CN112730554B - 一种电极、包含该电极的生物传感器的制备及其在检测甲基转移酶中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种电极、包含该电极的生物传感器的制备及其在检测甲基转移酶中的应用。本发明所述电极,其结构为β‑CD/Ag‑MOG/GCE,由银金属有机凝胶、环糊精与玻碳电极组成,其中,银金属有机凝胶、环糊精修饰在玻碳电极表面。该电极及包含该电极的生物传感器可用于甲基转移酶的检测,检测灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及电化学领域,具体涉及一种电极、包含该电极的生物传感器的制备及其在检测甲基转移酶中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
金属有机凝胶(MOGs)是一种新型的金属有机杂化材料,它可以由金属离子和有机配体通过金属-配体相互作用和分子间作用力直接自组装而快速建立。由于具有明确的金属/配体催化活性位点、独特的多孔结构、高表面积和高热稳定性,其在吸附、催化、药物传输和环境污染治理等领域显示出了广阔的应用前景。
电化学发光(ECL)是在电极表面发生的化学发光反应。ECL由电极表面的可调电势触发,可精确控制发射光的时间和位置,具有高灵敏度和极佳的重现性。ECL已广泛应用于生物分析和诊断。发光团的发射体包括鲁米诺、钌配合物、金属团簇和量子点在ECL研究中被广泛应用。然而,目前报道的大多数发射体对改性有害,且价格高、稳定性差、毒性大。聚合诱导发射(AIE)是分子在聚合状态下受到分子内部振动、旋转和运动的限制而产生的一种发光现象。AIE为新型生物材料的开发以及生物医学和药物应用开辟了新的途径。在有机分子中首次发现了具有螺旋状结构的金属纳米晶体。典型的AIE材料包括Au、Ag、Cu纳米晶和一些杂化体,它们极大地丰富了AIE体系。配位金属纳米晶体的一些聚合诱导发射在有机溶剂或稀水溶液中进行。然而,由金属有机凝胶聚合诱导的ECL探索有限,现有的报道往往将金属有机凝胶作为新型共反应剂比如应用在三(2,2’-联吡啶)钌(II)-共反应剂(Ru(bpy)3 2+-coreactant)体系中增强发光强度,仍然难以克服钌配合物所存在的缺陷。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明提供了一种电极、包含该电极的生物传感器以及包含该生物传感器的试剂盒,以及提供所述电极、生物传感器、试剂盒在检测甲基转移酶中的应用,并同时提供了检测甲基转移酶的方法。本发明基于主客体作用和模拟酶介导的电催化信号放大,可实现碱基切除修复酶的低背景一步检测。
在本发明的第一方面,本发明提供了一种电极,其结构为β-CD/Ag-MOG/GCE,由银金属有机凝胶(Ag-MOG)、环糊精(β-CD)与玻碳电极(GCE)组成,其中,银金属有机凝胶、环糊精修饰在玻碳电极表面。
在本发明的一些实施方式中,可对玻碳电极进行预处理,比如修饰玻碳电极前,分别用1.0、0.3和0.05微米α-Al2O3粉抛光GCE电极,然后分别依次用乙醇和超纯水超声处理3分钟。
在本发明的一些实施方式中,所述银金属有机凝胶的制备方法包括:将硝酸银和硫代水杨酸分散在水中超声,然后加入氨水继续超声获得包含 Ag9NCs(即(NH4)9[Ag9(C7H4SO2)9])的溶液(黄色清晰溶液),取该溶液与乙醇摇匀,凝胶化获得Ag-MOG。在本发明的实施方式中,加入乙醇后, Ag9NCs的溶解度降低导致凝胶化。Ag9NCs聚集成胶状,具有高胶体稳定性。
在一些实施方式中,Ag-MOG通过以下方法制备得到:硝酸银(1毫摩尔,170毫克)和硫代水杨酸(1毫摩尔,155毫克)分散在6毫升的水中,超声 20分钟;将氨水(25%,0.5毫升)添加到上述混合物超声处理获得包含 Ag9NCs的黄色清晰溶液;然后用5.0mM Ag9NCs和70%乙醇(EtOH)在 20.0±0.1℃下轻轻摇匀,凝胶化得到Ag-MOG。
在本发明的一些实施方式中,为进一步使用,可以对Ag-MOG进行冻干处理,获得Ag-MOG粉。
在本发明的实施方式中,Ag-MOG的合成方法温和,在很低的反应温度、中性条件、较短的反应时间和常规的溶剂中实现,比如在一些实施方式中,反应温度为20.0±0.1℃,溶剂为水、乙醇,轻摇即可实现凝胶化易于操作,同时Ag-MOG是一种优秀的ECL发光体。
在本发明的第二方面,本发明提供了一种生物传感器,其包含上述第一方面中所述的β-CD/Ag-MOG/GCE电极。
在本发明的第三方面,本发明提供了制备上述第一方面所述β-CD/Ag-MOG/GCE电极地方法,其包括先将Ag-MOG滴加至玻碳电极表面,干燥后,再向玻碳电极表面滴加环糊精溶液。
比如,在一些实施方式中,将Ag-MOG和环糊精修饰至玻碳电极获得β-CD/Ag-MOG/GCE电极的过程中,先将Ag-MOG溶于超纯水中,然后滴加20微升至玻碳电极表面,干燥后,再向玻碳电极表面滴加20微升环糊精溶液。
在本发明的第四方面,本发明提供了上述第一方面的β-CD/Ag-MOG/GCE电极或者上述第二方面所述的生物传感器在体外检测甲基转移酶中的应用。
在本发明的一些实施方式中,所述甲基转移酶为M.SssI MTase。
在本发明的第五方面,本发明提供了一种试剂盒,其包括上述第一方面中所述的电极或者上述第二方面中所述的生物传感器。
在本发明的一些实施方式中,所述试剂盒中还含有双链DNA探针。
在本发明的实施方式中,本发明的试剂盒可用于检测甲基转移酶,探针可根据所检测的甲基转移酶进行设计。
比如,在本发明的一些实施方式中,本发明提供了检测甲基转移酶 M.SssI Mtase的探针,该为含有特异性识别序列5’-CCGG-3’并组装在磁珠 (MBs)上的杂交探针,简称MBs/dsDNA探针。
本发明提供了双链DNA探针的制备思路,包括:dsDNA的两条DNA 链为互补的ssDNA,DNA1含有特异性识别序列5’-CCGG-3’和3端生物素基团,DNA2含有特异性识别序列5’-CCGG-3’和3端Fc标签;通过特异性生物素-链霉亲和素相互作用,DNA1组装在链霉亲和素包覆的磁珠 (MBs)上,随后与DNA2杂交;
其中,所述探针5’到3’的序列为:
DNA1:5’-CAG TCC GGA GGT G-biotin-3’(SEQ ID NO.1)
DNA2:5’-CAC CTC CGG ACT G-Fc-3’(SEQ ID NO.2)。
在本发明的一些实施方式中,MBs/dsDNA探针的制备方法包括:将 DNA1和DNA2在杂交缓冲液(比如:含有10毫摩尔每升Tris、1.0毫摩尔每升EDTA和1.0摩尔每升NaCl的溶液,pH 7.4)中混合,在37℃条件下孵育30分钟进行DNA杂交,得到的DNA1/DNA2杂交(dsDNA)探针在使用前保存在4℃;取链霉亲和素修饰的磁珠,用洗涤缓冲液(比如:0.5摩尔每升NaCl、20毫摩尔每升Tris-HCl(pH 7.4)和1毫摩尔每升EDTA的溶液) 洗涤,PBS重悬;然后,将dsDNA探针添加到磁珠中通过生物素链霉亲和素的相互作用(比如在室温下作用30分钟)形成MBs/dsDNA探针。
在本发明的一些实施方式中,MBs/dsDNA探针可分散在磷酸缓冲液中,比如用洗涤缓冲液洗涤三次后,分散在100微升磷酸缓冲液中。
在本发明的一些实施方式中,本发明的MBs/dsDNA探针用于M.SssI MTase甲基化或限制性内切酶HpaII消化。
在本发明的一些实施方式中,检测甲基转移酶M.SssI Mtase时,在没有靶标M.SssI MTase的情况下,识别序列(5’-CCGG-3’)中CpG二核苷酸位点不能甲基化,导致dsDNA探针被HpaII消化;磁分离后,磁珠中释放的Fc通过主客体作用被环糊精识别,导致Fc猝灭ECL发射,产生低ECL 信号。
在本发明的一些实施方式中,检测甲基转移酶M.SssI Mtase时,当存在靶标M.SssI MTase的情况下,M.SssI MTase催化dsDNA探针中特定CpG 二核苷酸的甲基化,而甲基化的dsDNA探针无法被HpaII内切酶裂解,导致dsDNA探针残留在磁珠表面。因此,Fc标记的DNA2不能在上清液中用于ECL信号的猝灭,可以观察到ECL信号明显增强。
在本发明的第六方面,本发明提供了一种检测甲基转移酶的方法,其包括采用上述第一方面中所述的β-CD/Ag-MOG/GCE电极或者上述第二方面中所述的生物传感器进行检测;或者,其包括采用上述第五方面中所述的试剂盒进行检测。
在本发明的一些实施方式中,本发明提供了检测甲基转移酶M.SssI Mtase的方法,包括采用本发明第一方面中所述的β-CD/Ag-MOG/GCE电极作为生物传感器,或者直接使用包含本发明第一方面中所述的β-CD/Ag-MOG/GCE电极的生物传感器;将DNA底物设计为两条互补的 ssDNA链,DNA1含有特异性识别序列5’-CCGG-3’和3端生物素基团, DNA2含有特异性识别序列5’-CCGG-3’和3端Fc标签;通过特异性生物素-链霉亲和素相互作用,将DNA1组装在链霉亲和素包覆的磁珠上,随后与DNA2杂交形成含有特异性识别序列5’-CCGG-3’的dsDNA探针,用于M.SssI MTase甲基化或限制性内切酶HpaII消化;在没有靶标M.SssIMTase的情况下,识别序列(5’-CCGG-3’)中CpG二核苷酸位点不能甲基化,导致dsDNA探针被HpaII消化。磁分离后,MB中释放的Fc通过主客体作用被环糊精识别,导致Fc猝灭ECL发射,产生低ECL信号。当存在靶标M.SssI MTase的情况下,M.SssI MTase催化dsDNA探针中特定CpG二核苷酸的甲基化,而甲基化的dsDNA探针无法被HpaII内切酶裂解,导致 dsDNA探针残留在MB表面。因此,Fc标记的DNA2不能在上清液中用于ECL信号的猝灭,可以观察到ECL信号明显增强。
在本发明的实施方式中,为了更好地发挥本发明所述生物传感器的高性能,本发明优化了检测条件,这些条件包括但不限于甲基化时间、HpaII 浓度、HpaII裂解时间和主客体相互作用反应时间。
在本发明的一些实施方式中,甲基化时间为30-150分钟;HpaII浓度为20~100U每毫升;HpaII裂解时间为30-150分钟;主客体相互作用时间即β-CD/Ag-MOG/GCE与检测时上层清液的孵育时间为20-60分钟。
在本发明的一些实施方式中,评估了甲基化时间对甲基化过程的影响,将MBs/dsDNA探针与M.SssI MTase孵育30-150min,随着甲基化时间的增加,ECL响应逐渐增强,在120min时达到最大值。
在本发明的一些实施方式中,ECL强度随HpaII浓度从20~100U每毫升增加而减小,到80U每毫升浓度后逐渐稳定。ECL强度随HpaII裂解时间从30~150分钟逐渐减小,在120分钟后逐渐减小。
在本发明的一些实施方式中,随着β-CD/Ag-MOG/GCE与检测时上层清液的孵育时间从20到60分钟增加,ECL强度迅速降低,在50分钟时达到最大值。
与现有技术相比,本发明的有益效果包括:
本发明Ag-MOG的合成策略温和,易于操作,同时Ag-MOG是一种优秀的ECL发光体。本发明的电极或生物传感器检测灵敏度高、对于 M.SssI MTase具有良好的选择性,并且具有良好的稳定性、重复性,具有稳定且持续的ECL信号;在存在目标M.SssI MTase时Ag-MOG的强ECL 发射以及在没有目标时Fc的高猝灭可灵敏检测M.SssI MTase,检测限为 3.5×10-3U每毫升,对于复杂生物样品M.SssI MTase的检测准确度高。本发明的电极、生物传感器以及试剂盒具有应用广泛:可以用于M.SssI MTase 抑制剂的筛选以及对于生物样品的分析,在生物医学研究中具有广泛的潜在应用。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解,本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1:A为合成银金属有机凝胶示意图,B为用于M.SssI MTase活性测定的ECL生物传感器构建示意图;
图2为银金属有机凝胶的表征图,A为合成的银金属有机凝胶的X射线衍射图(XRD),B为合成的银金属有机凝胶的扫描电子显微镜(SEM) 图像,C为合成的银金属有机凝胶的透射电子显微镜(TEM)图像,D为合成的银金属有机凝胶的傅里叶变换红外光谱,E为合成的银金属有机凝胶的紫外可见漫反射光谱,F为合成的银金属有机凝胶在激发波长234nm处的光致发光光谱;
图3为银金属有机凝胶的X射线光电子能谱图(XPS),A为合成的银金属有机凝胶,B为Ag-MOG中银的高分辨率XPS图,C为银金属有机凝胶中硫的高分辨率XPS图,D为银金属有机凝胶中氮的高分辨率XPS 图;
图4为Ag-MOG-S2O8 2-体系的电致化学发光机理图;
图5为银金属有机凝胶的电致化学发光机理研究图,A为在0.1M PBS (pH 7.4)条件下,裸GCE(绿色)和AgMOG/GCE(红色)在电位范围为0~2V 时的CV曲线(上)和相应的ECL电位分布曲线(下);B为在含有10毫摩尔每升的TPrA的0.1M PBS(pH 7.4)条件下,裸GCE(绿色)和 AgMOG/GCE(红色)在电位范围为0~2V时的CV曲线(上)和相应的ECL电位分布曲线(下);C为在0.1M PBS(pH 7.4)条件下,裸GCE(绿色)和 AgMOG/GCE(红色)在电位范围为0~-2V时的CV曲线(上)和相应的ECL 电位分布曲线(下)。D为在含有10毫摩尔每升的S2O8 2-的0.1M PBS(pH 7.4) 条件下,裸GCE(绿色)和AgMOG/GCE(红色)在电位范围为0~-2V时的CV 曲线(上)和相应的ECL电位分布曲线(下)。
图6为在含有10毫摩尔每升S2O8 2-的0.1摩尔每升的PBS中的不同修饰电极的电致化学发光响应图,A为硫代水杨酸,B为Ag9NCs,C为 Ag-MOG;
图7为实验可行性分析表征图,A为在含有0.1摩尔每升KCl的5毫摩尔每升的Fe(CN)6 3-/4-中的不同修饰电极的电化学阻抗谱(EIS),a为裸玻碳电极(GCE),b为Ag-MOG/GCE,c为β-CD/Ag-MOG/GCE,d为存在100U mL-1M.SssI MTase和80U mL-1HpaII的情况下,释放的上清孵育的β-CD/Ag-MOG/GCE电极;B为不同修饰电极的电致化学发光响应图,a为裸玻碳电极(GCE),b为Ag-MOG/GCE,c为不存在目标M.SssI MTase只存在80U每毫升HpaII时,释放的上清孵育β-CD/Ag-MOG/GCE, d为存在100U每毫升M.SssI MTase和80U每毫升HpaII的情况下,释放的上清孵育的β-CD/Ag-MOG/GCE电极;
图8为实验条件优化图,A为甲基化时间的优化,B为HpaII浓度的优化,C为HpaII切割时间的优化,D为主客体作用时间的优化,误差棒代表三次独立实验的标准偏差;
图9为灵敏度实验结果表征图,A为用不同浓度的M.SssI MTase(从 a到j:0、0.05、0.1、0.5、1、5、20、50、100U每毫升)孵育的生物传感器的电化学发光(ECL)强度曲线,B为ECL强度和M.SssI MTase浓度的对数在0.05至100U每毫升的范围内之间的线性关系,检测条件:含有10毫摩尔每升的K2S2O8的0.1摩尔每升的pH为7.4的磷酸缓冲溶液;
图10为5-氮杂胞嘧啶(5-Aza)和5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-dc)对 M.SssIMTase相对活性的影响差异。A为5-氮杂胞嘧啶(5-Aza)对M.SssI MTase相对活性的影响,B为5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-dc)对M.SssI MTase相对活性的影响,M.SssI MTase的浓度保持为100U每毫升,误差棒代表三次独立实验的标准偏差;
图11为选择性和稳定性实验结果表征图,A图分别为100U每毫升的 Dam甲基转移酶,100U每毫升的HhaI甲基转移酶,误差棒代表三次独立实验的标准偏差;B图为在0~-2.0V连续15个周期的循环电位扫描下,所述ECL生物传感器的稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得,如无特殊说明,本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用,生物材料可购买获得或者根据特定试剂盒按照试剂盒说明书的方法提取得到。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例
使用Ag9NC合成Ag-MOG。首先,将硝酸银(1毫摩尔)和硫代水杨酸 (1毫摩尔)在室温下混合,然后加入氨水(25%,0.5毫升),得到Ag9NCs。在5.0毫摩尔每升的Ag9NCs中加入体积百分比为70%的乙醇(EtOH),形成Ag-MOG。加入乙醇后,Ag9NCs的溶解度降低可能导致凝胶化。Ag9NCs 聚集成胶状,从而形成了具有高胶体稳定性的MOG。
用于M.SssI MTase检测的电化学发光生物传感器原理如图1所示。将银金属有机凝胶(Ag-MOG)和环糊精(β-CD)修饰至玻碳电极获得β-CD/Ag-MOG/GCE电极。采用上述生物传感器,DNA底物设计为两条互补的ssDNA链,DNA 1含有特异性识别序列5’-CCGG-3’和3端生物素基团,DNA2含有特异性识别序列5’-CCGG-3’和3端Fc标签。通过特异性生物素-链霉亲和素相互作用,将DNA1组装在链霉亲和素包覆的磁珠 (MBs)上,随后与DNA2杂交形成含有特异性识别序列5’-CCGG-3’的 dsDNA探针,用于M.SssI MTase甲基化或限制性内切酶HpaII消化。在没有靶标M.SssI MTase的情况下,识别序列(5’-CCGG-3’)中CpG二核苷酸位点不能甲基化,导致dsDNA探针被HpaII消化。磁分离后,MB中释放的Fc通过主客体作用被环糊精识别,导致Fc猝灭ECL发射,产生低 ECL信号。当存在靶标M.SssI MTase的情况下,M.SssI MTase催化dsDNA 探针中特定CpG二核苷酸的甲基化,而甲基化的dsDNA探针无法被HpaII 内切酶裂解,导致dsDNA探针残留在MB表面。因此,Fc标记的DNA2 不能在上清液中用于ECL信号的猝灭,可以观察到ECL信号明显增强。
具体实施过程:
Ag-MOG的合成:硝酸银(1毫摩尔,170毫克)和硫代水杨酸(1毫摩尔, 155毫克)分散在6毫升的水,超声20分钟。将氨水(25%,0.5毫升)添加到上述混合物超声处理获得包含Ag9NCs的黄色清晰溶液。然后用5.0毫摩尔每升Ag9NCs和70%乙醇(EtOH)在20.0±0.1℃下轻轻摇匀,凝胶化得到Ag-MOG。为进一步使用,对Ag-MOG进行冻干处理,得到Ag-MOG 粉。
MBs/dsDNA探针的合成:将DNA1和DNA2在杂交缓冲液(10毫摩尔每升Tris,1.0毫摩尔每升EDTA,1.0摩尔每升NaCl,pH 7.4)中混合, 在37℃条件下孵育30分钟进行DNA杂交,得到的DNA1/DNA2杂交 (dsDNAs)在使用前保存在4℃。取10微升链霉亲和素修饰的磁珠,用50 微升洗涤缓冲液(0.5摩尔每升NaCl、20毫摩尔每升Tris-HCl(pH 7.4)和1 毫摩尔每升EDTA)洗涤3次,用190微升PBS重悬。然后,将10微升10 微摩尔每升dsDNA探针添加到磁珠中通过生物素链霉亲和素的相互作用在室温下30分钟形成MBs/dsDNA探针。用洗涤缓冲液洗三次,获得的 MBslinked dsDNA探针分散在100微升磷酸缓冲液中。
探针5’到3’的序列为
DNA1:5’-CAG TCC GGA GGT G-biotin-3’(SEQ ID NO.1)
DNA2:5’-CAC CTC CGG ACT G-Fc-3’。(SEQ ID NO.2)
电化学发光生物传感器的制备:电化学发光生物传感器是构建在GCE 电极上。电极在修饰之前,分别用1.0、0.3和0.05微米α-Al2O3粉抛光GCE 电极,然后分别依次用纯水和乙醇超声处理3分钟。将20微升Ag-MOG 溶液(0.5毫克每毫升,溶剂为超纯水)滴加到GCE表面上以获得 Ag-MOG/GCE。在室温下干燥后,将20微升的β-CD溶液(3毫摩尔每升,溶剂为超纯水)滴在Ag-MOG/GCE上以获得β-CD/Ag-MOG/GCE。
UDG和抑制剂分析的电化学发光检测:将10μL MBs/dsDNA探针添加到含有不同浓度M.SssI MTase和1×NEBuffer 2以及160微摩尔每升 SAM37℃孵育2h。磁分离法去除上清液,用0.5摩尔每升NaCl,20毫摩尔每升Tris-HCl(pH 7.4),1毫摩尔每升EDTA洗涤缓冲液洗涤。随后,将磁珠连接的dsDNA探针与含有80U每毫升HpaII限制性内切酶的 CutSmart缓冲液在37℃孵育2h。然后用磁铁分离上清液,将上清液加入准备好的传感器中孵育50min。ECL测定在含10毫摩尔每升K2S2O8的PBS 溶液(pH 7.4)中进行。M.SssI MTase抑制试验采用了与M.SssI MTase试验类似的方法,只是不同浓度的抑制剂与含有100U每毫升M.SssI MTase的反应缓冲液预混合。
实验结果:
1、材料的表征
本实施例使用X射线衍射图(XRD)研究了合成的Ag-MOG的晶体结构(图2A)。在2到40度的宽范围内观察到各种尖峰,表明所获得的 Ag-MOG的非晶态性质。Ag-MOG的扫描电子显微镜(SEM)(图2B)和透射电子显微镜(TEM)(图2C)表明该凝胶由纠缠纤维组成。利用傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)验证了簇内和簇间多重相互作用(特别是氢键)的存在。从图2D可以看出,凝胶化后C=O不对称拉伸从1680cm-1向1665cm-1蓝移, -OH在3200cm-1处的峰值变宽。C=O在1377cm-1处的对称拉伸消失,在 1570-1235cm-1范围内出现了一些新的峰值。这些变化可以归因于氢键的形成,包括邻近的Ag9NCs之间或Ag9与溶剂分子之间的O-H··O键,以及NH4 +与Ag9NCs之间的N-H··O键。紫外可见漫反射光谱(DRS)可以提供关于固体不同轨道的电子跃迁和聚合物的带隙能的信息。Ag-MOG的 DRS在可见区表现出较宽的吸收范围(图2E)。Ag-MOG的带隙可以根据公式Eg(eV)=hc/λ由吸收边得到,Ag-MOG的带隙计算为2.48eV。进一步测量了AgMOG的光致发光(PL)光谱(图2F)。Ag-MOG在234nm激发波长下具有较宽的发光光谱,峰值发射为575nm。
用X射线光电子能谱(XPS)分析Ag-MOG的表面化学成分(图3)。如图3A,在XPS图谱观察到明显碳(C 1s)氧(O 1s),硫(S 2p)和氮(N 1s)和银 (Ag 3d)信号的峰值,证明在Ag-MOG中存在大量的Ag、C、O、N元素。凝胶和粉状Ag9 NCs从图3B中的Ag 3d5/2和Ag 3d3/2中得到了非常相似的信号,这表明Ag9NCs在凝胶化过程中没有发生化学或结构上的转变。
2、银金属有机凝胶的电致化学发光机理研究
为了研究Ag-MOG的ECL机制,测定了裸玻碳电极GCE和Ag-MOG 修饰的GCE的ECL和循环伏安曲线。如图5A和B,在从0到2V的电压范围内,无论是在PBS或PBS+TPrA的反应溶液中,裸GCE(图5A和 B,绿线)与Ag-MOG/GCE(图5A和B,红线)的ECL强度都很小,表明 Ag-MOG的电致化学发光不是基于阳极共反应剂途径。图5C显示了裸 GCE(图2C,绿线)和Ag-MOG/GCE(图5C,红线)在0.1M pH 7.4PBS中,电压范围为0~-2V的循环伏安和ECL曲线。裸GCE在PBS中没有明显的氧化还原峰(图2C,上方绿线)和ECL信号(图5C,下方黑线)。而Ag-MOG 的循环伏安曲线还原峰(图5C,上方红线)位于-1.35V左右,显示出 Ag-MOG较弱的还原过程,ECL信号极弱(图5C,下方红色)。在S2O8 2-(图 5D)存在下,Ag-MOG CV曲线还原峰(图5D,上方红线)位于-1.35V左右,裸GCE(图5D,上方绿线)显示Ag-MOG的还原过程。Ag-MOG的ECL起始电压为-1.1V,此时将产生阴离子自由基(图5D,下方红线)。当扫描到更负电位时,观察到ECL变化,ECL最大值为-1.7V,表明将产生更多 Ag-MOG·-自由基。S2O8 2-中Ag-MOG的ECL强度比裸GCE(图5D,下方绿线)和不含S2O8 2-的Ag-MOG(图5C,下方红线)分别高60倍和2000倍。这些结果表明,S2O8 2-在电还原过程中产生S2O8 2·-负离子自由基。
图4示出了Ag-MOG/S2O8 2-体系的ECL机制。扫描过程中,Ag-MOG 氧化形成阴离子自由基Ag-MOG·-。与此同时,电还原共反应剂S2O8 2-产生S2O8 2·-阴离子自由基。随后S2O8 2·-阴离子自由基可以产生一种很强的氧化剂SO4 ·-。然后SO4·-自由基向Ag-MOG·-注入一个洞生成一个激发态 Ag-MOG*。当Ag-MOG*衰变回到基态时,观察到明显的ECL发射。当 Fc加入反应体系时,S2O8 2-与Fc发生反应,产生低ECL信号。
图6研究了Ag-MOG的聚集诱导电化学发光。虽然硫代水杨酸(图6A) 和Ag9NCs(图6B)的ECL强度可以达到380au和2200a.u.,但信号不稳定,不适合实际应用。相比之下,Ag-MOG显示了非常强而稳定的ECL信号 (12000au,图6C)。Ag-MOG修饰电极的ECL发射发生在-1.35V,Ag-MOG 修饰电极在含有10毫摩尔每升K2S2O8的PBS(pH 7.4)溶液中的ECL强度分别是H2mba(硫代水杨酸)和Ag9NCs的32和5.5倍。特别是Ag-MOG 修饰的GCE的ECL强度大于Ag9NCs修饰的GCE,说明Ag9NCs凝胶化后,Ag-MOG的ECL强度可以增强。
3、原理的实验验证
为了证明本技术方案的可行性,本实施例通过电化学阻抗谱(EIS) 来表征了修饰电极在5毫摩尔每升[Fe(CN)6]3-/4-溶液中不同阶段的电化学行为。裸GCE显示一个小半圆直径和长尾的电荷转移电阻(Rct)250Ω,表明 [Fe(CN)6]3-/4-在电极表面的扩散(图7A,曲线a)。当Ag-MOG包覆在GCE 上时,由于AgMOG电导率较小,比裸玻碳电极(GCE)(图7A,曲线a)相比,电荷转移电阻增加到586Ω曲线(图7A,曲线b)。当β-CD组装到 Ag-MOG/GCE上时,由于环糊精不导电,电荷转移电阻进一步增加到 851Ω(图7A,曲线c)在β-CD/Ag-MOG/GCE表面上组装与100UmL-1 M.SssI MTase和80U mL-1HpaII反应的MBs/dsDNA探针时Rct进一步增加到1352Ω,这可以通过dsDNA探针中带负电荷的磷酸盐骨架与 [Fe(CN)6]3-/4-之间的静电排斥效应来解释。
利用电化学发光方法(ECL)探讨了不同修饰电极的生物传感器的可行性。在含有10毫摩尔每升K2S2O8的PBS(pH 7.4)溶液中,与裸GCE(280 au)相比(图7B,曲线a),Ag-MOG修饰的GCE上观察到一个高ECL信号 (10660au)(图7B,曲线b),表明Ag-MOG可能是一种优秀的ECL发光体。在M.SssI MTase存在的情况下,β-CD/Ag-MOG/GCE与dsDNA探针上清孵育,与没有M.SssI MTase(2200au)(图7B,曲线c)的dsDNA探针释放 Fc上清相比,可以观察到较大的ECL强度(9670au)(图7B,曲线d)。这些结果表明,该ECL生物传感器可用于M.SssI MTase的检测。
4、实验条件优化
为了保证ECL生物传感器的高性能,优化了甲基化时间、HpaII浓度、 HpaII裂解时间和主客体相互作用反应时间等实验条件(图8)。为了评估甲基化时间对甲基化过程的影响,将MBs/dsDNA探针与M.SssI MTase孵育 30-150min(图8A)。随着甲基化时间的增加,ECL响应逐渐增强,在120min 时达到最大值,因此在后续的研究中选择120min为最佳甲基化时间。进一步优化了HpaII内切酶的浓度和裂解时间。优化HpaII浓度(图8B)和裂解时间(图8C),ECL强度随HpaII浓度从20~100U每毫升增加而减小,到80U每毫升浓度后逐渐稳定。ECL强度随HpaII裂解时间从30~150分钟逐渐减小,在120分钟后逐渐减小,因此后续实验选用80U每毫升HpaII 和120分钟HpaII裂解时间。如图8D,随着β-CD/Ag-MOG/GCE与上层清液的孵育时间从20到60分钟,ECL强度迅速降低在50分钟时达到一个最大值。因此,在随后的研究中选择50分钟的主客体作用反应时间。
5、灵敏度实验
为了评估本技术方案检测M.SssI MTase的灵敏度,在优化的实验条件下,使用ECL生物传感器在含10毫摩尔每升K2S2O8的0.1摩尔每升PBS (pH为7.4)中测量不同浓度的M.SssI MTase。如图9A所示,ECL强度随 M.SssI MTase浓度从0.05到100U每毫升的增加而逐渐增强。在0.05~100 U每毫升范围内,ECL强度与M.SssI MTase浓度的对数呈线性关系(图9B)。回归方程为IECL=5328+2119log10C(R2=0.9959),其中IECL为ECL强度, C为M.SssIMTase(U每毫升)的浓度。基于空白响应的3倍标准偏差,该生物传感器的检测限为3.5×10- 3U每毫升。提出ECL生物传感器的敏感性优于所报道的M.SssI MTase测定方法,比电化学法高7.1倍,比电化学发光法高8.6倍,比光电法高10倍,比荧光法高40倍,比比色法高714.3倍。这种生物传感器的高灵敏度可能归因于(1)在存在M.SssI MTase时 Ag-MOG的强ECL发射;(2)在没有目标M.SssI MTase时Fc的高猝灭。
6、M.SssI MTase抑制剂实验
为了验证所提出的用于M.SssI MTase抑制实验的电化学发光生物传感器的可行性,使用5-氮杂胞嘧啶(5-Aza)和5-氮杂-2'-脱氧胞苷 (5-Aza-dc)作为模型抑制剂。M.SssI MTase的相对活性(RA)根据 计算,No代表没有M.SssI MTase时的ECL强度,Nt 代表在100U每毫升M.SssI MTase存在时的ECL强度,Ni代表在100U 每毫升M.SssI MTase和抑制剂同时存在时的ECL强度。抑制剂的抑制效率可以表示为最大抑制浓度一半(IC50),它表示降低50%酶活性所需的抑制剂浓度。如图10A所示,M.SssI MTase的相对活性随着5-Aza浓度的增加而降低,且呈剂量依赖性。计算出IC50值为1.36微摩尔每升,与电化学传感器测得的值(2.4微摩尔每升)一致。从图9B中可以看出,M.SssI MTase的相对活性随着5-Aza-dC浓度从0增加到2微摩尔每升而降低,且呈剂量依赖性。计算得出IC50值为0.69微摩尔每升,与血糖仪作为信号传感器得到的值(0.67微摩尔每升)一致。这些结果清楚地表明,所提出的ECL生物传感器可用于筛选M.SssI MTase抑制剂,在药物发现方面具有很大的潜力。
7、电化学生物传感器的重现性和稳定性实验
为了评估本技术方案检测M.SssI MTase的特异性,本实施例使用DNA 腺嘌呤MTase(Dam)和HhaI MTase,研究了ECL生物传感器的选择性。 Dam MTase可以甲基化识别序列5’-GATC-3'内的腺嘌呤残基,HhaI MTase 催化序列5’-GCGC-3’内胞嘧啶残基的甲基化。如图10A所示,在HhaI MTase(图11A,绿色柱)或Dam MTase(图11A,红色柱)存在时,可以观察到极低的化学发光信号,而M.SssI MTase存在时则可以观察到高的ECL 信号(图11A,蓝色柱)。这可以解释为HpaII内切酶识别序列5-CCGG-3’中的CpG二核苷酸位点不能被HhaI或Dam MTase甲基化。这些结果表明,该生物传感器对M.SssI MTase具有良好的选择性。随后,通过对100U每毫升M.SssI MTase在0~-2V连续15个周期内的测量,考察ECL生物传感器的稳定性。即使在15个CV周期后,仍可观察到稳定且持续的ECL 信号,其相对标准偏差(RSD)为1.40%(图11B)。通过测量相同的M.SssI MTase(100U每毫升)在相同条件下制备的三个电极,研究了ECL生物传感器的再现性。测定的RSD为0.39%,表明该ECL生物传感器用于M.SssI MTase检测具有良好的重复性。
8、生物样品实验
为了评估本技术方案所提出的生物传感器对真实复杂生物样品分析的能力,本实施例使用人体血清为真实样品进行了回收实验。定量回收率为97.9%-119.0%,RSD为3.1%-4.9%。这些结果表明,所提出的ECL 生物传感器可用于复杂生物样品中M.SssIMTase活性的准确检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 一种电极、包含该电极的生物传感器的制备及其在检测甲基转移酶中的应用
<130> 202028561
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cagtccggag gtg 13
<210> 2
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cacctccgga ctg 13
Claims (11)
1.一种电极的制备方法,其特征在于,所述电极的结构为β-CD/Ag-MOG/GCE,由银金属有机凝胶、环糊精与玻碳电极组成,其中,银金属有机凝胶、环糊精修饰在玻碳电极表面;
具体方法包括:
先将银金属有机凝胶滴加至玻碳电极表面,干燥后,再向玻碳电极表面滴加环糊精溶液。
2.根据权利要求1所述的电极的制备方法,其特征在于,所述银金属有机凝胶的制备方法包括:将硝酸银和硫代水杨酸分散在水中超声,然后加入氨水继续超声获得包含Ag9NCs的溶液,取该溶液与乙醇摇匀,凝胶化获得银金属有机凝胶。
3.一种生物传感器,其包含权利要求1所述的的电极。
4.权利要求1所述的电极或者权利要求3所述的生物传感器在体外检测甲基转移酶中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述甲基转移酶为M.SssI MTase。
6.一种试剂盒,其包括权利要求1所述的电极或者权利要求3所述的生物传感器。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括双链DNA探针,所述双链DNA探针为含有特异性识别序列5’-CCGG-3’并组装在磁珠上的杂交探针。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述双链DNA探针的制备方法包括:两条DNA链为互补的ssDNA,DNA1含有特异性识别序列5’-CCGG-3’和3端生物素基团,DNA2含有特异性识别序列5’-CCGG-3’和3端Fc标签;通过特异性生物素-链霉亲和素相互作用,将DNA1组装在链霉亲和素包覆的磁珠上,随后与DNA2杂交。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述探针5’到3’的序列为:
DNA1:5’-CAG TCC GGA GGT G-biotin-3’;
DNA2:5’-CAC CTC CGG ACT G-Fc-3’。
10.一种检测甲基转移酶的方法,其包括采用权利要求1所述的电极或者权利要求3中所述的生物传感器进行检测。
11.一种检测甲基转移酶的方法,其包括采用权利要求6-9所述的试剂盒。
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