HhaI检测CpG-甲基化。

A：反应方案(灰球＝链霉抗生物素蛋白)；B：未修饰的(a)、CpG-甲基化的(b)、CpG-甲基化并用1和M.HhaI处理的(c)和生物素标记的(d)线性化pUC19质粒DNA(LpUC19)电泳后的琼脂糖凝胶。泳道1：质粒DNA(a)、(b)、(c)或(d)；泳道2：与R.HhaI一起孵育的质粒DNA(a)、(b)、(c)或(d)；泳道3：与链霉抗生物素蛋白一起孵育的质粒DNA(a)、(b)、(c)或(d)。

图3：用M.HhaI和7Baz对测试DNA进行序列特异性标记。左：反应方案。右：分别加入R.HhaI和链霉抗生物素蛋白，然后在琼脂糖凝胶上电泳检测标记反应。

图4：用M.HhaI和6TexAz序列特异性标记测试DNA。左：反应方案。右：通过加入R.HhaI，然后在琼脂糖凝胶上电泳检测标记反应。

图5：M.SssI-催化的生物素化氮丙啶辅因子3与半甲基化的双链体寡脱氧核苷酸I·II(A)和未甲基化的双链体寡脱氧核苷酸I·III(B)的偶联，在反应开始时(a)，反应1小时(b)、2小时(c)、3小时(d)后，额外加热到95℃10分钟后(e)和再加入链霉抗生物素蛋白后(f)用阴离子交换HPLC进行分析。

图6：(A)用DNA-甲基转移酶和氮丙啶衍生物标记DNA的原理；(B)用氮丙啶-标记的DNA模板抑制PCR-扩增的原理。

图7：用重叠延伸-PCR合成底物。

图8：对DNA底物进行序列分析。

图9：(A)甲基化/部分甲基化的DNA底物的产生；(B)甲基化/部分甲基化的DNA底物的分析。

图10：用LightCycler-PCR比较未标记的和氮丙啶标记的DNA底物(A＝1.5ng模板DNA)；(B＝150pg模板DNA)；(C＝15pg模板DNA)；(D＝1.5pg模板DNA)。

通常，在甲基转移酶辅因子的存在下使生物分子与甲基转移酶接触。所述辅因子优选式(I)的N-腺苷氮丙啶衍生物。

术语“甲基转移酶”通常指将活化甲基从S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)转移到它们的底物上的酶。甲基转移酶优选为能够甲基化DNA、RNA或(多)肽的酶。甲基转移酶更优选为选自M.HhaI、M.TaqI、M.BseCI和M.SssI的DNA甲基转移酶。

术语“检测所述甲基转移酶的识别序列是否经辅因子或其衍生物修饰”指评价式(I)的辅因子或其衍生物是否连接于生物分子。检测方法优选包括鉴定甲基转移酶识别序列内经辅因子或其衍生物修饰的具体残基。所述衍生物可以是式(I)的N-腺苷氮丙啶衍生物和生物分子之间反应产生的任何化合物。

术语“识别序列”指生物分子内被甲基转移酶识别的特定序列。在甲基转移酶是DNA甲基转移酶时，识别序列可包含2、3、4、5、6或8个核苷酸或核苷酸对。本文所用识别序列也包括式(I)的N-腺苷氮丙啶衍生物或其衍生物的受体位点。本发明内容允许以甲基化依赖性方式进行序列特异性标记。位于称为CpG岛的胞嘧啶残基的DNA标记是本发明的特定方面，因为它能够评价人染色体DNA的甲基化状态。因此，本发明方法尤其可用于(但不限于)诊断与染色体DNA的甲基化状态改变相关的疾病。也应该可用于获得(access)其它来源的DNA甲基化状态以及RNA或(多)肽的甲基化状态。此外，与甲基转移酶形成复合物的式(I)的辅因子或其衍生物可用于序列特异性标记DNA、RNA或(多)肽，从而可用于生物化学、分子生物学、基因治疗和纳米生物技术中的各种应用。此外，式(I)的辅因子或其衍生物可用于寻找甲基转移酶的新甲基化靶点。

本文公开的实验结果证明，本发明N-腺苷氮丙啶衍生物可取代M.HhaI的天然辅因子。发现其它S-腺苷-L-甲硫氨酸-依赖性DNA甲基转移酶，如M.TaqI、M.BseCI和M.SssI也可采用本发明N-腺苷氮丙啶衍生物。所述S-腺苷-L-甲硫氨酸-依赖性甲基转移酶优选选自DNA甲基转移酶M.HhaI、M.TaqI、M.BseCI、M.SssI、M.RsrI、M.DpnM、M.PvuII或M.MboII，选自RNA甲基转移酶VP39、Fts/RrmJ、NS5或ErmC’，或者选自(多)肽甲基转移酶hPIMT、LSMT、SET7/9、HemK/PrmC、hDOT1L或PRMT1。

在本发明的优选实施方式中，所述生物分子是核酸分子或(多)肽。应理解，核酸分子包括DNA和RNA。DNA优选为染色体或基因组DNA。生物分子可以是任何长度。术语“染色体DNA”也包括染色体片段。所述片段的长度优选为长达500个核苷酸(nt)、1千碱基(kb)、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb，甚至更长。然而，术语染色体DNA也包括长度至多5nt、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、100nt、200nt、300nt、400nt、500nt的短片段。

在本发明的又一优选实施方式中，在体外用细胞提取物进行或在体内进行所述步骤(a)。通常，用限制性酶和DNA甲基转移酶处理的适当反应条件为本领域技术人员所知并有记载，例如，分子生物学的标准教科书中的记载(参见例如Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)；ISBN：0879695765，CSH Press，Cold Spring Harbor，2001)。M.HhaI介导的辅因子标记的适当条件是(例如)：80μM N-腺苷氮丙啶衍生物，11.3nM双链质粒DNA，380nM M.HhaI的缓冲液(10mM Tris盐酸，pH7.4，50mM氯化钠，0.05mM乙二胺四乙酸和2mM β-巯基乙醇)溶液。可在37℃孵育2小时。

在体外实施本发明方法时，在分析之前从个体中分离生物样品。术语“生物样品”涉及取自该个体的样品。所述样品优选取自毛发、皮肤、粘膜表面、体液(包括血液、血浆、血清、尿液、唾液、痰、泪、脑脊液、精液、滑液、羊水、乳汁、淋巴、肺痰、支气管分泌物或粪便)。

该个体可以是人或动物。该个体优选为禽类，包括火鸡或家鸡，或者该个体是哺乳动物，包括人、灵长动物、大鼠、小鼠、豚鼠、猪、牛、猫或兔。

在本发明更优选的实施方式中，所述核酸分子是DNA。所述DNA优选为染色体DNA。

在本发明另一更优选的实施方式中，该方法还包括在步骤(a)之前用限制性酶处理DNA的步骤。限制性酶可选自AatII、AccI、Acc65I、AciI、AcII、AfeI、AfIII、AfIIII、AgeI、AhdI、AIuI、AIwI、AIwNI、ApaI、ApaLI、ApoI、AscI、AseI、AsiSI、AvaI、AvaII、AvrII、BaeI、BamHI、BanI、BanII、BbsI、BbvI、BbvCI、BceAI、BcgI、BciVI、BcII、BfaI、BfrBI、BfuAI、BgII、BgIII、BIpI、Bme1580I、BmgBI、BmrI、BpmI、BsaI、BsaAI、BsaBI、BsaHI、BsaJI、BsaWI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsiEI、BsiHKAI、BsiWI、BsII、BsmI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsoBI、Bsp1286I、BspCNI、BspDI、BspEI、BspHI、BspMI、BsrI、BsrBI、BsrDI、BsrFI、BsrGI、BssHII、BssKI、BssSI、BstAPI、BstBI、BstEII、BstF5I、BstNI、BstUI、BstXI、BstYI、BstZ17I、Bsu36I、BtgI、BtrI、BtsI、Cac8I、CIaI、DdeI、DpnI、DpnII、DraI、DraIII、DrdI、EaeI、EagI、EarI、EciI、EcoNI、EcoO109I、EcoRI、EcoRV、FauI、Fnu4HI、FokI、FseI、FspI、HaeII、HaeIII、HgaI、HhaI、HinP1I、HincII、HindIII、HinfI、HpaI、HpaII、HphI、Hpy99I、Hpy188I、Hpy188III、HpyCH4III、HpyCH4IV、HpyCH4V、KasI、KpnI、MboI、MboII、MfeI、MIuI、MIyI、MnII、MscI、MseI、MsII、MspI、MspA1I、MwoI、NaeI、NarI、NciI、NcoI、NdeI、NgoMIV、NheI、NIaIII、NIaIV、NotI、NmI、NsiI、NspI、PacI、PaeR7I、PciI、PfIFI、PfIMI、PIeI、PmeI、PmII、PpuMI、PshAI、PsiI、PspGI、PspOMI、PstI、PvuI、PvuII、RsaI、RsrII、SacI、SacII、SaII、SapI、Sau96I、Sau3AI、SbfI、ScaI、ScrFI、SexAI、SfaNI、SfcI、SfiI、SfoI、SgrAI、SmaI、SmII、SnaBI、SpeI、SphI、SspI、StuI、StyI、SwaI、TaqI、TfiI、TIiI、TseI、Tsp45I、Tsp509I、TspRI、Tth111I、XbaI、XcmI、XhoI、XmaI或XmnI。

在本发明又一更优选的实施方式中，将所述DNA分子固定在固体支持物上。可用于本发明的固体支持物包括过滤材料、芯片、晶片、微量滴定板。可通过不同方式固定在固体支持物上，包括共价偶联于活化表面或与核酸分子杂交。

在本发明另一更优选的实施方式中，通过使DNA分子与连接于所述固体支持物的寡核苷酸杂交将所述DNA分子偶联于固体支持物。杂交条件可以是低严谨、中度严谨和高度严谨的。本领域技术人员熟知本文所用术语“严谨条件”，对应于高度严谨条件。本领域技术人员可通过改变参数如温度、核酸分子组成、盐条件等建立适合各序列的严谨杂交条件；参见例如，Sambrook等，《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)；CSH Press，Cold SpringHarbor，1989或Higgins和Hames(编)，《核酸杂交，实践方法》(Nucleic acidhybridization，a practical approach)，IRL Press，Oxford 1985，具体参见Britten和Davidson所著的“杂交策略”章节，3-15。严谨杂交条件是(例如)包括在含有以下成分的溶液中42℃孵育过夜的条件：50％甲酰胺，5×SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardt溶液，10％硫酸葡聚糖和20μg/mL变性、剪切的鲑精DNA，然后用0.1×SSC在约65℃洗涤滤纸。其它严谨杂交条件是(例如)0.2×SSC(0.03M NaCl，0.003M柠檬酸钠，pH7)，65℃。此外，为了实现较低的严谨性，严谨杂交后可在较高的盐浓度(例如5×SSC)下进行洗涤。需要注意的是，可通过包括和/或替换用于抑制杂交实验的背景的另选封闭试剂改变上述条件。典型的封闭试剂包括但不限于：Denhardt试剂、BLOTTO、肝素、变性的鲑精DNA和市售专利制剂。由于相容性问题，特定封闭试剂的加入可能需要改变上述杂交条件。也考虑了低严谨杂交条件。杂交的严谨性和信号检测中的改变是(例如)通过操作甲酰胺浓度(较低百分数的甲酰胺导致严谨性降低)、盐条件或温度完成的。例如，较低严谨条件包括在包含以下成分的溶液中37℃孵育过夜：6×SSPE(20×SSPE＝3M NaCl；0.2M NaH₂PO₄；0.02M EDTA，pH7.4)，0.5％SDS，30％甲酰胺，100μg/mL鲑精封闭DNA；然后用1×SSPE、0.1％SDS在50℃洗涤。此外，为了实现甚至更低的严谨性，严谨杂交后可在较高的盐浓度(例如5×SSC)下进行洗涤。

在本发明另一更优选的实施方式中，甲基转移酶是单独(orphan)DNA甲基转移酶或细菌限制性修饰系统的一部分。

在本发明又一更优选的实施方式中，细菌限制性修饰系统的所述甲基转移酶选自M.HhaI、M.TaqI、M.BseCI和M.SssI。术语“M.HhaI”指保存在Swissprot数据库中登录号为P05102的DNA甲基转移酶。术语“M.TaqI”指保存在Swissprot数据库中登录号为P14385的DNA甲基转移酶。术语“M.BseCI”指保存在Swissprot数据库中登录号为P43423的DNA甲基转移酶。然而，具有相同序列特异性(即识别序列相同)或降低的序列特异性(仅包含M.HhaI，M.TaqI或M.BseCI识别序列的一部分)的任何其它甲基转移酶可用于本发明方法。

在本发明另一更优选的实施方式中，(a)N-腺苷氮丙啶衍生物在DNA甲基转移酶识别序列阻断了限制性酶切；和(b)通过测定N-腺苷氮丙啶衍生物对DNA进行的修饰是否阻断了所述识别序列处的限制性酶切介导的酶切来检测甲基化。进行此方法时，可采用本发明所述的任何限制性酶和DNA甲基转移酶。

本发明发明者观察到，识别序列的受体位点存在N-腺苷氮丙啶衍生物阻断了具有重叠或相同识别序列的限制性酶的DNA酶切。本文所用“阻断限制性酶切”指，阻止限制性酶切割DNA链。不受限于理论，假定位阻作用阻断了接近识别序列，以致限制性酶不能再以生产性方式(productive manner)结合于其靶序列。可通过试验获得此观察结果，此试验包括先用本发明N-腺苷氮丙啶衍生物标记的步骤和随后用限制性酶酶切的步骤。天然情况下，限制性酶的选择取决于标记步骤所用的具体DNA甲基转移酶。作为通用指南，限制性酶的识别序列应该在修饰碱基附近。限制性酶的识别序列优选包含修饰碱基。更优选地，DNA甲基转移酶的识别序列和限制性酶的识别序列相同。限制性酶和DNA甲基转移酶的具体组合的选择对于本领域技术人员而言是显而易见的，无需作进一步解释。而且，可在标准条件下进行DNA甲基转移酶和限制性酶切进行的标记反应。

在本发明又一更优选的实施方式中，(a)N-腺苷氮丙啶衍生物干扰了甲基转移酶的识别位点处的核酸扩增；和(b)通过测试甲基转移酶识别位点处核酸分子的扩增是否被阻滞检测甲基化。

扩增反应期间可通过干扰引物结合或链延伸阻滞扩增。

术语“扩增”指拷贝数增加。本领域技术人员知晓各种扩增核酸分子的方法，这些方法也可用于本发明的诊断方法中。扩增方法包括但不限于：“聚合酶链反应”(PCR)、“连接酶链反应”(LCR，EPA320308)，“环探针反应”(CPR)，“链取代扩增”(SDA，Walker等，(1992)Nucleic Acid Res.7，1691-1696)，“基于转录的扩增系统”(TAS，Kwoh等，(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86，1173；Gingeras等，PCT申请WO 88/10315)。优选用聚合酶链反应(PCR)进行DNA扩增[《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)，第226卷(Bartlett和Stirling编)：PCR方法(PCR protocols)，第二版；《PCR技术：DNA扩增的原理和应用》(PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification)(Erlich编)，New York 1992；《PCR方法：方法和应用指南》(PCR Protocols：A guide tomethods and applications)(Innis等编)，Academic Press，圣地亚哥1990]。核酸扩增方法尤其可用于样品仅含有少量核酸的情况。如果所述核酸是RNA，可以进行RT-PCR。随后，可进行包括PCR的另一扩增步骤。或者，如果样品所含核酸是DNA，则进行PCR。

PCR通常由许多重复循环组成，各循环由以下步骤组成：(a)变性步骤，使DNA分子的两条链解链；(b)退火步骤，目的是使引物特异性退火到DNA分子的解链链上；和(c)延伸步骤，用模板链提供的信息延长退火引物。通常，可在50μL反应混合物中进行PCR，反应混合物中含有5μL 10×PCR缓冲液(1.5mMMgCl₂)、200μM各脱氧核苷三磷酸、0.5μL各引物(10μM)、约10-100ng模板DNA和1-2.5单位Taq DNA聚合酶。扩增引物可以是标记或未标记的。可用(例如)2400型热循环仪(Applied Biosystems，加利福尼亚州福斯特城)进行DNA扩增：94℃2分钟，然后是35个由以下步骤组成的循环：退火(50℃30秒)，延伸(72℃1分钟)，变性(94℃10秒)，最后的退火步骤：55℃1分钟以及最后的延伸步骤：72℃5分钟。然而，本领域技术人员知道如何优化这些条件以扩增特定核酸分子或者按比例减少或增加反应混合物的体积。

核酸扩增的另一方法是“逆转录酶聚合酶链反应”(RT-PCR)。当待扩增核酸由RNA组成时采用此方法。术语“逆转录酶”指催化脱氧核糖核苷三磷酸聚合形成与核糖核酸模板互补的引物延伸产物的酶。该酶在引物的3′端开始合成，向模板的5′端进行直到合成终止。将RNA靶序列转变为互补的DNA拷贝(cDNA)序列的合适聚合剂的例子是禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶和嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)DNA聚合酶，后者是Perkin Elmer出售的一种具有逆转录酶活性的热稳定DNA聚合酶。在产生用作扩增模板的DNA链的初始逆转录步骤后第一个变性步骤期间，基因组RNA/cDNA双链体模板一般是热变性的。DNA模板所用的合适聚合酶包括例如：大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I或其冈崎片段、T.sub.4DNA聚合酶、Tth聚合酶和Taq聚合酶，Taq聚合酶是分离自水生栖热菌(Thermusaquaticus)的热稳定DNA聚合酶，由Hoffmann-La Roche开发和生产、Perkin Elmer销售。Taq聚合酶广泛用于核酸的扩增和测序。本领域已知采用Taq DNA聚合酶的反应条件，参见例如：《PCR技术》(PCR Technology)，Erlich(1989，StocktonPress，New York；或者：Innis、Gelfand、Sninsky和White，1990，《PCR方法：方法和应用指南》(PCR Protocols：A guide to methods and applications)AcademicPress，纽约。高温RT提供了较高的引物特异性和提高的效率。1991年8月15日提交的共待批美国专利申请序列号07/746,121描述了“均一RT-PCR”，其中使相同引物和聚合酶满足逆转录和PCR扩增步骤，优化反应条件以便在不改变试剂的情况下进行两个反应。可用作逆转录酶的热稳定DNA聚合酶——嗜热栖热菌DNA聚合酶可用于所有引物延伸步骤，无论模板是什么。无需打开试管改变或加入试剂就可完成这两个步骤；仅需调整第一个循环(RNA模板)和其余扩增循环(DNA模板)之间的温度分布情况。可在(例如)20μL反应混合物中进行RT反应，该混合物含有：4μL 5×ANV-RT缓冲液、2μL寡聚dT(100μg/mL)、2μL10mM dNTP、1μL总RNA、10单位AMV逆转录酶，和H₂O至20μL终体积。可采用以下条件进行反应：使该反应维持70℃15分钟，进行逆转录。然后将反应温度提高到95℃1分钟，以使RNA-cDNA双链体变性。接着，反应温度进行两个95℃15秒和60℃20秒的循环，然后是38个90℃15秒和60℃20秒的循环。最后，将反应温度维持在60℃4分钟，以进行最终延伸步骤，冷却到15℃并维持该温度，直到进一步加工扩增样品。

本文通篇所用术语“引物”或“寡核苷酸”指长约8-30个，最长约50个核苷酸的短核酸分子，它们是天然或合成的，在诱导与模板核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下，即在存在四种不同的核苷三磷酸或其类似物和聚合剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)的合适缓冲液中和合适温度下能够用作核酸合成起点。引物优选为单链寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的预计用途，PCR引物和用于测序反应的引物的长度范围一般是10-25个核苷酸。短引物分子通常需要较低的温度才能与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物不需要反映模板的确切序列，但必须足够互补，以与模板特异性杂交，条件是它介导扩增的能力未受损。“杂交”指两个单链核酸通过互补碱基配对即A与T(在RNA中是U)、G与C配对而结合。术语“引物对”指分别与双链核酸分子的正链或负链杂交的两种引物，以在例如PCR反应中扩增(例如)DNA片段。如果需要，可通过掺入可通过光谱、光化学、生化、免疫化学或化学方法检测的化合物标记引物。例如，有用的标记包括但不限于：荧光染料、电子致密试剂、生物素或可获得抗血清或单克隆抗体的小肽。也可用标记“捕获”引物，从而有利于选择扩增核酸或其片段。羧基荧光素(FAM)和6-羧基-X-罗丹明(ROX)是优选的标记。然而，其它优选标记包括荧光染料，如荧光素异硫氰酸酯(FITC)、德克萨斯红、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、6-羧基荧光素(6-FAM)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、5-羧基荧光素(5-FAM)或N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、放射性标记(如³²p、³⁵S、³H)等。

该标记也可以是二阶体系，其中引物偶联于具有高亲和结合对如抗生物素蛋白、特定抗体等的生物素、半抗原等，其中结合对偶联于可检测标记。该标记可偶联于一个或两个引物。

在所述方法用于诊断时，可进行核酸测序步骤。本领域已知的任何方法均可用于测序。优选用基于Sanger或Maxam/Gilbert的测序技术的方法测定核酸序列(参见例如：《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)，第167卷(Graham和Hill编)：《DNA测序方法》(DNA sequencing protocols)，第2版，2001；Galas和McCormack，《基因组技术：现状和未来》(Genomic Technologies：Present and Future)，Caister Academic Press，英国Wymondham，2002)。

在本发明的优选实施方式中，PCR是实时PCR。在本发明另一优选实施方式中，通过实时PCR进行核酸扩增。

在本发明又一更优选的实施方式中，(a)N-腺苷氮丙啶衍生物含有荧光标记；和(b)通过测定所述核酸分子中荧光的存在或量检测甲基化。可用本发明所述或本领域技术人员已知的任何荧光标记物标记所述N-腺苷氮丙啶衍生物。根据本发明，Alexa、BODIPY、荧光素、罗丹明、德克萨斯红、花青荧光团或其衍生物是尤其优选的标记。

“测定荧光的存在或量”指评价荧光光谱法是否可检测到或检测到多少荧光。

在本发明另一更优选的实施方式中，(a)通过亲和纯化法纯化甲基转移酶识别序列处修饰的核酸分子；和(b)N-腺苷氮丙啶衍生物含有亲和标记物。

可采用能够特异性结合本发明N-腺苷氮丙啶衍生物的标记的化合物纯化核酸分子。在这种情况下标记对应于或包含亲和标记物。亲和标记物可与一种或多种荧光标记组合。能够结合标记或亲和标记物的化合物优选抗体、蛋白质、肽或适体，其中这些化合物的结合是特异性的。亲和标记物可以是表位如flag标签、c-myc标签、HA标签、地谷新配基或二硝基酚。或者，亲和标记物可以是人工肽，如His标签。“His标签”可选自His₄、His₅、His₆、His₇、His₈、His₉、His₁₀、His₁₁、His₁₂、His₁₃、His₁₄、His₁₅。而且，亲和标记物可以是生物素、链霉素标签、谷胱甘肽、镍-三乙酸腈(NTA)或麦芽糖。如果亲和标记物是“His标签”，那么可用偶联于固体支持物的镍进行纯化。如果亲和标记物是表位，那么可用偶联于固体支持物的亲和抗体进行纯化。如果亲和标记物是生物素或链霉素标签，那么可用结合于固体支持物的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白等进行纯化。如果亲和标记物是谷胱甘肽，那么可用结合于固体支持物的谷胱甘肽转移酶(GST)进行纯化。如果亲和标记物是麦芽糖，那么可用结合于固体支持物的麦芽糖结合蛋白进行纯化。如果亲和标记物是镍-三乙酸腈(NTA)，那么可用结合于固体支持物的含有几个组氨酸残基的肽进行纯化。

亲和纯化通常包括根据与固定于固定材料(固相)的配体的结合作用差异分离溶液(流动相)中的分子。亲和纯化中的支持物或基质是可共价连接配体的任何材料。一般地，用作亲和基质的材料在发现靶分子的体系中不可溶。不溶性基质通常但不总是固体。已经描述了几百种物质可用作亲和基质。有用的亲和支持物是具有高表面积/体积比、具有易于为配体的共价连接而被修饰的化学基团、最小非特异性结合性能、良好的流动特性以及机械和化学稳定性的支持物。固体支持物优选琼脂糖、琼脂糖凝胶和聚苯乙烯珠。

优选用生物素、地谷新配基(digoxygenin)、谷胱甘肽或镍-三乙酸腈(NTA)作为本发明N-腺苷氮丙啶衍生物的亲和标记物进行亲和纯化。

在本发明另一更优选的实施方式中，N-腺苷氮丙啶衍生物被加到胞嘧啶残基中，而不能被加到DNA的5-甲基胞嘧啶残基中。

在本发明的优选实施方式中，该方法包括在步骤(a)后再对DNA分子进行测序的步骤。本领域已知的任何方法可用于测序。优选通过基于Sanger或Maxam/Gilbert测序技术的方法测定核酸序列(参见例如：《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)，第167卷(Graham和Hill编)：《DNA测序方法》(DNA sequencing protocols)，第2版，2001；Galas和McCormack，《基因组技术：现状和未来》(Genomic Technologies：Present and Future)。Caister AcademicPress，Wymondham，英国，2002)。

在本发明另一优选实施方式中，通过(a)与所述可检测辅因子特异性结合的抗体或(b)与所述可检测辅因子特异性结合的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白检测所述可检测辅因子。

本文通篇所用术语“抗体”指单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体或其片段。抗体优选对其表位特异。抗体可以是人源化抗体，合成抗体，抗体片段如Fab、F(ab2)’、Fv或scFv片段等，或它们的化学修饰衍生物。可通过(例如)最初在Khler和Milstein，(1975)Nature 256，495和Galfré，(1981)Meth.Enzymol.73，3中描述的技术制备单克隆抗体，所述技术包括将小鼠骨髓瘤细胞与衍生自免疫的哺乳动物的脾细胞融合，本领域对其做出了各种改进。而且，可用(例如)Harlow和Lane《抗体，实验室手册》(Antibodies，A Laboratory Manual)，CSH Press，Cold Spring Harbor，1998所述的方法获得抗体或其片段。当用噬菌体呈现技术获得所述抗体的衍生物时，可用BIAcore系统所用表面等离振子共振技术提高结合于待分析表位的噬菌体抗体的效率(Schier，(1996)Human Antibodyhybridomas 7，97-105；Malmborg，(1995)J.Immunol.Methods 183，7-13)。嵌合抗体的产生如WO89/09622所述。

抗体可以是标记的，其中标记物可以是本发明所述的任何标记物。

最后，在本发明另一优选实施方式中，通过DNA测序、杂交、Maldi-Tof或通过酶片段化和色谱进行核苷组成分析来确定所述DNA分子的身份。

本发明也涉及本发明方法在与增加或减少的DNA甲基化相关的疾病的诊断或预后中的应用，其中所述疾病是癌症或ICF综合征。优选对获自患者的样品进行诊断。

术语“增加或减少的甲基化”指健康个体的DNA与患病个体的DNA相比时染色体DNA的甲基化状态改变。根据本发明内容，染色体DNA甲基化状态改变可反映出基因表达的改变。事实上，在许多情况下，DNA甲基化状态的改变造成转录水平的提高或降低。改变的甲基化模式可能与具体疾病紧密关联，以致于染色体DNA内甲基化模式改变的诊断可用作该疾病的诊断或预后标记。

可用本发明内容诊断的癌症包括但不限于：实体瘤，包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、睾丸癌、肝癌、腮腺癌、胆道癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌；原发性肿瘤和转移癌；黑色素瘤；成胶质细胞瘤；卡波济氏肉瘤；平滑肌肉瘤；非小细胞肺癌；结直肠癌；晚期恶性肿瘤以及血液肿瘤(blood born tumors)如白血病。

术语“ICF综合征”指特征是免疫缺陷、着丝粒区域不稳定性和面部异常的疾病。ICF综合征是通过染色体异常，尤其是促分裂原刺激的淋巴细胞中染色体1、9和16(Chr1和Chr16)的着丝粒附近染色体异常诊断的一种独特的DNA甲基化缺陷型疾病。这些异常包括着丝粒附近的异染色质的解凝聚、具有多达12条臂的多辐射状染色体和全臂缺失。在分子水平，ICF综合征中最一致的特征之一是染色体1、9和16上近着丝粒重复序列的过度甲基化(Jeanpierre等，(1993)Hum.Mol.Genet.2，731-735)。因此，可分析过度甲基化的DNA区域，一种诊断方法基于这种分析。

本发明辅因子是式(I)代表的N-腺苷氮丙啶衍生物，

式中

W选自N和CH，

X是N或CR¹，

Y是NH₂或NHR²，

Z是H、R³或CH₂CH(COOH)(NH₂)，

条件是：

如果X是CR¹，那么Y是NH₂和Z是H或CH₂CH(COOH)(NH₂)，

如果X是N且Y是NHR²，那么Z是H或CH₂CH(COOH)(NH₂)，

如果X是N且Y是NH₂，那么Z是R³，

R¹选自-(CH₂)_nR⁴、-(CH＝CH)_m(CH₂)_nR⁴、-(CH₂)_o(CH＝CH)_m(CH₂)_nR⁴、-(C≡C)_m(CH₂)_nR⁴、-(C≡C)_m(C₆H₄)_o(CH₂)_nR⁴、-(C₆H₄)_m(CH₂)_nR⁴、-CO(CH₂)_nR⁴或-S(CH₂)_nR⁴；

R²选自-(CH₂)_nR⁴、-(C₆H₄)_m(CH₂)_nR⁴、-CO(C₆H₄)_m(CH₂)_nR⁴或-CO(CH₂)_nR⁴；

R³选自-(CH₂)_nR⁴、-(CH＝CH)_m(CH₂)_nR⁴、-(C≡C)_m(CH₂)_nR⁴、-(C₆H₄)_m(CH₂)_nR⁴或-CONH(CH₂)_nR⁴；

R⁴选自-NHR⁵、-NHCO(CH₂)_pSR⁵、-SR⁵、-OR⁵、-O(C₂H₅O)_n(C₂H₅)NHR⁵、-CH₂NHNHR⁵、-NHCOCH(CH₂SH)NHR⁵或-CONHR⁵；

R⁵选自荧光团、亲和标记物、交联剂、生色团、蛋白质、肽、可任选修饰的氨基酸、核苷酸、核苷、核酸、糖、脂质、PEG、转染试剂、珠、嵌入剂、核酸切割试剂或纳米颗粒(如金簇)；

n、m、o和p独立地选自0或1-5000的整数。

R¹优选选自-(CH₂)_nR⁴、-(CH＝CH)_m(CH₂)_nR⁴、-(C≡C)_m(CH₂)_nR⁴、-(C≡C)_m(C₆H₄)_o(CH₂)_nR⁴或-(C₆H₄)_m(CH₂)_nR⁴，更优选为R¹-(CH₂)_nR⁴或-(C≡C)_m(CH₂)_nR⁴。

R²优选选自-(CH₂)_nR⁴或-(C₆H₄)_m(CH₂)_nR⁴，更优选为-(CH₂)_nR⁴。

R³优选选自-(CH₂)_nR⁴或-CONH(CH₂)_nR⁴，更优选为-(CH₂)_nR⁴。

R⁴优选选自-NHR⁵、-NHCO(CH₂)_pSR⁵或-O(C₂H₅O)_n(C₂H₅)NHR⁵，R⁴更优选为-NHR⁵。

R⁵优选选自荧光团、亲和标记物、交联剂、肽、核酸、糖、脂质、转染试剂、嵌入剂、核酸切割试剂和纳米颗粒(如金簇)，更优选为亲和标记物。

n优选选自0或1-100的整数，更优选为1、3和4。m优选为1-10的整数，更优选为1。o优选为1-10的整数，更优选为1。p优选为1-10的整数，更优选为3。

根据优选实施方式，式(I)的辅因子选自

在本发明的优选实施方式中，所述荧光团是Alexa、BODIPY、香豆素、丹酰、荧光素、N-甲基苯胺基萘磺酰(mansyl)、芘、罗丹明、德克萨斯红、TNS、花青荧光团或其衍生物或本发明说明书中所述的任何其它标记。

在本发明另一优选实施方式中，所述亲和标记物是肽标记物、生物素、麦芽糖、镍-三乙酸腈(NTA)、地谷新配基或二硝基酚。

在本发明更优选的实施方式中，所述肽标记物是组氨酸标签或具有金属螯合性能的标签、链霉素标签、flag标签、c-myc标签、HA标签、表位或谷胱甘肽。连接于固体支持物的结合对可用于亲和纯化用本发明N-腺苷氮丙啶衍生物标记的核酸分子或(多)肽。肽标记物优选组氨酸标签或链霉素标签。

术语“具有金属螯合性能的标签”涉及这样一种标签：它能将共价偶联于生物分子后的N-腺苷氮丙啶衍生物结合到固定金属离子亲和色谱( Immobilized  MetalIon  Affinity  Chromatography，IMAC)所用的基材上。Porath等(Porath等，(1975)Nature 258，598-599)开发的IMAC技术基于某些蛋白质表面残基(组氨酸、半胱氨酸和较低程度的色氨酸)与过渡金属阳离子之间的相互作用，该相互作用能形成具有聚羧基配体的螯合物。本领域描述了典型条件，它们是技术人员已知的条件(Porath，(1992)Protein Expression and Purification 3，263-281；Hemdan和Porath，(1985)Journal ofChromatography 323，255-264；Porath和Hansen，(1991)Joumal ofChromatography 550，751-764)。

术语“链霉素标签”涉及8个氨基酸的链霉抗生物素蛋白结合序列。通过系统筛选随机肽文库以鉴定具有最优亲和标记物特性的肽结合序列，从而发现了此序列(Schmidt和Skerra，(1993)Prot.Engineering 6，109-122)。当连接于本发明N-腺苷氮丙啶衍生物时，可采用(例如)装有含有StrepTactin、链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白等的基质的重力流柱亲和纯化这些修饰的核酸分子或(多)肽。这种基质可购自(例如)Sigma-Genosys/The Woodlands(美国得克萨斯州)或IBA/Goettingen(德国)。

术语“flag标签”涉及能结合抗-flag抗体的8个氨基酸的肽。当连接于本发明N-腺苷氮丙啶衍生物时，可采用(例如)装有含固定的抗-flag抗体的基质的重力流柱亲和纯化这些修饰的核酸分子或(多)肽。这种基质可购自(例如)Sigma-Aldrich。

术语“c-myc标签”涉及能结合抗c-myc抗体的10个氨基酸的肽。当连接于本发明N-腺苷氮丙啶衍生物时，可采用(例如)装有含固定的抗c-myc抗体的基质的重力流柱亲和纯化这些修饰的核酸分子或(多)肽。这种基质可购自(例如)PierceBiotechnology(美国伊利诺斯州)。

术语“HA标签”涉及衍生自流感病毒的表面血凝素并能结合于抗-HA抗体的9个氨基酸的肽。当连接于本发明N-腺苷氮丙啶衍生物时，可采用(例如)装有含固定的抗-HA抗体的基质的重力流柱亲和纯化这些修饰的核酸分子或(多)肽。

术语“谷胱甘肽”涉及能结合谷胱甘肽转移酶(GST)的三肽L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰基甘氨酸。当连接于本发明N-腺苷氮丙啶衍生物时，可采用(例如)装有含固定的谷胱甘肽转移酶的基质的重力流柱亲和纯化这些修饰的核酸分子或(多)肽。

在本发明的另一优选实施方式中，所述交联剂是马来酰亚胺、碘乙酰胺或其衍生物或醛衍生物，或者光致交联剂。交联剂优选为光致交联剂。

在本发明更优选的实施方式中，所述光致交联剂是芳基氮化物(arylazide)、重氮化合物、补骨脂素或苯甲酮化合物。光致交联剂优选为补骨脂素。

在本发明另一优选实施方式中，所述核酸切割试剂是铁-EDTA、吖啶或其衍生物或铑复合物。

本发明也涉及本发明辅因子和通常用S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)作为辅因子的甲基转移酶的复合物。

在本发明的优选实施方式中，所述甲基转移酶通常将S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)的甲基残基转移到核酸分子或(多)肽上。

在本发明的优选实施方式中，所述甲基转移酶是单独的DNA甲基转移酶或细菌的限制性修饰系统的一部分。

所述DNA甲基转移酶可选自M.AacDam、M.AatII、M.AbaORFDP、M.AbaORFKP、M.AbrI、M.AccI、M.AccIII、M.AciI、M.AcII、M.AcuI、M.Afa22MI、M.AfIII、M.AfIIII、M.AgeI、M.AhdI、M.AhyBP、M.AIaK2I、M.AIuI、M.AIwI、M.AIw26I、M.ApaI、M.ApaLI、M.ApeKI、M.ApoI、M.AquI、M.AscI、M.AseI、M.AseII、M.AsiSI、M.AspCNI、M.AtuCI、M.AtuCORF1997P、M.AtuDORF794P、M.AtuDORF3839P、M.AvaI、M.AvaII、M.AvaIII、M.AvaIVP、M.AvaV、M.AvaVI、M.AvaVII、M.AvaVIII、M.AvaIX、M.AvaORF3700P、M.AvaORF7270P、M.AvrI、M.AvrII、M.BabI、M.BaeI、M.BaII、M.BamHI、M.BamHII、M.BanI、M.BanII、M.BanIII、M.BatAORF3814P、M.BatA581ORF3846P、M.Bbu297I、M.BbvI、M1.BbvCI、M2.BbvCI、M.BbvSI、M1.BccI、M2.BccI、M.Bce1247I、M1.BceAI、M2.BceAI、M.Bce14579ORF939P、M.BceSORF365P、M.BceSORF4605P、M1.BceSORF5606P、M2.BceSORF5606P、M.Bcep1P、M.Bcep43ORFAP、M.BchI、M.BcII、M1.BcnI、M2.BcnI、M1.BcoKI、M2.BcoKI、M.Bcs139P、M.BdiI、M.BepI、M1.BfaI、M2.BfaI、M.BfaORFC157P、M1.BfuAI、M2.BfuAI、M.BgII、M.BgIII、M1.BhaI、M2.BhaI、M.BhaII、M.BjaORF2509P、M.BIoNORF564P、M.BIoNORF1473P、M.BIpI、M.BmaI、M.BmaphiE125ORF56P、M.Bme216I、M.BmeLORF1444P、M.BmeTI、M1.BmrI、M2.BmrI、M.BnaI、M.BpmI、M1.Bpu10I、M2.Bpu10I、M1.BsaI、M2.BsaI、M.BsaAI、M.BsaJI、M.BsaWI、M1.BscGI、M2.BscGI、M.Bse634I、M.BseCI、M.BseDI、BseMII、BseRI、M.BseRI、M.BseYI、BsgI、M.BsgI、M.BsiWI、M.BsII、M1.BsmI、M2.BsmI、M.BsmAI、M.BsmBI、M.BsoBI、M.BspI、M.Bsp6I、M.Bsp50I、M.Bsp98I、M.Bsp106I、M.Bsp143II、BspCNI、M.BspCNI、M.BspEI、M.BspHI、M.BspIS4I、M.BspKT6I、BspLU11III、M1.BspLU11III、M2.BspLU11III、M1.BspMI、M2.BspMI、M.BspMII、M.BspRI、M.BspST5I、M1.BsrI、M2.BsrI、M1.BsrBI、M2.BsrBI、M.BsrFI、M.BssHI、M.BssHII、M.BssSI、M.BstI、M.BstEII、M.BstEIII、M1.BstF5I、M2.BstF5I、M3.BstF5I、M4.BstF5I、M.BstGII、M.BstLVI、M.BstNI、M.BstNBI、M.BstVI、M.BstXI、M.BstYI、M.Bsu15I、M.Bsu36I、M.Bsu6633I、M.BsuBI、M.BsuEII、M.BsuFI、M.Bsu1330ORF491P、M.BsuRI、M.BthIPS78、M.BthVORF4625P、M.BusLBORFC747P；M.BusLBORFC755P、M.Cac8I、M.Cac824I、M.Cac824ORF3358P、M.CauJORFC101P、M.CauJORFC102P、M.CauJORFC103P、M.CauJORFC104P、M.CauJORFC107P、M.CauJORFCll0P、M.CauJORFC111P、M.CboI、M.CcrMI、M.Cdi630I、M.CdiCD6I、M.CdiCD6II、M.Cdi630ORFC898P、M.CefORF1493P、M.CeqI、M.CfrI、M.Cfr6I、M.Cfr9I、M.Cfr10I、M.Cfr13I、M.Cfr42I、M.CfrAI、M.CfrBI、M.CgII、M.CgIASI、M.CgILP6P、M.CjeNI、M.Cje81116ORFBP、M.Cje81116ORFCP、M.CIaI、M.Csp6I、M.Csp68KI、M.Csp68KIV、M.Csp68KV、M.CteEORF387P、M.CthORFS26P、M.CthORFS34P、M.CthORFS93P、M.CviAI、M.CviAII、M.CviAIV、M.CviBI、M.CviBII、M.CviBIII、M.CviJI、M.CviORF5P、M.CviORF2111P、M.CviPI、M.CviQI、M.CviQII、M.CviQIII、M.CviQIVP、M.CviQVP、M.CviQVI、M.CviQVII、M.CviQVIIIP、M.CviQIXP、M.CviQXP、M.CviQXI、M.CviRI、M.CviRII、M.CviSI、M.CviSII、M.CviSIII、M.CviSIVP、M.CviSVP、M.CviSVIP、M.CviTI、M.DdeI、DhaORFC135P、M1.DpnII、M2.DpnII、M.DraI、M.DraII、M.DraIII、M.DsaV、M.DvuORF19P、M.DvuORF2842P、M.EacI、M.EaeI、M.EagI、M1.EarI、M2.EarI、M.EcaI、M.EcI18kI、M.Eco32I、M.Eco47II、M.Eco47III、M.Eco56I、Eco57I、M.Eco57I、M.Eco64I、M.Eco72I、M.Eco88I、M.Eco98I、M.Eco105I、M.Eco147I、M.Eco231I、M.Eco255I、M.Eco536P、M.Eco1639P、M.Eco1831I、M.Eco248534P、M.EcoAI、M.EcoBI、M.EcoCFTDamP、M.EcoCFTDam2P、M.EcoCFTDam3P、M.EcoCFTDcmP、M.EcoDI、M.EcoDR2、M.EcoDR3、M.EcoDXXI、M.Eco67Dam、M.EcoEI、M.EcoHI、M.EcoHK31I、M.EcoKI、M.EcoKII、M.EcoKDam、M.EcoKDcm、M.EcoKO157DamP、M.EcoKO157Dam2P、M.EcoKO157Dam3P、M.EcoKO157DcmP、M.EcoKO157ORF1953P、M.EcoLahn1P、M.EcoLahn3P、M.EcoNI、M.EcoNi12P、M.EcoO109I、M.EcoO157DamP、M.EcoO157DcmP、M.EcoO157ORF1454P、M.EcoO157ORF2389P、M.EcoO157ORF3349P、M.Eco536ORF3P、M.EcoPI、M.EcoP15I、M.EcoP1Dam、M.EcoPhi4795DamP、M.EcoRI、M.EcoRII、M.EcoRV、M.EcoR124I、M.EcoR124II、M.EcoRD2、M.EcoRD3、M.EcoStx1DamP、M.EcoStx2DamP、M.EcoT22I、M.EcoT38I、M.EcoT1Dam、M.EcoT2Dam、M.EcoT4Dam、M.EcoVIII、M.EcoVT2Dam、M.EcoWphiP、M.Eco29kI、M.EcopHSHP、M.EcopHSH2P、M.EcoprrI、M.EfaHGSORFHP、M.EphP1ORF1P、M.EsaBC1I、M.EsaBC3I、M.EsaBC4I、M.EsaBS1I、M.EsaBS9I、M.EsaDix1I、M.EsaDix2I、M.EsaDix3I、M.EsaDix4I、M.EsaDix5I、M.EsaDix6I、M.EsaDix7I、M.EsaLHCI、M.EsaLHCIII、M.EsaRM1P、M.EsaRM13P、M.EsaRM16P、M.EsaRM17P、M.EsaRM21P、M.EsaRM38P、M.EsaRM61P、M.EsaRM63P、M.EsaRM65P、M.EsaRM67P、M.EsaRM69P、M1.EsaS1I、M2.EsaS1I、M.EsaS3I、M.EsaS4I、M.EsaS6I、M.EsaS7I、M.EsaS8I、M.EsaSS2P、M.EsaSS5P、M.EsaSS12P、M.EsaSS13P、M.EsaSS15P、M.EsaSS16P、M.EsaSS18P、M.EsaSS19P、M.EsaSS22P、M.EsaSS30P、M.EsaSS31P、M.EsaSS35P、M.EsaSS36P、M.EsaSS40P、M.EsaSS43P、M.EsaSS47P、M.EsaSS48P、M.EsaSS49P、M.EsaSS52P、M.EsaSS55P、M.EsaSS57P、M.EsaSS67P、M.EsaSS69P、M.EsaSS70P、M.EsaSS71P、M.EsaSS72P、M.EsaSS73P、M.EsaSS74P、M.EsaSS75P、M.EsaSS76P、M.EsaSS79P、M.EsaSS81P、M.EsaSS83P、M.EsaSS87P、M.EsaSS88P、M.EsaSS90P、M.EsaSS96P、M.EsaSS97P、M.EsaSS103P、M.EsaSS104P、M.EsaSS105P、M.EsaSS106P、M.EsaSS107P、M.EsaSS108P、M.EsaSS109P、M.EsaSS110P、M.EsaSS111P、M.EsaSS113P、M.EsaSS117P、M.EsaSS120P、M.EsaSS123P、M.EsaSS126P、M.EsaSS130P、M.EsaSS131P、M.EsaSS134P、M.EsaSS136P、M.EsaSS137P、M.EsaSS144P、M.EsaSS145P、M.EsaSS150P、M.EsaSS153P、M.EsaSS154P、M.EsaSS155P、M.EsaSS156P、M.EsaSS160P、M.EsaSS163P、M.EsaSS165P、M.EsaSS167P、M.EsaSS169P、M.EsaSS170P、M.EsaSS172P、M.EsaSS174P、M.EsaSS177P、M.EsaSS181P、M.EsaSS182P、M.EsaSS186P、M.EsaSS187P、M.EsaSS192P、M.EsaSS195P、M.EsaSS200P、M.EsaSS214P、M.EsaSS215P、M.EsaSS216P、M.EsaSS218P、M.EsaSS221P、M.EsaSS222P、M.EsaSS223P、M.EsaSS225P、M.EsaSS228P、M.EsaSS237P、M.EsaSS238P、M.EsaSS241P、M.EsaSS244P、M.EsaSS245P、M.EsaSS246P、M.EsaSS247P、M.EsaSS254P、M.EsaSS259P、M.EsaSS264P、M.EsaSS266P、M.EsaSS268P、M.EsaSS269P、M.EsaSS270P、M.EsaSS275P、M.EsaSS278P、M.EsaSS281P、M.EsaSS282P、M.EsaSS283P、M.EsaSS289P、M.EsaSS297P、M.EsaSS302P、M.EsaSS303P、M.EsaSS305P、M.EsaSS315P、M.EsaSS317P、M.EsaSS318P、M.EsaSS319P、M.EsaSS323P、M.EsaSS326P、M.EsaSS328P、M.EsaSS329P、M.EsaSS334P、M.EsaSS335P、M.EsaSS336P、M.EsaSS51DamP、M.EsaSS65DamP、M.EsaSS138DamP、M.EsaSS198DamP、M.Esp3I、M.Esp1396I、M.EspRB49DamP、M.FauI、M.FnuDI、M.FnuDII、M.FnuDIII、M.Fnu4HI、M.FnuVDamP、M.FokI、M.FseI、M.FspI、M.FssI、M.GmeORFC6P、M.GmeORFC16P、M.GsuI、M.GviDamP、M.H2I、M.HaeII、M.HaeIII、M.HapII、M.HduDamP、M1.HgaI、M2.HgaI、M.HgiAI、M.HgiBI、M.HgiCI、M.HgiCII、M.HgiDI、M.HgiDII、M.HgiEI、M.HgiGI、M.HhaI、M.HhaII、M.HheORF238P、M.HheORF1050P、M.HheORF1244P、M.HheORF1445P、M.Hin1II、M.HinB231ORFDP、M.HinHP1Dam、M.HinHP2Dam、M.HinP1I、M.HincII、M.HindI、M.HindII、M.HindIII、M.HindV、M.HindDam、M.HinfI、M.HinfIII、M.HjaI、M.HpaI、M.HpaII、M1.HphI、M2.HphI、M.HpyI、M.Hpy8I、M.Hpy87AP、M.Hpy99I、M.Hpy99II、M.Hpy99III、M.Hpy99IV、M1.Hpy99V、M2.Hpy99VP、M.Hpy99VI、M.Hpy99VIII、M.Hpy99IX、M.Hpy99X、M.Hpy99XI、M.Hpy166IV、M.Hpy178IP、M.Hpy188I、M.Hpy188II、M.Hpy188III、M.Hpy788606P、M.Hpy788845P、M.Hpy788849P、M.Hpy789115P、M.Hpy789117P、M.Hpy789137P、M.Hpy789145P、M.Hpy790101P、M.Hpy959772P、M.HpyAI、M1.HpyAII、M2.HpyAII、M.HpyAIII、M.HpyAIV、M.HpyAV、M1.HpyAVI、M2.HpyAVI、M.HpyAVII、M.HpyAVIII、M.HpyAIX、M.HpyAX、M.Hpy87AI、M.HpyAORF263P、M.HpyAORF369P、M.HpyAORF481P、M.HpyAORF483P、M1.HpyC1I、M2.HpyC1I、M.HpyCH4IV、M.HpyCH4V、M.HpyCR2ORF1P、M.HpyCR2ORF3P、M1.HpyCR4RM1P、M2.HpyCR4RM1P、M.HpyCR9RM1P、M.HpyCR9RM2P、M.HpyCR14RM1P、M.HpyCR14RM2P、M.HpyCR15RM2P、M.HpyCR1 6RM1P、M.HpyCR29RM1P、M.HpyCR29RM2P、M.HpyCR35RM1P、M.HpyCR35RM2P、M1.HpyCR38RM1P、M2.HpyCR38RM1P、M.HpyCR38RM2P、M.HpyF17I、M.Hpy99ORF430P、M.Hpy99ORF433P、M.Hpy99ORF846P、M.Hpy99ORF1012P、M.HspNORF1543P、M.KasI、M.KpnI、M.Kpn2I、M.KpnAI、M.KpnBI、M.Kpn19097DamP、M.Kpn19097Dam2P、M.Kpn19097ORFFP、M.Kpn2kI、M.Lci22RP、M.LinFORF11323P、M.LinFORF12222P、M.LinFORF12737P、M.LinLORF903P、M.LinLORF1547P、M.LinLORF2668P、M1.LIaAI、M2.LIaAI、M.LIaBI、M.LIaCI、M.LIaDI、M.LIaDII、M1.LIaDCHI、M2.LIaDCHI、M.LIaKR2I、M.LmoAP、M.LmoEORF470P、M.LmoFORF327P、M.Lmo19115ORF1P、M.Lsp1109I、M.MamI、M1.MboI、M2.MboI、M1.MboII、M2.MboII、M.Mca43617ORFAP、M.Mca43617ORFBP、M1.Mca43617ORFDP、M2.Mca43617ORFDP、M.Mca43617ORFJP、M.MfeI、M.MjaI、M.MjaII、M.MjaIII、M.MjaIVP、M.MjaV、M.MjaVI、M.M1oORFmlr7520P、M.MIuI、M.MIyI、M.MmaMORFC174P、M.MmaSORF735P、M.MmeI、M.MmeII、M.MmoORF950P、M.MmoORF3450P、M.MmyIP、M.MmySCORF186P、M.MmySCORF216P、M.MmySCORF950P、M1.MnII、M2.MnII、M.MpeORF1230P、M 1.MpeORF1780P、M2.MpeORF1780P、M.MpeORF4940P、M.MpeORF9800P、M.MpuCORF430P、M.MscI、M.MseI、M.MsmChe9cORF76P、M.MsmChe9cORF77P、M.MsmChe9cORF80P、M.MsmcdP、M.MsmomegaORF127P、M.MspI、M.MspA1I、M.MspSD10I、M.MthFI、M.MthTI、M.MthZI、M.MunI、M.MvaI、M.Mva1269I、M.MwoI、M.NaeI、M.NarAORFC306P、M.NcoI、M.NdeI、M.NdeII、M.Ngo18785P、M.Ngo185840P、M.Ngo185841P、M.NgoAI、M.NgoAII、M.NgoAIII、M.NgoAIV、M.NgoAV、M.NgoAVIIP、M.NgoAXIP、M.NgoAORFC708P、M 1.NgoAORFC717P、M2.NgoAORFC717P、M.NgoBI、M.NgoBII、M.NgoBIIIP、M.NgoBIVP、M.NgoBV、M1.NgoBVIII、M2.NgoBVIII、M.NgoBIX、M.NgoBXII、M.NgoDIII、M.NgoEI、M.NgoFVII、M.NgoGI、M.NgoGII、M.NgoGIII、M.NgoGIVP、M.NgoGV、M.NgoHIP、M.NgoHIIP、M.NgoHIIIP、M.NgoHIVP、M.NgoHVP、M.NgoHVIP；M.NgoHVIIP、M.NgoHVIII、M.NgoKVIP、M.NgoLIP、M.NgoLII、M.NgoLIIIP、M.NgoLIVP、M.NgoLVP、M.NgoMI、M.NgoMII、M.NgoMIII、M.NgoMIV、M.NgoMV、M.NgoMVIII、M.NgoMXV、M.NgoNIP、M.NgoNII、M.NgoNIIIP、M.NgoNIVP、M.NgoNVP、M.NgoPIP、M.NgoPII、M.NgoPIII、M.NgoPIVP、M.NgoPVP、M.NgoQIP、M.NgoQIIP、M.NgoQIIIP、M.NgoQIVP、M.NgoQVP、M.NgoSIP、M.NgoSII、M.NgoSIIIP、M.NgoSIVP、M.NgoSVP、M.NgoTIP、M.NgoTII、M.NgoTIIIP、M.NgoTIVP、M.NgoTVP、M.Ngo125VIIP、M.NIaI、M.NIaIII、M.NIaIV、M.NIaX、M.NIaL17ORFAP、M.NmaPhiCh1I、M.NmeAORF1453P、M.NmeAORF1500P、M1.NmeBI、M2.NmeBI、M.NmeBF13P、M.NmeBORF1033P、M.NmeBORF1290P、M.NmeSI、M.NmeST1117ORF1P、M.NmepNLE1P、M.NpuORFC221P、M.NpuORFC222P、M.NpuORFC224P、M.NpuORFC226P、M.NpuORFC228P、M.NpuORFC230P、M.NpuORFC231P、M.NpuORFC234P、M.NsiI、M.NspI、M.NspIII、M.NspV、M.NspHI、M.OihORF3333P、M.OihORF3336P、M.OkrAI、M.Pac25I、M.PaeI、M.PaeIMORF3201P、M.PaeMSHORF1P、M.Pae2164ORF7P、M.PaeR7I、M.PfIMI、M.PgiI、M.PhaI、M.PhiBssHII、M.PhiMx8I、M.Phi3TI、M.Phi3TII、M.PhoI、M.PhoII、M.PhoWORFBP、M.PhsOYDam1P、M.PhsOYDam2P、M.PhsOYDam3P、M.PhsOYDam4P、M.PhsOYDam5P、M.PIeI、M.PIeLFBORF8P、M.PIuTDamP、M.PIuTDcmP、M.PIuTORF600P、M.PIuTORF2710P、M.PIuTORF2942P、M.Pmi16525DamP、M.Pmi16525Dam2P、M.Pmi16525ORFDP、M.PmuADam、M.PmuDam、M.Ppu21I、M.Ppu111I、M.Ppu1253I、M.PpuMI、M.PshAI、M.PspGI、M.PspPI、M.PstI、M.PvuI、M.PvuII、M.PvuRts1DamP、M.PvuRts1Dam2P、M.RcoORF690P、M.ReuORF325P、M.Rho11sI、M.Rho11sII、M.RIe39BI、M.RmeADam、M.RpaORF1026P、M.RpapRPA4P、M.Rrh4273I、M.RruMORFS5P、M.RruMORFS15P、M.RsaI、M.RshI、M.RshIII、M.RsrI、M.RsrII、M.SPBetaI、M.SPRI、M.SacI、M.SacII、M.SaII、M2.SapI、M.Sau96I、M.Sau3239I、M.Sau6782I、M.Sau3AI、M.SauLPI、M.SbaI、M.SbfI、M.Sbo13I、M.ScaI、M1.ScrFI、M2.ScrFI、M.SduI、M.SenPI、M.SenPhiE15P、M.SenPhiE15DamP、M.SenpCI、M.SeqORFC57P、M.SeqORFC272P、M.SeqORFC448P、M.SfaNI、M.SfeI、M.SfiI、M.Sf12DamP、M.Sfl2DcmP、M.Sfl2ORF3300P、M.SflSf6DamP、M.SITDamP、M.SfITDcmP、M.SfITORF3517P、M.SfI2aI、M.SfoI、M.Sho27844P、M.SinI、M.SmaI、M.SmaII、M.SmapR478DcmP、M.SmapR478ORF272P、M.SmeIP、M1.SmuUORF504P、M2.SmuUORF504P、M.SnaBI、M.SonDamP、M.SonORF4P、M.SpeI、M.SphI、M.Spn526P、M.Spn6BI、M1.Spn19FORF24P、M2.Spn19FORF24P、M.Spn19FORF927P、M.SpnHGORF4P、M.SpnORF1431P、M.SpnORF1849P、M.SpnRORF1287P、M.SpomI、M.SptAI、M.SscL1I、M.Sse9I、M.SsI1I、M.SsoI、M.SsoII、M.Ssp6803I、M.Ssp6803ORF729P、M.Ssp6803ORF1803P、M.SspPhiBt1P、M.SssI、M.SstI、M.Ssu211I、M.Ssu212I、M1.Ssu2479I、M2.Ssu2479I、M1.Ssu4109I、M2.Ssu4109I、M1.Ssu4961I、M2.Ssu4961I、M1.Ssu8074I、M2.Ssu8074I、M1.Ssu11318I、M2.Ssu11318I、M1.SsuDAT1I、M2.SsuDAT1I、M.Sth368I、M.SthSt8IP、M.StsI、M.StyI、M.StyCDamP、M.StyCDam2P、M.StyCDam3P、M.StyCDam4P、M.StyCDcmP、M.StyD4I、M.StyDam、M.StyDam2P、M.StyDam3P、M.Sty1344Dam、M.Sty14028Dam、M.StyHCM1ORF187P、M.StyLTI、M.StyLTIII、M.StyLT2Dam、M.StyLT2DcmP、M.StyLT2Fe1sDamP、M.StyR27ORF154P、M.StySJI、M.StySKI、M.StySPI、M.StySQI、M.StySopEDamP、M.StyTDamP、M.StyTDam2P、M.StyTDam3P、M.StyTDam4P、M.StyTDcmP、M.SuaI、M.TaeII、M.TaqI、M.TdeII、M.TdeIII、M.TdeORF706P、M.TelBORF1578P、M.TelBORF1640P、M.TelBORF1878P、M1.TerORFS1P、M2.TerORFS1P、M.TerORFS14P、M.TerORFS18P、M.TerORFS62P、M.TerORFS122P、M.TfiTok6A1I、M.ThaI、M.ThaII、M.ThaIII、M.TIiI、M.TmaI、M.TpaI、M.TrsKTI、M.TrsSI、M.TrsTI、M.TseI、M.Tsp32I、M.Tsp45I、M.Tsp509I、M.TspRI、M.Tth111I、Tth111II、M.TthHB8I、M.TthHB27P、M.TthHB27ORF41P、M.TvoORF849P、M.TvoORF1192P、M.TvoORF1400P、M.TvoORF1413P、M.TvoORF1416P、M.TwhORF771P、M.TwhTORF783P、M.Uba580P、M.Ucr1P、M.Van91II、M.VchADamP、M.Vch569BdamP、M.Vch0395Dam、M.VchK139I、M.VpaRDamP、M.VspI、M.VvuDamP、M.VvuYDamP、M.WsuORF1405P、M.WsuORF1930P、M.XamI、M.XaxCORF2436P、M.XbaI、M.XcmI、M.XcyI、M.XfaAORFC345P、M.XfaAORFC348P、M.XfaOORFC725P、M.X.ORF1804P、M.XfaTORF577P、M.XfaTORF1062P、M.XfaTORF1607P、M.XhoI、M.XhoI、M.XmaI、M.XmaIII、M.XmnI、M.XorII、M.XphI、M.YenI、M.YenSDamP、M.YenSORFC666P、M.YenWI、M.YpeDamP、M.YpeKDamP、M.YpeKORF2224P、M.YpeKORF3792P、M.YpeMDamP、M.YpeMORF1932P、M.YpeMORF3790P、M.YpeORF391P、M.YpeORF2088P、M.YpsDam。

在本发明更优选的实施方式中，甲基转移酶选自DNA甲基转移酶M.HhaI、M.TaqI、M.BseCI或M.SssI。

本发明也涉及包括本发明辅因子和本发明所述甲基转移酶或本发明复合物的试剂盒。可将该试剂盒的各种化合物包装到一个或多个容器中，任选地溶解于合适缓冲液以进行储存。可加入一页使用说明书。

本发明也涉及包含本发明辅因子或本发明复合物和任选的药学上可接受的运载体的药物组合物。

本发明也涉及包含本发明辅因子或本发明复合物的诊断组合物。

诊断组合物的主要溶剂在本质上是水性溶剂。此外，该组合物可含有改变或维持pH、渗透压、粘度、澄清度、颜色、无菌性、稳定性、解离速率或制剂气味的其它成分或运载体。相似地，该组合物可含有其它药学上可接受的成分以改变或维持诊断组合物的稳定性、解离速率、释放或吸收。一旦配制好诊断组合物，可将其作为溶液、悬液、凝胶、乳剂、固体或脱水或冻干粉末储存于无菌瓶中。可用即用型形式或需要临用前重建的形式储存这些制剂。

本发明也涉及本发明辅因子或本发明复合物在检测DNA分子中序列特异性甲基化中的应用。典型应用是根据本发明内容的方法，如本文所述方法。

本发明也涉及本发明辅因子或本发明复合物在诊断DNA甲基化增加或减少相关性疾病的应用。

本文所用术语“DNA甲基化增加或减少相关性疾病”尤其指诸如癌症或ICF综合征等疾病。

本发明也涉及本发明辅因子或本发明复合物在制备诊断DNA甲基化增加或减少相关性疾病的诊断组合物中的应用。

在本发明的优选实施方式中，所述疾病是癌症或ICF综合征。

癌症优选选自乳腺癌、结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、肠癌、睾丸癌、胃癌、成神经细胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、内皮瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤或腺瘤。

还通过以下实施例说明本发明，但本发明不受这些实施例的限制：

实施例1：M.HhaI-催化的生物素化氮丙啶辅因子1(A)、2(B)和3(C)与双链体寡脱氧核苷酸I·II的偶联

具有连接于7位的生物素基团的氮丙啶辅因子1和2或具有连接于腺嘌呤环6位的生物素基团的氮丙啶辅因子3是M.HhaI的良好底物(方案1)。见图1。

在37℃孵育氮丙啶辅因子1、2或3(32nmol，80μM)，双链体寡脱氧核苷酸I·II(4nmol，10μM)和M.HhaI(4.4nmol，11μM)的缓冲液(10mM Tris盐酸、pH7.4、50mM氯化钠、0.05mM乙二胺四乙酸和2mMβ-巯基乙醇)溶液(400μL)。用阴离子交换HPLC(Poros10 HQ，10μm，4.6×10mm，Applied Biosystems)监测偶联反应过程。用氯化钾在Tris盐酸缓冲液(10mM，pH7.6)中的水溶液(0.2M 5分钟，然后5分钟内线性梯度至0.4M，20分钟内至0.6M，5分钟内至1M)洗脱化合物，流速4mL/分钟。混合1、2或3与I·II和M.HhaI化合物后，除了初始双链体I·II外，1和2也观察到较短的保留时间。不同孵育时间后，观察到这三种辅因子几乎完全转化为这些新化合物，在没有M.HhaI的平行对照试验中没有产生新的化合物(未显示)。根据260nm和280nm的UV吸收率，指定这些新化合物是M.HhaI和偶联产物I¹·II、I²·II和I³·II之间的非共价蛋白质-DNA复合物。在65℃孵育30分钟后，偶联产物I¹·II、I²·II和I³·II从其蛋白质-DNA复合物上释放，与初始双链体I·II相比，观察到修饰双链体I¹·II、I²·II和I³·II的保留时间稍短。

通过加入链霉抗生物素蛋白验证I¹·II，I²·II和I³·II中生物素基团的存在和功能。首先根据供应商说明书用NAP-5柱(Amersham Biosciences，德国弗赖堡)通过凝胶过滤去除标记双链体I¹·II、I²·II或I³·II中残留的氮丙啶辅因子1、2或3。然后，将链霉抗生物素蛋白(25μg)加入该溶液(25μL，0.25nmol I¹·II、I²·II或I³·II)，37℃孵育30分钟。阴离子交换HPLC(见上)揭示了新的主要化合物，该化合物具有短的保留时间，这与链霉抗生物素蛋白和生物素化双链体I¹·II、I²·II和I³·II之间的复合物的形成相符。除这些复合物外，在所有三种情况下都观察到少量起始双链体I·II，这证明只有产物双链体才能与链霉抗生物素蛋白紧密地相互作用。

方案1：M.HhaI催化的生物素化氮丙啶辅因子1、2和3与短双链体寡脱氧核苷酸I·II的偶联(M＝5-甲基-2′-脱氧胞苷)：

实施例2：DNA甲基化的特异性检测

用与氮丙啶辅因子1和M.HhaI的反应特异性检测质粒DNA的DNA甲基化(图2)。用R.XmnI-线性化质粒pUC19 DNA(LpUC19)进行实验。用DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶M.SssI和天然辅因子AdoMet使LpUC19的5′-CG-3′DNA序列(CpG-基序)内的胞嘧啶残基甲基化。用生物素化氮丙啶辅因子1和M.HhaI处理非甲基化和CpG-甲基化的LpUC19；如果残基不被内部CpG-基序的甲基化阻断，生物素化氮丙啶辅因子1和M.HhaI仅可烷基化5′-GCGC-3′DNA序列内第一个胞嘧啶残基。然后用限制性核酸内切酶R.HhaI(5′-GCGC-3′识别序列)或链霉抗生物素蛋白(与生物素基团的紧密结合)处理分析不同质粒，导致片段化、没有反应或电泳迁移率变化(图2A)。用琼脂糖凝胶电泳证明线性化质粒DNA LpUC19的甲基化-敏感性酶生物素化(图2B)。

A.pUC19质粒DNA的线性化

用限制性核酸内切酶R.XmnI(100U)的缓冲液(40μL、10mM Tris盐酸盐、pH7.9、10mM氯化镁、50mM氯化钠、1mM 1，4-二硫苏糖醇和1mg/mL牛血清白蛋白)溶液使pUC19质粒DNA(10μg)线性化，37℃孵育1小时。

B.CpG-甲基化

用M.SssI(2.4μg)和AdoMet(160μM)的缓冲液(40μL、10mM Tris盐酸、pH7.9、6mM氯化镁、50mM氯化钠、1mM 1，4-二硫苏糖醇和0.6mg/mL牛血清白蛋白)溶液在37℃处理1小时，来进行线性化pUC19质粒DNA LpUC19(6μg，来自A)的CpG-甲基化。通过加热到65℃20分钟终止反应。用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN GmbH，德国希尔敦)按照供应商说明书纯化甲基化LpUC19并用Tris盐酸缓冲液(10mM，pH8.5)洗脱。

C.用氮丙啶辅因子1和M.HhaI处理

将非甲基化和CpG-甲基化LpUC19质粒DNA(各2μg，来自A或B)、氮丙啶辅因子1(80μM)和M.HhaI(38pmol)的缓冲液(100μL，10mM Tris盐酸，pH7.4，50mM氯化钠，0.05mM乙二胺四乙酸和2mMβ-巯基乙醇)溶液在37℃孵育2小时，然后在65℃孵育20分钟。用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN GmbH，德国希尔敦)纯化质粒DNA，并用Tris盐酸缓冲液(10mM，pH8.5)洗脱。

D.限制性核酸内切酶保护分析

将未修饰的(A)、甲基化(B或C)或生物素化(C)LpUC19质粒DNA(200ng)的缓冲液(10mM Tris盐酸，pH7.9，10mM氯化镁，50mM氯化钠，1mM 1，4-二硫苏糖醇和1mg/mL牛血清白蛋白)溶液样品(10μL)与R.HhaI(2U)一起在37℃孵育1小时。用琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖凝胶)分析DNA片段化。仅在未修饰的LpUC19(A)中发现R.HhaI导致的片段化，而甲基化(B或C)或生物素化(C)LpUC19受到保护，不被R.HhaI酶切(图2B，泳道2)。此结果证实了LpUC19被完全修饰。

E.通过链霉抗生物素蛋白的结合分析功能生物素化

将未修饰的(A.)、甲基化(B.或C.)或生物素化(C.)LpUC19质粒DNA(200ng)的Tris盐酸缓冲液(10mM，pH8.5)溶液样品(10μL)与链霉抗生物素蛋白(5μg)一起在37℃孵育1小时。用琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖凝胶)的电泳迁移率变动实验分析链霉抗生物素蛋白的结合。在链霉抗生物素蛋白(图2B，泳道3)存在下，仅在生物素化LpUC19(C.)中观察到链霉抗生物素蛋白结合引起的电泳迁移率降低，而未修饰的LpUC19(A.)、甲基化LpUC19(B.)或用氮丙啶辅因子1和M.HhaI(C.)处理的甲基化LpUC19没有改变其电泳迁移率。此结果明确证实，氮丙啶辅因子1和M.HhaI的标记反应是序列特异性的，并且被CpG-甲基化阻断。因此，可用此系统区分非甲基化和CpG-甲基化的DNA序列。

实施例3：合成氮丙啶辅因子1

如方案2所示合成辅因子1。合成的详情见下(嘌呤采用IUPAC编号)。

方案2：合成氮丙啶辅因子1。

A.7-(5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′，3′-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)-4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物4

在氩气气氛下将三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺(TDA-1)(200μL，0.6mmol)加入粉末化氢氧化钾(280mg，5.0mmol)的无水乙腈(15mL)悬液中，在室温下搅拌该混合物30分钟。然后，加入4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(Gourlain等，(2001)NucleicAcid Res.29，1898-1905)(500mg，1.79mmol)，再搅拌该悬液30分钟。然后，加入新鲜制备的5-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2，3-O-异亚丙基-α-D-呋喃核糖基氯(Rosemeyer和Seela.，(1998)Helv.Chim.Acta71，1573-1585)(3.61mmol)的四氢呋喃溶液(8mL)，在室温下搅拌该反应混合物2天。通过加入乙酸乙酯(60mL)稀释该悬液，并使其通过滤纸。减压去除溶剂，利用柱色谱(硅胶，用乙酸乙酯/己烷15：85洗脱)纯化粗产物，产生淡黄色油状核苷4(431mg，43％)(R_f0.43，乙酸乙酯/己烷20∶80)。

¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)：δ＝0.12(s，3H，SiCH₃a)，0.12(s，3H，SiCH₃b)，0.92(s，9H，SiC(CH₃)₃)，1.38(s，3H，异亚丙基-CH₃a)，1.65(s，3H，异亚丙基-CH₃b)，3.81(dd，²J＝11.29Hz，³J＝3.05Hz，1H，H5′a)，3.92(dd，²J＝11.60Hz，³J＝2.75Hz，1H，H5′b)，4.40(q，³J＝2.75Hz，1H，H4′)，4.90(dd，³J＝2.44Hz，³J＝6.10Hz，1H，H3′)，4.94(dd，³J＝3.05Hz，³J＝6.10Hz，1H，H2′)，6.43(d，³J＝3.05Hz，1H，H1′)，7.78(s，1H，H6)，8.65(s，1H，H2)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)：δ＝-5.379(SiCH₃a)，-5.219(SiCH₃b)，18.427(Si C(CH₃)₃)，25.376(异亚丙基-CH₃a)，25.983(SiC( CH₃)₃)，27.318(异亚丙基-CH₃b)，52.125(C5)，63.481(C5′)，80.785(C4′)，85.383(C3′)，86.194(C2′)，90.769(C1′)，114.020(异亚丙基- C(CH₃)₂)，117.237(C9)，131.886(C6)，150.252(C2)，150.859(C8)，152.399(C4)。

B.4-氯-5-碘-7-(2′，3′-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]-嘧啶，化合物5

将核苷4(348mg，0.61mmol)的四氢呋喃溶液(10mL)冷却到0℃。加入四丁基氟化铵(TBAF)(291mg，0.92mmol)后，0℃搅拌该反应混合物2小时。将该反应混合物加温到室温，减压去除溶剂。将残留物溶解于乙酸乙酯(10mL)，用水(2mL)和盐水(2mL)洗涤有机层。用硫酸镁干燥有机层，过滤，减压去除溶剂。柱色谱(硅胶，用乙酸乙酯/己烷40∶60洗脱)纯化，产生淡黄色泡沫状的所需化合物5(192mg，69％)(R_f0.23，乙酸乙酯/己烷40∶60)。

¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)：δ＝1.37(s，3H，异亚丙基-CH₃a)，1.64(s，3H，异亚丙基-CH₃b)，3.81(t，²J＝³J＝10.68Hz，1H，H5′a)，3.95(dd，²J＝12.51Hz，³J＝1.83Hz，1H，H5′b)，4.47-4.49(m，1H，H4′)，4.76(d，³J＝10.07Hz，1H，5′-OH)，5.09(dd，³J＝2.14，³J＝6.10，1H，H3′)，5.19(dd，³J＝4.88Hz，³J＝6.10Hz，1H，H2′)，5.88(d，³J＝4.88Hz，1H，H1′)，7.51(s，1H，H6)，8.63(s，1H，H2)；¹³C-NMR(75MHz，CDCl₃)：δ＝25.298(异亚丙基-CH₃a)，27.542(异亚丙基-CH₃b)，51.941(C5)，63.085(C5′)，81.162(C4′)，83.279(C3′)，85.762(C2′)，94.582(C1′)，114.436(异亚丙基- C(CH₃)₂)，118.719(C9)，134.551(C6)，149.558(C2)，150.597(C8)，153.674(C4)；ESI-MS m/z(相对强度)：452.3(9)[M+H]⁺，280.5(100)[4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶+H]⁺。

C.4-氨基-5-碘-7-(2′，3 ′-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]-嘧啶，化合物6

将核苷5(981mg，2.17mmol)的甲醇溶液(80mL)冷却到0℃，用气态氨饱和。用该溶液充满预冷的高压灭菌器，密封并加热到80-85℃过夜。将该高压灭菌器冷却到室温，取出溶液，减压蒸发溶剂。用柱色谱(硅胶，用甲醇/二氯甲烷5∶95洗脱)纯化粗产物，产生淡黄色泡沫状核苷6(557mg，59％)(R_f0.21，甲醇/二氯甲烷5∶95)。

¹H-NMR(400MHz，[D₆]DMSO)：δ＝1.31(s，3H，异亚丙基-CH₃a)，1.53(s，3H，异亚丙基-CH₃b)，3.49-3.59(m 2H，H5′)，4.10-4.13(m，1H，H4′)，4.90(dd，³J＝3.02Hz，³J＝6.32Hz，1H，H3′)，5.11(dd，³J＝3.29Hz，³J＝6.31Hz，1H，H2′)，5.16(t，³J＝5.49Hz，1H，5′-OH)，6.19(d，³J＝3.30Hz，1H，H1′)，6.76(s，br，2H，NH₂)，7.69(s，1H，H6)，8.12(s，1H，H2)；¹³C-NMR(75MHz，[D₆]DMSO)：δ＝25.678(异亚丙基-CH₃a)，27.589(异亚丙基-CH₃b)，52.837(C5)，62.046(C5′)，81.432(C3′)，84.025(C2′)，85.985(C4′)，89.276(C1′)，103.665(C9)，113.659(异亚丙基- C(CH₃)₂)，127.810(C6)，150.218(C8)，152.653(C2)，157.761(C4)；ESI-MS m/z(相对强度)：433.2(100)[M+H]⁺，261.5(8)[4-氨基-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]-嘧啶+H]⁺。

D.4-氨基-7-(2′，3′-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)-5-[1″-(3″-三氟乙酰胺基)丙-1-炔基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物7

在氩气气氛下将碘化亚铜(I)(39.4mg，0.21mmol)、3-三氟-乙酰胺基-丙-1-炔(Trybulski等，(1993)J.Med.Chem.36，3533-3541)(1.05g，6.95mmol)、三乙胺(290μL，2.08mmol)和四(三苯基膦)-钯(118mg，0.10mmol)加入6(295mg，0.68mmol)的无水二甲基甲酰胺溶液(10mL)中。在室温下搅拌该反应混合物过夜。然后，通过加入Dowex 1×8树脂(1.3g，用碳酸氢盐加载)和甲醇/二氯甲烷(1∶1混合物，15mL)终止反应。室温搅拌40分钟后，通过硅藻土过滤该混合物，减压去除溶剂。用柱色谱(硅胶，用甲醇/二氯甲烷7∶93洗脱)纯化粗产物，产生淡黄色泡沫状核苷7(305mg，98％)(R_f0.23，甲醇/二氯甲烷7∶93)。

¹H-NMR(400MHz，[D₆]DMSO)：δ＝1.31(s，3H，异亚丙基-CH₃a)，1.53(s，3H，异亚丙基-CH₃b)，3.51-3.57(m，2H，H5′)，4.13-4.16(m，1H，H4′)，4.32(d，³J＝5.22Hz，2H，H3″)，4.91(dd，³J＝2.75Hz，³J＝6.04Hz，1H，H3′)，5.12(dd，³J＝3.30Hz，³J＝6.05Hz，1H，H2′)，5.17，(t，³J＝5.36Hz，1H，5′-OH)，6.19(d，³J＝3.30Hz，1H，H1′)，7.95(s，1H，H6)，8.14(s，1H，H2)，10.10(t，³J＝5.22Hz，1H，3″-NH)；¹³C-NMR(100MHz，[D₆]DMSO)：δ＝25.125(异亚丙基-CH₃a)，27.029(异亚丙基-CH₃b)，29.882(C3″)，61.486(C5′)，75.846(C2″)，80.914(C3′)，83.554(C2′)，85.579(C4′)，86.892(C1″)，88.948(C1′)，94.417(C5)，102.049(C9)，112.912(异亚丙基- C(CH₃)₂)，115.624(q，¹J＝286Hz， CF₃)，126.825(C6)，149.075(C8)，152.717(C2)，156.070(q，²J＝36.4Hz， COCF₃)，157.299(C4)；¹⁹F-NMR(376MHz，[D₆]DMSO)：δ＝-69.72(CF₃)；ESI-MS m/z(相对强度)：456.4(12)[M+H]⁺，284.4(100)[4-氨基-5-[1′-(3′-三氟乙酰胺基)丙-1-炔基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶+H]⁺。

E.4-氨基-7-(2′，3′-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)-5-[1″-(3″-三氟乙酰胺基)丙基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物8

将氧化铂(IV)(10mg，44μmol)加入核苷7(305mg，0.67mmol)的甲醇溶液(75mL)中，在室温下将氢气鼓入该溶液5小时。通过硅藻土过滤去除催化剂，用甲醇洗涤。减压去除溶剂，用柱色谱(硅胶，用甲醇/二氯甲烷5∶95洗脱)纯化粗产物。获得淡黄色固状核苷8(248mg，81％)(R_f0.30，甲醇/二氯甲烷5∶95)。

¹H-NMR(400MHz，[D₆]DMSO)：δ＝1.31(s，3H，异亚丙基-CH₃a)，1.53(s，3H，异亚丙基-CH₃b)，1.75-1.82(m，2H，H2″)，2.75-2.79(m，2H，H1″)，3.25-3.30(m，2H，H3″)，3.48-3.58(m，2H，H5′)，4.06-4.09(m，1H，H4′)，4.88(dd，³J＝3.02Hz，³J＝6.32Hz，1H，H3′)，5.11(dd，³J＝3.57Hz，³J＝6.32Hz，1H，H2′)，5.16(t，³J＝5.64Hz，1H，5′-OH)，6.14(d，³J＝3.84Hz，1H，H1′)，6.65(s，br，2H，NH₂)，7.14(s，1H，H6)，8.04(s，1H，H2)，9.43(t，³J＝5.36Hz，3″-NH)；¹³C-NMR(75MHz，[D₆]DMSO)：δ＝23.529(C2″)，25.695(异亚丙基-CH₃a)，27.622(异亚丙基-CH₃b)，29.756(C1″)，29.258(C3″)，62.141(C5′)，81.527(C3′)，83.620(C2′)，85.421(C4′)，89.070(C1′)，102.459(C9)，113.698(异亚丙基- C(CH₃)₂)，116.859(q，¹J＝226.7Hz， CF₃)，115.348(C5)，120.051(C6)，150.858(C8)，151.691(C2)，156.696(q，²J＝35.7Hz， COCF₃)，157.838(C4)；¹⁹F-NMR(376MHz，[D₆]DMSO)：δ＝-74.74(CF₃)；ESI-MS：m/z(相对强度)：460.4(88)[M+H]⁺，288.5(100)[4-氨基-5-[1′-(3′-三氟乙酰胺基)丙基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶+H]⁺。

F.4-氨基-7-(2′，3′-O-异亚丙基-5′-O-甲磺酰基-β-D-呋喃核糖基)-5-[1″-(3″-三氟乙酰胺基)丙基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物9

在氩气气氛下将二甲基氨基吡啶(DMAP)(20mg，164μmol)和三乙胺(66μL，474μmol)加入核苷8(72mg，157μmol)的无水二氯甲烷溶液(7mL)中，用冰浴将该混合物冷却到0℃。缓慢加入甲磺酰氯(MesCl)(40μL，515μmol)，0℃搅拌该反应混合物2小时。然后，通过加入冰冷的饱和碳酸氢钠溶液(1mL)终止反应，去除有机相。用冰冷的氯仿(3×2mL)萃取水层，用硫酸镁干燥合并的有机层。过滤后减压去除溶剂，用柱色谱(硅胶，甲醇/二氯甲烷7∶93)纯化粗产物，产生淡黄色固状核苷9(40mg，47％)(R_f0.47，甲醇/二氯甲烷10∶90)。

¹H-NMR(400MHz，[D₆]DMSO)：δ＝1.33(s，3H，异亚丙基-CH₃a)，1.54(s，3H，异亚丙基-CH₃b)，1.77-1.81(m，2H，H2″)，2.77(t，³J＝7.42Hz，2H，H1″)，3.12(s，3H，甲磺酰基-CH₃)，3.24-3.32(m，2H，H3″)，4.31-4.35(m，2H，H5′)，4.38-4.42(m，1H，H4′)，4.99(dd，³J＝2.75Hz，³J＝6.32Hz，1H，H3′)，5.23(dd，³J＝3.02Hz，³J＝6.32Hz，1H，H2′)，6.23(d，³J＝3.02Hz，1H，H1′)，6.68(s，br，2H，NH₂)，7.13(s，1H，H6)，8.07(s，1H，H2)，9.42(t，br，1H，3″-NH)；¹⁹F-NMR(376MHz，[D₆]DMSO)：δ＝-74.74(CF₃)。

G.4-氨基-7-(5′-O-甲磺酰基-β-D-呋喃核糖基)-5-[1″-(3″-三氟乙酰胺基)丙基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物10

在室温下搅拌核苷9(40mg，74μmol)的三氟乙酸水溶液(TFA)(70％，2mL)45分钟。减压去除溶剂，其余溶剂与乙醇和二氯甲烷共蒸发。将粗产物10(R_f0.22，甲醇/二氯甲烷10∶90)直接用于以下反应。

¹⁹F-NMR(376MHz，[D₆]DMSO)：δ＝-74，75(CF₃)。

H.4-氨基-7-(5 ′-N-氮丙啶基-5′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-5-[1″-(3″-氨基-丙基)]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物11

在氩气气氛下将来自前述步骤的粗核苷10溶解于无水氮丙啶(Gabriel，(1888)Chem.Ber.21，2664-2669；Gabriel和Stelzner，(1895)Chem.Ber.28，2929-2938)(1mL，16.3mmol)和N-乙基二异丙胺(EDIA)(300μL，1.8mmol)的混合物中，在室温下搅拌该反应混合物4天。通过分析反相HPLC(Prontosil-ODS，5μm，120，250×4.6mm，Bischoff，德国利昂)监测反应过程。用乙腈的三乙基乙酸铵缓冲液(0.1M，pH7.0)溶液洗脱化合物(7％5分钟，然后10分钟内线性梯度至31.5％，15分钟内至35％，5分钟内至70％)，流速1mL/分钟。洗脱出产物11，保留时间为10.2分钟(在280nm和300nm进行UV检测)。减压去除挥发性化合物，将残留物溶解于三乙基碳酸氢铵缓冲液(4mL，0.1M，pH8.6)中。用制备型反相HPLC(Prontosil-ODS，5μm，120，250×8mm，Bischoff，德国利昂)纯化粗产物。用乙腈的三乙基碳酸氢铵缓冲液(0.01M，pH8.6)溶液洗脱化合物(7％5分钟，然后15分钟内线性梯度至21％，5分钟内至70％)，流速3mL/分钟。合并含有产物11的级分(保留时间16.8分钟，在280nm和310nm进行UV检测)，储存于-80℃。用UV光谱法测定合并级分中产物11的量(10mg，39％来自9)，其中采用发表的4-氨基-7-(2′-脱氧-β-D-赤-戊呋喃糖基)-5-[1″-(5″-三氟乙酰胺基)戊基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶的消光系数，ε²⁷⁸＝8500L mol^-1 cm^-1(Seela等，(2000)Helv.Chim.Acta83，910-927)。

I.4-氨基-7-(5′N-氮丙啶基-5′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-5-[1″-(N″-生物素基)-3″-氨基丙基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物1

将N-羟基琥珀酰亚胺基生物素(NHS生物素)(10.2mg，30μmol)的二甲基亚砜溶液(500μL)加入核苷11(10mg，29μmol)的三乙基碳酸氢铵缓冲液(0.1M，pH8.6，含有乙腈)溶液(12mL)中。在室温下搅拌该反应混合物2小时。用分析反相HPLC(Prontosil-ODS，5μm，120，250×4.6mm，Bischoff，德国利昂)监测反应过程。用乙腈的三乙基乙酸铵缓冲液(0.1M，pH7.0)溶液洗脱化合物(7％5分钟，然后在10分钟内线性梯度至31.5％，15分钟内至35％，5分钟内至70％)，流速1mL/分钟。洗脱出产物1，保留时间为20.8分钟(280nm和300nm UV检测)。用制备型反相HPLC(Prontosil-ODS，5μm，120，250×8mm，Bischoff，德国利昂)纯化粗产物。用乙腈的三乙基碳酸氢铵缓冲液(0.01M，pH8.6)溶液洗脱化合物(7％5分钟，然后5分钟内线性梯度至31.5％，10分钟内至35％，5分钟内至70％)，流速3mL/分钟。合并含有产物1的组分(保留时间14.8分钟，在280nm和300nm进行UV检测)，冻干去除溶剂。获得白色固状氮丙啶辅因子1(5.2mg，32％)。

¹H-NMR(300MHz，[D₆]DMSO)：δ＝1.10-1.15(m，2H，脂族生物素-H)，1.25-1.35(m，4H，氮丙啶-H)，1.45-1.55(m，2H，脂族生物素-H)，1.55-1.63(m，2H，脂族生物素-H)，1.64-1.72(m，2H，H2″)，2.04-2.06(m，2H，脂族生物素-H)，2.28-2.34(m，2H，H5′a)，2.46-2.50(m，2H，H5′b)，2.54-2.58(m，1H，生物素-SCH₂a)，2.72-2.77(m，2H，H1″)，2.77-2.83(m，1H，生物素-SCH₂b)，3.05-3.16(m，3H，生物素-SCH，H3″)，3.89-3.94(m，1H，H4′)，4.08-4.15(m，2H，生物素-SCHRC H，H3′)，4.25-4.34(m，2H，生物素-SCH₂C H，H2′)，6.05(d，³J＝5.69 Hz，1H，H1′)，6.35(s，1H，生物素-NHa)，6.42(s，1H，生物素-NHb)，6.53(s，2H，NH₂)，7.10(s，1H，H6)，7.79(t，³J＝5.69Hz，1H，3″-NH)，8.03(s，1H，H2)；ESI-MS：m/z(相对强度)：575.25(100)[M+H]⁺，418.18(7)[4-氨基-5-[1′-(N-生物素基)-3′-氨基-丙基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶+H]⁺。

实施例4：合成氮丙啶辅因子2

如方案3所示合成辅因子2。合成详情见下(嘌呤采用IUPAC编号)。

方案3：合成氮丙啶辅因子2。

A.4-氨基-7-(2′，3′-O-异亚丙基-5′-O-甲磺酰基-β-D-呋喃核糖基)-5-[1″-(3″-三氟乙酰胺基)丙-1-炔基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物12

在氩气气氛下将二甲基氨基吡啶(DMAP)(26.8mg，220μmol)和三乙胺(92μL，660μmol)加入核苷7(100mg，220μmol，实施例3D)的无水二氯甲烷溶液(10mL)中。将该溶液冷却到0℃后，缓慢加入甲磺酰氯(MesCl)(25.2μl，330μmol)，0℃搅拌该反应混合物1.5小时。然后，通过加入冰冷的饱和碳酸氢钠溶液(2mL)终止反应。去除有机层，用冰冷的氯仿(3×4mL)萃取水层。用硫酸镁干燥合并的有机层。过滤后减压去除溶剂，用柱色谱(硅胶，甲醇/二氯甲烷7∶93)纯化粗产物，产生淡黄色泡沫状核苷12(63mg，54％)(R_f0.39，甲醇/二氯甲烷10∶90)。

¹H-NMR(400 MHz，[D₆]DMSO)：δ＝1.32(s，3H，异亚丙基-CH₃a)，1.54(s，3H，异亚丙基-CH₃b)，3.13(s，3H，甲磺酰基-CH₃)，4.32(d，³J＝5.22Hz，2H，H3″)，4.33-4.37(m，2H，H5′)，4.40-4.43(m，1H，H4′)，5.02(dd，³J＝3.03Hz，³J＝6.32，1H，H3′)，5.26(dd，³J＝2.35Hz，³J＝6.32，1H，H2′)，6.25(d，³J＝2.75Hz，1H，H1′)，7.74(s，1H，H6)，8.15(s，1H，H2)，10.11(t，³J＝5.22Hz，1H，3″-NH)；¹⁹F-NMR(376MHz，[D₆]DMSO)：δ＝-74.317(CF₃)。

B.4-氨基-7-(5′-O-甲磺酰基-β-D-呋喃核糖基)-5-[1″-(3″-三氟乙酰胺基)-丙-1-炔基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物13

在室温下搅拌核苷12(48mg，90μmol)的三氟乙酸水溶液(TFA)(70％，3mL)过夜。减压去除溶剂，其余溶剂与乙醇共蒸发两次，与二氯甲烷共蒸发一次。产物13(R_f0.38，甲醇/二氯甲烷10∶90)直接用于以下反应。

¹H-NMR(300MHz，[D₆]DMSO)：δ＝3.19(s，3H，甲磺酰基-CH₃)，3.60-4.00(m，3H，H5′和H4′)，4.10-4.16(m，1H，H3′)，4.33(d，³J＝5.19Hz，2H，H3″)，4.40-4.44(m，1H，H2′)，6.11(d，³J＝5.69Hz，1H，H1′)，7.86(s，1H，H6)，8.29(s，1H，H2)，10.12(s，br，1H，3″-NH)；¹⁹F-NMR(282 MHz，[D₆]DMSO)：δ＝-74.293(CF₃)。

C.4-氨基-7-(5 ′-N-氮丙啶基-5′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-5-[1″-(3″-氨基丙-1-炔基)]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物14

在氩气气氛下将来自前述步骤的粗核苷13(41mg，83μmol)溶解于无水氮丙啶(Gabriel，(1888)Chem.Ber.21，2664-2669；Gabriel和Stelzner，(1895)Chem.Ber.28，2929-2938)(1mL，16.3mmol)和N-乙基二异丙胺(EDIA)(300μl，1.8mmol)的混合物中，在室温下搅拌4天。通过分析反相HPLC(Prontosil-ODS，5μm，120，250×4.6mm，Bischoff，德国利昂)监测反应过程。用乙腈的三乙基乙酸铵缓冲液(0.1M，pH7.0)溶液洗脱化合物(7％5分钟，然后10分钟内线性梯度至31.5％，15分钟内至35％，5分钟内至70％)，流速1mL/分钟。洗脱出产物14，保留时间为13.5分钟(在254nm和280nm进行UV检测)。减压去除挥发性化合物，将残留物溶解于三乙基碳酸氢铵缓冲液(0.01M，pH8.6)。用制备型反相HPLC(Prontosil-ODS，5μm，120，250×8mm，Bischoff，德国利昂)纯化粗产物。用乙腈的三乙基碳酸氢铵缓冲液(0.01M，pH8.6)溶液洗脱化合物(7％5分钟，然后5分钟内线性梯度至28％，15分钟内至42％，5分钟内至70％)，流速3mL/分钟。合并含有产物14的组分(保留时间15.7分钟，在280nm和300nm进行UV检测)。用UV光谱法测定合并组分(12.5mL)中产物14的量(2.3mg，8.1％)，其中采用发表的4-氨基-7-(2′-脱氧-β-D-赤戊呋喃糖基)-5-[1″-(3″-三氟乙酰胺基)丙-1-炔基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶的消光系数，ε²⁷⁸＝14200L mol^-1cm^-1(Seela和Zulauf，(1999) Helv.Chim.Acta 82，1878-1898)。

D.4-氨基-7-(5′-N-氮丙啶基-5′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-5-[1″-(N″-生物素基)-3″-氨基丙-1-炔基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，化合物2

将N-羟基琥珀酰亚胺基生物素(NHS生物素)(15mg，44μmol)的二甲基亚砜溶液(400μL)加入核苷14(2.3mg，6.7μmol)的三乙基碳酸氢铵缓冲液(0.01M，pH8.6，含有乙腈)溶液(12.5mL)中。在室温下搅拌该反应混合物2小时。通过分析反相HPLC(Prontosil-ODS，5μm，120，250×4.6mm，Bischoff，德国利昂)监测反应过程。用乙腈的三乙基乙酸铵缓冲液(0.1M，pH7.0)溶液洗脱化合物(7％5分钟，然后10分钟内线性梯度至31.5％，15分钟内至35％，5分钟内至70％)，流速1mL/分钟。洗脱出产物2，保留时间为17.5分钟(在254nm和280nm进行UV检测)。用制备型反相HPLC(Prontosil-ODS，5μm，120，250×8mm，Bischoff，德国利昂)纯化粗产物。用乙腈的三乙基碳酸氢铵缓冲液(0.01M，pH8.6)溶液洗脱化合物(7％5分钟，然后5分钟内线性梯度至28％，15分钟内至42％，5分钟内至70％)，流速3mL/分钟。合并含有产物2的组分(保留时间16.0分钟，在280nm和300nm进行UV检测)，冻干去除溶剂。获得白色固状氮丙啶辅因子2(1.0mg，26％)。

ESI-MS：m/z(相对强度)：571.5(100)[M+H]⁺。

实施例5：合成氮丙啶辅因子3

如方案4所示合成辅因子3。合成详情见下。

方案4：合成氮丙啶辅因子3。

A.N6-[1″-(4″-氨基丁基)]-2′，3′-O-异亚丙基腺苷，化合物15

将6-氯-2′，3′-O-异亚丙基腺苷(Kappler和Hampton，(1990)J.Med.Chem.33，2545-2551)(0.97g，2.97mmol)的乙醇溶液(50mL)缓慢加入1，4-二氨基丁烷(1.05g，11.9mmol)和三乙胺(1.70mL，6.92mmol)的乙醇溶液(5mL)中，60℃搅拌该反应混合物18小时。减压去除溶剂和过量试剂，产生白色固状粗核苷15(1.07g，95％)。

¹H-NMR(300MHz，[D₆]DMSO)：δ＝1.33(s，3H，异亚丙基-CH₃a)，1.56(s，3H，异亚丙基-CH₃b)，1.58-1.70(m，4H，H2″，H3″)，2.55-2.62(m，2H，H4″)，3.46-3.54(m，2H，H1″)，3.54-3.60(m，2H，H5′)，4.22-4.26(m，1H，H4′)，4.98(dd，³J＝2.48Hz，³J＝6.19Hz，1H，H3′)，5.34(dd，³J＝2.97Hz，³J＝6.18Hz，1H，H2′)，6.13(d，³J＝2.97Hz，1H，H1′)，8.00(s，br，1H，6-NH)，8.23(s，1H，H8)，8.37(s，1H，H2)。

B.N6-[1″-(4″-三氟乙酰胺基)丁基]-2′，3′-O-异亚丙基腺苷，化合物16

将三氟乙酸乙酯(1.9mL，16.6mmol)加入核苷15(1.05g，2.77mmol)和三乙胺(0.96mL，6.92mmol)的甲醇溶液(50mL)中。在室温下搅拌该反应混合物过夜。减压去除溶剂，用柱色谱(硅胶，乙酸乙酯)纯化粗产物，产生白色固状核苷16(0.87g，66％)(R_f0.20，乙酸乙酯)。

¹H-NMR(300MHz，[D₆]DMSO)：δ＝1.33(s，3H，异亚丙基-CH₃a)，1.55(s，3H，异亚丙基-CH₃b)，1.57-1.61(m，4H，H2″，H3″)，3.18-3.24(m，2H，H4″)，3.43-3.62(m，4H，H5′，H1″)，4.20-4.24(m，1H，H4′)，4.97(dd，³J＝2.47Hz，³J＝6.18Hz，1H，H3′)，5.24(t，³J＝5，57Hz，1H，5′-OH)，5.34(dd，³J＝2.97Hz，³J＝6.19Hz，1H，H2′)，6.13(d，³J＝2.97Hz，1H，H1′)，7.92，(s，br，1H，6-NH)，8.23(s，1H，H8)，8.34(s，1H，H2)，9.41(t，³J＝5.44Hz，1H，4″-NH)；¹⁹F-NMR(282 MHz，[D₆]DMSO)：δ＝-74.353；ESI-MS：m/z(相对强度)：475.7(100)[M+H]⁺，303.7(27)[N6-[1″-(4″-三氟乙酰胺基)丁基]腺嘌呤+H]⁺。

C.N6-[1″-(4″-三氟乙酰胺基)丁基]-2′，3′-O-异亚丙基-5′-O-甲磺酰基-腺苷，化合物17

在氩气气氛下将二甲基氨基吡啶(DMAP)(0.22g，1.79mmol)和三乙胺(6.24mL，44.4mmol)加入核苷16(0.85g，1.79mmol)的无水二氯甲烷溶液(60mL)中，用冰浴将该溶液冷却到0℃。缓慢加入甲磺酰氯(1.39mL，17.9mmol)，0℃搅拌该反应混合物2小时。通过加入冰冷的饱和碳酸氢钠溶液(15mL)终止反应，去除有机层。用冰冷的氯仿(3×25mL)萃取水层，用硫酸镁干燥合并的有机层。过滤后减压去除溶剂，用柱色谱(硅胶，甲醇/二氯甲烷5∶95)纯化粗产物，产生淡黄色固状核苷17(0.85mg，86％)(Rf0.21，甲醇/二氯甲烷5∶95)。

¹H-NMR(300MHz，[D₆]DMSO)：δ＝1.34(s，3H，异亚丙基-CH₃a)，1.56(s，3H，异亚丙基-CH₃b)，1.56-1.64(m，4H，H2″，H3″)，3.11(s，3H，甲磺酰基-CH₃)，3.16-3.23(m，2H，H4″)，3.25-3.36(m，2H，H1″)，4.36-4.50(m，3H，H5′，H4′)，5.07-5.11(m，1H，H3′)，5.45(dd，³J＝2.23Hz，³J＝6.43Hz，1H，H2′)，6.25(d，³J＝2.23Hz，1H，H1′)，7.90(s，br，6-NH)，8.24(s，1H，H8)，8.31(s，1H，H2)，9.45(t，³J＝4.70Hz，1H，4″-NH)；¹⁹F-NMR(282MHz，[D₆]DMSO)：＝-74.35；ESI-MS：m/z(相对强度)：591.1(10)[M+K]⁺，575.1(15)[M+Na]⁺，553.3(17)[M+H]⁺，457.5(100)[环核苷]。

D.N6-[1″-(4″-三氟乙酰胺基)丁基]-5′-O-甲磺酰基腺苷，化合物18

将核苷17(500mg，0.905mmol)溶解于甲酸水溶液(50％，35mL)中，在室温下搅拌该反应混合物3天。减压去除溶剂，将剩余溶剂与水/甲醇(1∶1，3×10mL)共蒸发。高真空干燥后，获得白色固状核苷18(447mg，96％)(R_f0.17，甲醇/二氯甲烷5∶95)

¹H-NMR(400MHz，[D₆]DMSO)：δ＝1.66-1.86(m，4H，H2″，H3″)，3.16(s，3H，甲磺酰基-CH₃)，3.18-3.24(m，2H，H4″)，3.25-3.39(m，2H，H1″)，4.13-4.18(m，1H，H4′)，4.23-4.28(m，1H，H3′)，4.40-4.55(m，2H，H5′)，4.64-4.69(m，1H，H2′)，5.48(s，br，1H，OH)，5.63(s，br，1H，OH)，5.95(d，³J＝5.50Hz，1H，H1′)，7.90(s，br，1H，6-NH)，8.22(s，1H，H8)，8.32(s，1H，H2)，9.41(t，³J＝5.50Hz，1H，4″-NH)；¹⁹F-NMR(376MHz，[D₆]DMSO)：δ＝-78.01；ESI-MS：m/z(相对强度)：535.2(5)[M+Na]⁺，513.3(100)[M+H]⁺，417.7(9)[环核苷]。

E.5′-N-氮丙啶基-N6-[1″-(4″-氨基丁基)]-5′-脱氧腺苷，化合物19

在氩气气氛下将核苷18(150mg，0.292mmol)溶解于无水氮丙啶(1.1mL，17.9mmol)(Gabriel，(1888)Chem.Ber.21，2664-2669；Gabriel和Stelzner，(1895)Chem.Ber.28，2929-2938)和N-乙基二异丙胺(EDIA)(3mL，18mmol)的混合物中，室温搅拌3天。用分析反相HPLC(Prontosil-ODS，5μm，120，250×4.6mm，Bischoff，德国利昂)监测反应过程。用乙腈的三乙基乙酸铵缓冲液(0.1M，pH7.0)溶液洗脱化合物(14％5分钟，然后在10分钟内线性梯度至31.5％，10分钟内至35％，5分钟内至70％)，流速1mL/分钟。洗脱出产物19，保留时间为4.4分钟(280nm和300nm UV检测)。减压去除挥发性化合物，将粗产物溶解于三乙基碳酸氢铵缓冲液(0.01M，pH8.6，2mL)，然后用制备型反相HPLC(Prontosil-ODS，5μm，120，250×8mm，Bischoff，德国利昂)纯化。用乙腈的三乙基碳酸氢铵缓冲液(0.01M，pH8.6)溶液洗脱化合物(7％5分钟，然后15分钟内线性梯度至21％，5分钟内至70％)，流速为3mL/分钟。将含有产物19的组分(保留时间17.4分钟，在280nm和300nm进行UV检测)储存于-80℃。用UV光谱法测定合并组分(30mL)中产物19的量(10.1mg，10％)，其中采用发表的N6-[1″-(4″-氨基丁基)-2′，3′-O-甲氧基-亚乙基腺苷的消光系数，ε²⁶⁷＝16000L mol^-1cm^-1(Murata等，(1980)J.Med.Chem.23，781-786)。

ESI-MS：m/z(相对强度)：364.3(11)[M+H]⁺。

F.5′-N-氮丙啶基-N6-[1″-(N″-生物素基)-4″-氨基丁基]-5′-脱氧腺苷，化合物3

将N-羟基琥珀酰亚胺基生物素(NHS生物素)(12.2mg，36μmol)的二甲基亚砜溶液(2mL)加入核苷19(10.1mg，27.8μmol)的三乙基碳酸氢铵缓冲液(0.01M，pH8.6，含有乙腈)溶液(30 mL)中。在室温下搅拌该反应混合物40分钟。用分析反相HPLC(Prontosil-ODS，5μm，120，250×4.6mm，Bischoff，德国利昂)监测反应过程。用乙腈的三乙基乙酸铵缓冲液(0.1M，pH7.0)溶液洗脱化合物(14％5分钟，然后在10分钟内线性梯度至31.5％，10分钟内至35％，5分钟内至70％)，流速1mL/分钟。洗脱出产物19，保留时间为19.1分钟(280nm和300nm UV检测)。用制备型反相HPLC(Prontosil-ODS，5μm，120，250×8mm，Bischoff，德国利昂)纯化粗产物，用乙腈的三乙基碳酸氢铵缓冲液(0.01M，pH8.6)溶液洗脱化合物(14％5分钟，然后5分钟内线性梯度至31.5％，10分钟内至35％，5分钟内至70％)，流速为3mL/分钟。合并并冻干含有产物3的组分(保留时间14.3分钟，在280nm和300nm进行UV检测)。获得白色固状氮丙啶辅因子3(3.0mg，18％)。

¹H-NMR(400MHz，[D₆]DMSO)：δ＝1.18-1.25(m，2H，脂族H)，1.32-1.36(m，2H，脂族H)，1.36-1.45(m，8H，4×脂族H，4×氮丙啶-H)，1.48-1.55(m，4H，脂族H)，1.97(t，³J＝7.42 Hz，2H，脂族H)，2.60-2.72(m，2H，生物素-SCH₂)，2.84-2.99(m，2H，H5′)，2.99-3.05(m，1H，生物素-SCH)，3.18-3.22(m，2H，脂族H)，3.80-3.91(m，1H，H4′)，4.02-4.10(m，1H，生物素-SCHRC H)，4.15-4.19(m，1H，H3′)，4.20-4.23(m，1H，生物素-SCH₂C H)，4.56-4.60(m，1H，H2′)，5.20(s，br，1H，OH)，5.40(s，br，1H，OH)，5.79-5.83(m，1H，H1′)，6.30(s，br，1H，生物素-NHa)，6.39(s，br，1H，生物素-NHb)，7.70(t，³J＝5.49Hz，1H，4″-NH)，7.75(m，1H，6-NH)，8.10(s，1H，H8)，8.22(s，1H，H2)；ESI-MS：m/z(相对强度)：612.6(53)[M+Na]⁺，590.5(100)[M+H]⁺，433.6(12)N6-[1″-(N″-生物素基)-4″-氨基丁基]-腺嘌呤+H]⁺。

实施例6：DNA的道路阻断(ROAD BLOCK)修饰

A.构思

后述实验方法基于核酸分子的空间排布苛求修饰能引起所述核酸分子扩增减少或阻断这一观点。在DNA-甲基转移酶特异性识别序列引入修饰。该修饰的先决条件是非甲基化识别序列的存在，因为在这些侧面的甲基化阻碍了空间排布苛求氮丙啶-辅因子进行的任意进一步修饰。因此，仅非甲基化DNA链被阻止扩增(在空间排布苛求氮丙啶衍生物的存在下)，然而甲基化DNA链(不能被氮丙啶衍生物修饰)能被后续PCR反应扩增。下列方案概述了该构思(方案1)。

方案5：测定DNA甲基化模式的“道路阻断(road block)”构思。左：利用DNA-甲基转移酶和氮丙啶-辅因子对非甲基化DNA-甲基转移酶识别序列(灰色柱)进行序列特异性修饰，因此DNA扩增(例如在后续PCR反应中)被阻碍或阻断。右：氮丙啶-辅因子不能修饰甲基化DNA-甲基转移酶识别序列，因此可扩增相应DNA(例如在后续PCR反应中)。

利用来自溶血嗜血菌(M.HhaI)的DNA-甲基转移酶修饰测试DNA。M.HhaI催化激活的甲基基团从自然辅因子S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)转移到位于双链DNA序列5’GCGC-3’(方案6)内的第一胞嘧啶残基5-位上，并因此能够修饰测试DNA的5’-GCGC-3’-序列。

方案6：M.Hhal催化的反应。

此外，酶对于序列特异性甲基转移酶诱导的DNA标记(SMILing DNA)相当有用。而且，分析MQ1(M.SssI)在SMILing DNA技术中的有用性。M.SssI是唯一已知具有5’-GCGC-3’识别序列的细菌胞嘧啶特异性DNA甲基转移酶，并且潜在地可用于分析(人)DNA CpG-基序的甲基化状态。

方案7：M.SssI催化的反应。

M.SssI具有高酶活性并能由大肠杆菌表达生产。此外，实验显示M.SssI可利用简单的氮丙啶-辅因子Az修饰DNA-分子(图解7)。

B.利用M.HhaI和7Baz进行序列特异性DNA标记

如本发明所述制备320碱基对长的测试DNA。该测试DNA包含13个5’-GCGC-3’M.HhaI识别序列，其中两个重叠(图3，左)。

测试DNA、M.HhaI和7BAz在37℃缓冲液中共孵育3小时。接下来，热失活酶，利用可购得的试剂盒纯化修饰的DNA。同时进行对照反应(无M.HhaI或无7BAz)，并利用“实时”PCR分析DNA样品。

利用无法切割修饰的识别序列的限制性核酸内切酶R.HhaI测试修饰。当测试DNA与M.HhaI和7BAz共孵育后，DNA被完全保护，不受R.HhaI的作用(图3，右)。两个不含M.HhaI和/或7BAz的对照完全被消化(即切割)。利用电泳迁移率变动实验分析修饰DNA上的生物素残基的存在。加入链霉抗生物素蛋白对于修饰DNA的电泳迁移率有显著影响(图4，右)。另一方面，本实验中不含M.HhaI或7Baz的对照基本上未显示DNA迁移上的差异。

C.利用M.HhaI和6TexAz进行序列特异性DNA标记

N-腺苷氮丙啶-辅因子7BAz分子量为534g/mol。为测试空间排列更加苛求的辅因子特性，合成N-腺苷氮丙啶-衍生物6TexAz，分子量1065g/mol(方案8)。

方案8：合成空间苛求N-腺苷氮丙啶-辅因子6TexAz(辅因子4)。

基于6BAz进行合成。从6-氯嘌呤-9-β-D-呋喃核酮糖苷(6-chloropurin-9-β-D-ribufuranosid)开始，将仲羟基保护为丙酮化物(acetonid)，将二氨基丁烷-接头引入6位，将该接头的伯氨基官能团保护为三氟乙酰胺(trifluoracetamid)。然后，将5’-羟基活化为甲磺酸酯，去除异亚丙基保护基并通过5’-位上的亲核取代引入氮丙啶基团。在制备过程中碱性条件导致接头的伯氨基官能团去保护，以便最后它们可与得克萨斯红的NHS酯反应。

对于标记序列特异性DNA(图4，左)，测试DNA与M.HhaI和6TexAz在37℃缓冲液中共孵育15小时。

接下来，热失活酶并利用可购得试剂盒纯化修饰DNA。此外，进行不含M.HhaI或不含6TexAz的平行对照。利用“实时”PCR实验分析三个DNA样品。

为检查标记反应，用R.HhaI处理三个样品。测试DNA与M.HhaI和6TexAz共孵育后，测试DNA被完全保护，测试DNA免受R.HhaI消化(图4，右)。另一方面，两个不含M.HhaI或6TexAz对照均完全消化。

D.N-腺苷氮丙啶衍生物6BAz作为M.SssI的辅因子

为分析人DNA的DNA甲基化状态，DNA甲基转移酶尤为有用，因为与M.HhI相比，它不能修饰各个和全部甲基化CpG-基序。因此，检测原则上M.SssI对于SMILing DNA技术和“road-block”构思是否有用。已知M.SssI能利用非复合氮丙啶-辅因子Az作为底物并将其与DNA连接(方案7)。另一方面，利用接头在8-或7-位与生物素基团连接的N-腺苷氮丙啶衍生物8BAz和7BAz不能被转移至DNA分子(方案9)，这也许是M.SssI辅因子结合口袋的不利空间位阻的结果。

方案9：N-腺苷氮丙啶-衍生物作为M.SssI辅因子。

利用双链体-寡脱氧核苷酸和纯化的DNA甲基转移酶研究M.SssI-介导的6BAz转换。调整和优化反应条件后(pH、缓冲液组分、温度和M.SssI的量)，2小时反应中60％半甲基化双寡脱氧核苷酸被标记。利用非甲基化双链体寡脱氧核苷酸时，约100％被标记。也许酶制备过程中出现的微量自然辅因子AdoMet导致了这种分歧的结果。

总之，利用DNA甲基转移酶M.HhaI序列特异性DNA标记显示了利用氮丙啶-辅因子6TexAz和7BAz的定量转换。“实时”PCR反应检测标记DNA样品和对照DNA样品。与两个对照相比，扩增反应明显削弱。当利用6TexAz-标记的测试DNA作为PCR模板时，这种削弱更加明显。这些结果显示“road-block”构思对于检测DNA甲基转移酶非甲基化识别序列有用。

此外，显示6BAz为DNA甲基化酶M.SssI的氮丙啶-辅因子，因此对于DNA中所有非甲基化CpG-基序进行序列特异性修饰是可能的。故检测DNA甲基化模式的一个有效方法可基于氮丙啶标记DNA的“实时”PCR。

E.方法

E1.利用M.HhaI和7BAz序列特异性标记测试DNA

测试DNA(1.2μg、320bp、13个M.HhaI识别序列，0.6μg/M M.HhaI-识别序列)，M.HhaI(1.2μM)和7BAz(80μM)在由Tris/HCI(10mM，pH7.4)，NaCl(50mM)，EDTA(0.05mM)和2-巯基乙醇(2mM)组成的缓冲液(118μl)37℃共孵育3小时。也在不含M.HhaI或7BAz(对照)的情况下孵育DNA。接着，加热样品20分钟至80℃。根据厂商操作方法，利用QUIAGEN(Hilden)的DNA QIAquick PCR纯化试剂盒纯化DNA，缓冲液(40μL，10mM Tris/HCl，pH8.5)洗脱DNA。

将3.3μL纯化标记DNA(或对照)与缓冲液(7.7μL，10mM Tris/HCl，pH7.9，15mM MgCl₂，75mM NaCl和1mM 1，4-二硫苏糖醇)和HhaI(8U)的缓冲液(9μL)37℃共孵育3小时进行限制性分析，后一缓冲液由Tris/HCl(10mM，pH7.9)，MgCl₂(10mM)，NaCl(50mM)，1，4-二硫苏糖醇(1mM)和BSA(2.2μg/μL)组成。接着，80℃孵育样品20分钟，加入蛋白酶K溶液(1μL，20μg/μL于10mM Tris/HCl，pH7.5中，QIAGEN蛋白酶K)，37℃孵育30分钟，并在80℃孵育20分钟。接着样品与样品缓冲液(2μL，0.25％溴酚蓝和30％甘油)混合并在1％琼脂糖凝胶上进行分析。

电泳迁移率变动实验：3.3μL纯化的标记DNA(或对照)与缓冲液(7.7μL，10mM Tris/HCl，pH7.9，15mM MgCl₂，75mM NaCl和1mM 1，4-二硫苏糖醇)、链霉抗生物素蛋白溶液(2μL，2.0μg/μL)混合，37℃孵育3小时。接着，利用样品缓冲液(2μL，0.25％溴酚蓝和30％甘油)处理样品并在1％琼脂糖凝胶上进行分析。

E2.合成空间排布苛求氮丙啶-辅因子6TEXAZ

6TexAz基本上按照方案8所述合成。德克萨斯红NHS酯(2.2μM)溶于DMSO(1.2mL)中，与1.35mL的5’-氮丙啶基-N6-[1”-(4”-氨基丁基)]-5’-脱氧腺苷(1.8μmol于10mM三乙基碳酸氢铵缓冲液和30％乙腈中)溶液混合并在室温下搅动30分钟。利用制备性反相HPLC(百浪多息(prontosil)-ODS，5μm，120，250×8mm，Bischoff，Leonberg)控制反应后，纯化产物。用乙腈的三乙基碳酸氢铵缓冲液(10mM，pH8.5)洗脱产物(21％5分钟，接着5分钟内线性梯度至70％，70％异丁烯基10分钟)，流速3mL/分钟。收集含有产物的级分(滞留时间13.5分钟，280和595nm UV检测并冻干，红色固体化合物溶解于100μLDMSO中。利用UV光谱法(ε⁵⁹⁵＝80.000cm^-1M^-1)检测氮丙啶-辅因子6TexAz的产量(17％)。

E3.利用M.HhaI和6TexAz序列特异性标记测试DNA

测试DNA(1.0μg，320bp，13个M.HhaI识别序列，0.6 μ/M M.HhaI-识别序列)，M.HhaI(1.2μM)和6TexAz(60μM)在由Tris/HCI(10mM，pH7.4)，NaCl(50mM)，EDTA(0.05mM)和2-巯基乙醇(2mM)组成的缓冲液(100μL)中37℃孵育15小时。作为平行对照，测试DNA在不含M.HhaI或6TexAz的条件下孵育。接着，80℃加热样品20分钟。根据制造商的方案，利用QUIAGEN(Hilden)的DNA QIAquickPCR纯化试剂盒纯化DNA，缓冲液(50μL，10mM Tris/HCl，pH8.5)洗脱DNA。

将5.0μL纯化的标记DNA(或对照)与缓冲液(5.0μL，20mM Tris/HCl，pH7.9，15mM MgCl₂，100mM NaCl和2mM 1，4-二硫苏糖醇)和R.HaI(8U)的缓冲液(9μL)37℃共孵育3小时，后一缓冲液由Tris/HCl(10mM，pH7.9)，MgCl₂(10mM)，NaCl(50mM)，1，4-二硫苏糖醇(1mM)和BSA(2.2μg/μL)组成。接着，80℃孵育样品20分钟，加入蛋白酶K溶液(1μL，20μg/μL于10mM Tris/HCl，pH7.5中，QIAGEN蛋白酶K)，37℃孵育30分钟，并在80℃孵育20分钟。接着样品与样品缓冲液(2μL，0.25％溴酚蓝和30％甘油)混合并在1％琼脂糖凝胶上进行分析。

E4.M.SssI催化的半甲基化的双链体寡脱氧核苷酸I·II和未甲基化的双链体寡脱氧核苷酸I·III与生物素化氮丙啶辅因子3的连接

具有连接于腺嘌呤环6位的生物素基团的氮丙啶辅因子3是M.SssI的底物(方案10)。如图5所示。

方案10：M.SssI催化的生物素化氮丙啶辅因子3与半甲基化的双链体寡脱氧核苷酸I·II(M＝5-甲基-2′-脱氧胞苷)的连接。

在21℃孵育半甲基化的双链体寡脱氧核苷酸I·II(1μM，I＝5’-TGTCAGCGCATGA-3’，II＝5’-TCATGMGCTGACA-3’，其中M＝5-甲基-2′-脱氧胞苷)或未甲基化的双链体寡脱氧核苷酸I·III(1μM，I＝5’-TGTCAGCGCATGA-3’，III＝5’-TCATGCGCTGACA-3’)、氮丙啶辅因子3(100μM)和M.SssI(2μM)的缓冲液(10mM Tris盐酸，pH7.4，50mM氯化钠，10mM乙二胺四乙酸和2mM二硫苏糖醇)溶液。用阴离子交换HPLC(Poros10HQ，10μm，4.6×100mm，Applied Biosystems)监测偶联反应过程。用氯化钾的Tris盐酸缓冲液(10mM，pH7.6)水溶液洗脱化合物(0.2M5分钟，然后5分钟内线性梯度至0.5M，30分钟内至1M)，该Tris盐酸缓冲液补充有叠氮化钠(1mM)，流速为4mL/分钟。

将3与双链体I·II和M.SssI混合后，观察到具有较短保留时间(7.9分钟)的新化合物(图5A)。在孵育期间此反应产物的量增加，原材料I·II的量减少。根据260nm和280nm处观察到的UV吸收率(未显示)，将该反应产物判定为M.SssI与偶联产物I³·II的非共价蛋白质-DNA复合物。95℃孵育10分钟后，偶联产物I³·II从蛋白质-DNA复合物上释放，观察到与原材料I·II的保留时间(20.2分钟)相比，产物双链体I³·II的保留时间(19.4分钟)稍短。起始双链体I·II转变为产物双链体I³·II的转化率约为60％。3小时后再加入一当量M.SssI并在21℃孵育1小时不会进一步形成产物，这说明3小时后反应完成(未显示)。此不完全转化归因于酶制剂中存在的少量天然辅因子S-腺苷-L-甲硫氨酸，以及M.SssI-催化了甲基从S-腺苷-L-甲硫氨酸转移到半甲基化双链体I·II，导致双甲基化双链体I^Me·II应该阻断与氮丙啶辅因子3的反应。

用非甲基化双链体I·III作为M.SssI-催化的与氮丙啶辅因子3的偶联反应的原材料，验证了此假设(图5B)。在3小时孵育期间，此双链体几乎完全转化为M.SssI和偶联产物(I·III)³之间的非共价蛋白质-DNA复合物(保留时间5.3-9.6分钟)。再次，通过在95℃孵育10分钟，偶联产物(I·III)³从蛋白质-DNA复合物上释放，观察到与起始双链体I·III的保留时间相比，产物双链体(I·III)³的保留时间稍短。此外，通过加入链霉抗生物素蛋白验证了产物双链体(I·III)³中生物素基团的存在和功能。首先用NAP-5柱(Amersham Biosciences，德国弗赖堡)通过凝胶过滤和Tris盐酸(10mM，pH7.4)、氯化钠(50mM)、乙二胺四乙酸(10mM)和二硫苏糖醇(2mM)的洗脱去除过量氮丙啶辅因子3。然后，加入链霉抗生物素蛋白(10pmol双链体1μg)，在室温下孵育该溶液30分钟。阴离子交换HPLC分析(见上)揭示出新的主要化合物，保留时间为14.2分钟，这与链霉抗生物素蛋白和生物素化双链体(I·III)³的复合物的形成相符。除此复合物外，观察到少量推测双甲基化的双链体I^Me·III^Me。

实施例7：道路阻断构思的实时PCR应用

可用S-腺苷-甲硫氨酸-类似物如N-腺苷氮丙啶衍生物和甲基转移酶实现核酸分子的序列特异性共价标记。然而，仅可能在DNA底物的非甲基化碱基上进行标记，甲基化碱基不可标记(图6A)。可以想象，用大容量(bulky)氮丙啶侧链标记DNA底物对后续PCR扩增反应具有抑制作用(图6B)。然而，甲基化DNA底物保持不受影响。可用实时PCR检测此区别(LightCycler)。

(A)制备DNA底物

作为“DNA模式底物”，选择人GSTP1基因的部分启动子和外显子1范围。用所谓的重叠延伸-PCR合成此DNA底物。此方法中，长度各约100bp的寡核苷酸在约20bp的重叠范围上杂交，随后用聚合酶反应扩增产生双链(图7)。随后用标准PCR处理足量底物(正向引物：5′-GACCTGGGAAAGAGGGAAAGGC-3′；反向引物：5′-CTGCGGGTTGGCCCCATGC-3′；变性：96℃30秒，退火：59℃60秒，扩增：72℃30秒；30个循环)。然后按照序列分析检测合成DNA底物的正确性(图8)。

(B)甲基化DNA底物

在随后的标记实验中，采用非-甲基化和(对照目的)甲基化底物。为了制备完全或部分甲基化的DNA底物，根据生产商说明书用天然甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)将DNA与甲基化酶M.SssI(识别序列CG)、M.HhaI(识别序列GCGC)和M.HpaII(识别序列CCGG)一起孵育。然后采用相应的限制性核酸内切酶HhaI和HpaII检测完全甲基化或纯化(甲基化序列未水解)(图9A)，然后按照制备型琼脂糖凝胶电泳进行纯化(图9B)。

(C)标记DNA底物

为了检测“道路阻断”构思，首先，仅非甲基化底物用氮丙啶衍生物7-BAz标记(用7-BAz标记的实验详情见上，实施例6)。然后将相应处理的DNA底物转移回LightCycler中的RCD用于对照目的。

(D)用LightCycler检测标记的DNA底物

为了检测7-Baz标记对聚合酶反应的可能影响，在LightCycler中用实时PCR反应检测对应的标记DNA以及两种未标记对照。在此部分内容中，先稀释DNA底物，所用稀释度为每反应批次1.5ng、150pg、15pg、1.5pg和150fg DNA。所有PCR批次分别分析两次。在扩增或检测中，采用以下引物/探针对：

正向引物：5′-GACCTGGGAAAGAGGGAAAGGC-3′

反向引物：5′-CTGCGGGTTGGCCCCATGC-3′

杂交探针：5′-LC Red640-GGCGCAGCGGGGCGGG-3′

荧光素-探针：5′-CGCCGTGACTCAGCACT-荧光素-3′

而且，在预实验中，可测定最佳MgCl₂浓度为2mM。用“FastStart DNA MasterHybridization Probes”试剂盒(Roche，序列号2 239 272)按照厂商说明书进行LightCycler中所有PCR反应。

各反应批次：H₂O，PCR级    7.2μl  -

MgCl₂储存液       0.8μl        2mM

正向引物          2.0μl        5μM

反向引物          2.0μl        5μM

杂交探针          2.0μl        0.3μM

荧光素探针        2.0μl        0.3μM

FastStart混合物   2.0μl        -

DNA模板           2.0μl        (150fg～1.5ng)

作为PCR反应的阴性对照，采用PCR-级H₂O而非DNA模板进行一个批次(双测定)。

LightCycler程序：

各轮次后，用“LightCycler软件4.0”进行评价。通过后者，将PCR期间检测到的荧光信号转变为所谓的“交叉点”。这使得可能对扩增过程或聚合酶反应的效率作出结论。

(E)结果和结论

在几次重现批次中重复如上所述采用LightCycler的实时-PCR。当比较各批次时，显示出与采用未标记DNA模板的对照相比，采用氮丙啶-标记的DNA底物时(即更迟的“交叉点”)反应过程较慢(图10A-D)。这意味着，非甲基化DNA底物中氮丙啶标记的碱基减慢了聚合酶反应。

总之，本实验结果明确证明，“道路阻断”构思可用于区分非甲基化和甲基化的DNA。

序列表

<110>马普科技促进协会(Max-Planck-Gesellschaft zur Frderung der Wissenschaftene.V.)

<120>生物分子中甲基化的序列特异性检测

<130>H1705PCT

<140>PCT/EP2005/006374

<141>2005-06-14

<150>EP 04 01 3894.3

<151>2004-06-14

<160>23

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>13

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<400>1

tgtcagcgca tga    13

<210>2

<211>13

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<220>

<221>修饰

<222>(6)..(6)

<223>5-甲基-2’-脱氧-胞苷

<400>2

tcatgcgctg aca    13

<210>3

<211>13

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<400>3

tcatgcgctg aca    13

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<400>4

gacctgggaa agagggaaag gc    22

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<400>5

ctgcgggttg gccccatgc        19

<210>6

<211>16

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<220>

<221>5’-修饰

<222>(1)..(1)

<223>用LC Red640在5’端标记寡脱氧核苷酸

<400>6

ggcgcagcgg ggcggg           16

<210>7

<211>17

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<220>

<221>3’-修饰

<222>(17)..(17)

<223>用荧光素标记寡脱氧核苷酸的3’端

<400>7

cgccgtgact cagcact            17

<210> 8

<211>28

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<400>8

atgcgtgggt agttcgatgg tctagtct  28

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<400>9

agactagacc atcgaactac ccacgcat                       28

<210>10

<211>28

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<220>

<221>修饰

<222>(4)..(4)

<223>m5c

<220>

<221>甲基化

<222>(15)..(15)

<223>m5c

<400>10

atgcgtgggt agttcgatgg tctagtct                          28

<210>11

<211>28

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<220>

<221>甲基化

<222>(13)..(13)

<223>m5c

<220>

<221>甲基化

<222>(24)..(24)

<223>m5c

<400>11

agactagacc atcgaactac ccacgcat                           28

<210>12

<211>50

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<400>12

ttccccggcc agctgcgcgg cgactccggg gactccaggg cgcccctctg    50

<210>13

<211>50

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<400>13

ttccccggcc agctgcgcgg cgactccggg gactccaggg cgcccctctg    50

<210>14

<211>50

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<400>14

cgcccgacgc ccggggtgca gcgggcgccg gggctggggc cggcgggagt    50

<210>15

<211>50

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<400>15

cgcccgacgc ccggggtgca gcgggcgccg gggctggggc cggcgggagt    50

<210>16

<211>50

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<400>16

ccgcgcgacc ctccagaaga gcgcccggcg ccgtgactca gcactggggc    50

<210> 17

<211>50

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<400>17

ccgcgcgacc ctccagaaga gcgcccggcg ccgtgactca gcactggggc    50

<210>18

<211>50

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<400>18

gcagcggggc gggaccaccc ttataaggct cggagggcgc gaggccttcg    50

<210>19

<211>50

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<400>19

gcagcggggc gggaccaccc ttataaggct cggagggcgc gaggccttcg    50

<210>20

<211>50

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<400>20

ctggagttgc gccgccgcag tcttcgccac cagtgagtac gcgcggcccg    50

<210>21

<211>50

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<400>21

ctggagttgc gccgccgcag tcttcgccac cagtgagtac gcgcggcccg    50

<210>22

<211>27

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<400>22

cgccccgggg atggggctca gagctcc                              27

<210>23

<211>27

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>寡脱氧核苷酸

<400>23

cgccccgggg atggggctca gagctcc                               27

Claims (39)

1.一种检测生物分子中序列特异性甲基化的方法，所述方法包括：

(a)在S-腺苷-L-甲硫氨酸-依赖性甲基转移酶的可检测辅因子的存在下将生物分子与所述甲基转移酶接触；和

(b)检测所述甲基转移酶的识别位点是否经辅因子或其衍生物修饰，其中所述甲基转移酶的识别位点的修饰说明所述识别位点上没有甲基化；

其中所述辅因子是式(I)代表的N-腺苷氮丙啶衍生物，

式中

W选自N和CH，

X是N或CR¹，

Y是NH₂或NHR²，

Z是H、R³或CH₂CH(COOH)(NH₂)，

条件是：

如果X是CR¹，那么Y是NH₂且Z是H或CH₂CH(COOH)(NH₂)，

如果X是N和Y是NHR²，那么Z是H或CH₂CH(COOH)(NH₂)，

如果X是N和Y是NH₂，那么Z是R³，

R¹选自-(CH₂)_nR⁴、-(CH＝CH)_m(CH₂)_nR⁴、-(CH₂)_o(CH＝CH)_m(CH₂)_nR⁴、-(C≡C)_m(CH₂)_nR⁴、-(C≡C)_m(C₆H₄)_o(CH₂)_nR⁴、-(C₆H₄)_m(CH₂)_nR⁴、-CO(CH₂)_nR⁴或-S(CH₂)_nR⁴；

R²选自-(CH₂)_nR⁴、-(C₆H₄)_m(CH²)_nR⁴或-CO(CH₂)_nR⁴；

R³选自-(CH₂)_nR⁴、-(CH＝CH)_m(CH₂)_nR⁴、-(C≡C)_m(CH₂)_nR⁴、-(C₆H₄)_m(CH₂)_nR⁴或-CONH(CH₂)_nR⁴；

R⁴选自-NHR⁵、-NHCO(CH₂)_pSR⁵、-SR⁵、-OR⁵、-O(C₂H₅O)_n(C₂H₅)NHR⁵、-CH₂NHNHR⁵、-NHCOCH(CH₂SH)NHR⁵或-CONHR⁵；

R⁵选自荧光团、亲和标记物、交联剂、生色团、蛋白质、肽、可任选修饰的氨基酸、核苷酸、核苷、核酸、糖、脂质、PEG、转染试剂、珠、嵌入剂、核酸切割试剂或纳米颗粒；

n、m、o和p独立地选自0或1-5000的整数。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物分子是核酸分子或(多)肽。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(a)在体外用细胞提取物进行或在体内进行。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述核酸分子是DNA。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(a)之前还包括用限制性酶处理DNA的步骤。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述DNA分子固定在固体支持物上。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，通过将DNA分子杂交于与所述固体支持物连接的寡核苷酸将所述DNA分子偶联于固体支持物。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述甲基转移酶是单独DNA甲基转移酶或细菌限制性修饰系统的一部分。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，来自细菌限制性修饰系统的所述甲基转移酶选自M.HhaI、M.TaqI、M.BseCI或M.SssI。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，

(a)式(I)的N-腺苷氮丙啶衍生物阻断了DNA甲基转移酶识别位点上的限制性酶切；和

(b)通过测试N-腺苷氮丙啶衍生物对DNA的修饰是否阻断了所述识别位点处限制性酶介导的酶切检测甲基化。

11.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，

(a)式(I)的N-腺苷氮丙啶衍生物干扰了甲基转移酶的识别位点处的核酸扩增；和

(b)通过测试甲基转移酶识别位点处的核酸分子扩增是否被阻滞检测甲基化。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，

(a)式(I)的N-腺苷氮丙啶衍生物含有荧光标记；和

(b)通过测定所述核酸分子中荧光的存在或量检测甲基化。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，

(a)通过亲和纯化纯化甲基转移酶识别位点处修饰的核酸分子；和

(b)式(I)的N-腺苷氮丙啶衍生物含有亲和标记物。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，式(I)的N-腺苷氮丙啶衍生物被加入胞嘧啶残基中，并且不能被加到DNA中的5-甲基胞嘧啶残基。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(a)之后包括DNA分子测序的额外步骤。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其特征在于，通过(a)特异性结合于所述可检测辅因子的抗体或(b)特异性结合于所述可检测辅因子的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白检测所述可检测辅因子。

17.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其特征在于，通过DNA测序、杂交、Maldi-Tof或通过酶片段化和色谱进行核苷组成分析来确定所述DNA分子的身份。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述N-腺苷氮丙啶衍生物选自

19.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述N-腺苷氮丙啶衍生物是

20.如权利要求1-19中任一项所述的方法在DNA甲基化增加或减少相关性疾病的诊断或预后中的应用，其特征在于，所述疾病是癌症或ICF综合征。

21.一种S-腺苷-L-甲硫氨酸-依赖性甲基转移酶的辅因子，具有式(I)：

式中

W选自N和CH，

X是N或CR¹，

Y是NH₂或NHR²，

Z是H、R³或CH₂CH(COOH)(NH₂)，

条件是：

如果X是CR¹，那么Y是NH₂且Z是H或CH₂CH(COOH)(NH₂)，

如果X是N且Y是NHR²，那么Z是H或CH₂CH(COOH)(NH₂)，

如果X是N且Y是NH₂，那么Z是R³，

R¹选自-(CH₂)_nR⁴、-(CH＝CH)_m(CH₂)_nR⁴、-(CH₂)_o(CH＝CH)_m(CH₂)_nR⁴、-(C≡C)_m(CH₂)_nR⁴、-(C≡C)_m(C₆H₄)_o(CH₂)_nR⁴、-(C₆H₄)_m(CH₂)_nR⁴、-CO(CH₂)_nR⁴或-S(CH₂)_nR⁴；

R²选自-(CH₂)_nR⁴、-(C₆H₄)_m(CH₂)_nR⁴、-CO(C₆H₄)_m(CH₂)_nR⁴或-CO(CH₂)_nR⁴；

R³选自-(CH₂)_nR⁴、-(CH＝CH)_m(CH₂)_nR⁴、-(C≡C)_m(CH₂)_nR⁴、-(C₆H₄)_m(CH₂)_nR⁴或-CONH(CH₂)_nR⁴；

R⁴选自-NHR⁵、-NHCO(CH₂)_pSR⁵、-SR⁵、-OR⁵、-O(C₂H₅O)_p(C₂H₅)NHR⁵、-CH₂NHNHR⁵、-NHCOCH(CH₂SH)NHR⁵或-CONHR⁵；

R⁵选自荧光团、亲和标记物、交联剂、生色团、蛋白质、肽、可任选修饰的氨基酸、核苷酸、核苷、核酸、糖、脂质、PEG、转染试剂、珠、嵌入剂、核酸切割试剂或纳米颗粒；和

n、m、o和p独立地选自0或1-5000的整数。

22.如权利要求21所述的辅因子，其特征在于，所述荧光团是Alexa、BODIPY、香豆素、丹酰、荧光素、N-甲基苯胺基萘磺酰、芘、罗丹明、德克萨斯红、TNS、花青荧光团或其衍生物。

23.如权利要求21所述的辅因子，其特征在于，所述亲和标记物是肽标记物、生物素、镍-三乙酸腈(NTA)、麦芽糖、地谷新配基或二硝基酚。

24.如权利要求23所述的辅因子，其特征在于，所述肽标记物是组氨酸标签或具有金属螯合性能的标签、链霉素标签、flag标签、c-myc标签、HA标签、表位或谷胱甘肽。

25.如权利要求21所述的辅因子，其特征在于，所述交联剂是马来酰亚胺、碘乙酰胺或其衍生物或醛衍生物，或者光致交联剂。

26.如权利要求25所述的辅因子，其特征在于，所述光致交联剂是芳基氮化物、重氮化合物、补骨脂素或苯甲酮化合物。

27.如权利要求21所述的辅因子，其特征在于，所述核酸切割试剂是铁-EDTA、吖啶或其衍生物或铑复合物。

28.如权利要求21-27中任一项所述的辅因子，其特征在于，所述N-腺苷氮丙啶衍生物选自：

29.如权利要求21-28中任一项所述的辅因子与通常采用S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)作为辅因子的甲基转移酶的复合物。

30.如权利要求29所述的复合物，其特征在于，所述甲基转移酶通常将S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)的甲基残基转移到核酸分子或(多)肽上。

31.如权利要求29或30所述的复合物，其特征在于，所述甲基转移酶是单独DNA甲基转移酶或细菌的限制性修饰系统的一部分。

32.如权利要求31所述的复合物，其特征在于，所述甲基转移酶选自DNA甲基转移酶M.HhaI、M.TaqI、M.BseCI或M.SssI。

33.一种包括权利要求21-28中任一项所述的辅因子和权利要求26-29中任一项所述的甲基转移酶或权利要求29-32中任一项所述的复合物的试剂盒。

34.一种包括权利要求21-28中任一项所述的辅因子或权利要求29-32中任一项所述的复合物和任选的药学上可接受的运载体的药物组合物。

35.一种诊断组合物，其包含权利要求21-28中任一项所述的辅因子或权利要求29-32中任一项所述的复合物。

36.如权利要求21-28中任一项所述的辅因子或权利要求29-32中任一项所述的复合物在检测DNA分子中序列特异性甲基化中的应用。

37.如权利要求21-28中任一项所述的辅因子或权利要求29-32中任一项所述的复合物在诊断与DNA甲基化增加或减少相关的疾病中的应用。

38.如权利要求21-28中任一项所述的辅因子或权利要求29-32中任一项所述的复合物在制备用于诊断与DNA甲基化增加或减少相关的疾病的诊断组合物中的应用。

39.如权利要求38所述的应用，其特征在于，所述疾病是癌症或ICF综合征。

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