JP4886679B2 - 生体分子中のメチル化の配列特異的検出 - Google Patents

生体分子中のメチル化の配列特異的検出 Download PDF

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Description

本発明は、（ａ）生体分子をＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼと、前記メチルトランスフェラーゼの検出可能な補助因子の存在下で接触させること；および（ｂ）前記メチルトランスフェラーゼの認識配列の修飾が前記認識配列でのメチル化の非存在を示すことである、前記メチルトランスフェラーゼの認識配列が補助因子またはその誘導体で修飾されているかどうかを検出することを含む、生体分子中の配列特異的メチル化を検出するための方法に関する。本発明はまた、アデニン環の６位または７位と結合するかまたはアジリジン環と結合するレポーター基を有するＮ−アデノシルアジリジン誘導体であることを特徴とする、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼに特異的な補助因子に関する。さらに、本発明は、本発明の補助因子および通常はＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）を補助因子として用いるメチルトランスフェラーゼの複合体に関する。加えて、本発明は、本発明の補助因子または本発明の複合体を含む診断組成物に関する。最後に、本発明は、ＤＮＡ分子中の配列特異的メチル化を検出するための本発明の補助因子または本発明の複合体の使用に関する。
いくつかの文書が本明細書の本文全体で引用される。引用される文書（仕様書、取扱説明書などを含む）の開示内容は参照により本開示に含まれる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施されたおよび本明細書全体で引用された任意の組み合わせの段階（一段階のみを含む）はまた、細胞抽出物を用いてまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施されうる。
本発明は、ヒトで見出されるＤＮＡメチル化を用いて例証される。しかし、他の生物におけるＤＮＡメチル化、およびＲＮＡメチル化およびタンパク質メチル化を検出するのにも用いることができる。
ＤＮＡメチル化はほとんどすべての生物で見出される（イェルチ（Ｊｅｌｔｓｃｈ），（２００２） ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ３，２７５−２９３）。ＤＮＡは、シトシン、アデニン、チミンおよびグアニンに加えて、メチル化核酸塩基５−メチルシトシン（５−ｍＣｙｔ）、Ｎ４−メチルシトシン（４−ｍＣｙｔ）またはＮ６−メチルアデニン（６−ｍＡｄｅ）を含みうる。これらのメチル化核酸塩基は、補助因子Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）からＤＮＡ認識配列内のシトシンのＣ５炭素、シトシンのＮ４窒素またはアデニンのＮ６窒素への活性化メチル基の転移を触媒するＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＴアーゼ）によって形成される（チェン（Ｃｈｅｎｇ），（１９９５） Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４，２９３−３１８）。特定のヌクレオチド配列がメチル化または非メチル化型で存在しうるため、ＤＮＡメチル化をＤＮＡの情報量の増加と見なすことができ、それは幅広い生物学的機能を果たす。原核生物ではＤＮＡメチル化は、内因性制限エンドヌクレアーゼからの宿主ゲノムの保護、ＤＮＡミスマッチ修復、遺伝子発現およびＤＮＡ複製の調節に関わる。真核生物ではＤＮＡメチル化は遺伝子サイレンシング（バード（Ｂｉｒｄ），（２００２） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６，６−２１ 、ゲノム刷り込み（フェイル（Ｆｅｉｌ）およびコスラ（Ｋｈｏｓｌａ），（１９９９） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１５，４３１ −４３５）、Ｘ染色体不活性化（パニング（Ｐａｎｎｉｎｇ）およびイーニッシュ（Ｊａｅｎｉｓｃｈ），（１９９８） Ｃｅｌｌ ９３，３０５−３０８）、ゲノム内寄生体のサイレンシング（ヨダー（Ｙｏｄｅｒ），（１９９７） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１３，３３５−３４０）、および発がん（ベイリン（Ｂａｙｌｉｎ），（１９９８） Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７２，１４１−１９６；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）およびレアード（Ｌａｉｒｄ），（１９９９） Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１，１６３−１６７）といった重要な調節過程に関与する。がん治療の成功は、一般的に、大体において腫瘍形成の早期診断に依存する。したがって、一般的な腫瘍形成の早期検定法を開発する重要な必要性がある。
いくつかの型のがんは遺伝子発現の調節における変化が随伴すると考えられている。多くの場合、遺伝子発現の変化は、染色体ＤＮＡのメチル化パターンの変化に遡ることができる。長い間、ＤＮＡメチル化は、遺伝子のコード機能を変化させずに遺伝子発現を変化させる機構であると知られていた。メチル化反応は、酵素ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼの溝内のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）からのメチル基の転移の結果５−メチルシトシン（５−ｍＣｙｔ）を形成することを含む。興味深いことに、５−メチルシトシンは染色体ＤＮＡ中で均一に分布するのでなく、ＣｐＧジヌクレオチドに位置する傾向がある。哺乳類ゲノムは、大部分メチル化されている孤立したＣｐＧジヌクレオチドを少数しか含まない（ラーセン（Ｌａｒｓｅｎ），他，（１９９２） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３，１０９５−１１０７）。より頻繁に観察されるのは、哺乳類遺伝子の約４０％のプロモーター領域およびエクソン領域に存在する、ＣｐＧのジヌクレオチドクラスターすなわち「ＣｐＧ島」である（ガーディナー・ガーデン（Ｇａｒｄｉｎｅｒ−Ｇａｒｄｅｎ）およびフロマー（Ｆｒｏｍｍｅｒ），（１９８７） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，２６１−２８２）。ＣｐＧ島は、ゲノムと相対的にシトシンおよびグアニンに富む、典型的には長さ０．２ないし約１ｋｂの、ゲノム中の領域である。ＣｐＧ島は、すべてのハウスキーピング遺伝子および多数の組織特異的遺伝子の５’末端、および一部の組織特異的遺伝子の３’末端に随伴することが示されている。５’ＣｐＧ島は５’隣接ＤＮＡ、エクソンおよびイントロンを通じて広がりうるが、一方、３’ＣｐＧ島の大部分はエクソンを伴うように見える。一部の注目すべき例外を除いて、ＣｐＧ島は一般的に、異なる種において等価な遺伝子の転写単位と相対的に同一位置に見出される（ガーディナー・ガーデン（Ｇａｒｄｉｎｅｒ−Ｇａｒｄｅｎ）およびフロマー（Ｆｒｏｍｍｅｒ），（１９８７） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，２６１−８２）。
ある遺伝子のＣｐＧ島内に含まれるシトシン残基のメチル化は、遺伝子活性と逆相関させられている。これは、クロマチン構造の局所的凝縮、転写因子−ＤＮＡ結合の阻害、またはメチル化ＣｐＧと特異的に相互作用するタンパク質を動員して転写因子結合を間接的に妨げることによる、といったさまざまな機構による遺伝子発現の低下に繋がりうることが考えられる。メチル化の増加はまた、たとえば、腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域に影響しうる。そのような領域でのメチル化の増加は、正常遺伝子発現の進行性低下に繋がる可能性があり、結果として選択的な増殖優位性を持つ細胞集団を生じうる。
しかし、がん細胞で観察されるのは単にＤＮＡのメチル化の増加ではない。むしろ、ＤＮＡのメチル化パターンの明らかな変化は、細胞における遺伝子発現を変化させおよび発がんを誘導するのに十分でありうる。実際、がん細胞は、その健常前駆細胞のメチル化パターンとは異なる、ＣｐＧ−メチル化の特徴的なパターンを伴うことが示されている。ゆえに、健常細胞および疾患細胞の染色体ＤＮＡの特異的メチル化パターンの知識は、がんのような疾患の検出のために使用されうるマーカーを開発するために利用できる。
ＤＮＡ中のメチル化領域のマッピング（ライン（Ｒｅｉｎ）他，（１９９８） ＮＵＣ１ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６，２２５５−２２６４）は、メチル化感受性制限酵素は一つ以上のメチル化ＣｐＧ配列を含む配列を切断できないことに基づく、サザンハイブリダイゼーション法に主に依存してきた。この方法は、ＣｐＧ島の全体的なメチル化状態の評価を、一部の定量分析を含め提供するが、しかし相対的に低感度であり、多量の試料を必要とし、およびメチル化感受性制限酵素によって認識される配列内に見出されるＣｐＧ配列についての情報しか与えることができない。
より高感度な手法は、メチル化感受性酵素およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の組み合わせを用いることによるメチル化パターンの検出に基づく。酵素によるＤＮＡの消化後、ＰＣＲが制限配列に隣接するプライマーから、ＤＮＡ切断がメチル化によって妨げられた場合に限って増幅する。サザンに基づく手法のように、この方法はメチル化感受性制限部位中のＣｐＧ−メチル化しか監視できない。制限エンドヌクレアーゼの使用を回避するもう一つの方法は、すべての非メチル化シトシンをウラシルへ変換する、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理である。変化したＤＮＡを増幅および配列決定して、すべてのＣｐＧ配列のメチル化状態を示す。代替的に、増幅されたＤＮＡをハイブリダイゼーション実験で分析できる。
先行技術の手法の主な不都合は、天然ＤＮＡの最初の修飾は検出可能な標識の組み込みに直接結びつかず、このことが以降の検出段階に適用可能な方法を強く制限することである。
近年、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来ＤＮＡ（アデニン−６）−メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＴａｑＩ）のための新規に設計された蛍光補助因子を用いる、ＤＮＡの配列特異的標識化のための新規の手法が紹介されている（プルイェバリシク（Ｐｌｊｅｖａｌｊｃｉｃ）他，（２００３） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，３４８６−３４９２）。もちろん、Ｍ．ＴａｑＩは二本鎖５’−ＴＣＧＡ−３’ＤＮＡ配列内のアデニンの環外アミノ基の、補助因子Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）のメチル基への求核攻撃を触媒し、配列特異的および塩基特異的なメチル基転移に繋がる。非常に重要なことに、Ｍ．ＴａｑＩは、他のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＴアーゼ）のように、一個のメチル基を標的塩基へ転移できるだけであり、および完全にメチル化された認識配列を有するＤＮＡはさらに修飾されない。
天然補助因子Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）のメチオニン側鎖の、アジリジニル残基による置換は、Ｍ．ＴａｑＩに触媒される求核開環およびＤＮＡ中の標的アデニンへのヌクレオシド全体のカップリングに繋がる。アデノシル部分は、補助因子結合のための分子アンカーである。柔軟なリンカーを介したアデノシル部分の８位へのフルオロフォアの結合は、補助因子結合を遮断しない。新規に設計された補助因子８−アミノ[１"−（Ｎ"−ダンシル）−４"−アミノブチル]−５’−（１−アジリジニル）−５’−デオキシアデノシンは、Ｍ．ＴａｑＩに触媒される反応においてＤＮＡを配列特異的に標識化するのに用いることができる。
ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼによって触媒される標識化反応のための新規に設計された蛍光補助因子を、ＣｐＧ島のＣｐＧモチーフを包含する認識配列と用いることが望ましい。シトシン残基のメチル化は、標識化された補助因子の酵素的カップリングを遮断するはずであるため、標識化反応の成功は非メチル化ＣｐＧ配列を示す一方、標識化された補助因子をカップリングすることの失敗はメチル化ＣｐＧ配列を示す。このように、この反応を用いて染色体ＤＮＡのメチル化状態を観測できる。
ヘモフィルス・ヘモリティカス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）は、必要な特異性を有しおよび二本鎖ＤＮＡ配列５’−ＧＣＧＣ−３’内の最初のシトシンをメチル化するＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼＭ．ＨｈａＩを天然に産生する。しかし、Ｍ．ＨｈａＩの検出可能なＮ−アデノシル−アジリジン補助因子または誘導体は本分野で入手できない。したがって、本明細書の教示の基礎を成す技術的問題は、Ｍ．ＨｈａＩおよび他のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼのための検出可能な補助因子、およびＤＮＡのメチル化状態における変化を検出するための方法を提供することであった。
この技術的問題への解決は、請求項に特徴づけられる実施形態を提供することによって達成される。
したがって、本発明は、Ｎ−アデノシルアジリジン誘導体が式（Ｉ）で表されることを特徴とする、（ａ）生体分子をＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼと、前記メチルトランスフェラーゼの検出可能な補助因子の存在下で接触させること；および（ｂ）前記メチルトランスフェラーゼの認識配列の修飾が前記認識配列でのメチル化の非存在を示すことを特徴とする、前記メチルトランスフェラーゼの認識配列が補助因子またはその誘導体で修飾されているかどうかを検出することを含む、生体分子中の配列特異的メチル化を検出するための方法に関し、
Figure 0004886679
 ここで
ＷはＮおよびＣＨから選択され、
ＸはＮまたはＣＲ1であり、
ＹはＮＨ2またはＮＨＲ2であり、
ＺはＨ、Ｒ3またはＣＨ2ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ2）であり、
ただし
ＸがＣＲ1である場合、ＹはＮＨ2でありおよびＺはＨまたはＣＨ2ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ2）であり、
ＸがＮでありおよびＹがＮＨＲ2である場合、ＺはＨまたはＣＨ2ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ2）であり、
ＸがＮでありおよびＹがＮＨ2である場合、ＺはＲ3であり、
Ｒ1は−（ＣＨ2）nＲ4、−（ＣＨ＝ＣＨ）m（ＣＨ2）nＲ4、−（ＣＨ2）o（ＣＨ＝ＣＨ）m（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ≡Ｃ）m（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ≡Ｃ）m（Ｃ6Ｈ4）o（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ6Ｈ4）m（ＣＨ2）nＲ4、−ＣＯ（ＣＨ2）nＲ4および−Ｓ（ＣＨ2）nＲ4から選択され；
Ｒ2は−（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ6Ｈ4）m（ＣＨ2）nＲ4、−ＣＯ（Ｃ6Ｈ4）m（ＣＨ2）nＲ4および−ＣＯ（ＣＨ2）nＲ4から選択され；
Ｒ3は−（ＣＨ2）nＲ4、−（ＣＨ＝ＣＨ）m（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ≡Ｃ）m（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ6Ｈ4）m（ＣＨ2）nＲ4および−ＣＯＮＨ（ＣＨ2）nＲ4から選択され；
Ｒ4は−ＮＨＲ5、−ＮＨＣＯ（ＣＨ2）pＳＲ5、−ＳＲ5、−ＯＲ5、−０（Ｃ2Ｈ5Ｏ）n（Ｃ2Ｈ5）ＮＨＲ5、−ＣＨ2ＮＨＮＨＲ5、−ＮＨＣＯＣＨ（ＣＨ2ＳＨ）ＮＨＲ5および−ＣＯＮＨＲ5から選択され；
Ｒ5はフルオロフォア、アフィニティタグ、架橋剤、発色団、タンパク質、ペプチド、随意的に修飾されうるアミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、糖質、脂質、ＰＥＧ、トランスフェクション試薬、ビーズ、介入剤、核酸切断試薬およびナノ粒子（たとえば金クラスター）から選択され、およびｎ、ｍ、ｏおよびｐは独立して０または１ないし５０００の整数から選択される。
「配列特異的メチル化を検出する」の語句は、本発明全体で、メチルトランスフェラーゼ（ＭＴアーゼ）の認識配列内の受容体部位がメチル基の付加によって修飾されているかどうかを評価することを意味する。好ましくは、前記受容体部位は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの認識配列の一部である。より好ましくは、前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼはＭ．ＨｈａＩおよびＭ．ＴａｑＩ、Ｍ．ＢｓｅＣＩおよびＭ．ＳｓｓＩから選択される。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼがＭ．ＨｈａＩである場合、受容体部位はＭ．ＨｈａＩのより大きい５’−ＧＣＧＣ−３’認識配列に包含される５’−ＣＧ−３’配列内のシトシンであることが好ましい。
「生体分子」の語は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは（ポリ）ペプチドを意味する。「（ポリ）ペプチド」の語は代替的にペプチドをまたはポリペプチドをいう。ペプチドは従来、共有結合した最大３０残基のアミノ酸であり、一方ポリペプチド（「タンパク質」ともいう）は３１以上のアミノ酸残基を含む。好ましくは、生体分子は染色体またはゲノムＤＮＡである。
「生体分子をメチルトランスフェラーゼと接触させる」の語は、生体分子をメチルトランスフェラーゼと接するに至らせることを意味する。一般的に、これは、生体分子を含む試料へメチルトランスフェラーゼを加えることによってなされうる。代替的に、生体分子を含む試料を、メチルトランスフェラーゼを含む溶液へ加えることができる。当業者は、特定の緩衝液条件が最適酵素活性に必要でありうることを理解している。これらの条件は、当業者に公知であるかまたは酵素活性をさまざまな検定条件下で試験することによって得ることができる。
通常、生体分子は、メチルトランスフェラーゼの補助因子の存在下で、メチルトランスフェラーゼによって接触させられる。好ましくは、前記補助因子は、式（Ｉ）のＮ−
アデノシルアジリジン誘導体である。
「メチルトランスフェラーゼ」の語は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）から基質へ活性化メチルを通常転移する酵素をいう。好ましくは、メチルトランスフェラーゼＤＮＡ、ＲＮＡまたは（ポリ）ペプチドをメチル化できる酵素である。より好ましくは、メチルトランスフェラーゼは、Ｍ．ＨｈａＩ、Ｍ．ＴａｑＩ、Ｍ．ＢｓｅＣＩおよびＭ．ＳｓｓＩから選択されるＤＮＡメチルトランスフェラーゼである。
「前記メチルトランスフェラーゼの認識配列が補助因子またはその誘導体で修飾されているかどうかを検出する」の語は、式（Ｉ）の補助因子またはその誘導体が生体分子と結合しているかどうかを評価することを意味する。好ましくは、検出法は補助因子またはその誘導体で修飾された、メチルトランスフェラーゼの認識配列内の特定残基を同定することを含む。．前記誘導体は、式（Ｉ）のＮ−アデノシルアジリジン誘導体と生体分子との間の反応の結果として生じる任意の化合物でありうる。
「認識配列」の語は、メチルトランスフェラーゼによって認識される、生体分子内の特定の配列をいう。メチルトランスフェラーゼがＤＮＡメチルトランスフェラーゼである場合は、認識配列は２、３、４、５、６、または８個の塩基または塩基対を含みうる。ここでは、認識配列はまた式（Ｉ）のＮ−アデノシルアジリジン誘導体またはその誘導体に対する受容体部位を含む。本発明の教示は、配列特異的標識化をメチル化依存的方法で可能にする。いわゆるＣｐＧ島に位置するシトシン残基のＤＮＡ標識化は、ヒト染色体ＤＮＡのメチル化状態を評価することを可能にするため、本発明の具体的な一態様である。したがって、本発明の方法は、染色体ＤＮＡのメチル化状態の変化を伴う疾患の診断に特に有用であるがそれに限定されない。他の起源由来のＤＮＡのメチル化状態およびＲＮＡまたは（ポリ）ペプチドのメチル化状態を入手することもまた有用なはずである。加えて、メチルトランスフェラーゼとの複合体中の式（Ｉ）の補助因子またはその誘導体を、生化学、分子生物学、遺伝子治療およびナノ生命工学におけるさまざまな用途に有用であるはずのＤＮＡ、ＲＮＡまたは（ポリ）ペプチドを配列特異的に標識化するのに用いることができる。さらに、式（Ｉ）の補助因子またはその誘導体は、メチルトランスフェラーゼのための新しいメチル化標識を見出すために用いることができる。
ここで開示される実験結果は、本発明のＮ−アデノシルアジリジン誘導体がＭ．ＨｈａＩの天然補助因子を交換しうることを証明する。本発明のＮ−アデノシルアジリジン誘導体はまたＭ．ＴａｑＩ、Ｍ．ＢｓｅＣＩおよびＭ．ＳｓｓＩのような他のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによって使用されうることが見出された。好ましくは、前記Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼは、Ｍ．ＨｈａＩ、Ｍ．ＴａｑＩ、Ｍ．ＢｓｅＣＩ、Ｍ．ＳｓｓＩ、Ｍ．ＲｓｒＩ、Ｍ．ＤｐｎＭ、Ｍ．ＰｖｕＩＩおよびＭ．ＭｂｏＩＩの群のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＶＰ３９、Ｆｔｓ／ＲｒｍＪ、ＮＳ５およびＥｒｍＣ’の群のＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、またはｈＰＩＭＴ、ＬＳＭＴ．ＳＥＴ７／９、ＨｅｍＫ／ＰｒｍＣ、ｈＤＯＴ１ＬまたはＰＲＭＴ１の群の（ポリ）ペプチドメチルトランスフェラーゼから選択される。
本発明の好ましい実施形態では、前記生体分子は核酸分子または（ポリ）ペプチドである。核酸分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含すると理解される。好ましくは、ＤＮＡは染色体またはゲノムＤＮＡである。生体分子は、任意の長さでありうる。「染色体ＤＮＡ」の語は染色体の断片も包含する。好ましくは、前記断片は、５００ヌクレオチド、１キロベース（ｋｂ）、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、またはそれ以上の長さまでを有する。しかし染色体ＤＮＡの語には、５ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔまでの長さを有する短い断片も包含される。
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、前記段階（ａ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞抽出物を用いてまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施される。一般的に、制限酵素およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼによる処理のための適切な反応条件は、当業者に公知であり、たとえば、分子生物学の標準的教科書中に文書化されている（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他、『分子クローニング−実験の手引き』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）；ＩＳＢＮ：０８７９６９５７６５，ＣＳＨプレス社（ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ），コールド・スプリング・ハーバー，２００１を参照）。Ｍ．ＨｈａＩによって媒介される補助因子標識化のための適切な条件は、たとえば、８０μＭのＮ−アデノシルアジリジン誘導体、１１．３ｎＭの二本鎖プラスミドＤＮＡ、緩衝液中の３８０ｎＭ Ｍ．ＨｈａＩである（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４、５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸、および２ｍＭβ―メルカプトエタノール）。インキュベーションは、３７℃にて２時間実施してもよい。
本発明の方法がｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される場合、生物試料は分析の前に個体から単離される。「生物試料」の語は、個体から採取される標本に関する。好ましくは、前記標本は、毛髪、皮膚、粘膜表面、血液、血漿、血清、尿、唾液、痰、涙液、髄液、精液、滑液、羊水、母乳、リンパ、肺痰、気管支の分泌または糞を含む体液から採取される。
個体は、人間または動物でありうる。好ましくは個体は、シチメンチョウまたは雌鶏を含む鳥であり、または個体は、ヒト、霊長類、ラット、マウス、モルモット、ブタ、ウシ、ネコまたはウサギを含む哺乳類である。
本発明のより好ましい実施形態では、前記核酸分子はＤＮＡである。好ましくは、前記ＤＮＡは染色体ＤＮＡである。
本発明の別のより好ましい実施形態では、本方法は段階（ａ）の前にＤＮＡを制限酵素で処理する段階をさらに含む。制限酵素は、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｉＩ、ＡｃＩＩ、ＡｆｅＩ、ＡｆＩＩＩ、ＡｆＩＩＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｈｄＩ、ＡｌｕＩ、ＡｌｗＩ、ＡｌｗＮＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｐｏＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｅＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａｉＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢａｎＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｂｖＣＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃＩ、ＢｆａＩ、ＢｆｒＢＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｇＩＩ、ＢｇＩＩＩ、ＢｌｐＩ、Ｂｍｅ１５８０Ｉ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＪＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓＩＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｏＢＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢｓｔＹＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｔｇＩ、ＢｔｒＩ、ＢｔｓＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＤｄｅＩ、ＤｐｎＩ、ＤｐｎＩＩ、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＥｃｏＮＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｏｋＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｈＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ｉＶ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ、ＭｂｏＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＭｌｙＩ、ＭｎＩＩ、ＭｓｃＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓＩＩ、ＭｓｐＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｃｉＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｉＩ、ＮｓｐＩ、ＰａｃＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｃｉＩ、ＰｆｌＦＩ、ＰｆｌＭＩ、ＰｌｅＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍＩＩ、ＰｐｕＭＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｉＩ、ＰｓｐＧＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａＩＩ、ＳａｐＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｂｆＩ、ＳｃａＩ、ＳｃｒＦＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｆｃＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｍＩＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＩ、ＳｗａＩ、ＴａｑＩ、ＴｆｉＩ、ＴｌｉＩ、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｔｓｐ５０９１、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＸｂａＩ、ＸｃｍＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩおよびＸｍｎＩから成る群から選択されうる。
本発明のさらに別のより好ましい実施形態では、前記ＤＮＡ分子は固相担体に固定化される。本発明によって使用されうる固相担体は、フィルタ材料、チップ、ウェーハ、マイクロタイタ・プレートを含む。固相担体への固定は、活性化された表面への共有結合を含む異なる手段によって、または核酸分子に対するハイブリダイゼーションによって達成されうる。
本発明の別のより好ましい実施形態では、前記ＤＮＡ分子は、前記固相担体に付加されるオリゴヌクレオチドにＤＮＡ分子をハイブリダイゼーションすることによって、固相担体に結合する。ハイブリダイゼーション条件は、低度、中間、または高度な厳密度でありうる。ここで用いられる「厳密（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件」の語は当業者に公知であり、高い厳密度の条件に対応する。各配列に対する適切な厳密条件は、温度、核酸分子の組成、塩の条件などといったパラメーターを修飾することによって当業者によって設定されうる。（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，『分子クローニング−実験の手引き』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）；ＣＳＨプレス社（ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ），コールド・スプリング・ハーバー，１９８９またはヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびハメス（Ｈａｍｅｓ）（編），『核酸ハイブリダイゼーション、実践的アプローチ』（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ），ＩＲＬプレス社（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ），オックスフォード１９８５，特にブリテン（Ｂｒｉｔｔｅｎ）およびデイビッドソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）による章『ハイブリダイゼーション戦略』（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｙ），３から１５を参照）。厳密なハイブリダイゼーション条件は、たとえば５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍＬの変性、せん断したサーモン精液ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にて一夜インキュベーションし、その後約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルタを洗浄する：ことを含む条件である。他の厳密なハイブリダイゼーション条件は、たとえば６５℃での０．２×ＳＳＣ（０．０３Ｍ塩化ナトリウム、０．００３Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）である。加えて、さらにより低い厳密度を達成するために、厳密なハイブリダイゼーションに続いて実施される洗浄は、より高い塩濃度（たとえば５×ＳＳＣ）で行ってもよい。上記の条件の変形例は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑制するために用いる代替ブロッキング試薬の包含および／または置換によって達成しうることに注意されたい。典型的なブロッキング試薬としては、デンハード試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サーモン精液ＤＮＡ、および市販の登録商標の処方が含まれるが、これらに限定されない。相溶性に関する問題を理由として、特定のブロッキング試薬の包含には、上記のハイブリダイゼーション条件の修正を必要としうる。また、より厳密度の低いハイブリダイゼーション条件も考えられる。ハイブリダイゼーションおよび信号検出の厳密度の変化は、たとえば、ホルムアミド濃度（より低いパーセンテージのホルムアミドの結果、厳密度も低下する）、塩条件または温度の操作を介して達成される。たとえば、より低い厳密度条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣＩ；０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサーモン精液ブロッキングＤＮＡを含む溶液中で３７℃にて一夜インキュベーションし、その後０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで約５０℃にて洗浄される：ことを含む条件である。加えて、さらにより低い厳密度を達成するために、厳密なハイブリダイゼーションに続いて実施される洗浄は、より高い塩濃度（たとえば５×ＳＳＣ）で行ってもよい。
本発明の別のより好ましい実施形態では、メチルトランスフェラーゼが、オーファンＤＮＡメチルトランスフェラーゼまたは細菌制限修飾系の一部である。
本発明のさらに別のより好ましい実施形態では、細菌制限修飾系由来の前記メチルトランスフェラーゼは、Ｍ．ＨｈａＩ、Ｍ．ＴａｑＩ、Ｍ．ＢｓｅＣＩおよびＭ．ＳｓｓＩから選択される。「Ｍ．ＨｈａＩ」の語は、スイスポートデータベース中に登録番号Ｐ０５１０２の下で蓄積されたＤＮＡメチルトランスフェラーゼをいう。「Ｍ．ＴａｑＩ」の語は、スイスポートデータベース中に登録番号Ｐ１４３８５の下で蓄積されたＤＮＡメチルトランスフェラーゼをいう。「Ｍ．ＴａｑＩ」の語は、スイスポートデータベース中に登録番号Ｐ１４３８５の下で蓄積されたＤＮＡメチルトランスフェラーゼをいう。「Ｍ．ＢｓｅＣＩ」の語は、スイスポートデータベース中に登録番号Ｐ４３４２３の下で蓄積されたＤＮＡメチルトランスフェラーゼをいう。しかし、同じ配列特異性、すなわち同じ認識配列を備えた、またはＭ．ＨｈａＩ、Ｍ．ＴａｑＩまたはＭ．ＢｓｅＣＩの認識配列の一部のみを含むより低い配列特異性を有する、他の任意のメチルトランスフェラーゼも本発明の方法のために有用でありえる。
本発明の別のより好ましい実施形態では、（ａ）Ｎ−アデノシルアジリジン誘導体がＤＮＡメチルトランスフェラーゼの認識配列での制限酵素切断をブロックし；および（ｂ）Ｎ−アデノシルアジリジン誘導体によるＤＮＡの修飾が前記認識配列での制限酵素によって媒介される切断をブロックするかどうかを試験することによってメチル化が検出される。この方法を実施する際には、本発明において言及される任意の制限酵素およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼを用いてもよい。
本発明の発明者によって、認識配列の受容体部位でのＮ−アデノシルアジリジン誘導体の存在が、重なり合うまたは同じ認識配列を有する制限酵素によるＤＮＡ切断をブロックすることが観察されてきた。ここで用いられる制限酵素切断のブロッキングは、制限酵素がＤＮＡ鎖を切断するのを防止することを意味する。理論に縛られずに、制限酵素がその標的配列と生産的な方法で結合できなくなるよう、立体障害が認識配列へのアクセスをブロックすると仮定する。この観察は、本発明のＮ−アデノシルアジリジン誘導体による初期標識化段階およびその後の制限酵素による切断段階を含む検定法によって利用されうる。当然制限酵素の選択は、標識化段階において使用される特定のＤＮＡメチルトランスフェラーゼに依存する。一般的なガイドラインとして、制限酵素の認識配列は修飾塩基の近傍であるべきである。好ましくは、制限酵素の認識配列は修飾塩基を含む。より好ましくは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの認識配列および制限酵素の認識配列は同一である。制限酵素およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼの特定の組合せの選択は当業者には自明であり、およびさらなる説明は必要としない。さらに、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼおよび制限酵素切断によって実施された標識化反応は、標準条件下で実施してもよい。
本発明のさらに別のより好ましい実施形態では、（ａ）式（Ｉ）のＮ−アデノシルアジリジン誘導体がＤＮＡメチルトランスフェラーゼの認識部位での核酸増幅に干渉し；および（ｂ）メチル化は、メチルトランスフェラーゼの認識配列での核酸分子の増幅が遅延したかどうかを試験することによって検出される。
増幅の遅滞は、プライマー結合へのまたは増幅反応中の鎖伸長への干渉によって達成されうる。
「増幅」または「増幅する」の語は、コピー数の増加を意味する。当業者は核酸分子を増幅するさまざまな方法を知っており、これら方法は、本発明の診断方法で用いられうる。増幅方法は『ポリメラーゼ連鎖反応』（ＰＣＲ），『リガーゼ連鎖反応』（ＬＣＲ，ＥＰＡ３２０３０８）、『環状プローブ反応』（ＣＰＲ）、『標準置換増幅』（ＳＤＡ，ウオーカー（Ｗａｌｋｅｒ）他，（１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．７， １６９１−１６９６），『転写に基づく増幅系』（ＴＡＳ，コウ（Ｋｗｏｈ）他，（１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６， １１７３；ジンゲラス（Ｇｉｎｇｅｒａｓ）他，国際出願第８８／１０３１５号）を含むが、これらに限定されない。好ましくは、ＤＮＡの増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて達成される。［『分子生物学の方法』（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），第２２６巻 （バートレット（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）およびスターリング（Ｓｔｉｒｌｉｎｇ）編）：『ＰＣＲ手順』（ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），第２版；『ＰＣＲ技術：原理およびＤＮＡ増幅への応用』（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（アーリッチ（Ｅｒｌｉｃｈ）編），ニューヨーク１９９２；『ＰＣＲ手順：方法および応用の手引き』（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（インニス（Ｉｎｎｉｓ）他編），アカデミック・プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），サンディエゴ１９９０］。核酸増幅方法は、試料が微量の核酸のみを含む場合特に有用でありうる。前記核酸がＲＮＡである場合、ＲＴ―ＰＣＲを実施してもよい。引き続き、ＰＣＲを伴う他の増幅手順を実施してもよい。代替的に、試料に含まれる前記核酸がＤＮＡである場合ＰＣＲを実施してもよい。
ＰＣＲは、一般的に：（ａ）ＤＮＡ分子の両方の鎖を融かす変性段階；（ｂ）プライマーをＤＮＡ分子の融けた鎖と特異的にアニーリングさせることを目的とするアニーリング段階；および（ｃ）テンプレート鎖によって提供される情報を用いて、アニーリングしたプライマーを伸長する伸長段階から成るサイクルの多数の反復から成る。一般的に、ＰＣＲは、たとえば、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２００μＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸、０．５μＬの各プライマー（１０μＭ）、約１０から１００ｎｇのテンプレートＤＮＡおよび１から２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む１０ｘＰＣＲ緩衝液５μＬを含む５０μＬの反応混合物中で実施されうる。増幅用のプライマーは標識化されていてもいなくてもよい。ＤＮＡ増幅は、たとえばモデル２４００サーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），カリフォルニア州フォスター市（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ））を用いて：２分間９４℃にて、次いでアニーリング（３０秒間５０℃にて）、伸長（１分間７２℃にて）、変性（１０秒間９４℃にて）から成る３５サイクル、および最終アニーリング段階５５℃にて１分間および最終伸長段階７２℃にて５分間で実施されうる。しかし、当業者は、特定の核酸分子の増幅のためにこれらの条件を最適化する方法、または反応混合物の量をスケールダウンまたは増加させる方法を知っている。
核酸増幅の別の方法が「逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応」（ＲＴ−ＰＣＲ）である。この方法は、増幅すべき核酸がＲＮＡから成る場合に用いられる。「逆転写酵素」の語は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の重合を触媒してリボ核酸テンプレートと相補的であるプライマー伸長産物を生じる酵素をいう。逆転写酵素はプライマーの３’末端で合成を開始し、およびテンプレートの５’末端へ向かって、合成が終止するまで進む。ＲＮＡ標的配列を相補的なコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列へ変換する適当な重合剤の例は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素および、パーキン・エルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）より市販されている逆転写酵素活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼである。典型的には、ゲノムＲＮＡ／ｃＤＮＡ二本鎖テンプレートは、最初の逆転写段階後の一回目の変性段階中に熱変性され、ＤＮＡ鎖を増幅テンプレートとして利用可能に残す。ＤＮＡテンプレートとの使用に適したポリメラーゼは、たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩまたはそのクレノー断片、Ｔ4ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、および、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離されおよびホフマン・ラ・ロシュ社（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）によって開発および製造されおよびパーキン・エルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）より市販されている熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼを含む。後者の酵素は核酸の増幅および配列決定に幅広く用いられている。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用するための反応条件は本分野で公知であり、およびたとえば：『ＰＣＲ技術（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）』，エーリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）（１９８９，ストックトン・プレス社（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク；または：イニス（Ｉｎｎｉｓ），ゲルファンド（Ｇｅｌｆａｎｄ），スニンスキー（Ｓｎｉｎｓｋｙ）およびホワイト（Ｗｈｉｔｅ）．１９９０，『ＰＣＲ手順：方法および応用の手引き（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）』．アカデミック・プレス社（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ），ニューヨークに記載されている。高温ＲＴはより大きなプライマー特異性および改善された効率を提供する。同時係属の１９９１年８月１５日出願の米国特許出願公開第０７／７４６，１２１号明細書は、「均一ＲＴ−ＰＣＲ」を記載し、そこでは同一のプライマーおよびポリメラーゼで逆転写およびＰＣＲ増幅段階の両方に足り、および反応条件は両方の反応が試薬の交換無しで起こるように最適化されている。逆転写酵素として機能しうる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼは、テンプレートにかかわらず、すべてのプライマー伸長段階に用いることができる。両方の過程は、試薬を交換または添加するためにチューブを開ける必要なく実施されうる；温度プロファイルだけが、一回目のサイクル（ＲＮＡテンプレート）および残りの増幅サイクル（ＤＮＡテンプレート）の間で調整される。ＲＴ反応は、たとえば、下記を含む２０μＬの反応混合物中で実施されうる：４μＬの５ｘＡＮＶ−ＲＴ緩衝液、２μｌのオリゴｄＴ（１００μｇ／ｍＬ）、２μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、１μＬ総ＲＮＡ、１０単位のＡＭＶ逆転写酵素、およびＨ2Ｏで終容量２０μＬとする。反応は、たとえば、下記の条件を用いて実施されうる：反応は７０℃に１５分間保たれ、逆転写を可能にする。反応温度を次いで９５℃へ１分間上昇させてＲＮＡ−ｃＤＮＡ二本鎖を変性させる。次に、反応温度は９５℃１５秒間および６０℃２０秒間の２サイクルを受け、次いで９０℃１５秒間および６０℃２０秒間の３８サイクルを受ける。最後に、最終伸長段階のために反応温度を６０℃に４分間保ち、１５℃へ冷却し、および増幅された試料のその後の処理までその温度に保つ。
「プライマー」または「オリゴヌクレオチド」の語は、本発明全体で、テンプレート核酸鎖と相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下で、すなわち、４種類の異なるヌクレオシド三リン酸またはそのアナログおよび重合剤（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下で適当な緩衝液中でおよび適当な温度にて、核酸合成の開始点として作用する能力を有する、天然または合成の、長さ約８ないし約３０、ないし最終的に約５０ヌクレオチドの核酸低分子をいう。好ましくは、プライマーは一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適当な長さはプライマーの使用目的に依存するが、しかし典型的には、配列決定反応に用いられるＰＣＲプライマーについては１０ないし２５ヌクレオチドの範囲にわたる。低分子プライマーは一般的に、テンプレートと十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにはより低温を必要とする。プライマーはテンプレートの正確な配列を反映する必要は無いが、しかし、増幅を媒介する能力が損なわれない限り、テンプレートと特異的にハイブリダイズするのに十分なほど相補的でなければならない。「ハイブリダイズ」とは、相補塩基対形成、すなわちＡとＴ（ＲＮＡでは：Ｕ）、ＧとＣを介した二本の一本鎖核酸の結合をいう。「プライマー対」の語は、二本鎖核酸分子のプラス鎖およびマイナス鎖とそれぞれハイブリダイズし、およびたとえばＤＮＡ断片の、たとえばＰＣＲ反応での増幅を可能にする二つのプライマーをいう。プライマーは、必要に応じて、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的方法によって検出可能な化合物を組み込むことによって標識化されうる。たとえば、有用な標識は、蛍光色素、高電子密度試薬、ビオチン、または、抗血清またはモノクローナル抗体が入手可能な低分子ペプチを含むがそれらに限定されない。標識はまた、増幅された核酸またはその断片の選択を円滑にするため、プライマーを「捕捉」するために用いることもできる。カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）および６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）が好ましい標識である。しかし、他の好ましい標識は、蛍光色素、たとえばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、放射性標識たとえば32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ；などを含む。
標識はまた、プライマーが、たとえばアビジン、特異的抗体などのような高い親和性結合パートナーを持つ、ビオチン、ハプテンなどと結合していて、結合パートナーは検出可能な標識と結合している、二段階系でもよい。標識はプライマーの一方または両方と結合されうる。
診断のための前記方法の間に、核酸配列決定の段階が実施されうる。本分野で公知である任意の方法を配列決定に用いることができる。好ましくは、核酸配列はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）またはマキサム（Ｍａｘａｍ）／ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）の配列決定法に基づく方法によって決定される（たとえば： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６７ （グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およびヒル（Ｈｉｌｌ）編）：『ＤＮＡ配列決定手順』第二版（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），２００１ ；ガラス（Ｇａｌａｓ）およびマコーマック（ＭｃＣｏｒｍａｃｋ），『ゲノム技術：現在と未来（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ： Ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ）』．ケイスター・アカデミック・プレス社（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），英国ワイモンダム（Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ），２００２）。
本発明の好ましい実施形態では、ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲである。本発明の別の好ましい実施形態では、核酸増幅はリアルタイムＰＣＲによって実施される。
本発明のさらに別のより好ましい一実施形態では、（ａ）Ｎ−アデノシルアジリジン誘導体は蛍光標識を含み；および（ｂ）メチル化は前記核酸分子中の蛍光の存在または量を測定することによって検出される。前記Ｎ−アデノシルアジリジン誘導体は、本発明で言及されたかまたは当業者に公知である蛍光標識の任意のものを用いて標識化されうる。本発明に従って、アレクサ（Ａｌｅｘａ）、ボデピー（ＢＯＤＩＰＹ）、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、シアニンフルオロフォアまたはその誘導体は特に好ましい標識である。
「蛍光の存在または量を測定」とは、蛍光が、またはどのくらいの蛍光が、蛍光スペクトル法によって検出されうるかを評価することを意味する。
本発明の別のより好ましい一実施形態では、（ａ）メチルトランスフェラーゼ認識配列で修飾された核酸分子はアフィニティ精製によって精製され；および（ｂ）Ｎ−アデノシルアジリジン誘導体はアフィニティタグを含む。
核酸分子は、本発明のＮ−アデノシルアジリジン誘導体の標識と特異的に結合できる化合物を用いることによって精製されうる。その場合、標識はアフィニティタグに相当するかまたはアフィニティタグを含む。アフィニティタグは、一つ以上の蛍光標識と組み合わせることができる。好ましくは、標識またはアフィニティタグと結合できる化合物は、それらの化合物との結合が特異的である、抗体、タンパク質、ペプチドまたはアプタマーである。アフィニティタグは、ｆｌａｇ−タグ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ、ジゴキシゲニンまたはジニトロフェノールといったエピトープでありうる。代替的に、アフィニティタグは、Ｈｉｓタグのような人工ペプチドでありうる。「Ｈｉｓタグ」は、Ｈｉｓ4、Ｈｉｓ5、Ｈｉｓ6、Ｈｉｓ7、Ｈｉｓ8、Ｈｉｓ9、Ｈｉｓ10、Ｈｉｓ11、Ｈｉｓ12、Ｈｉｓ13、Ｈｉｓ14、Ｈｉｓ15から選択されうる。さらに、アフィニティタグはビオチン、ストレプ−タグ、グルタチオン、ニッケル−ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）またはマルトースでありうる。アフィニティタグが「Ｈｉｓタグ」である場合、固相担体にカップリングされたニッケルを精製に用いることができる。アフィニティタグがエピトープである場合、固相担体にカップリングされた抗体−アフィニティを精製に用いることができる。アフィニティタグがビオチンまたはストレプ−タグである場合、固相担体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンなどを精製に用いることができる。アフィニティタグがグルタチオンである場合、固相担体に結合したグルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を精製に用いることができる。アフィニティタグがマルトースである場合、固相担体に結合したマルトース結合タンパク質を精製に用いることができる。アフィニティタグがニッケル−ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）である場合、固相担体に結合した、数個のヒスチジン残基を含むペプチドを精製に用いることができる。
アフィニティ精製は一般的に、固定材料（固相）に固定化されているリガンドとの結合相互作用における差に基づく溶液（移動相）中の分子の分離を含む。アフィニティ精製における担体すなわちマトリクスは、リガンドを共有結合させることができる任意の物質である。典型的には、アフィニティマトリクスとして使用される材料は、標的分子が見出される系において不溶性である。普通は、しかし常にとは限らないが、不溶性マトリクスは固体である。アフィニティマトリクスとして数百種類の物質が記載されおよび使用されている。有用なアフィニティ担体は、高い容量対表面積比、リガンドの共有結合のために容易に修飾される化学基、最小の非特異的結合特性、良好な流動特性、および機械的および化学的安定性を持つものである。好ましい固相担体は、アガロース、セファロースおよびポリスチレンビーズである。
好ましくは、アフィニティ精製は、ビオチン、ジゴキシゲニン、グルタチオンまたはニッケル−ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）を、本発明のＮ−アデノシルアジリジン誘導体のアフィニティタグとして用いることによって実施される。
本発明の別のより好ましい一実施形態では、Ｎ−アデノシルアジリジン誘導体はＤＮＡ中のシトシン残基に付加されおよび５−メチルシトシン残基には付加できない。
本発明の好ましい一実施形態では、本方法は段階（ａ）の後にＤＮＡ分子を配列決定する追加の段階を含む。配列決定には本分野で公知である任意の方法が使用されうる。好ましくは、核酸配列はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）または マキサム（Ｍａｘａｍ）／ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）の配列決定法に基づく方法によって決定される（たとえば： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６７ （グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およびヒル（Ｈｉｌｌ）編）：『ＤＮＡ配列決定手順』第二版（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），２００１ ；ガラス（Ｇａｌａｓ）およびマコーマック（ＭｃＣｏｒｍａｃｋ），『ゲノム技術：現在と未来（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ： Ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ）』．ケイスター・アカデミック・プレス社（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），英国ワイモンダム（Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ），２００２を参照）。
本発明の別の好ましい一実施形態では、前記検出可能な補助因子は、（ａ）前記検出可能な補助因子と特異的に結合する抗体によって、または（ｂ）前記検出可能な補助因子と特異的に結合するアビジンまたはストレプトアビジンによって検出される。
「抗体」の語は、本発明全体で、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはその断片をいう。好ましくは、抗体はそのエピトープに特異的である。抗体は、ヒト化抗体、合成抗体、抗体断片、たとえばＦａｂ、Ｆ（ａｂ２）’、ＦｖまたはｓｃＦｖ断片など、またはこれらのうち任意のものの化学的に修飾された誘導体でありうる。モノクローナル抗体は、たとえば、本分野によって開発された改変を伴う、免疫化哺乳類に由来する脾臓細胞へのマウスミエローマ細胞の融合を含む、ケーラー（Ｋoｈｌｅｒ）およびミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ），（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５，およびガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ），（１９８１） Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３，３によって最初に記載された方法によって調製されうる。さらに，抗体 または その断片は、たとえばハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）『抗体、実験の手引き』（”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"），ＣＳＨプレス社（ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ），コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ），１９９８に記載される方法を用いることによって得ることができる。前記抗体の誘導体がファージディスプレイ法によって得られる場合、ＢＩＡコアシステムに用いられるような表面プラズモン共鳴を用いて、分析すべきエピトープと結合するファージ抗体の効率を増大させることができる（シーア（Ｓｃｈｉｅｒ），（１９９６） Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７，９７−１０５；マルムボルク（Ｍａｌｍｂｏｒｇ），（１９９５） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３，７−１３）。キメラ抗体の製造は、たとえば、国際公開第８９／０９６２２号パンフレットに記載されている。
抗体は標識化でき、ここで標識は本発明で言及される標識のうち任意のものでありうる。
最後に、本発明の別の好ましい一実施形態では、前記ＤＮＡ分子の同一性は、ＤＮＡ配列決定、ハイブリダイゼーション、Ｍａｌｄｉ−Ｔｏｆまたは、酵素断片化およびクロマトグラフィー法によるヌクレオシド組成の分析によって決定される。
本発明はまた、疾患状態ががんまたはＩＣＦ症候群である、ＤＮＡメチル化の増加または減少を伴う疾患状態の診断または予測のための本発明の方法の使用に関する。好ましくは、診断は患者から入手可能な試料について実施される。
「ＤＮＡメチル化の増加または減少」の語は、健常者のＤＮＡを疾患患者のＤＮＡと比較する際の、染色体ＤＮＡのメチル化状態の変化をいう。本発明の教示によると、染色体ＤＮＡのメチル化状態の変化は遺伝子発現の変化を反映しうる。実際、多くの場合でＤＮＡのメチル化状態の変化は転写の増加または減少に寄与する。メチル化パターンの変化は特定の疾患状態と密接に連動している可能性があり、そのため染色体ＤＮＡ内のメチル化パターンの変化は、その疾患の診断または予防マーカーとして使用されうる。
本発明の教示を用いて診断されうるがんは、前立腺、肺、乳房、卵巣、胃、膵臓、喉頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆道、結腸、直腸、子宮頸部、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、甲状腺がんを含む固形腫瘍；原発腫瘍および転移；黒色腫；膠芽細胞腫；カポジ肉腫；平滑筋肉腫；非小細胞肺がん；結腸直腸がん；進行悪性腫瘍；および白血病などの血液腫瘍を含むがそれらに限定されない。
「ＩＣＦ症候群」の語は、免疫不全、動原体領域不安定性および顔面異常によって特徴づけられる疾患をいう。ＩＣＦ症候群は、細胞分裂促進剤で刺激されたリンパ球での、特に第１、９および１６染色体（第１および第１６染色体）の動原体の近傍における染色体異常によって診断される、独特のＤＮＡメチル化障害疾患である。これらの異常は、動原体に隣接するヘテロクロマチンの脱凝縮、最大１２腕を有する多放線状染色体、および全腕欠失を含む。分子レベルでは、ＩＣＦ症候群の最も一貫した特性の一つは、第１、９および１６染色体上の動原体近傍反復配列の低メチル化である（ジャンピエール（Ｊｅａｎｐｉｅｒｒｅ）他，（１９９３） Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２，７３１−７３５）。したがって、低メチル化ＤＮＡ領域を分析でき、および診断方法はそれに基づくことができる。
本発明の補助因子は、式（Ｉ）で表されるＮ−アデノシルアジリジン誘導体であり、
Figure 0004886679
 ここで
ＷはＮおよびＣＨから選択され、
ＸはＮまたはＣＲ1であり、
ＹはＮＨ2またはＮＨＲ2であり、
ＺはＨ、Ｒ3またはＣＨ2ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ2）であり、
ただし
ＸがＣＲ1である場合、ＹはＮＨ2でありおよびＺはＨまたはＣＨ2ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ2）であり、
ＸがＮでありおよびＹがＮＨＲ2である場合、ＺはＨまたはＣＨ2ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ2）であり、
ＸがＮでありおよびＹがＮＨ2である場合、ＺはＲ3であり、
Ｒ1は−（ＣＨ2）nＲ4、−（ＣＨ＝ＣＨ）m（ＣＨ2）nＲ4、−（ＣＨ2）o（ＣＨ＝ＣＨ）m（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ≡Ｃ）m（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ≡Ｃ）m（Ｃ6Ｈ4）o（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ6Ｈ4）m（ＣＨ2）nＲ4、−ＣＯ（ＣＨ2）nＲ4および−Ｓ（ＣＨ2）nＲ4から選択され；
Ｒ2は−（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ6Ｈ4）m（ＣＨ2）nＲ4、−ＣＯ（Ｃ6Ｈ4）m（ＣＨ2）nＲ4および−ＣＯ（ＣＨ2）nＲ4から選択され；
Ｒ3は−（ＣＨ2）nＲ4、−（ＣＨ＝ＣＨ）m（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ≡Ｃ）m（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ6Ｈ4）m（ＣＨ2）nＲ4および−ＣＯＮＨ（ＣＨ2）nＲ4から選択され；
Ｒ4は−ＮＨＲ5、−ＮＨＣＯ（ＣＨ2）pＳＲ5、−ＳＲ5、−ＯＲ5、−０（Ｃ2Ｈ5Ｏ）n（Ｃ2Ｈ5）ＮＨＲ5、−ＣＨ2ＮＨＮＨＲ5、−ＮＨＣＯＣＨ（ＣＨ2ＳＨ）ＮＨＲ5および−ＣＯＮＨＲ5から選択され；
Ｒ5はフルオロフォア、アフィニティタグ、架橋剤、発色団、タンパク質、ペプチド、随意的に修飾されうるアミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、糖質、脂質、ＰＥＧ、トランスフェクション試薬、ビーズ、介入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、核酸切断試薬およびナノ粒子（たとえば金クラスター）から選択され、および
ｎ、ｍ、ｏおよびｐは独立して０または１ないし５０００の整数から選択される。
好ましくは、Ｒ1は−（ＣＨ2）nＲ4、−（ＣＨ＝ＣＨ）m（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ≡Ｃ）m（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ≡Ｃ）m（Ｃ6Ｈ4）o（ＣＨ2）nＲ4、および−（Ｃ6Ｈ4）m（ＣＨ2）nＲ4から選択され、より好ましくは、Ｒ1は−（ＣＨ2）nＲ4、または−（Ｃ≡Ｃ）m（ＣＨ2）nＲ4；
Ｒ2は−（ＣＨ2）nＲ4、および−（Ｃ6Ｈ4）m（ＣＨ2）nＲ4から選択され、より好ましくは、−（ＣＨ2）nＲ4；
Ｒ3は−（ＣＨ2）nＲ4および−ＣＯＮＨ（ＣＨ2）nＲ4から選択され、より好ましくは、−（ＣＨ2）nＲ4；
Ｒ4は−ＮＨＲ5、−ＮＨＣＯ（ＣＨ2）pＳＲ5、および−０（Ｃ2Ｈ5Ｏ）n（Ｃ2Ｈ5）ＮＨＲ5から選択され、より好ましくは、−ＮＨＲ5；
Ｒ5はフルオロフォア、アフィニティタグ、架橋剤、ペプチド、核酸、糖質、脂質、トランスフェクション試薬、介入剤、核酸切断試薬およびナノ粒子（たとえば金クラスター）から選択される。
ｎは好ましくは０または１ないし１００の整数、より好ましくは１、３、および４である。ｍは好ましくは１ないし１０の整数、より好ましくは１である。ｏは好ましくは１ないし１０の整数、より好ましくは１である。ｐは好ましくは１ないし１０の整数、より好ましくは３である。
本発明の好ましい実施形態では、式（Ｉ）の補助因子は、
Figure 0004886679
 から選択される。
本発明の好ましい実施形態では、前記フルオロフォアは、アレクサ（Ａｌｅｘａ）、ボデピー（ＢＯＤＩＰＹ）、クマリン、ダンシル、フルオレセイン、マンシル、ピレン、ローダミン、テキサスレッド、ＴＮＳ、シアニンフルオロフォアまたはその誘導体、または本発明の明細書において言及される他の任意の標識である。
本発明の別の好ましい実施形態では、前記アフィニティタグは、ペプチドタグ、ビオチン、マルトース、ニッケル−ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）、ジゴキシゲニンまたはジニトロフェノールである。
本発明のより好ましい実施形態では、前記ペプチドタグは、Ｈｉｓ−タグまたは金属キレート特性を有するタグ、ストレプ−タグ、ｆｌａｇ−タグ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ、エピトープまたはグルタチオンを有するタグである。固相担体に付加される結合パートナーは、核酸分子またはペプチド（ポリ）のアフィニティ精製のために用いられうる。好ましくは、ペプチドタグは、Ｈｉｓ−タグまたはストレプ−タグである。
「金属キレート特性を有するタグ」の語は、生体分子への共有結合後のＮ−アデノシルアジリジン誘導体の結合を、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｅｔａｌ ｌｏｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＩＭＡＣ）で用いられるマトリックスへに与えるタグに関する。ポラス（Ｐｏｒａｔｈ）他によって開発されたＩＭＡＣ技術（ポラス（Ｐｏｒａｔｈ）他、（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５８（５９８−５９９））は、特定のタンパク質表面上の残渣（ヒスチジン、システイン、およびより低級なトリプトファン中の）と、ポリカルボキシル配位子を有するキレートを形成する遷移金属由来の陽イオンとの相互作用に基づく。典型的な条件は従来技術に記載され、および当業者に公知である（ポラス（Ｐｏｒａｔｈ），（１９９２）『タンパク質発現および精製３』（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３）， ２６３−２８１； ヘムダン（Ｈｅｍｄａｎ）およびポラス（Ｐｏｒａｔｈ），（１９８５） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ３２３， ２５５−２６４； ポラス（Ｐｏｒａｔｈ）およびハンセン（Ｈａｎｓｅｎ），（１９９１） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ５５０， ７５１−７６４）。
「ストレプ−タグ」の語は、８個のアミノ酸ストレプトアビジン結合配列に関する。この配列は、最適なアフィニティタグ特性を有するペプチド結合配列を同定するために、ランダムなペプチド・ライブラリの組織的スクリーニングによって見出された（シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）およびスケラ（Ｓｋｅｒｒａ），（１９９３） Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６， １０９−１２２）。本発明のＮ−アデノシルアジリジン誘導体に付加される場合、修飾された核酸分子または（ポリ）ペプチドは、たとえば、ストレプトアクチン、ストレプトアビジン、アビジン等を含むマトリックスを有する重力フローカラムを用いることによって、アフィニティ精製されうる。このようなマトリックスは、たとえばシグマ−ジェノシス社（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）／ウッドランド社（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ）（米国、テキサス）またはＩＢＡ／ゲッティンゲン（ＩＢＡ／Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）（ドイツ）から市販されている。
「ｆｌａｇ−タグ」の語は、抗ｆｌａｇ抗体と結合する８個のアミノ酸ペプチドに関する。本発明のＮ−アデノシルアジリジン誘導体に付加される場合、修飾された核酸分子または（ポリ）ペプチドは、固定化された抗ｆｌａｇ抗体を含むマトリックスを有する重力フローカラムを用いることによって、アフィニティ精製されうる。このようなマトリックスは、たとえばシグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から市販されている。
「ｃ−ｍｙｃータグ」の語は、抗ｃ−ｍｙｃ抗体と結合する１０個のアミノ酸ペプチドに関する。本発明のＮ−アデノシルアジリジン誘導体に付加される場合、修飾核酸分子または（ポリ）ペプチドは、固定化された抗ｃ−myc−タグ抗体を含むマトリックスを有する重力フローカラムを用いることによって、アフィニティ精製されうる。たとえばピアースバイオテクノロジー社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から市販されている（米国、イリノイ）。
「ＨＡ−タグ」の語は、インフルエンザウイルスの表面血球凝集素から誘導され、および抗ＨＡ抗体と結合する９個のアミノ酸ペプチドに関する。本発明のＮ−アデノシルアジリジン誘導体に付加される場合、修飾核酸分子または（ポリ）ペプチドは、たとえば固定化された抗ＨＡ抗体を含むマトリックスを有する重力フローカラムを用いることによってアフィニティ精製されうる。
「グルタチオン」の語は、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と結合するトリペプチドＬ−γ−グルタミル−Ｌ−システイニルグリシンに関する。本発明のＮ−アデノシルアジリジン誘導体に付加される場合、修飾核酸分子または（ポリ）ペプチドは、たとえば固定化されたグルタチオントランスフェラーゼを含むマトリックスを有する重力フローカラムを用いることによってアフィニティ精製されうる。
本発明の別の好ましい実施形態では、前記架橋剤は、マレイミド、イオドアセトアミド、またはその誘導体、またはアルデヒド誘導体、または光架橋剤である。好ましくは架橋剤は光架橋剤である。
本発明のより好ましい実施形態では、前記光架橋剤は、アリールアジド、ジアゾ化合物、ソラーレンまたはベンゾフェノン化合物である。好ましくは、光架橋剤はソラーレンである。
本発明の別の好ましい実施形態では、前記核酸切断試薬は、鉄−ＥＤＴＡ、アクリジンまたはその誘導体、またはロジウム複合体である。
本発明は、本発明の補助因子および、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）を補助因子として通常使用するメチルトランスフェラーゼの複合体にも関する。
本発明の好ましい実施形態では、前記メチルトランスフェラーゼがＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）のメチル残基を核酸分子または（ポリ）ペプチドへ通常転移させる。
本発明の好ましい実施形態では、前記メチルトランスフェラーゼが、オーファンＤＮＡメチルトランスフェラーゼまたは細菌制限修飾系の一部である。
前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、Ｍ．ＡａｃＤａｍ、Ｍ．ＡａｔＩＩ、Ｍ．ＡｂａＯＲＦＤＰ、Ｍ．ＡｂａＯＲＦＫＰ、Ｍ．ＡｂｒＩ、Ｍ．ＡｃｃＩ、Ｍ．ＡｃｃＩＩＩ、Ｍ．ＡｃｉＩ、Ｍ．ＡｃＩＩ、Ｍ．ＡｃｕＩ、Ｍ．Ａｆａ２２ＭＩ、Ｍ．ＡｆＩＩＩ、Ｍ．ＡｆＩＩＩＩ、Ｍ．ＡｇｅＩ、Ｍ．ＡｈｄＩ、Ｍ．ＡｈｙＢＰ、Ｍ．ＡｌａＫ２Ｉ、Ｍ．ＡｌｕＩ、Ｍ．ＡｌｗＩ、Ｍ．Ａｌｗ２６Ｉ、Ｍ．ＡｐａＩ、Ｍ．ＡｐａＬＩ、Ｍ．ＡｐｅＫＩ、Ｍ．ＡｐｏＩ、Ｍ．ＡｑｕＩ、Ｍ．ＡｓｃＩ、Ｍ．ＡｓｅＩ、Ｍ．ＡｓｅＩＩ、Ｍ．ＡｓｉＳＩ、Ｍ．ＡｓｐＣＮＩ、Ｍ．ＡｔｕＣＩ、Ｍ．ＡｔｕＣＯＲＦ１９９７Ｐ、Ｍ．ＡｔｕＤＯＲＦ７９４Ｐ、Ｍ．ＡｔｕＤＯＲＦ３８３９Ｐ、Ｍ．ＡｖａＩ、Ｍ．ＡｖａＩＩ、Ｍ．ＡｖａＩＩＩ、Ｍ．ＡｖａＩＶＰ、Ｍ．ＡｖａＶ、Ｍ．ＡｖａＶＩ、Ｍ．ＡｖａＶＩＩ、Ｍ．ＡｖａＶＩＩＩ、Ｍ．ＡｖａＩＸ、Ｍ．ＡｖａＯＲＦ３７００Ｐ、Ｍ．ＡｖａＯＲＦ７２７０Ｐ、Ｍ．ＡｖｒＩ、Ｍ．ＡｖｒＩＩ、Ｍ．ＢａｂＩ、Ｍ．ＢａｅＩ、Ｍ．ＢａＩＩ、Ｍ．ＢａｍＨＩ、Ｍ．ＢａｍＨＩＩ、Ｍ．ＢａｎＩ、Ｍ．ＢａｎＩＩ、Ｍ．ＢａｎＩＩＩ、Ｍ．ＢａｔＡＯＲＦ３８１４Ｐ、Ｍ．ＢａｔＡ５８１ＯＲＦ３８４６Ｐ、Ｍ．Ｂｂｕ２９７Ｉ、Ｍ．ＢｂｖＩ、Ｍ１．ＢｂｖＣＩ、Ｍ２．ＢｂｖＣＩ、Ｍ．ＢｂｖＳＩ、Ｍ１．ＢｃｃＩ、Ｍ２．ＢｃｃＩ、Ｍ．Ｂｃｅ１２４７Ｉ、Ｍ１．ＢｃｅＡＩ、Ｍ２．ＢｃｅＡＩ、Ｍ．Ｂｃｅ１４５７９ＯＲＦ９３９Ｐ、Ｍ．ＢｃｅＳＯＲＦ３６５Ｐ、Ｍ．ＢｃｅＳＯＲＦ４６０５Ｐ、Ｍ１．ＢｃｅＳＯＲＦ５６０６Ｐ、Ｍ２．ＢｃｅＳＯＲＦ５６０６Ｐ、Ｍ．Ｂｃｅｐ１Ｐ、Ｍ．Ｂｃｅｐ４３ＯＲＦＡＰ、Ｍ．ＢｃｈＩ、Ｍ．ＢｃＩＩ、Ｍ１．ＢｃｎＩ、Ｍ２．ＢｃｎＩ、Ｍ１．ＢｃｏＫＩ、Ｍ２．ＢｃｏＫＩ、Ｍ．Ｂｃｓ１３９Ｐ、Ｍ．ＢｄｉＩ、Ｍ．ＢｅｐＩ、Ｍ１．ＢｆａＩ、Ｍ２．ＢｆａＩ、Ｍ．ＢｆａＯＲＦＣ１５７Ｐ、Ｍ１．ＢｆｕＡＩ、Ｍ２．ＢｆｕＡＩ、Ｍ．ＢｇＩＩ、Ｍ．ＢｇＩＩＩ、Ｍ１．ＢｈａＩ、Ｍ２．ＢｈａＩ、Ｍ．ＢｈａＩＩ、Ｍ．ＢｊａＯＲＦ２５０９Ｐ、Ｍ．ＢｌｏＮＯＲＦ５６４Ｐ、Ｍ．ＢｌｏＮＯＲＦ１４７３Ｐ、Ｍ．ＢｌｐＩ、Ｍ．ＢｍａＩ、Ｍ．ＢｍａＰｈｉＥ１２５ＯＲＦ５６Ｐ、Ｍ．Ｂｍｅ２１６Ｉ、Ｍ．ＢｍｅＬＯＲＦ１４４４Ｐ、Ｍ．ＢｍｅＴＩ、Ｍ１．ＢｍｒＩ、Ｍ２．ＢｍｒＩ、Ｍ．ＢｎａＩ、Ｍ．ＢｐｍＩ、Ｍ１．Ｂｐｕ１０Ｉ、Ｍ２．Ｂｐｕ１０Ｉ、Ｍ１．ＢｓａＩ、Ｍ２．ＢｓａＩ、Ｍ．ＢｓａＡＩ、Ｍ．ＢｓａＪＩ、Ｍ．ＢｓａＷＩ、Ｍ１．ＢｓｃＧＩ、Ｍ２．ＢｓｃＧＩ、Ｍ．Ｂｓｅ６３４Ｉ、Ｍ．ＢｓｅＣＩ、Ｍ．ＢｓｅＤＩ、ＢｓｅＭＩＩ、ＢｓｅＲＩ、Ｍ．ＢｓｅＲＩ、Ｍ．ＢｓｅＹＩ、ＢｓｇＩ、Ｍ．ＢｓｇＩ、Ｍ．ＢｓｉＷＩ、Ｍ．ＢｓＩＩ、Ｍ１．ＢｓｍＩ、Ｍ２．ＢｓｍＩ、Ｍ．ＢｓｍＡＩ、Ｍ．ＢｓｍＢＩ、Ｍ．ＢｓｏＢＩ、Ｍ．ＢｓｐＩ、Ｍ．Ｂｓｐ６Ｉ、Ｍ．Ｂｓｐ５０Ｉ、Ｍ．Ｂｓｐ９８Ｉ、Ｍ．Ｂｓｐ１０６Ｉ、Ｍ．Ｂｓｐ１４３ＩＩ、ＢｓｐＣＮＩ、Ｍ．ＢｓｐＣＮＩ、Ｍ．ＢｓｐＥＩ、Ｍ．ＢｓｐＨＩ、Ｍ．ＢｓｐＩＳ４Ｉ、Ｍ．ＢｓｐＫＴ６Ｉ、ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ、Ｍ１．ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ、Ｍ２．ＢｓｐＵ１１ＩＩＩ、Ｍ１．ＢｓｐＭＩ、Ｍ２．ＢｓｐＭＩ、Ｍ．ＢｓｐＭＩＩ、Ｍ．ＢｓｐＲＩ、Ｍ．ＢｓｐＳＴ５Ｉ、Ｍ１．ＢｓｒＩ、Ｍ２．ＢｓｒＩ、Ｍ１．ＢｓｒＢＩ、Ｍ２．ＢｓｒＢＩ、Ｍ．ＢｓｒＦＩ、Ｍ．ＢｓｓＨＩ、Ｍ．ＢｓｓＨＩＩ、Ｍ．ＢｓｓＳＩ、Ｍ．ＢｓｔＩ、Ｍ．ＢｓｔＥＩＩ、Ｍ．ＢｓｔＥＩＩＩ、Ｍ１．ＢｓｔＦ５Ｉ、Ｍ２．ＢｓｔＦ５Ｉ、Ｍ３．ＢｓｔＦ５Ｉ、Ｍ４．ＢｓｔＦ５Ｉ、Ｍ．ＢｓｔＧＩＩ、Ｍ．ＢｓｔＬＶＩ、Ｍ．ＢｓｔＮＩ、Ｍ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｍ．ＢｓｔＶＩ、Ｍ．ＢｓｔＸＩ、Ｍ．ＢｓｔＹＩ、Ｍ．Ｂｓｕ１５Ｉ、Ｍ．Ｂｓｕ３６Ｉ、Ｍ．Ｂｓｕ６６３３Ｉ、Ｍ．ＢｓｕＢＩ、Ｍ．ＢｓｕＥＩＩ、Ｍ．ＢｓｕＦＩ、Ｍ．Ｂｓｕ１３３０ＯＲＦ４９１Ｐ、Ｍ．ＢｓｕＲＩ、Ｍ．ＢｔｈＩＰＳ７８、Ｍ．ＢｔｈＶＯＲＦ４６２５Ｐ、Ｍ．ＢｕｓＬＢＯＲＦＣ７４７Ｐ；Ｍ．ＢｕｓＬＢＯＲＦＣ７５５Ｐ、Ｍ．Ｃａｃ８Ｉ、Ｍ．Ｃａｃ８２４Ｉ、Ｍ．Ｃａｃ８２４ＯＲＦ３３５８Ｐ、Ｍ．ＣａｕＪＯＲＦＣ１０１Ｐ、Ｍ．ＣａｕＪＯＲＦＣ１０２Ｐ、Ｍ．ＣａｕＪＯＲＦＣ１０３Ｐ、Ｍ．ＣａｕＪＯＲＦＣ１０４Ｐ、Ｍ．ＣａｕＪＯＲＦＣ１０７Ｐ、Ｍ．ＣａｕＪＯＲＦＣ１１０Ｐ、Ｍ．ＣａｕＪ０ＲＦＣ１１１Ｐ、Ｍ．ＣｂｏＩ、Ｍ．ＣｃｒＭＩ、Ｍ．Ｃｄｉ６３０Ｉ、Ｍ．ＣｄｉＣＤ６Ｉ、Ｍ．ＣｄｉＣＤ６ＩＩ、Ｍ．Ｃｄｉ６３０ＯＲＦＣ８９８Ｐ、Ｍ．ＣｅｆＯＲＦ１４９３Ｐ、Ｍ．ＣｅｑＩ、Ｍ．ＣｆｒＩ、Ｍ．Ｃｆｒ６Ｉ、Ｍ．Ｃｆｒ９Ｉ、Ｍ．Ｃｆｒ１０Ｉ、Ｍ．Ｃｆｒ１３Ｉ、Ｍ．Ｃｆｒ４２Ｉ、Ｍ．ＣｆｒＡＩ、Ｍ．ＣｆｒＢＩ、Ｍ．ＣｇＩＩ、Ｍ．ＣｇＩＡＳＩ、Ｍ．ＣｇＩＬＰ６Ｐ、Ｍ．ＣｊｅＮＩ、Ｍ．Ｃｊｅ８１１１６ＯＲＦＢＰ、Ｍ．Ｃｊｅ８１１１６ＯＲＦＣＰ、Ｍ．ＣｌａＩ、Ｍ．Ｃｓｐ６Ｉ、Ｍ．Ｃｓｐ６８ＫＩ、Ｍ．Ｃｓｐ６８ＫＩＶ、Ｍ．Ｃｓｐ６８ＫＶ、Ｍ．ＣｔｅＥＯＲＦ３８７Ｐ、Ｍ．ＣｔｈＯＲＦＳ２６Ｐ、Ｍ．ＣｔｈＯＲＦＳ３４Ｐ、Ｍ．ＣｔｈＯＲＦＳ９３Ｐ、Ｍ．ＣｖｉＡＩ、Ｍ．ＣｖｉＡＩＩ、Ｍ．ＣｖｉＡＩＶ、Ｍ．ＣｖｉＢＩ、Ｍ．ＣｖｉＢＩＩ、Ｍ．ＣｖｉＢＩＩＩ、Ｍ．ＣｖｉＪＩ、Ｍ．ＣｖｉＯＲＦ５Ｐ、Ｍ．ＣｖｉＯＲＦ２１１１Ｐ、Ｍ．ＣｖｉＰＩ、Ｍ．ＣｖｉＱＩ、Ｍ．ＣｖｉＱＩＩ、Ｍ．ＣｖｉＱＩＩＩ、Ｍ．ＣｖｉＱＩＶＰ、Ｍ．ＣｖｉＱＶＰ、Ｍ．ＣｖｉＱＶＩ、Ｍ．ＣｖｉＱＶＩＩ、Ｍ．ＣｖｉＱＶＩＩＩＰ、Ｍ．ＣｖｉＱＩＸＰ、Ｍ．ＣｖｉＱＸＰ、Ｍ．ＣｖｉＱＸＩ、Ｍ．ＣｖｉＲＩ、Ｍ．ＣｖｉＲＩＩ、Ｍ．ＣｖｉＳＩ、Ｍ．ＣｖｉＳＩＩ、Ｍ．ＣｖｉＳＩＩＩ、Ｍ．ＣｖｉＳＩＶＰ、Ｍ．ＣｖｉＳＶＰ、Ｍ．ＣｖｉＳＶＩＰ、Ｍ．ＣｖｉＴＩ、Ｍ．ＤｄｅＩ、ＤｈａＯＲＦＣ１３５Ｐ、Ｍ１．ＤｐｎＩＩ、Ｍ２．ＤｐｎＩＩ、Ｍ．ＤｒａＩ、Ｍ．ＤｒａＩＩ、Ｍ．ＤｒａＩＩＩ、Ｍ．ＤｓａＶ、Ｍ．ＤｖｕＯＲＦ１９Ｐ、Ｍ．ＤｖｕＯＲＦ２８４２Ｐ、Ｍ．ＥａｃＩ、Ｍ．ＥａｅＩ、Ｍ．ＥａｇＩ、Ｍ１．ＥａｒＩ、Ｍ２．ＥａｒＩ、Ｍ．ＥｃａＩ、Ｍ．Ｅｃｌ１８ｋＩ、Ｍ．Ｅｃｏ３２Ｉ、Ｍ．Ｅｃｏ４７ＩＩ、Ｍ．Ｅｃｏ４７ＩＩＩ、Ｍ．Ｅｃｏ５６Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｍ．Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｍ．Ｅｃｏ６４Ｉ、Ｍ．Ｅｃｏ７２Ｉ、Ｍ．Ｅｃｏ８８Ｉ、Ｍ．Ｅｃｏ９８Ｉ、Ｍ．Ｅｃｏ１０５Ｉ、Ｍ．Ｅｃｏ１４７Ｉ、Ｍ．Ｅｃｏ２３１Ｉ、Ｍ．Ｅｃｏ２５５Ｉ、Ｍ．Ｅｃｏ５３６Ｐ、Ｍ．Ｅｃｏ１６３９Ｐ、Ｍ．Ｅｃｏ１８３１Ｉ、Ｍ．Ｅｃｏ２４８５３４Ｐ、Ｍ．ＥｃｏＡＩ、Ｍ．ＥｃｏＢＩ、Ｍ．ＥｃｏＣＦＴＤａｍＰ、Ｍ．ＥｃｏＣＦＴＤａｍ２Ｐ、Ｍ．ＥｃｏＣＦＴＤａｍ３Ｐ、Ｍ．ＥｃｏＣＦＴＤｃｍＰ、Ｍ．ＥｃｏＤＩ、Ｍ．ＥｃｏＤＲ２、Ｍ．ＥｃｏＤＲ３、Ｍ．ＥｃｏＤＸＸＩ、Ｍ．Ｅｃｏ６７Ｄａｍ、Ｍ．ＥｃｏＥＩ、Ｍ．ＥｃｏＨＩ、Ｍ．ＥｃｏＨＫ３１Ｉ、Ｍ．ＥｃｏＫＩ、Ｍ．ＥｃｏＫＩＩ、Ｍ．ＥｃｏＫＤａｍ、Ｍ．ＥｃｏＫＤｃｍ、Ｍ．ＥｃｏＫＯ１５７ＤａｍＰ、Ｍ．ＥｃｏＫＯ１５７Ｄａｍ２Ｐ、Ｍ．ＥｃｏＫＯ１５７Ｄａｍ３Ｐ、Ｍ．ＥｃｏＫＯ１５７ＤｃｍＰ、Ｍ．ＥｃｏＫＯ１５７ＯＲＦ１９５３Ｐ、Ｍ．ＥｃｏＬａｈｎ１Ｐ、Ｍ．ＥｃｏＬａｈｎ３Ｐ、Ｍ．ＥｃｏＮＩ、Ｍ．ＥｃｏＮｉ１２Ｐ、Ｍ．ＥｃｏＯ１０９Ｉ、Ｍ．ＥｃｏＯ１５７ＤａｍＰ、Ｍ．ＥｃｏＯ１５７ＤｃｍＰ、Ｍ．ＥｃｏＯ１５７０ＲＦ１４５４Ｐ、Ｍ．ＥｃｏＯ１５７ＯＲＦ２３８９Ｐ、Ｍ．ＥｃｏＯ１５７ＯＲＦ３３４９Ｐ、Ｍ．Ｅｃｏ５３６ＯＲＦ３Ｐ、Ｍ．ＥｃｏＰＩ、Ｍ．ＥｃｏＰ１５Ｉ、Ｍ．ＥｃｏＰ１Ｄａｍ、Ｍ．ＥｃｏＰｈｉ４７９５ＤａｍＰ、Ｍ．ＥｃｏＲＩ、Ｍ．ＥｃｏＲＩＩ、Ｍ．ＥｃｏＲＶ、Ｍ．ＥｃｏＲ１２４Ｉ、Ｍ．ＥｃｏＲ１２４ＩＩ、Ｍ．ＥｃｏＲＤ２、Ｍ．ＥｃｏＲＤ３、Ｍ．ＥｃｏＳｔｘ１ＤａｍＰ、Ｍ．ＥｃｏＳｔｘ２ＤａｍＰ、Ｍ．ＥｃｏＴ２２Ｉ、Ｍ．ＥｃｏＴ３８Ｉ、Ｍ．ＥｃｏＴ１Ｄａｍ、Ｍ．ＥｃｏＴ２Ｄａｍ、Ｍ．ＥｃｏＴ４Ｄａｍ、Ｍ．ＥｃｏＶＩＩＩ、Ｍ．ＥｃｏＶＴ２Ｄａｍ、Ｍ．ＥｃｏＷｐｈｉＰ、Ｍ．Ｅｃｏ２９ｋＩ、Ｍ．ＥｃｏｐＨＳＨＰ、Ｍ．ＥｃｏｐＨＳＨ２Ｐ、Ｍ．ＥｃｏｐｒｒＩ、Ｍ．ＥｆａＨＧＳＯＲＦＨＰ、Ｍ．ＥｐｈＰ１０ＲＦ１Ｐ、Ｍ．ＥｓａＢＣ１Ｉ、Ｍ．ＥｓａＢＣ３Ｉ、Ｍ．ＥｓａＢＣ４Ｉ、Ｍ．ＥｓａＢＳ１Ｉ、Ｍ．ＥｓａＢＳ９Ｉ、Ｍ．ＥｓａＤｉｘ１Ｉ、Ｍ．ＥｓａＤｉｘ２Ｉ、Ｍ．ＥｓａＤｉｘ３Ｉ、Ｍ．ＥｓａＤｉｘ４Ｉ、Ｍ．ＥｓａＤｉｘ５Ｉ、Ｍ．ＥｓａＤｉｘ６Ｉ、Ｍ．ＥｓａＤｉｘ７Ｉ、Ｍ．ＥｓａＬＨＣＩ、Ｍ．ＥｓａＬＨＣＩＩＩ、Ｍ．ＥｓａＲＭ１Ｐ、Ｍ．ＥｓａＲＭ１３Ｐ、Ｍ．ＥｓａＲＭ１６Ｐ、Ｍ．ＥｓａＲＭ１７Ｐ、Ｍ．ＥｓａＲＭ２１Ｐ、Ｍ．ＥｓａＲＭ３８Ｐ、Ｍ．ＥｓａＲＭ６１Ｐ、Ｍ．ＥｓａＲＭ６３Ｐ、Ｍ．ＥｓａＲＭ６５Ｐ、Ｍ．ＥｓａＲＭ６７Ｐ、Ｍ．ＥｓａＲＭ６９Ｐ、Ｍ１．ＥｓａＳ１Ｉ、Ｍ２．ＥｓａＳ１Ｉ、Ｍ．ＥｓａＳ３Ｉ、Ｍ．ＥｓａＳ４Ｉ、Ｍ．ＥｓａＳ６Ｉ、Ｍ．ＥｓａＳ７Ｉ、Ｍ．ＥｓａＳ８Ｉ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ５Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１２Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１３Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１５Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１６Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１８Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１９Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２２Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ３０Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ３１Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ３５Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ３６Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ４０Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ４３Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ４７Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ４８Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ４９Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ５２Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ５５Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ５７Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ６７Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ６９Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ７０Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ７１Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ７２Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ７３Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ７４Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ７５Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ７６Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ７９Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ８１Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ８３Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ８７Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ８８Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ９０Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ９６Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ９７Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１０３Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１０４Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１０５Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１０６Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１０７Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１０８Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１０９Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１１０Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１１１Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１１３Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１１７Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１２０Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１２３Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１２６Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１３０Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１３１Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１３４Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１３６Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１３７Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１４４Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１４５Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１５０Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１５３Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１５４Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１５５Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１５６Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１６０Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１６３Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１６５Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１６７Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１６９Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１７０Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１７２Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１７４Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１７７Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１８１Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１８２Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１８６Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１８７Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１９２Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ１９５Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２００Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２１４Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２１５Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２１６Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２１８Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２２１Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２２２Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２２３Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２２５Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２２８Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２３７Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２３８Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２４１Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２４４Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２４５Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２４６Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２４７Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２５４Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２５９Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２６４Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２６６Ｐ、Ｍ．ＥｓａＳＳ２６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本発明のより好ましい実施形態では、メチルトランスフェラーゼはＤＮＡメチルトランスフェラーゼＭ．ＨｈａＩ、Ｍ．ＴａｑＩ、Ｍ．ＢｓｅＣＩおよびＭ．ＳｓｓＩから選択される。
本発明は、本発明の補助因子および本発明において定義された通りのメチルトランスフェラーゼまたは本発明の複合体を含むキットにも関する。キットのさまざまな化合物は、一つ以上の容器に詰めてもよく、保管のために適切な緩衝剤の中で随意的に溶解される。使用のための指示を記載した小冊子を追加してもよい。
本発明は、本発明の補助因子または本発明の複合体および随意的に薬学的に許容可能なキャリヤーを含む医薬品組成物にも関する。
本発明は、本発明の補助因子または本発明の複合体を含む診断組成物にも関する。
診断組成物の主な溶媒は水系である。加えて、組成物は、処方のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、無菌性、安定性、溶解速度、または匂いを改変または維持するために、他の成分またはキャリヤーを含みうる。同様に、組成物は、診断組成物の安定性、溶解、放出、または吸収の速度を改変または維持するために、医薬品として許容されるさらに別の成分を含みうる。診断組成物はいったん処方されれば、溶液、懸濁液、ゲル、乳液、固体、または脱水または凍結乾燥された粉末として無菌バイアル中で保存されうる。そのような処方は、すぐ使用できる形で、または使用直前に再構成を必要とする形で保存されうる。
本発明は、ＤＮＡ分子中の配列特異メチル化の検出のための本発明の補助因子または本発明の複合体の使用にも関する。典型的な使用は、本明細書中に記載されている方法といった本発明の教示による方法である。
本発明は、ＤＮＡメチル化の増加または減少を伴う疾患の診断のための、本発明の補助因子または本発明の複合体の使用にも関する。
本明細書中に用いられる「ＤＮＡメチル化の増加または減少を伴う疾患」の語は特にがんまたはＩＣＦ症候群といった疾患をいう。
本発明は、ＤＮＡメチル化の増加または減少を伴う疾患の診断用の診断組成物の調製のための、本発明の補助因子または本発明の複合体の使用にも関する。
本発明の好ましい実施形態では、前記疾患はがんまたはＩＣＦ症候群である。
好ましくは、がんは、乳がん、大腸がん、心臓腫瘍、膵がん、黒色腫、網膜芽腫、神経膠芽腫、肺がん、腸がん、精巣がん、胃がん、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫または腺腫からなる群から選択される。
本発明は、実施例に制限されることなく、下記の実施例によってさらに説明される。
実施例１：ビオチン化アジリジン補助因子１（Ａ）、２（Ｂ）および３（Ｃ）の二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ・ＩＩとのＭ．ＨｈａＩに触媒されるカップリング
ビオチン基がアデニン環の７位に結合したアジリジン補助因子１および２またはビオチン基が６位に結合したアジリジン補助因子３は、Ｍ．ＨｈａＩの良好な基質である（スキーム１）。これは図１に示される。
アジリジン補助因子１、２または３（３２ｎｍｏｌ、８０μＭ）、二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ・ＩＩ（４ｎｍｏｌ、１０μＭ）およびＭ．ＨｈａＩ（４．４ｎｍｏｌ、１１μＭ）を含む緩衝液（１ＯｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４、５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸および２ｍＭβ−メルカプトエタノール）の溶液（４００μＬ）を３７℃にてインキュベートした。カップリング反応の進行は陰イオン交換ＨＰＬＣ（ポロス（Ｐｏｒｏｓ）１０ＨＱ、１０μｍ、４．６ｘ１０ｍｍ、アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））によって監視した。化合物を塩化カリウム水溶液（０．２Ｍ５分間、次いで５分間で０．４Ｍへ、２０分間で０．６Ｍへ、および５分間で１Ｍへの直線グラジエント）を含むトリス塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．６）で流速４ｍＬ／分で溶出した。１、２または３をＩ・ＩＩおよびＭ．ＨｈａＩと混合した直後、保持時間の短い化合物が１および２と共に、開始二本鎖Ｉ・ＩＩに加えて観察された。異なるインキュベート時間後、三種類すべての補助因子についてこれらの新しい化合物へのほぼ完全な変換が観察され、およびＭ．ＨｈａＩ無しの平行対照実験では新しい化合物の形成は起こらなかった（記載せず）。これらの新しい化合物は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの紫外吸収率に基づいて、Ｍ．ＨｈａＩとカップリング産物Ｉ1・ＩＩ、Ｉ2・ＩＩおよびＩ3・ＩＩとの間の非共有タンパク質−ＤＮＡ複合体が割り当てられる。カップリング産物Ｉ1・ＩＩ、Ｉ2・ＩＩおよびＩ3・ＩＩは６５℃で３０分間のインキュベートによってタンパク質−ＤＮＡ複合体から放出され、および開始二本鎖Ｉ・ＩＩと比較して、修飾二本鎖についてわずかに短い保持時間が観察された。
Ｉ1・ＩＩ、Ｉ2・ＩＩおよびＩ3・ＩＩ中のビオチン基の存在および機能性はストレプトアビジンの添加によって検証された。残存するアジリジン補助因子１、２または３が最初に、標識化二本鎖Ｉ1・ＩＩ、Ｉ2・ＩＩまたはＩ3・ＩＩから、ＮＡＰ−５カラム（アマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），ドイツ・フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ））を用いたゲル濾過によって取扱説明書に従って除去された。その後、ストレプトアビジン（２５μｇ）を溶液（２５μＬ，Ｉ1・ＩＩ、Ｉ2・ＩＩまたはＩ3・ＩＩ０．２５ｎｍｏｌ）に加え、およびインキュベートを３７℃にて３０分間実施した。陰イオン交換ＨＰＬＣ（上記参照）は、ストレプトアビジンとビオチン化二本鎖Ｉ1・ＩＩ、Ｉ2・ＩＩおよびＩ3・ＩＩとの間の複合体の形成に合致する、保持時間の短い新しい主要な化合物を示した。これらの複合体に加えて、少量の開始二本鎖Ｉ・ＩＩが三例すべてで観察され、それは産物二本鎖だけがストレプトアビジンと密に相互作用できることを実証する。
スキーム１：ビオチン化アジリジン補助因子１、２および３の、低分子二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ・ＩＩとのＭ．ＨｈａＩに触媒されるカップリング（Ｍ＝５−メチル−２’−デオキシシチジン）。
Figure 0004886679
実施例２：ＤＮＡメチル化の特異的検出
アジリジン補助因子１およびＭ．ＨｈａＩとの反応を用いて、プラスミドＤＮＡのＤＮＡメチル化を特異的に検出した（図２）。実験はＲ．ＸｍｎＩ−直線化プラスミドｐＵＣ１９ＤＮＡ（ＬｐＵＣ１９）を用いて実施した。ＬｐＵＣ１９の５’−ＣＧ−３’ＤＮＡ配列（ＣｐＧモチーフ）内のシトシン残基を、ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼＭ．ＳｓｓＩおよび天然補助因子ＡｄｏＭｅｔを用いてメチル化した。非メチル化およびＣｐＧメチル化ＬｐＵＣ１９を、ビオチン化アジリジン補助因子１および、５’−ＧＣＧＣ−３’ＤＮＡ配列内の最初のシトシン残基が内部のＣｐＧモチーフのメチル化によってブロックされていなければこの残基だけをアルキル化できるＭ．ＨｈａＩで処理した。異なるプラスミドを次いで制限エンドヌクレアーゼＲ．ＨｈａＩ（５’−ＧＣＧＣ−３’認識配列）またはストレプトアビジン（ビオチン基と密に結合）を用いた処理によって分析し、結果として断片化、無反応または電気泳動移動度シフトを生じた（図２Ａ）。直線化プラスミドＤＮＡＬｐＵＣ１９のメチル化感受性酵素的ビオチン化はアガロースゲル電気泳動によって実証される（図２Ｂ）。
Ａ．ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡの直線化
ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ（１０μｇ）の直線化は、制限エンドヌクレアーゼＲ．ＸｍｎＩ（１００Ｕ）を含む緩衝液（４０μＬ、１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ １，４−ジチオスレイトールおよび１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン）中でおよび３７℃にて１時間のインキュベーションで実施した。
Ｂ．ＣｐＧ−メチル化
直線化ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡＬｐＵＣ１９（６μｇ、Ａから）のＣｐＧ−メチル化を、Ｍ．ＳｓｓＩ（２．４μｇ）およびＡｄｏＭｅｔ（１６０μＭ）を含む緩衝液（４０μＬ、１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．９、６ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ １，４−ジチオスレイトールおよび０．６ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン）を用いて３７℃にて１時間実施した。反応は６５℃へ２０分間加熱することにより停止した。メチル化ＬｐＵＣ１９は、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）、ドイツ・ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））を用いて取扱説明書に従って精製し、およびトリス塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．５）で溶出した。
Ｃ．アジリジン補助因子１およびＭ．ＨｈａＩを用いた処理
非メチル化およびＣｐＧメチル化ＬｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ（各２μｇ、Ａ．またはＢ由来）、アジリジン補助因子１（８０μＭ）およびＭ．ＨｈａＩ（３８ｐｍｏｌ）を含む緩衝液（１００μｌ、１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４、５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸および２ｍＭβ−メルカプトエタノール）を３７℃にて２時間、および次いで６５℃にて２０分間インキュベートした。プラスミドＤＮＡはキアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）、ドイツ・ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））を用いて精製し、およびトリス塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．５）で溶出した。
Ｄ．制限エンドヌクレアーゼ保護による分析
未修飾（Ａ．）、メチル化（Ｂ．またはＣ．）またはビオチン化（Ｃ．）ＬｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ（２００ｎｇ）を含む緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ １，４−ジチオスレイトールおよび１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン）の試料（１０μＬ）をＲ．ＨｈａＩ（２Ｕ）と共に３７℃にて１時間インキュベートした。ＤＮＡ断片化をアガロースゲル電気泳動（１％アガロースゲル）によって分析した。Ｒ．ＨｈａＩによる断片化は未修飾ＬｐＵＣ１９（Ａ．）についてだけ起こった一方、メチル化（Ｂ．またはＣ．）またはビオチン化（Ｃ．）ＬｐＵＣ１９はＲ．ＨｈａＩによる切断に対して保護された（図２Ｂ，レーン２）。この結果はＬｐＵＣ１９の完全な修飾を支持する。
Ｅ．ストレプトアビジンの結合による機能性ビオチン化分析
未修飾（Ａ．）、メチル化（Ｂ．またはＣ．）またはビオチン化（Ｃ．）ＬｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ（２００ｎｇ）を含むトリス塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．５）の試料（１０μＬ）をストレプトアビジン（５μｇ）と共に３７℃にて１時間インキュベートした。ストレプトアビジンの結合を、アガロースゲル電気泳動（１％アガロースゲル）を用いた電気泳動移動度シフト検定によって分析した。ストレプトアビジンの存在下で（図２Ｂ、レーン３）、ストレプトアビジンの結合によって生じた電気泳動移動度の低下はビオチン化ＬｐＵＣ１９（Ｃ．）だけで観察された一方、未修飾ＬｐＵＣ１９（Ａ．）、メチル化ＬｐＵＣ１９（Ｂ．）またはアジリジン補助因子１およびＭ．ＨｈａＩで処理したメチル化ＬｐＵＣ１９（Ｃ．）は電気泳動移動度が変化しなかった。この結果は、アジリジン補助因子１およびＭ．ＨｈａＩを用いた標識化反応は配列特異的でありおよびＣｐＧ−メチル化によって遮断されることを明らかに支持する。したがって、この系は、非メチル化およびＣｐＧ−メチル化ＤＮＡ配列を識別するのに用いることができる。
実施例３：アジリジン補助因子１の合成
補助因子１の合成はスキーム２に示す通り実施された。合成の詳細を下記に示す（プリンについてのＩＵＰＡＣ番号が用いられている）。
Figure 0004886679
 スキーム２：アジリジン補助因子１の合成。
Ａ．７−（５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−クロロ−５−ヨード−７Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン、化合物４
水酸化カリウム粉末（２８０ｍｇ，５．０ｍｍｏｌ）を含む乾燥アセトニトリル（１５ｍＬ）の懸濁液へ、アルゴン雰囲気下でトリス[２−（２−メトキシエトキシ）−エチル]アミン（ＴＤＡ−１）（２００μＬ，０．６ｍｍｏｌ）を加え、および混合物を室温にて３０分間撹拌した。その後、４−クロロ−５−ヨード−７Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン（グーレイン（Ｇｏｕｒｌａｉｎ）他，（２００１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９，１８９８−１９０５）（５００ｍｇ，１．７９ｍｍｏｌ）を加え、および懸濁液をさらに３０分間撹拌した。その後、５−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−リボフラノシル塩化物（ローズマイヤー（Ｒｏｓｅｍｅｙｅｒ）およびシーラ（Ｓｅｅｌａ），（１９９８） Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７１ ，１５７３−１５８５）（３．６１ｍｍｏｌ）を含むテトラヒドロフラン（８ｍＬ）の新規に調製された溶液を加え、および反応混合物を室温にて２日間撹拌した。懸濁液を、酢酸エチル（６０ ｍＬ）を加えて希釈し、および濾紙を通した。溶媒を減圧下で除去し、および粗産物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン１５：８５で溶出）によって精製し、淡黄色のオイルとしてヌクレオシド４（４３１ｍｇ、４３％）（Ｒｆ０．４３、酢酸エチル／ヘキサン２０：８０）を与えた。
1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ＝０．１２（ｓ，３Ｈ，ＳｉＣＨ3ａ），０．１２（ｓ，３Ｈ，ＳｉＣＨ3ｂ），０．９２（ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ3）3），１．３８（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ3ａ），１．６５（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ3ｂ），３．８１（ｄｄ，2Ｊ＝１１．２９Ｈｚ，3Ｊ＝３．０５Ｈｚ，１ Ｈ１ Ｈ５’ａ），３．９２（ｄｄ，2Ｊ＝１１．６０Ｈｚ，3Ｊ＝２．７５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ５’ｂ），４．４０（ｑ，3Ｊ＝２．７５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ４’），４．９０（ｄｄ，3Ｊ＝２．４４Ｈｚ，3Ｊ＝６．１０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３’），４．９４（ｄｄ，3Ｊ＝３．０５Ｈｚ，3Ｊ＝６．１０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ２’），６．４３（ｄ，3Ｊ＝３．０５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’），７．７８（ｓ，１Ｈ，Ｈ６），８．６５（ｓ，１Ｈ，Ｈ２）；13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ＝−５．３７９（ＳｉＣＨ3ａ），−５．２１９（ＳｉＣＨ3Ｄ），１８．４２７ （ＳｉＣ（ＣＨ3）3），２５．３７６（イソプロピリデン−ＣＨ3ａ），２５．９８３ （ＳｉＣ（ＣＨ2）3），２７．３１８（イソプロピリデン−ＣＨ3ｂ），５２．１２５（Ｃ５），６３．４８１（Ｃ５’，８０．７８５（Ｃ４’，８５．３８３（Ｃ３’，８６．１９４（Ｃ２’，９０．７６９（Ｃ１’），１１４．０２０（イソプロピリデン−Ｃ（ＣＨ3）2），１１７．２３７（Ｃ９），１３１．８８６（Ｃ６），１５０．２５２（Ｃ２），１５０．８５９（Ｃ８），１５２．３９９（Ｃ４）。
Ｂ．４−クロロ−５−ヨード−７−（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシル）−７Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン、化合物５
ヌクレオシド４（３４８ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）を含むテトラヒドフランの溶液（１０ｍＬ）を０℃へ冷却した。フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）（２９１ｍＬ、０．９２ｍｍｏｌ）を加えた後、反応混合物を０℃にて２時間撹拌した。反応混合物を室温まで温め、および溶媒を減圧下で除去した。残渣を酢酸エチル（１０ｍＬ）中で溶解し、有機層を水（２ｍＬ）およびおよび塩水（２ｍｌ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、および溶媒を減圧下で除去した。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン４０：６０で溶出）による精製によって、目的の化合物５（１９２ｍｇ、６９％）を淡黄色の泡[Ｒf０．２３、酢酸エチル／ヘキサン４０：６０）として与えた。
1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ＝１．３７（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ3ａ），１．６４（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ3ｂ），３．８１（ｔ，2Ｊ＝3Ｊ＝１０．６８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ５’ａ），３．９５（ｄｄ，2Ｊ＝１２．５１Ｈｚ，3Ｊ＝１．８３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ５’ｂ），４．４７−４．４９（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），４．７６（ｄ，3Ｊ＝１０．０７Ｈｚ，１Ｈ，５’―ＯＨ），５．０９（ｄｄ，3Ｊ＝２．１４，3Ｊ＝６．１０，１Ｈ，Ｈ３’），５．１９（ｄｄ，3Ｊ＝４．８８Ｈｚ，3Ｊ＝６．１０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ２’），５．８８（ｄ，3Ｊ＝４．８８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’），７．５１（ｓ，１Ｈ，Ｈ６），８．６３（ｓ，１Ｈ，Ｈ２）；13Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣＩ3）：δ＝２５．２９８（イソプロピリデン−ＣＨ3ａ），２７．５４２（イソプロピリデン−ＣＨ3ｂ），５１．９４１（Ｃ５），６３．０８５（Ｃ５’），８１．１６２（Ｃ４’），８３．２７９（Ｃ３’），８５．７６２（Ｃ２’），９４．５８２（Ｃ１’），１１４．４３６（イソプロピリデン−Ｃ（ＣＨ3）2），１１８．７１９（Ｃ９），１３４．５５１（Ｃ６），１４９．５５８（Ｃ２），１５０．５９７（Ｃ８），１５３．６７４（Ｃ４）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：４５２．３（９）［Ｍ＋Ｈ］+，２８０．５（１００）［４−クロロ−５−ヨード−７−Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン＋Ｈ］+。
Ｃ．４−アミノ−５−ヨード−７−（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシル）−７Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン、化合物６
ヌクレオシド５（９８１ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を含むメタノール溶液（８０ｍＬ）を０℃へ冷却し、気体アンモニアで飽和した。事前に冷却したオートクレーブに溶液を充填し、封止し、８０〜８５℃で一夜加熱した。オートクレーブを室温まで冷却し、溶液を除去し、および溶媒を減圧下で蒸発させた。粗産物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、メタノール／塩化メチレン５：９５で溶出）によって精製し、ヌクレオシド６（５５７ｍｇ、５９％）を淡黄色の泡（Ｒf０．２１、メタノール／塩化メチレン５：９５）として与えた。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，［Ｄ6］ＤＭＳＯ）：δ＝１．３１（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ3ａ），１．５３（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ3ｂ），３．４９−３．５９（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’），４．１０−４．１３（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），４．９０（ｄｄ，3Ｊ＝３．０２Ｈｚ，3Ｊ＝６．３２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３’），５．１１（ｄｄ，3Ｊ＝３．２９Ｈｚ，3Ｊ＝６．３１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ２’），５．１６（ｔ，3Ｊ＝５．４９Ｈｚ，５’−ＯＨ），６．１９（ｄ，3Ｊ＝３．３０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’），６．７６（ｓ，ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ2），７．６９（ｓ，１Ｈ，Ｈ６）；13Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，［Ｄ6］ＤＭＳＯ）：δ＝２５．６７８（イソプロピリデン−ＣＨ3ａ），２７．５８９（イソプロピリデン−ＣＨ3ｂ），５２．８３７（Ｃ５），６２．０４６（Ｃ５’），８１．４３２（Ｃ３’），８４．０２５（Ｃ２’），８５．９８５（Ｃ４’），８９．２７６（Ｃ１’），１０３．６６５（Ｃ９），１１３．６５９（イソプロピリデン−Ｃ（ＣＨ3）2），１２７．８１０（Ｃ６），１５０．２１８（Ｃ８），１５２．６５３（Ｃ２），１５７．７６１（Ｃ４）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：４３３．２（１００）［Ｍ＋Ｈ］+，２６１．５（８）［４−アミノ−５−ヨード−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン＋Ｈ］+。
Ｄ．４−アミノ−７−（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［１”−（３”−トリフルオロ−アセトアミド）プロプ−１−イニル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、化合物７
溶液６（２９５ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）を含む乾燥ジメチルホルアミド中（１０ｍｌ）に、アルゴン雰囲気下で、ヨウ化銅（Ｉ）（３９．４ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）、３−トリフルオロ−アセトアミド−プロプ−１−イン（トリブルスキ（Ｔｒｙｂｕｌｓｋｉ）他，（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，３５３３−３５４１）（１．０５ｇ、６．９５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２９０μＬ、２．０８ｍｍｏｌ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（１１８ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にて一夜撹拌した。次いで、Ｄｏｗｅｘ１×８樹脂（１．３ｇ，炭酸水素塩を負荷）およびメタノール／塩化メチレン（１：１混合，１５ｍＬ）を加えて、反応を停止した。室温にて４０分間撹拌した後、混合物をセライトで濾過し、および溶媒を減圧下で除去した。粗産物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、メタノール／塩化メチレン７：９３で溶出）によって精製し、ヌクレオシド７（３０５ｍｇ，９８％）を淡黄色の泡（Ｒf０．２３、メタノール／塩化メチレン７：９３）として与えた。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，［Ｄ6］ＤＭＳＯ）：δ＝１．３１（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ3ａ），１．５３（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ3ｂ），３．５１−３．５７（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’），４．１３−４．１６（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），４．３２（ｄｄ，3Ｊ＝５．２２Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ３”），４．９１（ｄｄ，3Ｊ＝２．７５Ｈｚ，3Ｊ＝６．０４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３’），５．１２（ｄｄ，3Ｊ＝３．３０Ｈｚ，3Ｊ＝６．０５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ２’），５．１７（ｔ，3Ｊ＝５．３６Ｈｚ，１Ｈ，５’−ＯＨ），６．１９（ｄ，3Ｊ＝３．３０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’），７．９５（ｓ，１Ｈ，Ｈ６），８．１４（ｓ，１Ｈ，Ｈ２），１０．１０（ｔ，3Ｊ＝５．２２Ｈｚ，１Ｈ，３”−ＮＨ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，［Ｄ6］ＤＭＳＯ）：δ＝２５．１２５（イソプロピリデン−ＣＨ3ａ），２７．０２９（イソプロピリデン−ＣＨ3ｂ），２９．８８２（Ｃ３”），６１．４８６（Ｃ５’），７５．８４６（Ｃ２”），８０．９１４（Ｃ３’），８３．５５４（Ｃ２’），８５．５７９（Ｃ４’），８６．８９２（Ｃ１”），８８．９４８（Ｃ１’），９４．４１７（Ｃ５），１０２．０４９（Ｃ９），１１２．９１２（イソプロピリデン−Ｃ（ＣＨ3）2），１１５．６２４（ｑ，1Ｊ＝２８６Ｈｚ，１Ｈ，ＣＦ3），１２６．８２５（Ｃ６），１４９．０７５（Ｃ８），１５２．７１７（Ｃ２），１５６．０７０（ｑ，2Ｊ＝３６．４Ｈｚ，１Ｈ，ＣＯＣＦ3），１５７．２９９（Ｃ４）；19Ｆ−ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，［Ｄ6］ＤＭＳＯ）：δ＝−６９．７２（ＣＦ3）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：４５６．４（１２）［Ｍ＋Ｈ］+，２８４．４（１００）［４−アミノ−５−［１’−（３’−トリフルオロアセトアミド）プロプ−１−イニル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン＋Ｈ］+。
Ｅ．４−アミノ−７−（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［１”−（３”−トリフルオロ−アセトアミド）プロピル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、化合物８
ヌクレオシド７（３０５ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）を含むメタノール（７５ｍｌ）溶液に酸化白金（ＩＶ）を加え、および水素ガスを室温にて５時間溶液中で泡立てた。触媒をセライトによる濾過によって除去し、およびメタノールで洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、および粗産物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、メタノール／塩化メチレン５：９５で溶出）によって精製した。ヌクレオシド８（２４８ｍｇ、９８％）を淡黄色の固体（Ｒf０．３０、メタノール／塩化メチレン５：９５）として与えた。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，［Ｄ6］ＤＭＳＯ）：δ＝１．３１（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ3ａ），１．５３（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ3ｂ），１．７５−１．８２（ｍ，２Ｈ，Ｈ２”），２．７５−２．７９（ｍ，２Ｈ，Ｈ１”），３．２５−３．３０（ｍ，２Ｈ，Ｈ３”），３．４８−３．５８（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’），４．０６−４．０９（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），４．８８（ｄｄ，3Ｊ＝３．０２Ｈｚ，3Ｊ＝６．３２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３’），５．１１（ｄｄ，3Ｊ＝３．５７Ｈｚ，3Ｊ＝６．３２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ２’），５．１６（ｔ，3Ｊ＝５．６４Ｈｚ，１Ｈ，５’−ＯＨ），６．１４（ｄ，3Ｊ＝３．８４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’），６．６５（ｓ，ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ2），７．１４（ｓ，１Ｈ，Ｈ６），８．０４（ｓ，１Ｈ，Ｈ２），９．４３（ｔ，3Ｊ＝５．３６Ｈｚ，３”−ＮＨ）；13Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，［Ｄ6］ＤＭＳＯ）：δ＝２３．５２９（Ｃ２”），２５．６９５（イソプロピリデン−ＣＨ3ａ），２７．６２２（イソプロピリデン−ＣＨ3ｂ），２９．７５６（Ｃ１”），２９．２５８（Ｃ３”），６２．１４１（Ｃ５’），８１．５２７（Ｃ３’），８３．６２０（Ｃ２’），８５．４２１（Ｃ４’），８９．０７０（Ｃ１’），１０２．４５９（Ｃ９），１１３．６９８（イソプロピリデン−Ｃ（ＣＨ3）2），１１６．８５９（ｑ，1Ｊ＝２２６．７Ｈｚ，ＣＦ3），１１５．３４８（Ｃ５），１２０．０５１（Ｃ６），１５０．８５８（Ｃ８），１５１．６９１（Ｃ２），１５６．６９６（ｑ，2Ｊ＝３５．７Ｈｚ，ＣＯＣＦ3），１５７．８３８（Ｃ４）；19Ｆ−ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，［Ｄ6］ＤＭＳＯ）：δ＝−７４．７４（ＣＦ3）；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ（相対強度）：４６０．４（８８）［Ｍ＋Ｈ］+，２８８．５（１００）［４−アミノ−５−［１’−（３’−トリフルオロアセトアミド）プロリル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン＋Ｈ］+。
Ｆ．４−アミノ−７−（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン−５’−Ｏ−メシル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［１”−（３”−トリフルオロアセトアミド）プロピル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、化合物９
ヌクレオシド８（７２ｍｇ、１５７μｍｏｌ）を含む乾燥塩化メチレンの溶液（７ｍＬ）へ、アルゴン雰囲気下でジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（２０ｍｇ、１６４μｍｏｌ）およびトリエチルアミン（６６μＬ、４７４μｍｏｌ）を加え、および溶液を０℃へ氷浴中で冷却した。塩化メタンスルホニル（ＭｅｓＣｌ）（４０μＬ、５１５μｍｏｌ）をゆっくり加え、および反応混合物を０℃にて２時間撹拌した。次に、氷冷飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１ｍＬ）を加えることによって反応を停止し、および有機相を除去した。水層を氷冷クロロホルム（３×２ｍＬ）で抽出し、および合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下で除去し、および粗産物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、メタノール／塩化メチレン７：９３）によって精製し、ヌクレオシド９（４０ｍｇ、４７％）を淡黄色固体[Ｒf０．４７、メタノール／塩化メチレン１０：９０）として与えた。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，［Ｄ6］ＤＭＳＯ）：δ＝１．３３（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ3ａ），（１．５４（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ3ｂ），１．７７−１．８１（ｍ，２Ｈ，Ｈ２”），２．７７（ｔ，3Ｊ＝７．４２Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ１”），３．１２（ｓ，３Ｈ，メシル−ＣＨ3），３．２４−３．３２（ｍ，２Ｈ，Ｈ３”），４．３１−４．３５（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’），４．３８−４．４２（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），４．９９（ｄｄ，3Ｊ＝２．７５Ｈｚ，3Ｊ＝６．３２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３’），５．２３（ｄｄ，3Ｊ＝３．０２Ｈｚ，3Ｊ＝６．３２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ２’），６．２３（ｄ，3Ｊ＝３．０２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’），６．６８（ｓ，ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ2），７．１３（ｓ，１Ｈ，Ｈ６），８．０７（ｓ，１Ｈ，Ｈ２），９．４２（ｔ，ｂｒ，１Ｈ，３”−ＮＨ）；19Ｆ−ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，［Ｄ6］ＤＭＳＯ）：δ＝−７４．７４（ＣＦ3）
Ｇ．４−アミノ−７−（５’−Ｏ−メシル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［１”−（３”−トリフルオロアセトアミド）プロピル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、化合物１０
ヌクレオシド９（４０ｍｇ、７４μｍｏｌ）を含む水溶性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（７０％，２ｍＬ）を室温で４５分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、および残留溶媒をエタノールおよび塩化メチレンで共蒸発させた。粗産物１０（Ｒf０．２２、メタノール／塩化メチレン１０：９０）を下記の反応において直接用いた。
19Ｆ−ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，［Ｄ6］ＤＭＳＯ）：δ＝−７４．７５（ＣＦ3）
Ｈ．４−アミノ−７−（５’−Ｎ−アジリジニル−５’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［１”−（３”−アミノプロピル）］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、化合物１１
前段階に由来する粗ヌクレオシド１０を、乾燥アジリジン（ガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ），（１８８８） Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．２１ ，２６６４−２６６９；ガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ）およびステルツナー（Ｓｔｅｌｚｎｅｒ），（１８９５） Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．２８，２９２９−２９３８） （１ ｍＬ、１６．３ｍｍｏｌ）およびＮ−エチルジイソプロピルアミン（ＥＤＩＡ）（３００μＬ、１．８ｍｍｏｌ）の混合物に、アルゴン雰囲気下で溶解し、および反応混合物を室温にて４日間撹拌した。反応進行を分析逆相ＨＰＬＣ（プロントシル（Ｐｒｏｎｔｏｓｉｌ）−ＯＤＳ、５μｍ、１２０Ａ、２５０ｘ４．６ｍｍ、ビショフ社（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ）、ドイツ・レオンベルク（Ｌｅｏｎｂｅｒｇ））によって監視した。化合物をアセトニトリル（７％５分間、次いで３１．５％へ１０分で、３５％へ１５分で、および７０％へ５分での直線グラジエント）を含む酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）で流速１ｍＬ／分にて溶出した。産物１１を保持時間１０．２分で溶出した（２８０ｎｍおよび３００ｎｍにてＵＶ検出）。揮発性化合物を減圧下で除去し、および残渣を炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（４ｍＬ、０．１Ｍ、ｐＨ８．６）に溶解した。粗産物を調製逆相ＨＰＬＣ（プロントシル−ＯＤＳ、５μｍ、１２０Ａ、２５０ｘ８ｍｍ、ビショフ社，ドイツ・レオンベルク）によって精製した。化合物をアセトニトリル（７％５分間、次いで２１％へ１５分で、および７０％へ５分での直線グラジエント）を含む炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ８．６）で流速３ｍＬ／分にて溶出した。産物１１を含む画分（保持時間１６．８分、２８０ｎｍおよび３１０ｎｍにてＵＶ検出）を合わせ、および−８０℃で保管した。合わせた画分中の産物１１（９由来の１０ｍｇ，３９％）の量は、４−アミノ−７−（２’−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−[１"−（３"−トリフルオロアセトアミド）ペンチル]−７Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジンの公表された吸光係数ε278＝８５００Ｌｍｏｌ-1ｃｍ-1（シーラ（Ｓｅｅｌａ）他，（２０００）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８３，９１０−９２７）を用いたＵＶスペクトル法によって決定した。
Ｉ．４−アミノ−７−（５’−Ｎ−アジリジニル−５’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［１”−（Ｎ”−ビオチニル）−３”−アミノプロピル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、化合物１
ヌクレオシド１１（１０ｍｇ、２９μｍｏｌ）を含むアセトニトリル含有炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．６）の溶液（１２ｍＬ）へ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルビオチン（ＮＨＳビオチン）（１０．２ｍｇ、３０μｍｏｌ）を含むジメチルスルホキシド（５００μＬ）を加えた。反応混合物を室温にて２時間撹拌した。反応の進行を分析逆相ＨＰＬＣ（プロントシル（Ｐｒｏｎｔｏｓｉｌ）−ＯＤＳ、５μｍ、１２０Ａ、２５０ｘ４．６ｍｍ、ビショフ社（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ）、ドイツ・レオンベルク（Ｌｅｏｎｂｅｒｇ））によって監視した。化合物をアセトニトリル（７％５分間、次いで３１．５％へ１０分で、３５％へ１５分で、および７０％へ５分での直線グラジエント）を含む酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）で流速１ｍＬ／分にて溶出した。産物１を保持時間２０．８分で溶出した（２８０ｎｍおよび３００ｎｍにてＵＶ検出）。粗産物を調製逆相ＨＰＬＣ（プロントシル−ＯＤＳ，５μｍ、１２０Ａ、２５０ｘ８ｍｍ、ビショフ社、ドイツ・レオンベルク）によって精製した。化合物をアセトニトリル（７％５分間、次いで３１．５％へ５分で、３５％へ１０分で、および７０％へ５分での直線グラジエント）を含む炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ８．６）で流速３ｍＬ／分にて溶出した。産物１を含む画分（保持時間１４．８分、２８０ｎｍおよび３００ｎｍにてＵＶ検出）を合わせ、および溶媒を凍結乾燥によって除去した。アジリジン補助因子１（５．２ｍｇ，３２％）は白色固体として得られた。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，［Ｄ6］ＤＭＳＯ）：δ＝１．１０−１．１５（ｍ，２Ｈ，脂肪族ビオチン−Ｈ），１．２５−１．３５（ｍ，４Ｈ，アジリジン−Ｈ），１．４５−１．５５（ｍ，２Ｈ，脂肪族ビオチン−Ｈ），１．５５−１．６３（ｍ，２Ｈ，脂肪族ビオチン−Ｈ），１．６４−１．７２（ｍ，２Ｈ，Ｈ２”），２．０４−２．０６（ｍ，２Ｈ，脂肪族ビオチン−Ｈ），２．２８−２．３４（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’ａ），２．４６−２．５０（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’ｂ），２．５４−２．５８（ｍ，１Ｈ，ビオチン−ＳＣＨ2ａ），２．７２−２．７７（ｍ，２Ｈ，Ｈ１”），２．７７−２．８３（ｍ，１Ｈ，ビオチン−ＳＣＨ2ｂ），３．０５−３．１６（ｍ，３Ｈ，ビオチン−ＳＣＨ，Ｈ３”），３．８９−３．９４（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），４．０８−４．１５（ｍ，２Ｈ，ビオチン−ＳＣＨＲＣＨ，Ｈ３’），４．２５−４．３４（ｍ，２Ｈ，ビオチン−ＳＣＨ2ＣＨ，Ｈ２’），６．０５（ｄ，3Ｊ＝５．６９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’），６．３５（ｓ，１Ｈ，ビオチン−ＮＨａ），６．４２（ｓ，１Ｈ，ビオチン−ＮＨｂ），６．５３（ｓ，２Ｈ，ＮＨ2），７．１０（ｓ，１Ｈ，Ｈ６），７．７９（ｔ，3Ｊ＝５．６９Ｈｚ，１Ｈ，３”−ＮＨ），８．０３（ｓ，１Ｈ，Ｈ２）；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ（相対強度）：５７５．２５（１００）［Ｍ＋Ｈ］+，４１８．１８（７）［４−アミノ−５−［１’−（Ｎ−ビオチニル）−３’−アミノプロピル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン＋Ｈ］+。
実施例４：アジリジン補助因子２の合成
補助因子２の合成はスキーム３に示す通り実施された。合成の詳細を下記に示す（プリンについてのＩＵＰＡＣ番号が用いられている）。
Figure 0004886679
 スキーム３：アジリジン補助因子２の合成。
Ａ．４−アミノ−７−（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン−５’−Ｏ−メシル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［１”−（３”−トリフルオロアセトアミド）プロプ−１−イニル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、化合物１２
ヌクレオシド７（１００ｍｇ、２２０μｍｏｌ、実施例３Ｄ）を含む乾燥塩化メチレンの溶液（１０ｍＬ）へ、アルゴン雰囲気下でジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（２６．８ｍｇ、２２０μｍｏｌ）およびトリエチルアミン（９２μＬ、６６０μｍｏｌ）を加えた。溶液を０℃へ冷却した後、塩化メタンスルホニル（ＭｅｓＣｌ）（２５．２μＬ、３３０μｍｏｌ）をゆっくり加え、および反応混合物を０℃にて１．５時間撹拌した。次に、氷冷飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２ｍＬ）を加えることによって反応を停止した。有機相を除去し、および水層を氷冷クロロホルム（３ｘ４ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下で除去し、および粗産物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、メタノール／塩化メチレン７：９３）によって精製し、ヌクレオシド１２（６２ｍｇ、５４％）を淡黄色泡[Ｒf０．３９、メタノール／塩化メチレン１０：９０）として与えた。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，［Ｄ6］ＤＭＳＯ）：δ＝１．３２（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ3ａ），１．５４（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ3ｂ），３．１３（ｓ，３Ｈ，メシル−ＣＨ3），４．３２（ｄ，3Ｊ＝５．２２Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ３”），４．３３−４．３７（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’），４．４０−４．４３（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），５．０２（ｄｄ，3Ｊ＝３．０３Ｈｚ，3Ｊ＝６．３２，１Ｈ，Ｈ３’），５．２６（ｄｄ，3Ｊ＝２．３５Ｈｚ，3Ｊ＝６．３２，１Ｈ，Ｈ２’），６．２５（ｄ，3Ｊ＝２．７５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’），７．７４（ｓ，１Ｈ，Ｈ６），８．１５（ｓ，１Ｈ，Ｈ２），１０．１１（ｔ，3Ｊ＝５．２２Ｈｚ，１Ｈ，３”−ＮＨ）；19Ｆ−ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，［Ｄ6］ＤＭＳＯ）：δ＝−７４．３１７（ＣＦ3）。
Ｂ．４−アミノ−７−（５’−Ｏ−メシル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［１”−（３”−トリフルオロアセトアミド）−プロプ−１−イニル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、化合物１３
ヌクレオシド１２（４８ｍｇ、９０μｍｏｌ）を含む水溶性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（７０％、３ｍＬ）を室温で一夜撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、および残留溶媒をエタノールで２回および塩化メチレンで１回共蒸発させた。産物１３（Ｒf０．３８、メタノール／塩化メチレン１０：９０）を下記の反応において直接用いた。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，［Ｄ6］ＤＭＳＯ）：δ＝３．１９（ｓ，３Ｈ，メシル−ＣＨ3），３．６０−４．００（ｍ，３Ｈ，Ｈ５’およびＨ４’），４．１０−４．１６（ｍ，１Ｈ，Ｈ３’），４．３３（ｄ，3Ｊ＝５．１９Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ３”），４．４０−４．４４（ｍ，１Ｈ，Ｈ２’），６．１１（ｄ，3Ｊ＝５．６９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’），７．８６（ｓ，１Ｈ，Ｈ６），８．２９（ｓ，１Ｈ，Ｈ２），１０．１２（ｓ，ｂｒ，１Ｈ，３”−ＮＨ）；19Ｆ−ＮＭＲ（２８２ＭＨｚ，［Ｄ6］ＤＭＳＯ）：δ＝−７４．２９３（ＣＦ3）。
Ｃ．４−アミノ−７−（５’−Ｎ−アジリジニル−５’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−[１"−（３"−アミノプロプ−１−イニル）]−７Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン、化合物１４
前段階に由来する粗ヌクレオシド１３（４１ｍｇ、８３μｍｏｌ）を、乾燥アジリジン（ガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ），（１８８８）Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．２１，２６６４−２６６９；ガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ）およびステルツナー（Ｓｔｅｌｚｎｅｒ），（１８９５） Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．２８，２９２９−２９３８）（１ｍＬ、１６．３ｍｍｏｌ）およびＮ−エチルジイソプロピルアミン（ＥＤＩＡ）（３００μｌ、１．８ｍｍｏｌ）の混合物に、アルゴン雰囲気下で溶解しおよび室温にて４日間撹拌した。反応進行を分析逆相ＨＰＬＣ（プロントシル（Ｐｒｏｎｔｏｓｉｌ）−ＯＤＳ、５μｍ、１２０Ａ、２５０ｘ４．６ｍｍ、ビショフ社（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ）、ドイツ・レオンベルク（Ｌｅｏｎｂｅｒｇ））によって監視した。化合物をアセトニトリル（７％５分間、次いで３１．５％へ１０分で、３５％へ１５分で、および７０％へ５分での直線グラジエント）を含む酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）で流速１ｍＬ／分にて溶出した。産物１４は保持時間１３．５分で溶出した（２５４ｎｍおよび２８０ｎｍにてＵＶ検出）。揮発性化合物を減圧下で除去し、および残渣を炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ８．６）に溶解した。粗産物を調製逆相ＨＰＬＣ（プロントシル−ＯＤＳ、５μｍ、１２０Ａ、２５０ｘ８ｍｍ、ビショフ社、ドイツ・レオンベルク）によって精製した。化合物をアセトニトリル（７％５分間、次いで２８％へ５分で、４２％へ１５分で、および７０％へ５分での直線グラジエント）を含む炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ８．６）で流速３ｍＬ／分にて溶出した。産物１４（保持時間１５．７分、２８０ｎｍおよび３００ｎｍにてＵＶ検出）を含む画分を合わせた。合わせた画分（１２．５ｍＬ）中の産物１４の量（２．３ｍｇ，８．１％）は、４−アミノ−７−（２’−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル）−５−[１"−（３"−トリフルオロアセトアミド）プロプ−１−イニル]−７Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジンの公表された吸光係数ε278＝１４２００Ｌｍｏｌ-1ｃｍ-1（シーラ（Ｓｅｅｌａ）およびズラウフ（Ｚｕｌａｕｆ），（１９９９） Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８２，１８７８−１８９８）を用いたＵＶスペクトル法によって決定した。
Ｄ．４−アミノ−７−（５’−Ｎ−アジリジニル−５’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−[１"−（Ｎ"−ビオチニル）−３"−アミノプロプ−１−イニル]−７Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン、化合物２
ヌクレオシド１４（２．３ｍｇ、６．７μｍｏｌ）を含むアセトニトリル含有炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ８．６）の溶液（１２．５ｍＬ）へ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルビオチン（ＮＨＳビオチン）（１５ｍｇ、４４μｍｏｌ）を含むジメチルスルホキシド（４００μＬ）を加えた。反応混合物を室温にて２時間撹拌した。反応の進行を分析逆相ＨＰＬＣ（プロントシル（Ｐｒｏｎｔｏｓｉｌ）−ＯＤＳ、５μｍ、１２０Ａ、２５０ｘ４．６ｍｍ、ビショフ社（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ）、ドイツ・レオンベルク（Ｌｅｏｎｂｅｒｇ））によって監視した。化合物をアセトニトリル（７％５分間、次いで３１．５％へ１０分で、３５％へ１５分で、および７０％へ５分での直線グラジエント）を含む酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）で流速１ｍＬ／分にて溶出した。産物２は保持時間１７．５分で溶出した（２５４ｎｍおよび２８０ｎｍにてＵＶ検出）。粗産物を調製逆相ＨＰＬＣ（プロントシル−ＯＤＳ、５μｍ、１２０Ａ、２５０ｘ８ｍｍ、ビショフ社、ドイツ・レオンベルク）によって精製した。化合物をアセトニトリル（７％５分間、次いで２８％へ５分で、４２％へ１５分で、および７０％へ５分での直線グラジエント）を含む炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ８．６）で流速３ｍＬ／分にて溶出した。産物２を含む画分（保持時間１６．０分、２８０ｎｍおよび３００ｎｍにてＵＶ検出）を含む画分を合わせ、および溶媒を凍結乾燥によって除去した。アジリジン補助因子２（１．０ｍｇ、２６％）は白色固体として得られた。
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ（相対強度）：５７１．５（１００）[Ｍ＋Ｈ]+。
実施例５：アジリジン補助因子３の合成
補助因子３の合成はスキーム４に示す通り実施された。合成の詳細を下記に示す。
Figure 0004886679
 スキーム４：アジリジン補助因子３の合成。
Ａ．Ｎ６−[１"−（４"−アミノブチル）]−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンアデノシン、化合物１５
１，４−ジアミノブタン（１．０５ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．７０ｍＬ、６．９２ｍｍｏｌ）を含むエタノール（５ｍＬ）の溶液へ、６−クロロ−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンアデノシン（カペラー（Ｋａｐｐｌｅｒ）およびハンプトン（Ｈａｍｐｔｏｎ），（１９９０） Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３３，２５４５−２５５１）（０．９７ｇ、２．９７ｍｍｏｌ）を含むエタノール（５０ｍＬ）の溶液をゆっくり添加し、および反応混合物を６０℃にて１８時間撹拌した。溶媒および過剰の試薬を減圧下で除去し、粗ヌクレオシド１５（１．０７ｇ、９５％）を白色固体として与えた。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、[Ｄ6]ＤＭＳＯ）：δ＝１．３３（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ3ａ），１．５６（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ3ｂ），１．５８−１．７０（ｍ，４Ｈ，Ｈ２"，Ｈ３"），２．５５−２．６２（ｍ，２Ｈ１Ｈ４"），３．４６−３．５４（ｍ，２Ｈ，Ｈ１"），３．５４−３．６０（ｍ，２Ｈ，Ｈ５'），４．２２−４．２６（ｍ，１Ｈ，Ｈ４'），４．９８（ｄｄ，3Ｊ＝２．４８Ｈｚ，3Ｊ＝６．１９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３１），５．３４（ｄｄ，3Ｊ＝２．９７Ｈｚ，3Ｊ＝６．１８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ２'），６．１３（ｄ，3Ｊ＝２．９７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１'），８．００（ｓ，ｂｒ，１Ｈ，６−ＮＨ），８．２３（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），８．３７（ｓ，１Ｈ，Ｈ２）。
Ｂ．Ｎ６−[１"−（４"−トリフルオロアセトアミド）ブチル]−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンアデノシン、化合物１６
ヌクレオシド１５（１．０５ｇ、２．７７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．９６ｍＬ、６．９２ｍｍｏｌ）を含むメタノール（５０ｍＬ）の溶液へ、トリフルオロ酢酸エチルエステル（１．９ｍＬ、１６．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温にて一夜撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、および粗産物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）によって精製し、ヌクレオシド１６（０．８７ｇ、６６％）を白色固体（Ｒｆ０．２０、酢酸エチル）として与えた。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、[Ｄ6]ＤＭＳＯ）：δ＝１．３３（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ3ａ），１．５５（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ3ｂ），１．５７−１．６１（ｍ，４Ｈ，Ｈ２"，Ｈ３"），３．１８−３．２４（ｍ，２Ｈ，Ｈ４"），３．４３−３．６２（ｍ，４Ｈ，Ｈ５’，Ｈ１"），４．２０−４．２４（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），４．９７（ｄｄ，3Ｊ＝２．４７Ｈｚ，3Ｊ＝６．１８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３'），５．２４（ｔ，3Ｊ＝５，５７Ｈｚ，１Ｈ，５’−ＯＨ）１５．３４（ｄｄ，3Ｊ＝２．９７Ｈｚ，3Ｊ＝６．１９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ２’），６．１３（ｄ，3Ｊ＝２．９７Ｈｚ１１Ｈ，Ｈ１ｒ），７．９２，（ｓ，ｂｒ，１Ｈ１６−ＮＨ）１８．２３（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），８．３４（ｓ，１Ｈ１Ｈ２），９．４１（ｔ，3Ｊ＝５．４４Ｈｚ，１Ｈ、４"−ＮＨ）；19Ｆ−ＮＭＲ（２８２ＭＨｚ、[Ｄ6]ＤＭＳＯ）：δ＝−７４．３５３；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ（相対強度）：４７５．７（１００）[Ｍ＋Ｈ]+，３０３．７（２７）[Ｎ６−[１"−（４"−トリフルオロアセトアミド）ブチル]アデニン＋Ｈ]+。
Ｃ．Ｎ６−[１"−（４"−トリフルオロアセトアミド）ブチル]−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン−５’−Ｏ−メシル−アデノシン、化合物１７
ヌクレオシド１６（０．８５ｇ、１．７９ｍｍｏｌ）を含む乾燥塩化メチレン（６０ｍＬ）の溶液へ、アルゴン雰囲気下でジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．２２ｇ、１．７９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（６．２４ｍＬ、４４．４ｍｍｏｌ）を加え、および溶液を０℃へ氷浴中で冷却した。塩化メタンスルホニル（１．３９ｍＬ、１７．９ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、および反応混合物を０℃にて２時間撹拌した。氷冷飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１５ｍＬ）を加えることによって反応を停止し、および有機層を除去した。水層を氷冷クロロホルム（３ｘ２５ｍＬ）で抽出し、および合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥した。ろ過後、溶媒を減圧下で除去し、および粗産物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、メタノール／塩化メチレン５：９５）によって精製し、ヌクレオシド１７（０．８５ｍｇ、８６％）を淡黄色固体[Ｒｆ０．２１、メタノール／塩化メチレン５：９５）として与えた。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、[Ｄ6]ＤＭＳＯ）：δ＝１．３４（ｓ，３Ｈ１イソプロピリデン−ＣＨ3ａ），１．５６（ｓ，３Ｈ，イソプロピリデン−ＣＨ３ｂ），１．５６−１．６４（ｍ，４Ｈ，Ｈ２"，Ｈ３"），３．１１（ｓ，３Ｈ，メシル−ＣＨ３），３．１６−３．２３（ｍ，２Ｈ，Ｈ４"），３．２５−３．３６（ｍ，２Ｈ，Ｈ１"），４．３６−４．５０（ｍ，３Ｈ，Ｈ５’，Ｈ４’），５．０７−５．１１（ｍ，１Ｈ，Ｈ３’），５．４５（ｄｄ，3Ｊ＝２．２３Ｈｚ，3Ｊ＝６．４３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ２’），６．２５（ｄ，3Ｊ＝２．２３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１'），７．９０（ｓ，ｂｒ，６−ＮＨ），８．２４（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），８．３１（ｓ，１Ｈ，Ｈ２），９．４５（ｔ，3Ｊ＝４．７０Ｈｚ，１Ｈ，４"−ＮＨ）；19Ｆ−ＮＭＲ（２８２ＭＨｚ、[Ｄ6]ＤＭＳＯ）：δ＝−７４．３５；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ（相対強度）：５９１．１（１０）[Ｍ＋Ｋ]+，５７５．１（１５）[Ｍ＋Ｎａ]+，５５３．３（１７）[Ｍ＋Ｈ]+，４５７．５（１００）[シクロヌクレオシド]。
Ｄ．Ｎ６−[１"−（４"−トリフルオロアセトアミド）ブチル]−５’−Ｏ−メシルアデノシン、化合物１８
ヌクレオシド１７（５００ｍｇ、０．９０５ｍｍｏｌ）をギ酸水溶液（５０％、３５ｍＬ）に溶解し、および反応混合物を室温にて３日間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、および残存する溶媒を水／メタノール（１：１、３ｘ１０ｍＬ）と共蒸発させた。高真空で乾燥後、ヌクレオシド１８（４４７ｍｇ、９６％）を白色固体（Ｒｆ０．１７、メタノール／塩化メチレン５：９５）として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，[Ｄ6]ＤＭＳＯ）：δ＝１．６６−１．８６（ｍ，４Ｈ，Ｈ２"，Ｈ３"），３．１６（ｓ，３Ｈ，メシル−ＣＨ３），３．１８−３．２４（ｍ，２Ｈ，Ｈ４"），３．２５−３．３９（ｍ，２Ｈ，Ｈ１"），４．１３−４．１８（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），４．２３−４．２８（ｍ，１Ｈ，Ｈ３’），４．４０−４．５５（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’），４．６４−４．６９（ｍ，１Ｈ，Ｈ２'），５．４８（ｓ，ｂｒ，１Ｈ，ＯＨ），５．６３（ｓ，ｂｒ，１Ｈ，ＯＨ），５．９５（ｄ，3Ｊ＝５．５０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１'），７．９０（ｓ，ｂｒ，１Ｈ，６−ＮＨ），８．２２（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），８．３２（ｓ，１Ｈ，Ｈ２），９．４１（ｔ，3Ｊ＝５．５０Ｈｚ，１Ｈ，４"−ＮＨ）；19Ｆ−ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，[Ｄ6]ＤＭＳＯ）：δ＝−７８．０１；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ（相対強度）：５３５．２（５）[Ｍ＋Ｎａ]+，５１３．３（１００）[Ｍ＋Ｈ]+，４１７．７（９）[シクロヌクレオシド]．
Ｅ．５’−Ｎ−アジリジニル−Ｎ６−[１"−（４"−アミノブチル）]−５’−デオキシアデノシン、化合物１９
ヌクレオシド１８（１５０ｍｇ、０．２９２ｍｍｏｌ）を、乾燥アジリジン（１．１ｍＬ、１７．９ｍｍｏｌ）（ガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ），（１８８８）Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．２１，２６６４−２６６９； ガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ）およびステルツナー（Ｓｔｅｌｚｎｅｒ），（１８９５） Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．２８，２９２９−２９３８））およびＮ−エチルジイソプロピルアミン（ＥＤＩＡ）（３ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）の混合物に、アルゴン雰囲気下で溶解しおよび室温にて３日間撹拌した。反応進行を分析逆相ＨＰＬＣ（プロントシル（Ｐｒｏｎｔｏｓｉｌ）−ＯＤＳ、５μｍ、１２０Ａ、２５０ｘ４．６ｍｍ、ビショフ社（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ）、ドイツ・レオンベルク（Ｌｅｏｎｂｅｒｇ））によって監視した。化合物をアセトニトリル（１４％５分間、次いで３１．５％へ１０分で、３５％へ１０分で、および７０％へ５分での直線グラジエント）を含む酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）で流速１ｍＬ／分にて溶出した。産物１９は保持時間４．４分で溶出した（２８０ｎｍおよび３００ｎｍにてＵＶ検出）。揮発性化合物を減圧下で除去し、および粗産物を、調製逆相ＨＰＬＣ（プロントシル−ＯＤＳ、５μｍ、１２０Ａ、２５０ｘ８ｍｍ、ビショフ社、ドイツ・レオンベルク）による精製前に、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ８．６、２ｍＬ）に溶解した。化合物をアセトニトリル（７％５分、次いで２１％へ１５分で、および７０％へ５分での直線グラジエント）を含む炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ８．６）で流速３ｍＬ／分にて溶出した。産物１９（保持時間１７．４分、２８０ｎｍおよび３００ｎｍにてＵＶ検出）を含む画分を−８０℃にて保存した。合わせた画分（３０ｍＬ）中の産物１９の量（１０．１ｍｇ、１０％）は、Ｎ６−[１"−（４"−アミノブチル]−２’，３’−Ｏ−メトキシ−エチリデンアデノシンの公表された吸光係数ε267＝１６０００Ｌｍｏｌ-1ｃｍ-1 （Ｍｕｒａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３，７８１−７８６）を用いたＵＶスペクトル法によって決定した。
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ（相対強度）：３６４．３（１１）[Ｍ＋Ｈ]+．
Ｆ．５’−Ｎ−アジリジニル−Ｎ６−[１"−（Ｎ"−ビオチニル）−４"−アミノブチル]−５’−デオキシアデノシン、化合物３
ヌクレオシド１９（１０．１ｍｇ、２７．８μｍｏｌ）を含むアセトニトリル含有炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ８．６）の溶液（３０ｍＬ）へ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルビオチン（ＮＨＳビオチン）（１２．２ｍｇ、３６μｍｏｌ）を含むジメチルスルホキシド（２ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温にて４０分間撹拌した。反応進行を分析逆相ＨＰＬＣ（プロントシル（Ｐｒｏｎｔｏｓｉｌ）−ＯＤＳ、５μｍ、１２０Ａ、２５０ｘ４．６ｍｍ、ビショフ社（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ）、ドイツ・レオンベルク（Ｌｅｏｎｂｅｒｇ））によって監視した。化合物をアセトニトリル（１４％５分間、次いで３１．５％へ１０分で、３５％へ１０分で、および７０％へ５分での直線グラジエント）を含む酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）で流速１ｍＬ／分にて溶出した。産物１９は保持時間１９．１分で溶出した（２８０ｎｍおよび３００ｎｍにてＵＶ検出）。調製逆相ＨＰＬＣ（プロントシル−ＯＤＳ、５μｍ、１２０Ａ、２５０ｘ８ｍｍ、ビショフ社、ドイツ・レオンベルク）によって精製された粗産物および化合物をアセトニトリル（１４％５分、次いで３１．５％へ５分で、３５％へ１０分で、および７０％へ５分での直線グラジエント）を含む炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ８．６）で流速３ｍＬ／分にて溶出した。産物３（保持時間１４．３分、２８０ｎｍおよび３００ｎｍにてＵＶ検出）を含む画分を合わせおよび凍結乾燥によって乾燥した。アジリジン補助因子３（３．０ｍｇ、１８％）は白色固体として得られた。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，［Ｄ6］ＤＭＳＯ）：δ＝１．１８−１．１５（ｍ，２Ｈ，脂肪族Ｈ），１．３２−１．３６（ｍ，２Ｈ，脂肪族Ｈ），１．３６−１．４５（ｍ，８Ｈ，４ｘ脂肪族Ｈ，４ｘアジリジン−Ｈ），１．４８−１．５５（ｍ，４Ｈ，脂肪族Ｈ），１．９７（ｔ，3Ｊ＝７．４２Ｈｚ，２Ｈ，脂肪族Ｈ），２．６０−２．７２（ｍ，２Ｈ，ビオチン−ＳＣＨ2），２．８４−２．９９（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’），２．９９−３．０５（ｍ，１Ｈ，ビオチン−ＳＣＨ），３．１８−３．２２（ｍ，２Ｈ，脂肪族Ｈ），３．８０−３．９１（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），４．０２−４．１０（ｍ，１Ｈ，ビオチン−ＳＣＨＲＣＨ），４．１５−４．１９（ｍ，１Ｈ，Ｈ３’），４．２０−４．２３（ｍ，１Ｈ，ビオチン−ＳＣＨ2ＣＨ），４．５６−４．６０（ｍ，１Ｈ，Ｈ２’），５．２０（ｓ，ｂｒ，１Ｈ，ＯＨ），５．４０（ｓ，ｂｒ，１Ｈ，ＯＨ），５．７９−５．８３（ｍ，１Ｈ，Ｈ１’），６．３０（ｓ，ｂｒ，１Ｈ，ビオチン−ＮＨａ），６．３９（ｓ，ｂｒ，１Ｈ，ビオチン−ＮＨｂ），７．７０（ｔ，3Ｊ＝５．４９Ｈｚ，１Ｈ，１４”−ＮＨ），７．７５（ｍ，１Ｈ，６−ＮＨ），８．１０（ｓ，１Ｈ，Ｈ８），８．２２（ｓ，１Ｈ，Ｈ２）；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ（相対強度）：６１２．６（５３）［Ｍ＋Ｎａ］+，５９０．５（１００）［Ｍ＋Ｈ］+，４３３．６（１２）Ｎ６−［１”−（Ｎ”−ビオチニル）−４”−アミノブチル］−アデニン＋Ｈ］+。
実施例６：ＤＮＡの道路障壁修飾（ＲＯＡＤ ＢＬＯＯＫ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ）
Ａ．概念
下記の実験手法は、核酸分子の立体的に過酷な修飾は前記核酸分子の増幅の減少または遮断に繋がりうるという考えに基づく。その修飾はＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼのための特異的認識配列に導入される。その修飾の前提条件は、これらの側でのメチル化は立体的に過酷なアジリジン補助因子でのさらなる修飾を妨げるため、非メチル化認識配列の存在である。その後、非メチル化ＤＮＡ鎖だけが増幅を妨げられる（立体的に過酷なアジリジン誘導体の存在によって）、一方メチル化ＤＮＡ鎖（アジリジン誘導体で修飾できない）は以降のＰＣＲ反応で増幅されうる。この概念が下記のスキーム（スキーム１）に要約される。
Figure 0004886679
 スキーム５：ＤＮＡのメチル化パターンを決定するための「道路障壁」概念。左：非メチル化ＤＮＡ−ＭＴアーゼ認識配列（灰色棒）はＤＮＡ−ＭＴアーゼおよびアジリジン補助因子を用いることによって配列特異的に修飾され、そのためＤＮＡ増幅（たとえば以降のＰＣＲ反応での）が妨害または遮断される。右：メチル化ＤＮＡ−Ｍｔアーゼ認識配列はアジリジン補助因子によって修飾できず、そのため対応するＤＮＡが増幅できる（たとえば以降のＰＣＲ反応で）。
被験ＤＮＡはヘモフィルス・ヘモリティカス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来ＤＮＡ−ＭＴアーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）を用いて修飾された。Ｍ．ＨｈａＩは活性化メチル基の天然補助因子Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）から二本鎖配列５’ＧＣＧＣ−３’内の最初のシトシン残基の５位への転移を触媒し（スキーム６）およびそれによって被験ＤＮＡの５’−ＧＣＧＣ−３’−配列を修飾できる。
Figure 0004886679
 スキーム６：Ｍ．ＨｈａＩに触媒される反応。
加えて、本酵素は配列特異的メチルトランスフェラーゼに誘導されるＤＮＡ標識化（ＳＭＩＬｉｎｇＤＮＡ）にかなり有用である。さらに、ＭＱ１（Ｍ．ＳｓｓＩ）をＳＭＩＬｉｎｇ ＤＮＡ法の範囲での有用性に関して分析した。Ｍ．ＳｓｓＩは５’−ＧＣＧＣ−３’認識配列を有する唯一公知であるシトシン特異的細菌ＤＮＡ−ＭＴアーゼであり、および潜在的に、（ヒト）ＤＮＡのＣｐＧモチーフのメチル化状態を分析するのに用いることができる。
Figure 0004886679
 スキーム７：Ｍ．ＳｓｓＩに触媒される反応。
Ｍ．ＳｓｓＩは高い酵素活性を有し、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における発現によって製造されうる。さらに、Ｍ．ＳｓｓＩは単純なアジリジン補助因子Ａｚを用いてＤＮＡ−分子を修飾できることを実験が示している（スキーム７）。
Ｂ．Ｍ．ＨｈａＩおよび７ＢＡｚを用いることによるＤＮＡの配列特異的標識化
被験ＤＮＡに沿った３２０塩基対を本文書に記載の通り調製した。この被験ＤＮＡは１３個の５’−ＧＣＧＣ−３’Ｍ．ＨｈａＩ認識配列を含み、そのうち２個は重複する（図３、左）。
被験ＤＮＡ、Ｍ．ＨｈａＩおよび７ＢＡｚを３時間、緩衝液中で３７度にて３時間インキュベートした。その後、熱失活した酵素および修飾ＤＮＡは市販のキットによって精製された。同時に、対照反応（Ｍ．ＨｈａＩ無しまたは７ＢＡｚ無し）を実施し、およびＤＮＡ試料を「リアルタイム」ＰＣＲによって分析した。
修飾は、修飾認識配列では切断できない制限エンドヌクレアーゼＲ．ＨｈａＩを用いることによって試験した。被験ＤＮＡをＭ．ＨｈａＩおよび７ＢＡｚと共にインキュベート後、ＤＮＡはＲ．ＨｈａＩ活性に対して完全に保護されていた（図３、右）。Ｍ．ＨｈａＩおよび／または７ＢＡｚ無しの２つの対照は完全に消化された（すなわち切断された）。修飾ＤＮＡ上のビオチン残基の存在もまた、電気泳動移動度シフト検定を用いることによって分析された。ストレプトアビジンの添加は、修飾ＤＮＡの電気泳動移動度に対して著しい影響を有した（図４、右）。一方、Ｍ．ＨｈａＩまたは７ＢＡｚ無しの対照は、この検定ではＤＮＡの移動度に本質的に差を示さなかった。
Ｃ．Ｍ．ＨｈａＩおよび６ＴｅｘＡｚを用いることによるＤＮＡの配列特異的標識化
Ｎ−アデノシルアジリジン補助因子７ＢＡｚは５３４ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。立体的により過酷な補助因子の特性を試験するため、１０６５ｇ／ｍｏｌの分子量を有するＮ−アデノシルアジリジン誘導体６ＴｅｘＡｚが合成された（スキーム８）。
Figure 0004886679
 スキーム８：立体的に過酷なＮ−アデノシルアジリジン補助因子６ＴｅｘＡｚ（補助因子４）の合成。
合成は、６ＢＡｚを基礎とした。６−クロロプリン−９−β−Ｄ−リボフラノシドから開始し、二次水酸基はアセトニドとして保護され、ジアミノブタン−リンカーは６位で導入され、およびリンカーの一次アミノ官能基はトリフルオラセタミドとして保護された。引き続き、５´水酸基をメシラートとして活性化し、イソプロピリデン保護基を除去し、およびアジリジン基は、求核置換によって５´位で導入した。調製中のアルカリ条件の結果、テキサスレッドのＮＨＳ−エステルとの最終反応に利用できるよう、リンカーの一次アミノ官能基の脱保護を生じる。
配列特異的ＤＮＡ標識のために（図４、左）、被験ＤＮＡをＭ．ＨｈａＩおよび６ＴｅｘＡｚで緩衝液中で３７℃にて１５時間インキュベートした。
引き続き、酵素は加熱することによって不活性化され、および修飾ＤＮＡは市販のキットによって精製した。加えて、Ｍ．ＨｈａＩの非存在下でまたは、６ＴｅｘＡｚの非存在下で並列制御を実施した。３つのＤＮＡ試料を「リアルタイム」ＰＣＲ実験で分析した。
標識化反応を確認するために、３つの試料をＲ．ＨｈａＩで処理した。Ｍ．ＨｈａＩおよび６ＴｅｘＡｚで被験ＤＮＡをインキュベートした後、被験ＤＮＡは、Ｒ．ＨｈａＩによる消化から完全に保護された（図４、右）。一方では、Ｍ．ＨｈａＩまたは６ＴｅｘＡｚのない両対照試料は、完全な消化を示した。
Ｄ．Ｍ．ＳｓｓＩの補助因子としてのＮ−アデノシルアジリジン誘導体６ＢＡｚ
ヒトＤＮＡのＤＮＡメチル化状態を分析するためには、ＤＮＡ−ＭＴａｓｅであるＭ．ＳｓｓＩはＭ．ＨｈＩと比較して、各メチル化ＣｐＧ−モチーフを修飾できないため特に有用でありうる。したがって、ＳＭＩＬｉｎｇＤＮＡ技術のためにおよびそれゆえ「障害物」概念に対して、Ｍ．ＳｓｓＩが原則として有用かどうかを試験した。Ｍ．ＳｓｓＩが非複合体アジリジン補助因子Ａｚを基質として用い、およびＤＮＡにそれをカップリングできることが公知であった（スキーム７）。一方では、８または７位のリンカーでビオチン基とカップリングするＮ−アデノシルアジリジン８ＢＡｚおよび７ＢＡｚは、ＤＮＡ分子上に転移できない（スキーム９）。これは、Ｍ．ＳｓｓＩの補助因子結合ポケットによる好ましくない立体障害の結果でありうる。
Figure 0004886679
 スキーム９：Ｍ．ＳｓｓＩの補助因子としてのＮ−アデノシルアジリジン誘導体
Ｍ．ＳｓｓＩによって媒介された６ＢＡｚの変換を、二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドおよび精製されたＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ用いて研究した。反応条件（緩衝液のｐＨおよび組成物、温度、Ｍ．ＳｓｓＩの量）を調整および最適化した後、ヘミメチル化二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドの６０％を、２時間の反応で標識化した。非メチル化二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを用いた場合、約１００％を標識化した。これらの結果の相違は、酵素調製中の微量の天然補助因子ＡｄｏＭｅｔの存在に起因しうる。
要約すると、ＤＮＡ−ＭＴアーゼＭ．ＨｈａＩを用いた被験ＤＮＡの配列特異的標識化は、アジリジン補助因子６ＴｅｘＡｚおよび７ＢＡｚについて定量的変換を示した。標識化ＤＮＡ試料および対照ＤＮＡ試料が「リアルタイム」ＰＣＲ反応で試験された。両方の対照と比較して、増幅反応は両方の対照と比較して明らかに損なわれた。増幅低下は６ＴｅｘＡｚ標識化被験ＤＮＡがＰＣＲテンプレートとして用いられた際にさらにより顕著であった。これらの結果は、「道路障壁」概念がＤＮＡ−ＭＴアーゼの非メチル化認識配列の検出に有用であることを実証する。
加えて、６ＢＡｚはＤＮＡ−ＭＴアーゼＭ．ＳｓｓＩのためのアジリジン補助因子であり、そのためＤＮＡ中のすべての非メチル化ＣｐＧモチーフの配列特異的修飾が可能であるはずなことが示された。ＤＮＡメチル化パターンの検出にための有効な方法は、したがって、アジリジン標識化ＤＮＡの「リアルタイム」ＰＣＲを基礎とすることができる。．
Ｅ．方法
Ｅ１．Ｍ．ＨｈａＩおよび７ＢＡｚを用いた被験ＤＮＡの配列特異的標識化
被験ＤＮＡ（１．２μｇ、３２０ｂｐ、Ｍ．ＨｈａＩの認識配列１３個、０．６μｇ／Ｍ Ｍ．ＨｈａＩ認識配列）、Ｍ．ＨｈａＩ（１．２μＭ）および７ＢＡｚ（８０μＭ）を含みトリス／ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（０．０５ｍＭ）および２−メルカプトエタノール（２ｍＭ）から成る緩衝液（１１８μｌ）を３時間３７℃にてインキュベートした。ＤＮＡをまたＭ．ＨｈａＩまたは７ＢＡｚの非存在下でインキュベートした（対照）。その後、試料を２０分間８０℃へ加熱した。ＤＮＡは、キアゲン社（ＱＵＩＡＧＥＮ）（ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））のキアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットを用いて取扱説明書に従って精製し、ＤＮＡは緩衝液（４０μＬ、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．５）で溶出した。
制限分析は、３．３μＬの精製標識化ＤＮＡ（または対照）を緩衝液（７．７μＬ、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、７５ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ １，４−ジチオスレイトール）およびＲ．ＨｈａＩ（８Ｕ）を含むトリス／ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ７．９）、ＭｇＣｌ2（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）、１，４−ジチオスレイトール（１ｍＭ）およびＢＳＡ（２．２μｇ／μＬ）から成る緩衝液（９μＬ）と共に３時間３７℃にてインキュベートすることによって実施した。その後、試料を２０分間８０℃にてインキュベートし、プロテイナーゼＫ溶液（１μＬ、２０μｇ／μＬを含む１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）プロテイナーゼＫ）を加え、次いで３０分間３７℃にておよび２０分間８０℃にてインキュベートした。その後、試料を試料緩衝液（２μＬ、０．２５％ブロモフェノールブルーおよび３０％グリセロール）と混合し、および１％アガロースゲルで分析した。
電気泳動移動度シフト検定：３．３μＬの精製標識化ＤＮＡ（または対照）を緩衝液（７．７μＬ、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、７５ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ １，４−ジチオスレイトール）およびストレプトアビジン溶液（２μＬ、２．０μｇ／μＬ）と混合し、および３時間３７℃にてインキュベートした。その後、試料を試料緩衝液（２μＬ、０．２５％ブロモフェノールブルーおよび３０％グリセロール）と混合し、および１％アガロースゲルで分析した。
Ｅ２．立体的に過酷なアジリジン補助因子６ＴＥＸＡＺの合成
６ＴｅｘＡｚは本質的にスキーム８に記載の通り合成された。テキサスレッドのＮＨＳエステル（２．２μＭ）をＤＭＳＯ（１．２ｍＬ）に可溶化し、５’−アジリジニル−Ｎ６−[１”−（４”−アミノブチル）]−５’−デスオキシアデノシン（１．８μｍｏｌを含む１０ｍＭ炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液および３０％アセトニトリル）の溶液１．３５ｍＬと混合し、および３０分間室温にて撹拌した。調製逆相ＨＰＬＣ（プロントシル−ＯＤＳ、５μｍ、１２０Ａ、２５０ｘ８ｍｍ、ビショフ社（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ）、レオンベルク（Ｌｅｏｎｂｅｒｇ））による反応の対照（ＨＰＬＣ対照）の後、産物を精製した。産物はアセトニトリル（２１％５分間、続いて５分間で７０％への直線グラジエントおよび７０％定組成１０分間）を含む炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．５）を用いて３ｍＬ／分にて溶出した。産物を含む画分（保持時間１３．５分、２８０および５９５ｎｍにてＵＶ検出）を回収しおよび凍結乾燥し、赤色の固体化合物をＤＭＳＯ１００μＬに溶解した。アジリジン補助因子６ＴｅｘＡｚの収率（１７％）はＵＶスペクトル法により決定した（ε595＝８０．０００ｃｍ-1Ｍ-1）。
Ｅ３．Ｍ．ＨｈａＩおよび６ＴｅｘＡｚを用いた被験ＤＮＡの配列特異的標識化
被験ＤＮＡ（１．０μｇ、３２０ｂｐ、Ｍ．ＨｈａＩの認識配列１３個、０．６μｇ／Ｍ Ｍ．ＨｈａＩ認識配列）、Ｍ．ＨｈａＩ（１．２μＭ）および６ＴｅｘＡｚ（６０μＭ）を含みトリス／ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（０．０５ｍＭ）および２−メルカプトエタノール（２ｍＭ）から成る緩衝液（１００μＬ）を１５時間３７℃にてインキュベートした。平行対照として、被験ＤＮＡをＭ．ＨｈａＩまたは６ＴｅｘＡｚの非存在下でインキュベートした。その後、試料を２０分間８０℃へ加熱した。ＤＮＡは、キアゲン社（ＱＵＩＡＧＥＮ）（ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））のキアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットを用いて取扱説明書に従って精製し、ＤＮＡは緩衝液（５０μＬ、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．５）で溶出した。
制限分析は、５．０μＬの精製標識化ＤＮＡ（または対照）を緩衝液（５．０μＬ、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび２ｍＭ １，４−ジチオスレイトール）およびＲ．ＨｈａＩ（８Ｕ）を含むトリス／ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ７．９）、ＭｇＣｌ2（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）、１，４−ジチオスレイトール（１ｍＭ）およびＢＳＡ（２．２μｇ／μＬ）から成る緩衝液（９μＬ）と共に３時間３７℃にてインキュベートすることによって実施した。その後、試料を２０分間８０℃にてインキュベートし、プロテイナーゼＫ溶液（１μＬ、２０μｇ／μＬを含む１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）プロテイナーゼＫ）を加え、次いで３０分間３７℃にておよび２０分間８０℃にてインキュベートした。その後、試料を試料緩衝液（２μＬ、０．２５％ブロモフェノールブルーおよび３０％グリセロール）と混合し、および１％アガロースゲルで分析した。
Ｅ４．ビオチン化アジリジン補助因子３のヘミメチル化二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ・ＩＩおよび非メチル化二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ・ＩＩＩとのＭ．ＳｓｓＩに触媒されるカップリング
ビオチン基がアデニン環の６位に結合したアジリジン補助因子３はＭ．ＳｓｓＩの基質である（スキーム１０）。これは図５に示されている。
Figure 0004886679
 スキーム１０：ビオチン化アジリジン補助因子３のヘミメチル化二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ・ＩＩとのＭ．ＳｓｓＩに触媒されるカップリング（Ｍ＝５−メチル−２’−デオキシシチジン）。
ヘミメチル化二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ・ＩＩの溶液（１μＭ、Ｉ＝５’−ＴＧＴＣＡＧＣＧＣＡＴＧＡ−３’、ＩＩ＝５’−ＴＣＡＴＧＭＧＣＴＧＡＣＡ−３’、Ｍ＝５−メチル−２’−デオキシシチジン）または非メチル化二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ・ＩＩＩ（１μＭ、Ｉ＝５’−ＴＧＴＣＡＧＣＧＣＡＴＧＡ−３’、ＩＩＩ＝５’−ＴＣＡＴＧＣＧＣＴＧＡＣＡ−３’）、アジリジン補助因子３（１００μＭ）およびＭ．ＳｓｓＩ（２μＭ）を含む緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸および２ｍＭジチオスレイトール）を２１℃にてインキュベートした。カップリング反応の進行を陰イオン交換ＨＰＬＣ（ポロス（Ｐｏｒｏｓ）１０ＨＱ、１０μｍ、４．６ｘ１００ｍｍ、アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））によって監視した。化合物を塩化カリウム水溶液（０．２Ｍ５分間、次いで５分間で０．５Ｍへ、および３０分間で１Ｍへの直線グラジエント）を含むアジ化ナトリウム（１ｍＭ）含有トリス塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．６）で流速４ｍＬ／分で溶出した。
３を二本鎖Ｉ・ＩＩおよびＭ．ＳｓｓＩと混合直後、はるかに短い保持時間（７．９分）を有する新規化合物が観察された（図５Ａ）。インキュベート中にこの反応産物の量は増加しおよび開始材料Ｉ・ＩＩの量は減少した。反応産物は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの観察されたＵＶ吸収比（記載せず）に基づき、Ｍ．ＳｓｓＩおよびカップリング産物Ｉ3・ＩＩの間の非共有タンパク質−ＤＮＡ複合体に割り当てられる。カップリング産物Ｉ3・ＩＩは９５℃で１０分間のインキュベートによってタンパク質−ＤＮＡ複合体から放出され、および開始材料Ｉ・ＩＩの保持時間（２０．２分）と比較して、産物二本鎖Ｉ3・ＩＩについてわずかに短い保持時間が観察された（１９．４分）。開始二本鎖Ｉ・ＩＩの産物二本鎖Ｉ3・ＩＩへの変換は約６０％であった。３時間後のＭ．ＳｓｓＩのさらに当量の添加および１時間２１℃にてのインキュベートはさらなる産物生成には繋がらず、反応は３時間後に完了したことを示した（記載せず）。この完全でない変換は、酵素調製物中に存在する天然補助因子Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの量の少なさが原因であり、およびＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンからヘミメチル化二本鎖Ｉ・ＩＩへのＭ．ＳｓｓＩに触媒される、二重にメチル化された二本鎖ＩMe・ＩＩを生じるメチル基転移がアジリジン補助因子３との反応をブロックする。
この仮定は、非メチル化二本鎖Ｉ・ＩＩＩを、アジリジン補助因子３とのＭ．ＳｓｓＩに触媒されるカップリング反応の開始材料として用いて検証された（図５Ｂ）。この二本鎖を用いて、Ｍ．ＳｓｓＩおよびカップリング産物（Ｉ・ＩＩＩ）3（保持時間５．３−９．６分）の間の非共有タンパク質−ＤＮＡ複合体へのほぼ完全な変換が、３時間インキュベートの間に起こった。ここでも、カップリング産物（Ｉ・ＩＩＩ）3は９５℃で１０分間のインキュベートによってタンパク質−ＤＮＡ複合体から放出され、および開始二本鎖Ｉ・ＩＩＩの保持時間と比較して産物二本鎖（Ｉ・ＩＩＩ）3についてわずかに短い保持時間が観察された。加えて、産物二本鎖（Ｉ・ＩＩＩ）3中のビオチン基の存在および機能性はストレプトアビジンの添加によって検証された。過剰のアジリジン補助因子３が最初に、ＮＡＰ−５カラム（アマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ドイツ・フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ））を用いたゲル濾過、およびトリス塩酸（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）、塩化ナトリウム（５０ｍＭ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（１０ｍＭ）およびジチオスレイトール（２ｍＭ）での溶出によって除去された。その後、ストレプトアビジン（二本鎖１０ｐｍｏｌに対１μｇし）を加え、および溶液を室温にて３０分間インキュベートした。陰イオン交換ＨＰＬＣ分析（上記参照）は、ストレプトアビジンおよびビオチン化二本鎖（Ｉ・ＩＩＩ）3との間の複合体の形成に合致する、保持時間１４．２分の新規の主要化合物を示した。この複合体に加えて、少量のおそらく二重にメチル化された二本鎖ＩMe・ＩＩＩMeが観察された。
実施例７：道路障壁概念のリアルタイムＰＣＲアプリケーション
核酸分子の共有結合による配列特異的標識化は、Ｎ−アデノシルアジリジン誘導体およびメチルトランスフェラーゼといったＮ−アデノシル−メチオニン類似体を用いて実現できる。しかし、標識化はＤＮＡ基質の非メチル化塩基でのみ可能であり、メチル化塩基は標識化できない（図６Ａ）。大きなアジリジン側鎖によるＤＮＡ基質の標識化は、その後のＰＣＲ増幅反応に対して抑制効果を有すると考えられうる（図６Ｂ）。しかし、メチル化ＤＮＡ基質は効果がないままであろう。この差はリアルタイムＰＣＲ（ライトサイクラー）で検出されうる。
（Ａ）ＤＮＡ基質の調製
「ＤＮＡモデル基質」として、ヒトＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーターおよびエキソン１範囲の一部を選択した。このＤＮＡ基質はいわゆる重複伸長ＰＣＲによって合成した。この方法では、長さが約１００ｂｐの各オリゴヌクレオチドを約２０ｂｐの重複範囲でハイブリダイズし、およびその後のポリメラーゼ反応で増殖して二本鎖を与えた（図７）。十分な量の基質を引き続く標準ＰＣＲで処理した（順方向プライマー：５´−ＧＡＣＣＴＧＧＧＡＡＡＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＣ―３’；逆方向プライマー：５´−ＣＴＧＣＧＧＧＴＴＧＧＣＣＣＣＡＴＧＣ―３´；変性：９６℃にて３０秒、アニーリング：５９℃にて６０秒；増幅：７２℃にて３０秒；３０サイクル）。引き続き配列分析によって合成したＤＮＡ基質の正確さを調べた（図８）。
（Ｂ）ＤＮＡ基質のメチル化
その後の標識化実験では、非メチル化およびメチル化（対照目的のため）基質を用いた。完全または部分メチル化ＤＮＡ基質を調製するために、ＤＮＡは、取扱説明書に従って天然メチル基ドナーＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を用いて、メチラーゼＭ．ＳｓｓＩ（認識配列ＣＧ）、Ｍ．ＨｈａＩ（認識配列ＧＣＧＣ）およびＭ．Ｈｐａｌｌ（認識配列ＣＣＧＧ）で、インキュベートした。引き続き、完全なメチル化または精製の検討を、対応する制限エンドヌクレアーゼＨｈａIおよびＨｐａII（メチル化配列が加水分解されていない）を用いて実施し（図９Ａ）、およびその後調製アガロースゲル電気泳動によって精製した（図９Ｂ）。
（Ｃ）ＤＮＡ基質の標識化
「道路障壁」概念を検討するために、最初に非メチル化基質のみを用いて、アジリジン誘導体７−ＢＡｚで標識した（７−ＢＡｚでの標識化に関する実験の詳細は上記実施例６を参照）。引き続き、対応している処理されたＤＮＡ基質を、ライトサイクラーでの対照目的のためにＲＣＤへと戻した。
（Ｄ）ライトサイクラー中の標識ＤＮＡ基質の検査
ポリメラーゼ反応に対する７―ＢＡｚ標識化の影響の可能性を調べるために、対応している標識ＤＮＡおよび２つの非標識対照を、ライトサイクラー中でのリアルタイムＰＣＲ反応で試験した。この文脈において、ＤＮＡ基質を前もって希釈し、各反応バッチにつきＤＮＡ希釈度１．５ｎｇ、１５０ｐｇ、１５ｐｇ、１．５ｐｇおよび１５０ｆｇで用いた。全ＰＣＲバッチをそれぞれ二回分析した。増幅または検出のために、下記のプライマー／プローブの対を用いた：
順方向プライマー：５’−ＧＡＣＣＴＧＧＧＡＡＡＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＣ−３’
逆方向プライマー：５’−ＣＴＧＣＧＧＧＴＴＧＧＣＣＣＣＡＴＧＣ−３’
ハイブリダイゼーションプローブ：５’−ＬＣ レッド６４０−ＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧ−３’
フルオレセイン−プローブ：５’−ＣＧＣＣＧＴＧＡＣＴＣＡＧＣＡＣＴ―フルオレセイン−３’
さらに予備試験では、２ｍＭの最適ＭｇＣｌ2濃度を決定できた。ライトサイクラーでのすべてのＰＣＲ反応は、取扱説明書に従って「ファーストスタートＤＮＡマスターハイブリダイゼーションプローブ」キット（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）、発注番号第２２３９２７２号）を用いて実施した。
各反応バッチ：Ｈ2Ｏ、ＰＣＲグレード ７．２μｌ
ＭｇＣｌ2原液 ０．８μｌ ２ｍＭ
順方向プライマー ２．０μｌ ５μＭ
逆方向プライマー ２．０μｌ ５μＭ
ハイブリダイゼーションプローブ ２．０μｌ ０．３μＭ
フルオレセインプローブ ２．０μｌ ０．３μＭ
ファーストスタート混合物 ２．０μｌ
ＤＮＡテンプレート ２．０μｌ （１５０ｆｇから１．５ｎｇ）
ＰＣＲ反応のための陰性対照として、ＤＮＡテンプレートではなく、Ｈ2Ｏ、ＰＣＲグレードを用いたバッチ（二重決定）を用いた。
ライトサイクラープログラム：
１．「プレインキュベーション」 １０分、９５℃
Figure 0004886679
３．「冷却」 １分、３７℃
各実施の後、「ライトサイクラーソフトウェア４．０」を用いて評価を実施した。後者によって、ＰＣＲ中に検出された蛍光信号は、いわゆる「クロッシングポイント」へと変換される。これによって、増幅方向またはポリメラーゼ反応の効率に対して結論を導き出すことができる。
（Ｅ）結果および結論
上述のライトサイクラーを用いたリアルタイムＰＣＲを、いくつかの複製バッチで繰り返した。それぞれのバッチを比較する場合、アジリジン標識ＤＮＡ基質を用いた場合（すなわち後の「クロッシングポイント」）のほうが、非標識ＤＮＡテンプレートを用いた対照よりも、反応過程がより遅かったことを示しうる（図１０Ａ〜Ｄ）。このことは、非メチル化ＤＮＡ基質のアジリジン標識塩基によってポリメラーゼ反応が遅延したことを意味する。
要約すると本実験の結果は、「道路障壁」概念が非メチル化およびメチル化ＤＮＡの識別に使用できることを明確に実証している。
ビオチン化アジリジン補助因子１（Ａ）、２（Ｂ）および３（Ｃ）の、反応開始時（ａ）、Ａでは３時間、Ｂでは１．５時間、Ｃでは６．２５時間後（ｂ）、６５℃へ３０分間追加加熱後（ｃ）およびストレプトアビジンのさらなる追加後（ｄ）に陰イオン交換ＨＰＬＣで分析した、二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ・ＩＩとのＭ．ＨｈａＩに触媒されるカップリング。 アジリジン補助因子１およびＭ．ＨｈａＩを用いたＣｐＧ−メチル化の検出。Ａ：反応スキーム（灰色丸＝ストレプトアビジン）；Ｂ：未修飾（ａ）、ＣｐＧメチル化（ｂ）、ＣｐＧメチル化ならびに１およびＭ．ＨｈａＩ処理（ｃ）およびビオチン標識化（ｄ）直線化ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ（ＬｐＵＣ１９）の電気泳動後のアガロースゲル。レーン１：プラスミドＤＮＡ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）；レーン２：プラスミドＤＮＡ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）Ｒ．ＨｈａＩとインキュベート；レーン３：プラスミドＤＮＡ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）ストレプトアビジンとインキュベート。 Ｍ．ＨｈａＩおよび７ＢＡｚを用いた被験ＤＮＡの配列特異的標識化。左：反応スキーム。右：Ｒ．ＨｈａＩに対応するストレプトアビジンの添加による標識化反応の試験、その後のアガロースゲル上の電気泳動。 Ｍ．ＨｈａＩおよび６ＴｅｘＡｚを用いた被験ＤＮＡの配列特異的標識化。左：反応スキーム。右：Ｒ．ＨｈａＩの添加による標識化反応の試験、その後のアガロースゲル上の電気泳動。 ビオチン化アジリジン補助因子３の、反応開始時（ａ）、１時間後（ｂ）、２時間後（ｃ）、３時間後（ｄ）、９５℃へ１０分間追加加熱後（ｅ）およびストレプトアビジンのさらなる追加後（ｆ）に陰イオン交換ＨＰＬＣで分析した、ヘミメチル化二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ・ＩＩ（Ａ）および非メチル化二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ・ＩＩＩ（Ｂ）とのＭ．ＳｓｓＩに触媒されるカップリング。 （Ａ）ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼおよびアジリジン誘導体を用いたＤＮＡ標識化の原理；（Ｂ）アジリジン標識ＤＮＡテンプレートによってＰＣＲ増幅を阻害する原理。 （Ａ）ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼおよびアジリジン誘導体を用いたＤＮＡ標識化の原理；（Ｂ）アジリジン標識ＤＮＡテンプレートによってＰＣＲ増幅を阻害する原理。 重複伸長ＰＣＲによる基質の合成。 ＤＮＡ基質の配列分析。 （Ａ）メチル化／部分メチル化ＤＮＡ基質の産生；（Ｂ）メチル化／部分メチル化ＤＮＡ基質の分析。 （Ａ）メチル化／部分メチル化ＤＮＡ基質の産生；（Ｂ）メチル化／部分メチル化ＤＮＡ基質の分析。 ライトサイクラー−ＰＣＲによる非標識およびアジリジン標識ＤＮＡ基質の比較（Ａ＝１．５ｎｇテンプレートＤＮＡ）；（Ｂ＝１５０ｐｇテンプレートＤＮＡ）；（Ｃ＝１５ｐｇテンプレートＤＮＡ）；（Ｄ＝１．５ｐｇテンプレートＤＮＡ）。 ライトサイクラー−ＰＣＲによる非標識およびアジリジン標識ＤＮＡ基質の比較（Ａ＝１．５ｎｇテンプレートＤＮＡ）；（Ｂ＝１５０ｐｇテンプレートＤＮＡ）；（Ｃ＝１５ｐｇテンプレートＤＮＡ）；（Ｄ＝１．５ｐｇテンプレートＤＮＡ）。 ライトサイクラー−ＰＣＲによる非標識およびアジリジン標識ＤＮＡ基質の比較（Ａ＝１．５ｎｇテンプレートＤＮＡ）；（Ｂ＝１５０ｐｇテンプレートＤＮＡ）；（Ｃ＝１５ｐｇテンプレートＤＮＡ）；（Ｄ＝１．５ｐｇテンプレートＤＮＡ）。 ライトサイクラー−ＰＣＲによる非標識およびアジリジン標識ＤＮＡ基質の比較（Ａ＝１．５ｎｇテンプレートＤＮＡ）；（Ｂ＝１５０ｐｇテンプレートＤＮＡ）；（Ｃ＝１５ｐｇテンプレートＤＮＡ）；（Ｄ＝１．５ｐｇテンプレートＤＮＡ）。

Claims (37)

  1. （ａ）生体分子をＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼとしてのＭ．ＨｈａＩと、前記メチルトランスフェラーゼの検出可能な補助因子の存在下で接触させること、但し、本工程(ａ)がｉｎ ｖｉｖｏにおいて実施される場合にはヒトを除く生物を用いる；および
    （ｂ）前記メチルトランスフェラーゼの認識部位が補助因子またはその誘導体で修飾されているかどうかを検出すること、但し、前記メチルトランスフェラーゼの認識部位の修飾が前記認識部位でのメチル化の非存在を示す、
    を含む、生体分子中の配列特異的メチル化を検出するための方法であって、
    補助因子が式（Ｉ）で表されるＮ−アデノシルアジリジン誘導体である、
    Figure 0004886679
     ここで
    ＷはＮおよびＣＨから選択され、
    ＸはＮまたはＣＲ1であり、
    ＹはＮＨ2またはＮＨＲ2であり、
    ＺはＨまたはＣＨ2ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ2）であり、
    ただし
    ＸがＣＲ1である場合、ＹはＮＨ2であり、
    ＹがＮＨＲ2である場合、ＸはＮであり、
    Ｒ1は−（ＣＨ2）nＲ4、−（ＣＨ＝ＣＨ）m（ＣＨ2）nＲ4、−（ＣＨ2）o（ＣＨ＝ＣＨ）m（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ≡Ｃ）m（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ≡Ｃ）m（Ｃ6Ｈ4）o（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ6Ｈ4）m（ＣＨ2）nＲ4、−ＣＯ（ＣＨ2）nＲ4および−Ｓ（ＣＨ2）nＲ4から選択され；
    Ｒ2は−（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ6Ｈ4）m（ＣＨ2）nＲ4および−ＣＯ（ＣＨ2）nＲ4から選択され；
    Ｒ4は−ＮＨＲ5、−ＮＨＣＯ（ＣＨ2）pＳＲ5、−ＳＲ5、−ＯＲ5、−０（Ｃ2Ｈ5Ｏ）n（Ｃ2Ｈ5）ＮＨＲ5、−ＣＨ2ＮＨＮＨＲ5、−ＮＨＣＯＣＨ（ＣＨ2ＳＨ）ＮＨＲ5および−ＣＯＮＨＲ5から選択され；
    Ｒ5はフルオロフォア、アフィニティタグ、架橋剤、発色団、タンパク質、ペプチド、随意的に修飾されうるアミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、糖質、脂質、ＰＥＧ、トランスフェクション試薬、ビーズ、介入剤、核酸切断試薬およびナノ粒子から選択され、および
    ｎ、ｍ、ｏおよびｐは独立して０または１ないし５０００の整数から選択される、
    前記方法。
  2. （ａ）生体分子をＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼとしてのＭ．ＳｓｓＩと、前記メチルトランスフェラーゼの検出可能な補助因子の存在下で接触させること、但し、本工程(ａ)がｉｎ ｖｉｖｏにおいて実施される場合にはヒトを除く生物を用いる；および
    （ｂ）前記メチルトランスフェラーゼの認識部位が補助因子またはその誘導体で修飾されているかどうかを検出すること、但し、前記メチルトランスフェラーゼの認識部位の修飾が前記認識部位でのメチル化の非存在を示す、
    を含む、生体分子中の配列特異的メチル化を検出するための方法であって、
    補助因子が式（Ｉ）で表されるＮ−アデノシルアジリジン誘導体である、
    Figure 0004886679
     ここで
    ＷはＮおよびＣＨから選択され、
    ＸはＮであり、
    ＹはＮＨＲ2であり、
    ＺはＨまたはＣＨ2ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ2）であり、
    Ｒ2は−（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ6Ｈ4）m（ＣＨ2）nＲ4および−ＣＯ（ＣＨ2）nＲ4から選択され；
    Ｒ4は−ＮＨＲ5、−ＮＨＣＯ（ＣＨ2）pＳＲ5、−ＳＲ5、−ＯＲ5、−０（Ｃ2Ｈ5Ｏ）n（Ｃ2Ｈ5）ＮＨＲ5、−ＣＨ2ＮＨＮＨＲ5、−ＮＨＣＯＣＨ（ＣＨ2ＳＨ）ＮＨＲ5および−ＣＯＮＨＲ5から選択され；
    Ｒ5はフルオロフォア、アフィニティタグ、架橋剤、発色団、タンパク質、ペプチド、随意的に修飾されうるアミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、糖質、脂質、ＰＥＧ、トランスフェクション試薬、ビーズ、介入剤、核酸切断試薬およびナノ粒子から選択され、および
    ｎ、ｍ、ｏおよびｐは独立して０または１ないし５０００の整数から選択される、
    前記方法。
  3. 前記生体分子が核酸分子または（ポリ）ペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 段階（ａ）がｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞抽出物を用いて、またはヒトを除く生物を用いてｉｎ ｖｉｖｏにおいて実施される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記核酸分子がＤＮＡである、請求項３または４の方法。
  6. 段階（ａ）の前に、ＤＮＡを制限酵素で処理する段階をさらに含む、請求項５の方法。
  7. ＤＮＡ分子が固相担体に固定化されている、請求項５または６の方法。
  8. 固相担体に付加されるオリゴヌクレオチドにＤＮＡ分子をハイブリダイゼーションすることによって、ＤＮＡ分子が固相担体に結合する、請求項７の方法。
  9. （ａ）式（Ｉ）のＮ−アデノシルアジリジン誘導体がＤＮＡメチルトランスフェラーゼの認識部位での制限酵素切断をブロックし；および
    （ｂ）Ｎ−アデノシルアジリジン誘導体によるＤＮＡの修飾が前記認識部位での制限酵素によって媒介される切断をブロックするかどうかを試験することによってメチル化が検出される、
    請求項１〜８のいずれか一つの方法。
  10. （ａ）式（Ｉ）のＮ−アデノシルアジリジン誘導体がメチルトランスフェラーゼの認識部位での核酸増幅に干渉し；および
    （ｂ）メチル化は、メチルトランスフェラーゼの認識部位での核酸分子の増幅が遅延したかどうかを試験することによって検出される、
    請求項１〜８のいずれか一つの方法。
  11. （ａ）式（Ｉ）のＮ−アデノシルアジリジン誘導体は蛍光標識を含み；および
    （ｂ）メチル化は、前記核酸分子中の蛍光の存在または量を測定することによって検出される、
    請求項１〜１０のいずれか一つの方法。
  12. （ａ）メチルトランスフェラーゼ認識部位で修飾された核酸分子は、アフィニティ精製によって精製され；および
    （ｂ）式（Ｉ）のＮ−アデノシルアジリジン誘導体、は、アフィニティタグを含む、
    請求項１〜１１のいずれか一つの方法。
  13. 式（Ｉ）のＮ−アデノシルアジリジン誘導体は、シトシン残基に付加され、および
    ＤＮＡ中の５―メチルシトシン残基には付加できない、請求項１〜１２のいずれか一つの方法。
  14. 段階（ａ）の後、ＤＮＡ分子を配列決定する追加的な段階を含む、請求項１〜１３のいずれか一つの方法。
  15. 前記検出可能な補助因子が、（ａ）前記検出可能な補助因子と特異的に結合する抗体によって、または、（ｂ）前記検出可能な補助因子と特異的に結合するアビジンまたはストレプトアビジンによって、検出される、請求項１〜１４のいずれか一つの方法。
  16. 前記ＤＮＡ分子の同一性は、ＤＮＡ塩基配列決定、ハイブリダイゼーション、Ｍａｌｄｉ−Ｔｏｆまたは、酵素の断片化およびクロマトグラフィーによるヌクレオシド組成物の分析によって決定される、請求項１〜１４のいずれか一つの方法。
  17. Ｎ−アデノシルアジリジン誘導体が、
    Figure 0004886679
    から選択される、請求項１の方法。
  18. Ｎ−アデノシルアジリジン誘導体が、
    Figure 0004886679
    である、請求項９〜１１のいずれか一つの方法。
  19. ＤＮＡメチル化の増加または減少を伴う疾患状態の検査のための請求項１〜１８のいずれか一つの方法の使用であって、前記疾患状態は、がんまたはＩＣＦ症候群である、前記使用。
  20. 式（Ｉ）を有し、
    Figure 0004886679
     ここで
    ＷはＮおよびＣＨから選択され、
    ＸはＮまたはＣＲ1であり、
    ＹはＮＨ2またはＮＨＲ2であり、
    ＺはＨまたはＣＨ2ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ2）であり、
    ただし
    ＸがＣＲ1である場合、ＹはＮＨ2であり、
    ＹがＮＨＲ2である場合、ＸはＮであり、
    Ｒ1は−（ＣＨ2）nＲ4、−（ＣＨ＝ＣＨ）m（ＣＨ2）nＲ4、−（ＣＨ2）o（ＣＨ＝ＣＨ）m（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ≡Ｃ）m（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ≡Ｃ）m（Ｃ6Ｈ4）o（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ6Ｈ4）m（ＣＨ2）nＲ4、−ＣＯ（ＣＨ2）nＲ4および−Ｓ（ＣＨ2）nＲ4から選択され；
    Ｒ2は−（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ6Ｈ4）m（ＣＨ2）nＲ4、−ＣＯ（Ｃ6Ｈ4）m（ＣＨ2）nＲ4および−ＣＯ（ＣＨ2）nＲ4から選択され；
    Ｒ4は−ＮＨＲ5、−ＮＨＣＯ（ＣＨ2）pＳＲ5、−ＳＲ5、−ＯＲ5、−０（Ｃ2Ｈ5Ｏ）p（Ｃ2Ｈ5）ＮＨＲ5、−ＣＨ2ＮＨＮＨＲ5、−ＮＨＣＯＣＨ（ＣＨ2ＳＨ）ＮＨＲ5および−ＣＯＮＨＲ5から選択され；
    Ｒ5はフルオロフォア、アフィニティタグ、架橋剤、発色団、タンパク質、ペプチド、随意的に修飾されうるアミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、糖質、脂質、ＰＥＧ、トランスフェクション試薬、ビーズ、介入剤、核酸切断試薬およびナノ粒子から選択され、および
    ｎ、ｍ、ｏおよびｐは独立して０または１ないし５０００の整数から選択される、
    生体分子中の配列特異的メチル化の検出に用いるための、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼとしてのＭ．ＨｈａＩの補助因子。
  21. 式（Ｉ）を有し、
    Figure 0004886679
     ここで
    ＷはＮおよびＣＨから選択され、
    ＸはＮであり、
    ＹはＮＨＲ2であり、
    ＺはＨまたはＣＨ2ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ2）であり、
    Ｒ2は−（ＣＨ2）nＲ4、−（Ｃ6Ｈ4）m（ＣＨ2）nＲ4、−ＣＯ（Ｃ6Ｈ4）m（ＣＨ2）nＲ4および−ＣＯ（ＣＨ2）nＲ4から選択され；
    Ｒ4は−ＮＨＲ5、−ＮＨＣＯ（ＣＨ2）pＳＲ5、−ＳＲ5、−ＯＲ5、−０（Ｃ2Ｈ5Ｏ）p（Ｃ2Ｈ5）ＮＨＲ5、−ＣＨ2ＮＨＮＨＲ5、−ＮＨＣＯＣＨ（ＣＨ2ＳＨ）ＮＨＲ5および−ＣＯＮＨＲ5から選択され；
    Ｒ5はフルオロフォア、アフィニティタグ、架橋剤、発色団、タンパク質、ペプチド、随意的に修飾されうるアミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、糖質、脂質、ＰＥＧ、トランスフェクション試薬、ビーズ、介入剤、核酸切断試薬およびナノ粒子から選択され、および
    ｎ、ｍ、ｏおよびｐは独立して０または１ないし５０００の整数から選択される、
    生体分子中の配列特異的メチル化の検出に用いるための、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼとしてのＭ．ＳｓｓＩの補助因子。
  22. フルオロフォアがアレクサ（Ａｌｅｘａ）色素、ジピロメテンボロンジフルオリド色素、クマリン、ダンシル、フルオレセイン、マンシル、ピレン、ローダミン、テキサスレッド、２−（ｐ−トルイジニル）−６−ナフタレンスルホネート、シアニンフルオロフォア又はその誘導体である、請求項２０または２１の補助因子。
  23. 前記アフィニティタグは、ペプチドタグ、ビオチン、ニッケル−ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）、マルトース、ジゴキシゲニンまたはジニトロフェノールである、請求項２０または２１の補助因子。
  24. 前記ペプチドタグは、Ｈｉｓ−タグまたは金属キレート特性を有するタグ、ストレプ−タグ、ｆｌａｇ−タグ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ、エピトープまたはグルタチオンである、請求項２３の補助因子。
  25. 前記架橋剤は、マレイミド、イオドアセトアミド（ｉｏｄａｃｅｔａｍｉｄｅ）、または、その誘導体、またはアルデヒド誘導体、または光架橋剤である、請求項２０または２１の補助因子。
  26. 前記光架橋剤は、アリルアジド、ジアゾ化合物、ソラーレンまたはベンゾフェノン化合物である、請求項２５の補助因子。
  27. 前記核酸切断試薬は、鉄−ＥＤＴＡ、アクリジンまたはその誘導体、またはロジウム複合体である、請求項２０または２１の補助因子。
  28. Ｎ−アデノシルアジリジン誘導体が、
    Figure 0004886679
    から選択される、請求項２０の補助因子。
  29. （ａ）請求項２０で定義された通りの補助因子と、
    （ｂ）Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼとしてのＭ．ＨｈａＩとの複合体であって、生体分子中の配列特異的メチル化の検出に用いるための複合体。
  30. （ａ）請求項２１で定義された通りの補助因子と、
    （ｂ）Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼとしてのＭ．ＳｓｓＩとの複合体であって、生体分子中の配列特異的メチル化の検出に用いるための複合体。
  31. 請求項２０の補助因子およびＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼとしてのＭ．ＨｈａＩ、または請求項２９の複合体を含むキット。
  32. 請求項２１の補助因子およびＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼとしてのＭ．ＳｓｓＩ、または請求項３０の複合体を含むキット。
  33. 請求項２０もしくは２１の補助因子または請求項２９もしくは３０の複合体を含む診断組成物。
  34. ＤＮＡ分子中の配列特異的メチル化の検出のための、請求項２０もしくは２１の補助因子または請求項２９もしくは３０の複合体の使用、但し、ヒトのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記使用は除く。
  35. ＤＮＡメチル化の増加または減少を伴う疾患の検査のための、請求項２０もしくは２１の補助因子または請求項２９もしくは３０の複合体の使用、但し、ヒトのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記使用は除く。
  36. ＤＮＡメチル化の増加または減少を伴う疾患の診断用の診断組成物の調製のための、請求項２０もしくは２１の補助因子または請求項２９もしくは３０の複合体の使用、但し、ヒトのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記使用は除く。
  37. 前記疾患ががんまたはＩＣＦ症候群である、請求項３６の使用。
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