PL190142B1 - Oligonukleotyd, sposób amplifikowania sekwencji docelowej kwasu nukleinowego i zestaw do przeprowadzenia reakcji amplifikacji kwasu nukleinowego - Google Patents
Oligonukleotyd, sposób amplifikowania sekwencji docelowej kwasu nukleinowego i zestaw do przeprowadzenia reakcji amplifikacji kwasu nukleinowegoInfo
- Publication number
- PL190142B1 PL190142B1 PL98325439A PL32543998A PL190142B1 PL 190142 B1 PL190142 B1 PL 190142B1 PL 98325439 A PL98325439 A PL 98325439A PL 32543998 A PL32543998 A PL 32543998A PL 190142 B1 PL190142 B1 PL 190142B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- amplification
- primers
- modified
- primer
- reaction
- Prior art date
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims description 211
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims description 209
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 51
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 47
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 47
- 239000002253 acid Substances 0.000 title description 11
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 61
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 51
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims abstract description 6
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims abstract description 5
- 125000000008 (C1-C10) alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 89
- -1 phenoxy, substituted phenyl Chemical group 0.000 claims description 44
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 33
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 24
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 20
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims description 8
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 4
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 abstract 1
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 346
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 78
- 239000000047 product Substances 0.000 description 66
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 65
- 239000002585 base Substances 0.000 description 65
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 60
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 49
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 42
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 31
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 27
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 25
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 22
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 16
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 15
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 15
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 14
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 13
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 13
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 125000006502 nitrobenzyl group Chemical group 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 10
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 10
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 10
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 10
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 10
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 10
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 10
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 9
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 9
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 9
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 9
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 7
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 7
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 7
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 7
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 7
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 7
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 6
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 6
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 5
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 5
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 5
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 5
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 5
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 5
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWZSNBJODPRUAV-GZBFAFLISA-N 4-(benzylamino)-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)N=C(NCC=2C=CC=CC=2)C=C1 TWZSNBJODPRUAV-GZBFAFLISA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N benzylamine Chemical compound NCC1=CC=CC=C1 WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 4
- 230000035322 succinylation Effects 0.000 description 4
- 238000010613 succinylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 4
- JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro-(4-methoxyphenyl)-phenylmethyl]-4-methoxybenzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 3
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 3
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 3
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HXBMIQJOSHZCFX-UHFFFAOYSA-N 1-(bromomethyl)-2-nitrobenzene Chemical group [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1CBr HXBMIQJOSHZCFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;6-amino-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FSASIHFSFGAIJM-UHFFFAOYSA-N 3-methyladenine Chemical compound CN1C=NC(N)=C2N=CN=C12 FSASIHFSFGAIJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 2
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 2
- 125000001743 benzylic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- NEHMKBQYUWJMIP-UHFFFAOYSA-N chloromethane Chemical compound ClC NEHMKBQYUWJMIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 2
- TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N methamphetamine hydrochloride Chemical compound Cl.CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OULURTMECJLPJQ-VDXPIPGDSA-N n-[9-[(2r,4s,5r)-5-[[bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethoxy]methyl]-4-hydroxyoxolan-2-yl]purin-6-yl]-n-[(4-tert-butylphenyl)methyl]benzamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OC)=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)OC[C@@H]1[C@@H](O)C[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(CC=2C=CC(=CC=2)C(C)(C)C)C(=O)C=2C=CC=CC=2)O1 OULURTMECJLPJQ-VDXPIPGDSA-N 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000004533 oil dispersion Substances 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 2
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- WZJWHIMNXWKNTO-VWZUFWLJSA-N (2r,3s,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol;hydrate Chemical compound O.C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 WZJWHIMNXWKNTO-VWZUFWLJSA-N 0.000 description 1
- NIMQVHDXSYNJJX-BFHYXJOUSA-N (2r,3s,5r)-5-[6-(benzylamino)purin-9-yl]-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(NCC=3C=CC=CC=3)=C2N=C1 NIMQVHDXSYNJJX-BFHYXJOUSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QZNQSIHCDAGZIA-UHFFFAOYSA-N 1-(bromomethyl)-4-tert-butylbenzene Chemical compound CC(C)(C)C1=CC=C(CBr)C=C1 QZNQSIHCDAGZIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XHBSBNYEHDQRCP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-methyl-3,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound O=C1NC(=N)N(C)C2=C1N=CN2 XHBSBNYEHDQRCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-5-methylpyridine Natural products CC1=CC=C(C)N=C1 XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 3-[chloro-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]oxypropanenitrile Chemical compound CC(C)N(C(C)C)P(Cl)OCCC#N QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- LXAHHHIGZXPRKQ-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-2-methylpyridine Chemical compound CC1=CC=C(F)C=N1 LXAHHHIGZXPRKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- MUSVHUYMGWQEPJ-OJIKYCEASA-N C(C)(C)(C)C1=CC=C(CC2(C3=NCN([C@H]4C[C@H](O)[C@@H](COC(C5=CC=C(C=C5)OC)(C5=CC=C(C=C5)OC)C5=CC=CC=C5)O4)C3=NC=N2)N)C=C1 Chemical compound C(C)(C)(C)C1=CC=C(CC2(C3=NCN([C@H]4C[C@H](O)[C@@H](COC(C5=CC=C(C=C5)OC)(C5=CC=C(C=C5)OC)C5=CC=CC=C5)O4)C3=NC=N2)N)C=C1 MUSVHUYMGWQEPJ-OJIKYCEASA-N 0.000 description 1
- XWQUFPWZAHCRIS-ISSFYUFGSA-N C(C1=CC=CC=C1)(=O)C1(C2=NCN([C@H]3C[C@H](O)[C@@H](COC(C4=CC=C(C=C4)OC)(C4=CC=C(C=C4)OC)C4=CC=CC=C4)O3)C2=NC=N1)NCC1=CC=C(C=C1)C(C)(C)C Chemical compound C(C1=CC=CC=C1)(=O)C1(C2=NCN([C@H]3C[C@H](O)[C@@H](COC(C4=CC=C(C=C4)OC)(C4=CC=C(C=C4)OC)C4=CC=CC=C4)O3)C2=NC=N1)NCC1=CC=C(C=C1)C(C)(C)C XWQUFPWZAHCRIS-ISSFYUFGSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- NJNFUMXDHMLOCT-XUVXKRRUSA-N N-benzyl-N-[9-[(2R,4S,5R)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]purin-6-yl]benzamide Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)C=3C=CC=CC=3)=C2N=C1 NJNFUMXDHMLOCT-XUVXKRRUSA-N 0.000 description 1
- 229930182474 N-glycoside Natural products 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 102000008021 Nucleoside-Triphosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010075285 Nucleoside-Triphosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 1
- LTKCXZGFJFAPLY-OERIEOFYSA-N [1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-2-oxopyrimidin-4-yl]azanium;chloride Chemical compound Cl.O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 LTKCXZGFJFAPLY-OERIEOFYSA-N 0.000 description 1
- AXVVWXCTOPRKCT-WVQJBOLRSA-N [N+](=O)([O-])C=1N=C(C=2N=C(N([C@]3(C[C@H](O)[C@@H](CO)O3)CC3=CC=CC=C3)C2N1)[N+](=O)[O-])N Chemical compound [N+](=O)([O-])C=1N=C(C=2N=C(N([C@]3(C[C@H](O)[C@@H](CO)O3)CC3=CC=CC=C3)C2N1)[N+](=O)[O-])N AXVVWXCTOPRKCT-WVQJBOLRSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012042 active reagent Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001409 amidines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N benzyl bromide Chemical compound BrCC1=CC=CC=C1 AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N dimethylpyridine Natural products CC1=CC=CN=C1C HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical group 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000006178 methyl benzyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- LPICNYATEWGYHI-WIHCDAFUSA-N n-[9-[(2r,4s,5r)-5-[[bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethoxy]methyl]-4-hydroxyoxolan-2-yl]purin-6-yl]benzamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OC)=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)OC[C@@H]1[C@@H](O)C[C@H](N2C3=NC=NC(NC(=O)C=4C=CC=CC=4)=C3N=C2)O1 LPICNYATEWGYHI-WIHCDAFUSA-N 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940083251 peripheral vasodilators purine derivative Drugs 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940083082 pyrimidine derivative acting on arteriolar smooth muscle Drugs 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000006965 reversible inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000006488 t-butyl benzyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 239000006226 wash reagent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Paints Or Removers (AREA)
- Dental Preparations (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
1. Oligonukleotyd o wzorze ogól- nym 1 lub 2, w którym S1 oznacza pierw- sza sekwencje nukleotydów o dlugosci pomiedzy 5 i 50 nukleotydów; S2 oznacza druga sekwencje o dlu- gosci 1-3 nukleotydów; N oznacza nukleotyd, który zawiera zasade purynowa lub pirymidynowa za- wierajaca egzocykliczna amine; R oznacza grupe modyfikujaca, jest zwiazany kowalencyjnie z N poprzez eg- zocykliczna amine i przedstawiony wzorem 3, w którym R 1 i R2 niezaleznie ozna- czaja wodór, grupe C 1-C 10 alkilowa, grupe alkoksylowa, grupe fenylowa, grupe feno- ksylowa, podstawiona grupe fenylowa, grupe naftylowa lub podstawiona grupe naftylowa. wzór 1 wzór 2 PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku są oligonukleotydy, sposób amplifikacji kwasu nukleinowego i zestaw do przeprowadzenia amplifikacji kwasu nukleinowego.
Wynalazek dotyczy dziedziny biologii molekularnej i chemii kwasów nukleinowych. W szczególności, dotyczy sposobów i reagentów do poprawy wydajności reakcji amplifikacji kwasu nukleinowego. Wynalazek ma więc zastosowanie w dowolnej dziedzinie, w której stosuje się amplifikację kwasu nukleinowego.
Wynalezienie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) umożliwiło amplifikację sekwencji kwasu nukleinowego in vitro. PCR opisano w patentach USA nr 4,683,195; 4,683,202 i 4,965,188; Saiki i in., 1985, Science 230:1350-1354; Mullis i in., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 i Mullis i Faloona, 1987, Methods Enzymol. 155:335-350. Opracowanie i zastosowanie PCR opisuje się często w literaturze. Przykładowo szereg zagadnień dotyczących PCR jest omówionych w PCR Technology - Principles and Applications for DNA Amplification, 1989 (wyd. HA Erlich) Stockton Press, New York; PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990 (wyd. M. A. Innis i in., Academic Press, San
190 142
Diego i PCR Strategies, 1995 (wyd. M. A. Innis i in.) Academic Press, San Diego. Dostawcy tacy jak Perkin-Elmer (Norwalk, CT) rozprowadzają reagenty PCR i publikują protokoły PCR.
Od pierwszej publikacji dotyczącej amplifikacji kwasu nukleinowego opisano wiele metod amplifikacji kwasu nukleinowego opartych na starterach, w tym, choć nie wyłącznie, reakcję łańcuchową ligazy (LCR, Wu i Wallace, 1989, Genomics 4:560-569 i Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193); reakcję łańcuchową polimerazy ligazy (Barany, 1991, PCR Methods and Applic., 1:5-16); Gap-LCR (publikacja zgłoszenia patentowego PCT nr WO 90/01069); reakcja łańcuchowa naprawy (publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego nr 439,182 A2), 3SR (Kwoh i in., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177; Guatelli i in. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878; publikacja zgłoszenia patentowego PCT nr WO 92/0880A) i NASBA (patent USA nr 5,130,238). Przegląd układów amplifikacji przedstawiono w publikacji Abramson i Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4:41-47.
Swoistość reakcji amplifikacji opartych na starterach zależy od swoistości hybrydyzacji starterów. W podwyższonych temperaturach stosowanych zwykle w amplifikacjach startery hybrydyzują wyłącznie z zamierzoną sekwencją docelową. Jednakże, mieszaniny reakcyjne reakcji amplifikacji są zwykle tworzone w temperaturze pokojowej, znacznie poniżej temperatury wymaganej do zapewnienia swoistości hybrydyzacji startera. W mniej surowych warunkach, startery mogą wiązać się nieswoiście z innymi, tylko częściowo komplementarnymi sekwencjami kwasu nukleinowego albo z innymi starterami i zapoczątkowywać syntezę niepożądanych produktów wydłużania, które mogą ulegać amplifikacji wraz z sekwencją docelową. Amplifikacja nieswoistych produktów wydłużania startera może współzawodniczyć ' z amplifikacją pożądanych sekwencji docelowych i może istotnie zmniejszyć wydajność amplifikacji pożądanej sekwencji.
Jednym z często obserwowanych nieswoistych produktów amplifikacji jest artefakt reakcji amplifikacji niezależny od matrycy określany jako dimer starterów („primer dimer”). Dimer starterów jest fragmentem dwuniciowym, którego długość jest zwykle bliska sumie długości dwóch starterów i pojawia się podczas wydłużania jednego ze starterów wzdłuż drugiego Powstałe połączenie kaskadowe tworzy niepożądaną matrycę, która z powodu swojej małej długości jest wydajnie amplifikowana.
Nieswoista amplifikacją może być zredukowana przez zmniejszenie tworzenia produktów wydłużania starterów przed rozpoczęciem reakcji. W jednej z metod, określanej jako protokół „hot-start”, jeden albo wiele kluczowych reagentów nie dodaje się do mieszaniny dopóki temperatura nie wzrośnie w sposób wystarczający do zapewnienia swoistości hybrydyzacji. W ten sposób, mieszanina reakcyjna nie podtrzymuje wydłużania starterów w czasie, gdy warunki reakcji nie zapewniają swoistej hybrydyzacji starterów.
Manualne metody hot-start, w których probówki reakcyjne otwierane są po początkowym etapie inkubacji w wysokiej temperaturze i dodawany jest brakujący reagent, są pracochłonne i zwiększają ryzyko zanieczyszczenia mieszaniny reakcyjnej. Alternatywnie, w celu oddzielenia albo sekwestracji składników reakcji stosuje się materiał wrażliwy na ciepło, taki jak wosk, jak to opisano w patencie USA nr 5,411,876 i w publikacji Chou i in., Nucl. Acids Res. 20 (7): 1717-1723. W metodach tych, w etapie inkubacji w wysokiej temperaturze topi się materiał wrażliwy na ciepło, co umożliwia wymieszanie się reagentów.
Inny sposób zmniejszania tworzenia się produktów wydłużania startera przed rozpoczęciem reakcji polega na odwracalnym pod wpływem ciepła zahamowaniu polimerazy DNA przez przeciwciała swoiste wobec polimerazy DNA, jak to opisano w patencie USA nr 5,338,671. Przeciwciała inkubuje się z polimerazą DNA w buforze w temperaturze pokojowej przed wytworzeniem mieszaniny reakcyjnej, w celu utworzenia kompleksu przeciwciała z polimerazą DNA. Zahamowanie aktywności polimerazy DNA przez przeciwciała jest inaktywowane przez inkubację w wysokiej temperaturze przed reakcją. Wadą tego sposobu jest to, ze wytwarzanie przeciwciał swoistych wobec polimerazy DNA jest kosztowne i czasochłonne, zwłaszcza w dużych ilościach. Ponadto, dodanie przeciwciał do mieszaniny reakcyjnej może wymagać ponownego zaplanowania reakcji amplifikacji.
190 142
Tworzenie produktów wydłużania przed rozpoczęciem reakcji może być również zahamowane przez dodanie do reakcji jednołańcuchowego białka wiążącego, które wiąże się niekowalencyjnie ze starterami w sposób odwracalny pod wpływem ciepła i hamuje wydłużanie startera przez blokowanie hybrydyzacji.
Amplifikacja nieswoista może być także zmniejszona przez enzymatyczny rozkład produktów wydłużania wytworzonych przed rozpoczęciem reakcji przy użyciu sposobów opisanych w patencie USA nr 5,418,149. Degradację nowopowstałych produktów wydłużania uzyskuje się przez włączenie do mieszaniny reakcyjnej dUTP i UNG i inkubowanie mieszaniny reakcyjnej w 45-60°C przed przeprowadzeniem reakcji amplifikacji. Wydłużanie starterów powoduje tworzenie dNa zawierającego uracyl, który jest degradowany przez UNG w warunkach inkubacji. Wadą tego sposobu jest to, ze degradacja produktu wydłużania współzawodniczy z tworzeniem produktu wydłużania, zaś produkt nieswoistego wydłużania nie jest całkowicie degradowany. Zaletą tego sposobu jest to, że DNA zawierający uracyl wprowadzony do mieszaniny reakcyjnej jako zanieczyszczenie z poprzedniej reakcji jest również degradowany, a więc, metoda zmniejsza również problem zanieczyszczenia PCR przez amplifikowany kwas nukleinowy z poprzednich reakcji.
Konwencjonalne techniki biologii molekularnej i chemii kwasów nukleinowych, które są w stanie techniki, opisano w pełni w literaturze. Patrz, przykładowo, Sambrook i in., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy York; Oligonucleotide Synthesis (wyd. M.J. Gait, 1984); Nucleic Acid Hybrydization (wyd. B.D. Hames i S.J. Higgins, 1984); oraz seria Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.).
Wynalazek dostarcza starterów oligonukleotydowych zmodyfikowanych kowalencyjnie, do amplifikacji sekwencji kwasu nukleinowego in vitro Zastosowanie zmodyfikowanych starterów według wynalazku powoduje zmniejszenie amplifikacji nieswoistej, zwłaszcza tworzenia dimerów starterów i/lub równoczesne zwiększenie uzysku zamierzonej sekwencji docelowej względem amplifikacji przeprowadzonej przy użyciu starterów niemodyfikowanych.
W jednym z aspektów wynalazek dotyczy startera oligonukleotydowego do amplifikacji sekwencji kwasu nukleinowego o budowie ogólnej określonej wzorem 1 albo 2, w których:
oznacza pierwszą sekwencję nukleotydową o długości pomiędzy 5 i 50 nukleotydów;
52 oznacza drugą sekwencję o długości pomiędzy 1-3 nukleotydów;
N oznacza nukleotyd, który zawiera zasadę purynową albo pirymidynową zawierającą aminę egzocykliczną;
R oznacza grupę modyfikującą kowalencyjnie związaną z N przez aminę egzocykliczną i ma budowę określoną wzorem 3;
w którym R1 i R2 oznaczają niezależnie wodór, grupę alkilową C1-C10, alkoksylową, fenylową, fenoksylową, podstawioną fenylową, naftylową albo podstawioną naftylową. Grupy alkilowe mogą być rozgałęzione albo nierozgałęzione.
W korzystnym wykonaniu, N oznacza zmodyfikowany konwencjonalny nukleotyd, to jest oznacza zmodyfikowaną adenozynę, cytydynę albo guanozynę, zaś cząstka modyfikująca jest kowalencyjnie przyłączona do aminy egzocyklicznej zasady adeninowej, guaninowej albo cytozynowej. W jeszcze korzystniejszym wykonaniu N oznacza zmodyfikowaną adenozynę.
W korzystnym wykonaniu, R oznacza grupę 2-nafylo-metylową; grupę benzylową albo podstawioną grupę benzylową. Korzystne podstawione grupy benzylowe mają budowę określoną wzorem 4, w którym
R3 oznacza rozgałęzioną albo liniową grupę alkilową Ci-Có, korzystniej rozgałęzioną albo liniową grupę alkilową C1-C4, grupę metoksy albo nitrową. Korzystnie, R3 oznacza przyłączony w położeniu para.
W jeszcze korzystniejszym wykonaniu, R oznacza grupę benzylową, p-metylobenzylową p-ter/f-butylobenzylową, p-metoksybenzylową albo 2-nafylometylową.
Inny aspekt wynalazku dotyczy starterów do amplifikacji, które są zmodyfikowane przez fotolabilne wiązanie kowalencyjne z grupą modyfikującą, co powoduje częściowe albo całkowite zahamowanie wydłużania startera. Fotolabilny modyfikator może być związany z aminą egzocykliczną, jak w opisanych wyżej zmodyfikowanych nukleotydach, albo z azotem pierścienia. W jednym z wykonań, przynajmniej jedna grupa nitrobenzylowa jest przyłą190 142 czona do aminy egzocyklicznej zasady adeninowej, guaninowej albo cytozynowej nukleotydu na końcu 3'.
Innym aspektem wynalazku jest para albo zestaw starterów, w których przynajmniej jest zmodyfikowany w opisany wyżej sposób. W korzystnym wykonaniu zmodyfikowane są oba z pary starterów, albo wszystkie z zestawu starterów.
Inny aspekt wynalazku dotyczy sposobów amplifikacji kwasu nukleinowego, które obejmują przeprowadzenie reakcji amplifikacji przy użyciu zmodyfikowanych starterów według wynalazku.
Inny aspekt wynalazku dotyczy sposobów amplifikacji docelowego kwasu nukleinowego, które obejmują przeprowadzenie reakcji amplifikacji przy użyciu zmodyfikowanych fotolabilnie starterów według wynalazku, w których mieszanina reakcyjna jest napromieniowana światłem wystarczającym do usunięcia grupy modyfikującej, co umożliwia tworzenie produktów wydłużania startera. W jednym wykonaniu wynalazku, napromieniowanie przeprowadza się jako osobny etap, przed rozpoczęciem reakcji amplifikacji, ale po podgrzaniu mieszaniny reakcyjnej do temperatury wyższej niż około 50°C. W innym wykonaniu, etap napromieniowania połączony jest ze wstępnym etapem procesu amplifikacji, takim jak etap odwrotnej transkrypcji w reakcji amplifikacji RNA albo początkowym etapem denaturacji w reakcji amplifikacji DNA.
Inny aspekt wynalazku dotyczy zestawów do amplifikacji sekwencji kwasu nukleinowego m vitro, które obejmują parę starterów, w których przynajmniej jeden jest zmodyfikowany w opisany wyżej sposób. Zestawy według wynalazku obejmują również jeden albo więcej reagentów do amplifikacji, np. polimerazę albo ligazę kwasu nukleinowego, trifosfatazę nukleozydową i odpowiednie bufory.
Krótki opis rysunków
Figura 1 pokazuje wyniki amplifikacji RNA HIV-1 przeprowadzonej przy użyciu starterów benzylowanych, jak to opisano w przykładzie V.
Figura 2 pokazuje wyniki amplifikacji RNA HCV przeprowadzonej przy użyciu starterów benzylowanych, jak to opisano w przykładzie VI.
Figura 3 pokazuje wyniki amplifikacji RNA HCV przeprowadzonej przy użyciu starterów zmodyfikowanych jedną z trzech grup modyfikujących, jak to opisano w przykładzie VII.
Figura 4 pokazuje wyniki amplifikacji RNA HCV przeprowadzonej przy użyciu starterów zmodyfikowanych fotolabilnie, jak to opisano w przykładzie VIII.
Figura 5 pokazuje wyniki amplifikacji DNA mykobakterii przeprowadzonej przy użyciu starterów zmodyfikowanych grupą benzylową i starterów modyfikowanych grupą p-tert-butylobenzylową, jak to opisano w przykładzie X.
Figura 6 pokazuje ogólny schemat reakcji odpowiedniej dla syntezy kontrolowanego dA szkła porowatego modyfikowanego grupą benzylową albo podstawioną benzylową (CPG).
W celu ułatwienia zrozumienia wynalazku, poniżej zdefiniowano kilka terminów.
Określenia „kwas nukleinowy” i „oligonukleotyd” dotyczą polidezoksyrybonukleotydów (zawierających 2-dezoksy-D-rybozę), poliiybonukleotydów (zawierających D-rybozę) i dowolnego innego rodzaju polinukleotydu, który jest N-glikozydem zasady purynowej albo pirymidynowej, albo zmodyfikowanej zasady purynowej albo pirymidynowej. Nie ma zamierzonego rozróżnienia w długości pomiędzy określeniami „kwas nukleinowy” i „oligonukleotyd” i terminy te będą stosowane zamiennie. Określenia te dotyczą wyłącznie struktury pierwszorzędowej cząsteczki. Tak więc, określenia te obejmują jedno-i dwuniciowe DNA, jak również jedno- i dwuniciowe RNA.
Określenie „konwencjonalne” w odniesieniu do zasad kwasu nukleinowego, nukleozydów albo nukleotydów, dotyczy takich, które występują naturalnie w opisywanych polinukleotydach Cztery konwencjonalne (określane również jako główne) dezoksyrybonukleotydy DNA zawierają zasady purynowe, adeninę i guaninę oraz zasady pirymidynowe, cytozynę i tyminę. Cztery konwencjonalne rybonukleotydy RNA zawierają zasady purynowe, adeninę i guaninę oraz zasady pirymidynowe, cytozynę i uracyl. Oprócz powyższych zasad konwencjonalnych albo powszechnych, w niektórych kwasach nukleinowych występują w małych ilościach liczne inne pochodne puryny i pirymidyny, zwane zasadami rzadkimi albo pobocznymi. W znaczeniu tu zastosowanym, „niekonwencjonalne”, w odniesieniu do zasad, nukle6
190 142 ozydów i nukleotydów kwasu nukleinowego, dotyczy rzadkich albo pobocznych zasad kwasu nukleinowego, nukleozydów albo nukleotydów i modyfikacji, pochodnych albo analogów konwencjonalnych zasad, nukleozydów albo nukleotydów i obejmuje syntetyczne nukleotydy 0 zmodyfikowanych resztach zasad i/lub zmodyfikowanych resztach cukru (patrz, Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Methods in Molecular Biology, vol. 26 (wyd. Sudhir Agrawal, Humana Press, Totowa, NJ (1994); i Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach (wyd. Fritz Eckstein, IRL Press, Oxford University Press, Oxford).
Oligonukleotydy można wytwarzać dowolną odpowiednią metodą, w tym, przykładowo, przez klonowanie i restrykcję odpowiednich sekwencji i bezpośrednią syntezę chemiczną takim sposobem jak metoda fosfodiestrowa Naranga i in., 1979, Meth. Enzymol. 68 90-99; metodą fosfodiestrowa według Browna i in., 1979, Meth. Enzymol 68:109-151; metodą dietylofosforo-amidynową Beaucage i in., 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; oraz metodą na podłożu stałym według patentu USA nr 4,458,066. Przegląd metod syntezy zamieszczono w publikacji Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry i (3): 165-187.
Określenie „parowanie zasad”, określane również jako „parowanie zasad Watsona-Cricka” dotyczy dobrze znanego łączenia się komplementarnych par zasad adeniny-tymidyny 1 guaniny-cytozyny w dwuniciowej strukturze DNA, adeniny-uracylu i guaniny-cytozyny w hybrydowej cząsteczce DNA/RNA i analogicznego wiązania się niekonwencjonalnych par zasad.
Określenie „hybrydyzacja dotyczy tworzenia się struktury dupleksu przez dwa jednoniciowe kwasy nukleinowe w wyniku komplementarnego parowania zasad. Hybrydyzacja może zajść pomiędzy w pełni komplementarnymi nićmi kwasu nukleinowego, albo pomiędzy „zasadniczo komplementarnymi” łańcuchami kwasu nukleinowego, który zawiera niewielkie regiony niezgodności.
Warunki, w których hybrydyzują tylko w pełni komplementarne sekwencje określane są jako „surowe warunki hybrydyzacji” albo „warunki hybrydyzacji swoistej”. Stabilne dupleksy sekwencji zasadniczo komplementarnych można uzyskać w mniej surowych warunkach hybrydyzacji; stopień tolerowanych niezgodności może być kontrolowany przez odpowiednie dostrojenie warunków hybrydyzacji. Specjaliści w dziedzinie technologii kwasów nukleinowych potrafią określić empirycznie stabilność dupleksu biorąc pod uwagę wiele zmiennych, przykładowo, długość i zagęszczenie par zasad oligonukleotydów, siłę jonową i występowanie niezgodnych par zasad, w oparciu o wskazówki istniejące w stanie techniki (patrz, Sambrook i in., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy York; Wetmur, 1991, Critical Revew in Biochem. and Mol. Biol. 26(3/4)-227-259).
Termin „starter” dotyczy oligonukleotydu zdolnego do działania jako punkt początkowy syntezy DNA w warunkach, w których zapoczątkowywana jest synteza produktu wydłużania startera komplementarnego do nici kwasu nukleinowego, tj. w obecności czterech różnych trifosforanów nukleozydów i środka do wydłużania (np. polimerazy DNA albo odwrotnej transkryptazy) w odpowiednim buforze i w odpowiedniej temperaturze. W znaczeniu tu zastosowanym, termin „starter” obejmuje oligonukleotydy zastosowane w procesach amplifikacji za pośrednictwem ligacji, w których jeden oligonukleotyd jest „wydłużany” dzięki ligacji z drugim oligonukleotydem, który hybrydyzuje w sąsiadującej pozycji. Tak więc, określenie „wydłużanie startera” w znaczeniu tu użytym oznacza, zarówno polimeryzację pojedynczych trifosforanów nukleozydów przy użyciu startera jako punktu zapoczątkowania syntezy dNa, jak i ligację dwóch starterów z wytworzeniem produktu wydłużania.
Starter jest korzystnie jednoniciowym DNA. Odpowiednia długość startera zalezy od zamierzonego zastosowania startera ale zwykle jest w zakresie od 6 do 50 nukleotydów. Krótkie cząsteczki startera z reguły wymagają nizszej temperatury aby wytworzyć wystarczająco stabilne kompleksy hybrydowe z matrycą. Starter nie musi odzwierciedlać dokładnie sekwencji matrycy kwasu nukleinowego, ale musi być wystarczająco komplementarny aby hybrydyzować z matrycą. Projektowanie odpowiednich starterów do amplifikacji danej sekwencji docelowej jest dobrze znane w technice i opisane w cytowanej tu literaturze.
Startery mogą posiadać dodatkowe cechy, które umożliwia ją wykrywanie albo unieruchamianie startera, ale nie zmienia ją zasadniczej właściwości startera, działania jako punkt
190 142 początkowy syntezy DNA. Przykładowo, startery mogą zawierać dodatkową sekwencję kwasu nukleinowego na końcu 5', która nie hybrydyzuje z docelowym kwasem nukleinowym, ale która ułatwia klonowanie amplifikowanego produktu. Region startera, który jest wystarczająco komplementarny z matrycą aby hybrydyzować, określany jest jako region hybrydyzujący.
Określenie „cel” „sekwencja docelowa” „region docelowy” i docelowy kwas nukleinowy” dotyczy regionu albo częściowej sekwencji kwasu nukleinowego, który ma być amplifikowany. ·
W znaczeniu tu zastosowanym, startery są „swoiste” dla sekwencji docelowej, jeżeli liczba niezgodności występujących pomiędzy sekwencją startera i sekwencją docelową jest mniejsza niz liczba niezgodności pomiędzy sekwencją startera i sekwencją nie będącą docelową, która może występować w próbce. Można dobrać warunki hybrydyzacji, w których stabilne dupleksy tworzą się wyłącznie wtedy, gdy liczba występujących niezgodności nie jest większa niz liczba niezgodności występujących pomiędzy sekwencją startera i sekwencją docelową. W takich warunkach, starter może tworzyć stabilny dupleks wyłącznie z sekwencją docelową. Tak więc, zastosowanie starterów swoistych wobec celu w odpowiednio surowych warunkach amplifikacji umożliwia swoistą amplifikację tych sekwencji docelowych, które zawierają docelowe miejsca wiązania startera. Zastosowanie warunków amplifikacji swoistych dla sekwencji umożliwia swoistą amplifikację tych sekwencji docelowych, które zawierają miejsca wiązania startera dokładnie komplementarne.
Określenie „nieswoista amplifikacja dotyczy amplifikacji sekwencji kwasu nukleinowego innej niz sekwencja docelowa, co jest spowodowane hybrydyzacją starterów z sekwencjami innymi niz sekwencja docelowa i działaniem jako substrat do wydłużania startera. Hybrydyzacja startera z sekwencją nie będącą docelową określane jest jako „nieswoista hybrydyzacja” i może zachodzić w warunkach nizszej temperatury i zmniejszonej surowości przed amplifikacją.
Określenie „dimer starterów” dotyczy niezależnego od matrycy, nieswoistego produktu amplifikacji, który jest wynikiem wydłużania startera, podczas którego drugi starter służy jako matryca. Jakkolwiek, dimer starterów często jest sekwencją kaskadową dwóch starterów, tj. dimerem, mogą występować również kaskady więcej niż dwóch starterów. Określenie „dimer starterów” stosowane jest tu ogólnie dla określenia niezależnych od matrycy, nieswoistych produktów amplifikacji.
Określenie „mieszanina reakcyjna” dotyczy roztworu zawierającego reagenty konieczne do przeprowadzenia danej reakcji. „Mieszanina reakcyjna amplifikacji”, co dotyczy roztworu zawierającego reagenty niezbędne do przeprowadzenia reakcji amplifikacji, zwykle zawiera startery oligonukleotydowe i polimerazę albo ligazę DNA w odpowiednim buforze. „Mieszanina reakcyjna PCR” zwykle zawiera startery oligonukleotydowe, termostabilną polimerazę DNA, dNTP i dwuwartościowe kationy metalu w odpowiednim buforze. Mieszanina reakcyjna określana jest jako kompletna jeżeli zawiera wszystkie reagenty niezbędne do umożliwienia reakcji, zaś niekompletna gdy zawiera tylko część niezbędnych reagentów. Dla specjalisty zrozumiałe jest, ze składniki reakcji są zwykle przechowywane osobno, przy czym każdy zawiera część całości składników, dla wygody, stabilności podczas przechowywania oraz w celu umożliwienia ustalenia zaleznie od potrzeby stężenia składników, oraz, że składniki reakcji są łączone przed reakcją tworząc kompletną mieszaninę reakcyjną. Ponadto, należy rozumieć, ze składniki reakcji są pakowane osobno do sprzedazy oraz, ze przydatne handlowo zestawy mogą zawierać dowolną część składników reakcji, która obejmuje zmodyfikowane startery według wynalazku.
Zmodyfikowane startery
Startery amplifikacji według wynalazku są zmodyfikowane przez kowalencyjne przyłączenie jednego z czterech nukleotydów na końcu 3' startera. W jednym wykonaniu, zmodyfikowany starter według wynalazku obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego o budowie ogólnej określonej wzorem 1 albo 2, w których:
S i oznacza pierwszą sekwencję nukleotydową o długości pomiędzy 5 i 50 nukleotydów;
S2 oznacza drugą sekwencję długości 1-3 nukleotydów;
N oznacza nukleotyd, który zawiera zasadę purynową albo pirymidynową zawierającą aminę egzocykliczną;
190 142
R oznacza grupę modyfikującą, kowalencyjnie związaną z N przez aminę egzocykliczną i ma budowę określoną jak niżej.
Jak pokazano w przykładach, wpływ modyfikacji jest maksymalizowany, gdy modyfikacja dotyczy nukleotydu końca 3'. Tak więc korzystnie, starter zawiera zmodyfikowany nukleotyd końca 3'.
Modyfikowany nukleotyd wybrany jest z grupy obejmującej nukleotydy, których zasada zawiera aminę egzocykliczną, która bierze udział w parowaniu zasady nukleotydu z jego nukleotydem komplementarnym. Zwykle, startery są DNA zawierającymi jedynie konwencjonalne nukleotydy. Wśród czterech konwencjonalnych zasad nukleotydów spotykanych w DNA, adenina, guanina i cytozyna zawierają egzocykliczną aminę pierwszorzędową, która bierze udział w parowaniu zasady z komplementarną zasadą. W korzystnym wykonaniu wynalazku, starter jest zmodyfikowany przez przyłączenie do aminy egzocyklicznej pojedynczej grupy modyfikującej, podstawionej zamiast jednego z dwóch wodorów grupy aminowej, które w niemodyfikowanej zasadzie mogą brać udział w parowaniu zasad. Budowy zmodyfikowanych nukleotydów zawierających zasadę adeninową, guaninową i cytozynową są przedstawione, odpowiednio, wzorami 5, 6 i 7, w których S oznacza resztę cukrową, zaś R oznacza grupę modyfikującą.
Wynalazek nie jest ograniczony do starterów zawierających konwencjonalne nukleotydy. Dowolny analog nukleotydu, w którym reszta zasady zawiera pierwszorzędową aminę egzocykliczną, która bierze udział w parowaniu zasady z zasadą komplementarną jest możliwa do modyfikacji, jak to opisano. Przykłady niekonwencjonalnych nukleotydów obejmują 3-metyloadeninę, 7-metyloguaninę, 3-metyloguaninę, 5-metylocytozynę i 5-hydroksymetylocytozynę.
Grupa modyfikująca ogranicza zdolność zmodyfikowanej zasady do włączania się w wiązanie wodorowe, ponieważ modyfikator zastępuje jeden atom wodoru. Pozostały atom wodoru może brać udział w wiązaniu wodorowym. Modyfikator może więc wpływać na kinetykę i termodynamikę hybrydyzacji. Uważa się, że wiele grup modyfikujących posiada pomzsze właściwości:
1. zakłóca, ale nie zapobiega parowaniu zasad Watsona-Cricka zmodyfikowanej zasady z zasadą komplementarną;
2. zakłóca, ale nie zapobiega wydłużaniu zmodyfikowanego startera; i umożliwia syntezę nici komplementarnej do produktu wydłużania zmodyfikowanego startera.
Grupa modyfikująca przestrzennie zakłóca parowanie zasady, tak więc również wydłużanie startera. Stąd, wielkość modyfikatora wpływa na stopień zakłócania hybrydyzacji. Gdy zmodyfikowany nukleotyd adeninowy albo cytydynowy jest włączony do dwuniciowego kwasu nukleinowego, grupa modyfikująca kieruje się do wnętrza rowka większego. W następstwie tego, nawet względnie duze grupy modyfikujące powodują jedynie niewielkie zaburzenie przestrzenne struktury dupleksu. Jednakże, odpowiednie modyfikatory nie są wystarczająco duze, aby zapobiec wiązaniu wodorowemu albo enzymatycznemu wydłużaniu startera 3'-hydroksylowego. Gdy zmodyfikowany nukleotyd guaninowy jest wprowadzony do dwuniciowego kwasu nukleinowego, grupa modyfikująca kieruje się w stronę rowka mniejszego, w którym jest mniej przestrzeni do pomieszczenia grupy modyfikującej. W następstwie tego, do przyłączania do zasady guaninowej korzystniejsze są mniejsze grupy modyfikujące.
Produkty wydłużania starterów, które są wykorzystywane jako matryce w kolejnych cyklach amplifikacji, zawierają modyfikowaną zasadę wprowadzona przez starter. Grupa modyfikująca jest tak wybrana, ze obecność zmodyfikowanej zasady w matrycy nie powoduje przerwania wydłużania startera albo zahamowania wydłużania startera. Korzystnie, natura grupy modyfikującej nie powinna powodować zjawisk mutagennych, w których tożsamość zmodyfikowanej zasady ulega utracie podczas replikacji matrycy pochodzącej ze startera. Wpływ zmodyfikowanej zasady w matrycy na wydłużanie startera można rutynowo badać w oparciu o obecne tu i w stanie techniki wskazówki (patrz, przykładowo, Gniazdowski i Cera, 1996, Chem. Rev 96:619-634).
190 142
Grupy modyfikujące R, które spełniają powyższe wymagania, są odpowiednie do zastosowania w sposobach według wynalazku. Korzystne grupy modyfikujące są przedstawione wzorem 3, w którym:
Ri i R2 oznaczają niezależnie wodór, grupę alkilową C1-C10, alkoksylową, fenylową, fenoksylową, podstawioną fenylową, naftylową albo podstawioną naftylową. Grupy alkilowe mogą być rozgałęzione albo nierozgałęzione. Można także stosować większe grupy alkilowe, do co najmniej C20·
W korzystnym wykonaniu, R oznacza grupę 2-naftylometyIową, benzylową albo podstawioną benzylową. Korzystna podstawiona grupa benzylowa ma budowę określoną wzorem 4, w którym:
R3 oznacza rozgałęzioną albo liniową grupę alkilową C1-C6, korzystniej rozgałęzioną albo liniową grupę alkilową C1-C6, grupę metoksylową albo nitrową. Rozgałęzionymi albo liniowymi grupami alkilowymi C1-C4 są grupy: metylowa, etylowa, propylowa, butylowa, izopropylowa, izobutylowa, tert-butylowa itp. Korzystnymi grupami alkilowymi są grupy metylowa i tertbutylowa. Korzystnie, R3 jest przyłączony w położeniu para.
Szczególnie korzystne grupy modyfikujące R przedstawione są wzorami:
Wzór 8 (benzyl), wzór 9 (p-metylobenzyl), wzór 10 (p-teri-butylobenzyl), wzór 11 (p-metoksybenzyl), wzór 12 (o-nitrobenzyl) i wzór 13 (2-naftylometyl).
Liczne grupy modyfikujące opisane są w przykładach. Ogólnie, dobór empiryczny konkretnej odpowiedniej grupy modyfikującej z klasy opisanych tu związków specjalista może przeprowadzić w oparciu o dostarczone tu wskazówki. Korzystnie, przydatność konkretnej grupy określa się empirycznie stosując zmodyfikowane startery w reakcji amplifikacji. Pomyślna amplifikacja wskazuje, ze zmodyfikowana zasada nie hamuje całkowicie wydłużania startera oraz, ze obecność zmodyfikowanej zasady w matrycy pochodzącej ze startera nie powoduje przerwania wydłużania startera. Zmniejszenie tworzenia dimerów startera określa się jak to opisano w przykładach.
Startery z modyfikacją fotolabilną
W alternatywnym wykonaniu wynalazku, startery modyfikowane są jedną lub wieloma grupami fotolabilnymi, które można usunąć przez ekspozycję na światło po tym jak reakcja osiągnęła warunki reakcji w wysokiej temperaturze, które zapewniają swoistość. Ponieważ modyfikator jest usuwany przed wydłużaniem startera, zmodyfikowany starter nie musi być możliwy do wydłużania przed usunięciem grupy. Przykłady modyfikatorów fotolabilnych, które można zastosować w sposobach według wynalazku opisane są w publikacji Pillai, 1980, „Photoremovable Protecting Groups in Organie Synthesis”, Synthesis: 1-26.
Korzystnie, startery fotolabilne według wynalazku są zmodyfikowane na nukleotydzie końca 3', przez przyłączenie jednej albo dwóch grup o-nitrobenzylowych o wzorze 12.
W starterach zmodyfikowanych przez przyłączenie pojedynczej grupy nitrobenzylowej do pierwszorzędowej aminy egzocyklicznej reszty zasady, powstała amina drugorzędowa może uczestniczyć w parowaniu zasady jeżeli grupa aminowa ulega rotacji w taki sposób, ze pozostały wodór jest zorientowany naprzeciw zasady komplementarnej. Jak opisano w przykładach, startery te można zastosować w amplifikacji z lub bez usunięcia przez napromieniowanie UV.
Startery zmodyfikowane przez przyłączenie dwóch grup nitrobenzylowych do aminy egzocyklicznej zasady nie mogą ulegać wydłużaniu. Zahamowanie wynika prawdopodobnie z niezdolności zmodyfikowanej zasady do parowania, co jest spowodowane zastąpieniem obu wodorów aminy egzocyklicznej znacznymi grupami nitrobenzylowymi. Zastosowanie starterów zmodyfikowanych dwiema grupami nitrobenzylowymi do amplifikacji, w której mieszaninę reakcyjną eksponuje się na UV przez czas wystarczająco długi dla usunięcia grup nitrobenzylowych, umożliwia w ten sposób wydłużanie startera, jak to opisano w przykładach.
W alternatywnym wykonaniu, grupa modyfikująca jest przyłączona do azotu pierścienia. Startery zmodyfikowane przez przyłączenie grupy nitrobenzylowej do azotu pierścienia zasady nie mogą być wydłużane z powodu niemożności parowania zasad przez zmodyfikowaną zasadę. Usunięcie grup nitrobenzylowych przez ekspozycję na UV umożliwia wydłużanie startera.
190 142
Zastosowanie starterów fotolabilnych, które nie mogą być wydłużane do momentu usunięcia grup modyfikujących zapewnia zasadniczo amplifikację „hot-start . Wydłużanie startera jest hamowane podczas nieswoistych warunków przed reakcją. Reakcja jest naświetlana, zaś startery są odblokowywane zaraz po tym, j’ak temperatura reakcji wzrośnie do temperatury zapewniającej swoistość reakcji.
Synteza zmodyfikowanych starterów
Synteza zmodyfikowanych starterów jest przeprowadzana przy użyciu standardowych środków chemicznych dobrze znanych w technice. Sposoby wprowadzania tych modyfikatorów mogą być podzielone na cztery klasy.
1. Modyfikator może być wprowadzany przez zastosowanie zmodyfikowanego nukleozydu jako podstawy do syntezy DNA.
2. Modyfikator może być wprowadzony przez zastosowanie zmodyfikowanego nukleozydu jako fosforamidit.
3. Modyfikator może być wprowadzony przez zastosowanie reagenta podczas syntezy DNA (np. traktowanie benzylaminą przekształcalnego amidynu, podczas wprowadzania do sekwencji DNA).
4. Modyfikacja po syntezie. Modyfikator może być wprowadzony jako aktywny reagent, gdy skontaktuje się go z syntetycznym DNA.
Synteza konkretnego zmodyfikowanego startera jest opisana w przykładach. Dodatkowe zmodyfikowane startery mogą być syntetyzowane przy użyciu standardowych metod syntezy w analogiczny sposób.
Korzystnie, zmodyfikowane startery są syntetyzowane przy użyciu podłoża z derywatyzowanego kontrolowanego porowatego szkła (CPG). Ogólny schemat reakcji syntezy derywatyzowanego dA CPG pokazano na figurze 6. Konkretne grupy modyfikujące mogą być dodane przez zastosowanie odpowiedniego środka alkilującego, takiego jak halogenek alkilu, halogenek benzylu, halogenek podstawionego benzylu, halogenek metylonaftylu albo halogenek podstawionego metylonaftylu. Syntezę benzylo- i p-/er/-butylobenzylo-dA CPG opisano w przykładzie I i II w oparciu o schemat pokazany na figurze 6.
Alkilowanie grupy aminy egzocyklicznej można przeprowadzić przy użyciu sposobów analogicznych do metylowania opisanego w publikacji Griffina i Reese, 1963, Biochim. Acta 68:185-192. Dodatkowe metody syntezy są opisane w publikacji Aritoma i in., 1995, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:1837-1849.
Amplifikacja przy użyciu zmodyfikowanych starterów
Sposób według wynalazku obejmują przeprowadzanie amplifikacji w oparciu o zmodyfikowane startery według wynalazku. Ogólnie, zmodyfikowane startery mogą zastąpić niemodyfikowane startery zawierające tę samą sekwencję nukleotydową w amplifikacji opartej na starterach bez zmian w warunkach reakcji amplifikacji. Oczywiście, specjalista zauwazy, ze rutynowa optymalizacja warunków reakcji może być w niektórych reakcjach korzystna.
W korzystnym wykonaniu, zmodyfikowane startery według wynalazku są stosowane w reakcji łańcuchowej polimerazy (PGR). Jednakże, wynalazek nie jest ograniczony do żadnego konkretnego układu amplifikacji. Zmodyfikowane startery według wynalazku mogą być zastosowane w dowolnym układzie amplifikacji opartym na starterach, w którym mogą się tworzyć dimery starterów albo produkt amplifikacji nieswoistej. Przykłady obejmują sposoby amplifikacji opisane w wyżej cytowanych odnośnikach. W miarę opracowywania nowych układów, mogą one korzystać w praktyce z wynalazku.
Sposoby według wynalazku są przydatne do amplifikacji DNA albo RNA. Przykładowo, amplifikacja RNA przy użyciu odwrotnej transkrypcji/reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR) jest dobrze znana i opisana w patentach USA nr 5,322,770 i 5,310,652; Myers i Gelfand, 1991, Biochemistry 30(31):7661-7666; Young i in., 1993, J. Clin. Microbiol., 31 (4):882-886 i Mulder i in., 1994, J. Clin. Microbiol. 32(2):292-300.
W amplifikacji opartej na starterze, wydłużanie startera jest zwykle przeprowadzane w podwyższonej temperaturze przy użyciu enzymu termostabilnego, takiego jak termostabilna polimerazą DNA Enzym rozpoczyna syntezę na końcu 3' startera i prowadzi ją w kierunku końca 5' matrycy do momentu przerwania syntezy. Oczyszczone termostabilne polimerazy
190 142
U
DNA przydatne w reakcjach amplifikacji są dobrze znane w technice i obejmują, choć me są ograniczone do enzymów opisanych w patentach USA nr 4,889,818; 5,079,352; 5,352,600; 5,491,086; w WO 91/09950; WO 92/03556; WO 92/06200; WO 92/06202; WO 92/09689 i patencie USA 5,210,036. Przegląd termostabilnych polimeraz DNA zamieszczony jest w publikacji Abramson, 1995, PCR Strategies (wyd. M.A. Innis i In.) str. 39-57, Academic Press, San Diego.
W korzystnym wykonaniu, szczególnie w amplifikacji DNA, amplifikację przeprowadza się stosując enzym inaktywowany odwracalnie. Zastosowanie odwracalnie maktywowanego enzymu, który jest reaktywowany w warunkach wysokiej temperatury, dalej zmniejsza amplifikację nieswoistą przez zahamowanie wydłużania startera przed rozpoczęciem reakcji. Odwracalnie inaktywowaną termostabilną polimerazę DNA, opracowaną i wytwarzaną przez Hoffmann-La Roche (Nutley, NJ) i sprzedawaną przez Perkin-Elmer (Norwalk, CT) opisano w publikacji Birch i in., 1996 Naturę 381 ( 6581) :445-446.
Wpływ grupy modyfikującej na zdolność enzymu do wydłużania startera zalezy, częściowo, od zastosowanego enzymu i częściowo od wybranych warunków reakcji. Przykładowo polimeraza DNA Tht jest bardziej permisywna, gdy jako kation dwuwartościowy stosuje się jony Mn2+ jak w niektórych amplifikacjach RNA, zamiast Mg2+. Specjalista na drodze rutynowej selekcji może dobrać odpowiednią grupę modyfikującą, enzym i warunki reakcji.
Metody preparatyki próbki odpowiednie do reakcji amplifikacji są dobrze znane w dziedzinie i w pełni opisane w cytowanej tu literaturze. Konkretna zastosowana metoda nie stanowi kluczowego elementu wynalazku. Specjalista może optymalizować warunki reakcji do zastosowania ze znanymi metodami preparatyki próbek.
Metody analizowania amplifikowanych kwasów nukleinowych są dobrze znane w technice i w pełni opisane w cytowanej tu literaturze. Konkretna zastosowana metoda nie stanowi kluczowego elementu wynalazku. Specjalista może optymalizować warunki reakcji do zastosowania ze znanymi metodami analizowania zaleznie od zastosowania.
Korzystnym sposobem analizowania reakcji amplifikacji jest śledzenie wzrostu całkowitej ilości dwuniciowego DNA w mieszaninie reakcyjnej, jak to opisał Higuchi i in., 1992, Bio/Technology 10:413-417; Higuchi i in., 1993, Bio/Technology 11:1026-1030, europejskie publikacje patentowe nr 512,334 i 640,828. W sposobie tym, określonym tu jako „kinetyczna PCR”, wykrywanie dwuniciowego DNA polega na wzroście fluorescencji bromku etydyny (EtBr) i innych znaczników wiążących DNA, wykazywanej po związaniu dwuniciowego DNA. Amplifikację przeprowadza się w obecności znacznika. Wzrost ilości dwuniciowego DNA spowodowany syntezą sekwencji docelowej powoduje wykrywalny wzrost fluorescencji, którą się śledzi podczas amplifikacji. Tak więc, metody umożliwiają śledzenie postępu reakcji amplifikacji.
W kinetycznej PCR, zmierzona fluorescencja zalezy od ilości całkowitej obecnego dwuniciowego DNA, niezaleznie od tego, czy pochodzi z amplifikacji nieswoistej czy amplifikacji sekwencji docelowych. Śledzenie fluorescencji umożliwia pomiar wzrostu ilości całkowitej dwuniciowego DNA, ale wzrost spowodowany amplifikacją sekwencji docelowej nie jest mierzony niezaleznie od wzrostu spowodowanego amplifikacją nieswoistą. Zmodyfikowane startery według wynalazku są szczególnie przydatne w kinetycznej PCR, ponieważ nie tylko zmniejszają ilość tworzonego dimeru starterów, ale również opóźniają tworzenie wykrywalnych ilości dimeru starterów. Opóźnienie tworzenia dimeru starterów do momentu istotnego zwiększenia ilości sekwencji docelowej umożliwia niezalezne śledzenie amplifikacji sekwencji docelowej i minimalizuje zakłócanie ze strony dimeru starterów.
Zestawy
Wynalazek dotyczy również zestawów, jednostek składających się z wielu pojemników, zawierających przydatne komponenty do wykonywania niniejszego sposobu. Przydatny zestaw składa się ze starterów, z których przynajmniej jeden jest zmodyfikowany w opisany tu sposób, do amplifikacji kwasu nukleinowego. Ewentualne inne składniki obejmują, przykładowo, środek do katalizowania syntezy produktów wydłużania starterów, trifosforany nukleozydów jako substrat, odpowiednie bufory reakcji i instrukcje do przeprowadzania sposobu.
Przykłady wynalazku przedstawione poniżej dostarczono jedynie w celu zilustrowania, nie zaś ograniczania wynalazku. Liczne wykonania wynalazku w zakresie zastrzezeń następu12
190 142 jących po przykładach staną się jasne dla specjalisty po przeczytaniu powyższego tekstu i poniższych przykładów.
Przykład I
Synteza starterów modyfikowanych grupą benzylową
Startery modyfikowane przez dodanie grupy benzylowej zsyntetyzowano jednym z opisanych poniżej sposobów. Startery modyfikowane w 3' końcowej zasadzie zsyntetyzowano stosując N6-benzylodezoksyadenozyna-Controlled Pore Glass (CPG) w celu zainicjowania syntezy DNA. Startery ze zmodyfikowaną zasadą wewnętrzną zsyntetyzowano stosując fosforamidyt N6-benzylodezoksyadenozyny
W przykładzie stosuje się następujące standardowe skróty:
DMAP 4-dimetylomiinopirddjma
DMF N,N-dimeyIlffomϋmi-d
TEA triieylo^jmih^a
EDC l-etylo-3((3-dimetyloϋninopropylo)ka.rbodiim-d, chlorowodorek
THF tetr;hlydrofi.iran
DMT 4,4'-ϋη!βΙοΐΜ)4:ηφ1
LCAA-CPG sta! joc—hoże Controlled Pore Glass mddykhowane długołańcuchową alkiloaminą
I. Synteza ^-benzylodezoksyadenozyno-CPG
Etap 1: Synteza N-benzoilo, Ns-benzyIo, 5'-O-DMT-2 '-deoksyadenhzyny
Do N—benzoilo-ó'-O-(4,4'-dimetoksytritylh)-2'-dezoksyadenozyny (657 mg, 1,0 mmo1a; Ałdrich Chemical Co., Milwaukee, WI) dodano pirydyny (10 ml) i mieszaninę wysuszono przez odparowanie pod próżnią. Procedurę tę powtórzono. Wytworzoną pianę rozpuszczono w bezwodnym DMF (15 ml; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) i oziębiono do 5°C. W atmosferze argonu dodano wodorku sodu (44 mg, 1,1 mmola, 1,1 równ., 60% dyspersja w oleju) i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 45 minut. W ciągu 2 minut dodano bromku benzylu (143 pl, 206 mg, 1,2 mmola, 1,2 równ., Aldrich Chemical Ch., Milwaukee, WI) i mieszaninę mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Mieszaninę wysuszono przez odparowanie pod próżnią, a pozostałość rozdzielono pomiędzy octan etylu i wodę (po 10 ml) i ekstrahowano. Fazę wodną ekstrahowano ponownie octanem etylu (10 ml) i połączone ekstrakty wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu, przesączono i odparowano. Surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (75 g), stosując metanol, trietyloaminę i chlorek metylenu (3:0,5:96,5). Połączono frakcje zawierające produkt i wysuszono przez odparowanie, uzyskując żądaną N-benzoilo, N-benzylo, 5'-O-DMT-2'-dezΌksyadenhzγnę (410 mg, 54%). Strukturę produktu potwierdzono metodą NMR.
Etap 2: Sukcynylowanie
Do N6-benzoilo,N6-benzylo, 5'-O-DMT-2'-dezoksyadenozyny (295 mg, 0,38 mmola) dodano pirydyny (10 ml) i mieszaninę wysuszono przez odparowanie pod wysoką próżnią. Etap ten powtórzono. Dodano świeżej bezwodnej pirydyny (10 ml) razem z bezwodnikiem bursztynowym (200 mg, 2 mmole, 5,0 równ.) i DMAP (24 mg) i roztwór mieszano w atmosferze argonu przez noc w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią, a pozostałość rozdzielono pomiędzy chlorek metylenu (20 ml) i roztwór cytrynianu sodu (20 ml, 0,1 M, pH 5,0) i ekstrahowano. Fazę wodną ekstrahowano jeszcze chlorkiem metylenu (20 ml), a połączone ekstrakty wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i wysuszono przez odparowanie. Produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (4,5 g) stosując octan etylu, Metyloaminę, chlorek metylenu (32:1 67). Otrzymano żądany 3'-bursztynian, N6-benzhllh,N6-benzylo-3'-bursztyniano-5'-C)-DMT-2'-dezhksyadenhzynę (247 mg, 74%).
Etap 3: Derywatyzowanie CPG
Przemyte kwasem CPG wytworzono w następujący sposób. LCAA-CPG (1,0 g, LCA00500C, 500 A, 88,6 (mol/g; CPG Inc., Fairiield, NJ) przemyto kwasem dichlhthhcthwym w dichlorometanie (2%, 20 ml) przez okresowe wirowanie w ciągu 20 minut w temperaturze pokojowej. CPG przemyte kwasem przesączono przez spiek szklany i przemywano di190 142 chlorometanem, az do usunięcia kwasu. Proszek wysuszono na powietrzu, a następnie pod próżnią w temperaturze pokojowej przez noc.
Sprzęganie modyfikowanego nukleozydowego produktu przejściowego z przemytym kwasem CPG prowadzono w następujący sposób. Do roztworu N6-benzoilo,N6-benzylo-3 -O-bursztyniano-5'-O-DMT-2'-dezoksyadenozyny (170 mg, 0,2 mmola), wytworzonej jak powyżej, w dichlorometanie (10 ml) dodano TEA (100 pl) i roztwór zatężono do objętości około 5 ml w atmosferze argonu. Po kolei dodano DMAP (12 mg, 0,1 mmola, 0,5 równ.), TEA (100 pl) i EDC (384 mg, 2,0 mmola, 10 równ.) i przemyte kwasem CPG. Dodano bezwodnej pirydyny (5 ml) i mieszaninę zamknięto i wytrząsano przez 3 dni w temperaturze pokojowej. CPG odsączono pod próżnią i dokładnie przemyto izopropanolem, następnie dichlorometanem, wysuszono na powietrzu, a następnie przez 1 godziną pod próżnią.
Blokowanie derywatyzowanego CPG prowadzono następująco.
Do suchego derywatyzowanego CPG dodano roztworów blokujących Cap A i Cap B (każdego po 5 ml, bezwodnik octowy/2,6-lutydyna/THF i 10% roztwór N-metyloimidazolu w THF; reagenty do syntezy DNA, Glen Research, Sterling, VA) i mieszaninę wytrząsano przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. CPG odsączono pod próżnią i dokładnie przemyto izopropanolem, a następnie dichlorometanem, wysuszono powietrzem, a następnie wysuszono pod próżnią przez noc.
II. Synteza fosforamiditu N6-benzylodezoksyadenozyny
N6-benzoilo, N6-benzylo, 5'-O-DMT-2'-dezoksyadenozynę zsyntetyzowano jak opisano powyżej.
Do N6-benzoilo, N6-benzylo, 5'-O-DMT-2'-dezoksyadenozyny (196 mg, 0,26 mmola) w suchym THF (8 ml) dodano diizopropyloetyloaminy (350 pl, 270 mg, 2,04 mmola, 7,8 równ.) i N,N-diizopropylochlorofosforamiditu 2-cyjanoetylu (161 mg, 0,68 mmola, 2,6 równ.; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) i mieszaninę mieszano przez 30 minut w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu. Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią, a pozostałość rozdzielono pomiędzy roztwór wodorowęglanu sodu (5%, 20 ml) i octan etylu (20 ml). Fazę organiczną przemyto kolejno roztworem wodorowęglanu, wodą i nasyconym roztworem solanki (po 20 ml), wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i odparowano Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (4 g) stosując ace-ton/heksan/TEA (34:65:0,7) i otrzymano żądany fosforamidit (248 mg, 100%).
III. Synteza, oczyszczanie i analiza DNA
Pochodną benzylową adenozyny-CPG (25 mg, 1,0 mola) przeniesiono do pustych kolumn do syntezy (Glen Research, Sterling, VA) i stosowano je do wytworzenia oligonukleotydów w syntezatorze DNA ABI 374 (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA), stosując konwencjonalną syntezę i warunki odblokowania. Surowy DMT-DNA oczyszczono i przeprowadzono w 5'-hydroksy-DNA standardową metodą DMT On/Off HPLC, stosując kolumnę Rainin Pure-DNA w systemie Rainin HPLC (Rainin Instrument Co, Woburn, MA). Oligonukleotydy analizowano stosując układ elektroforezy kapilarnej ABI (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) lub metodą denaturującej chromatografii anionowymiennej HPLC na kolumnie Dionex Nucleopak (Dionex Corp., Sunnyvale, CA).
Podobnie, syntezę wewnętrznie modyfikowanych starterów prowadzono stosując niezmodyfikowane CPG i zmodyfikowany fosforamidit, wytworzone jak powyżej.
Przykład II
Synteza starterów zmodyfikowanych grupą t-butylobenzylową
W przykładzie niniejszym opisano syntezę starterów zmodyfikowanych w 3' końcowej adenozynie grupą p-tert-butylobenzylową. Zmodyfikowane primery wytworzono zasadniczo jak opisano w przykładzie I, ale stosowano N6-(p-tert-butylobenzylo)dezoksyadenozynę CPG. Poniżej opisano syntezę derywatyzowanego CPG.
Etap 1: Synteza N6-benzoilo-N6-(p-tert-butylobenzylo)-5’-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-2'-dezoksyadenozyny
Do N6-benzoilo-5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-2'-dezoksyadenozyny (658 mg, 1,0 mmola) dodano DMF (bezwodny, 10 ml) i odparowano do suchości Czynność tę powtórzono W atmosferze argonu dodano świeżego dMf (10 ml). Dodano wodorku sodu (44 mg, 60%
190 142 w oleju, 1,1 mmola) i mieszaninę mieszano przez 0,5 godziny w temperaturze pokojowej. Wkroplono bromek 4-(tert-butylo)benzylu (272 mg, 1.2 mmola) i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez noc. Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią, a pozostałość rozdzielono pomiędzy octan etylu i wodę (po 20 ml). Fazę organiczną przemyto wodą (3 razy, 20 ml), wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu, przesączono i odparowano do suchości. Surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (100 g), stosując chlorek metylenu:metanol:trietyloaminę, 96,5:3:0,5. Otrzymano N6-benzoilo-N6-(p-tert-butylobenzylo)-5 '-O-(4,4 '-dimetoksytritylo)-2'-dezoksyadenozynę (229 mg, 28,5%).
Etap 2: Sukcynylowanie
N6-benzoilo-N6-(p-tert-butylobenzylo)-5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-2'-dezoksyadenozynę (217 mg, 0,27 mmola) potraktowano bezwodnikiem bursztynowym (135 mg, 5 równ.) i DMAP (17 mg, 0,5 równ.) w pirydynie (10 ml). Po obróbce i chromatografii, jak opisano w powyższym przykładzie I, otrzymano 3 '-O-bursztynian N6-benzoilo-N6-(p-tert-butylobenzylo)-5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-2'-dezoksyadenozyny (199 mg, 82%).
Etap 3: Derywatyzowanie CPG
Bursztynian (180 mg, 0,2 mmola) z powyższego etapu 2 potraktowano LCAA-CPG przemytym kwasem, jak opisano w przykładzie I. CPG zablokowano i wysuszono pod próżnią i otrzymano CPG derywatyzowane 3'-O-bursztynianem N6-benzoilo-N6-(p-tert-butylobenzylo)-5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-2'-dezoksyadenozyny (1,065 g).
Przykład 3 J
Synteza starterów modyfikowanych grupą metylową
Startery modyfikowane w 3' końcowej adenozynie grupą metylową zsyntetyzowano stosując N6-metyl dA CPG (22 mg, 1 pl, Glen Research, Sterling, VA). N6-metyl dA CPG wprowadzono do pustej kolumny do syntezy i wytworzono startery stosując standardowe warunki syntezy i odblokowania. Startery oczyszczono metodą DMT On/Off HPLC, jak opisano w przykładzie I.
Przykład 4
Synteza fotolabilnych modyfikowanych starterów
W przykładzie niniejszym opisano syntezę starterów modyfikowanych w 3' końcowej adenozynie jedną lub dwoma grupami nitrobenzylowymi. Modyfikowane startery zsyntetyzowano zasadniczo jak opisano w przykładzie I, ale stosowano mononitrobenzylo-dA CPG lub bis-nitrobenzylo-dA CPG.
Mononitrobenzylowane startery
Do syntezy N^-benzoilo-NAorto-nitrobenzyloC-dezoksyadenozyny CPG stosowano ogólną metodę syntezy N6-benzoilo-N6-benzylo-2'-dezoksyadenozyny CPG (patrz przykład I), przez podstawienie bromkiem orto-nitrobenzylu jako środkiem alkilującym. Następne etapy dla CPG były identyczne do opisanych w przykładzie I, z tą różnicą, ze produkty przejściowe chroniono przez światłem zewnętrznym owijając kolby reakcyjne folią aluminiową.
Po syntezie derywatyzowanego CPG zsyntetyzowano startery, jak opisano w przykładzie I, ale wyodrębniono je przez ekstrakcję w fazie stałej, stosując kolumny rozdzielające Nensorb Prep (NEN Research Products Biotechnology System, Du Pont Co, Boston, MA), według instrukcji opisanej przez producenta.
II. Bis-nitrobenzylowane startery
Bis-nitrobenzylodezoksyadenozynę CPG zsyntetyzowano opisanym poniżej sposobem. Po syntezie derywatyzowanego CPG zsyntetyzowano i oczyszczono startery, jak opisano dla starterów mononitrobenzylowanych.
Etap 1: Synteza 5 '-O-DMT-N6-bis-orto-nitrobenzylo-2 '-dezoksyadenozyny
Monohydrat 2'-dezoksyadenozyny (538 mg, 2,0 mmola, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) wysuszono przez odparowanie pod próżnią z bezwodną pirydyną (2 razy, 10 ml). Pozostałość rozpuszczono w bezwodnym DMF (10 ml, Aldrich, Milwaukee, WI) w atmosferze argonu, dodano wodorku sodu (88 mg, 2,2 mmola, 1,1 równ., 60% dyspersja w oleju) i mieszano przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Dodano bromku 2-nitrobenzylu
190 142 (710 mg, 3,3 mmola, 1,5 równ.) i roztwór mieszano przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. DMF usunięto przez odparowanie pod próżnią, a pozostałość rozdzielono pomiędzy octan etylu i wodę (po 20 ml). Fazę wodną ekstrahowano octanem etylu (20 ml), a połączone ekstrakty przemyto wodą (20 ml), wysuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i odparowano. Surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (50 g, stosując 3% MeOH w CH2G2) i otrzymano 2'-deoksy-N6-bis-ortonitrobenzyloadenozynę (320 mg, 30%).
Do 2'-dezoksy-N6-bis-orto-nitrobenzyloadenozyny (200 mg, 0,518 mmola) dodano bezwodnej pirydyny (10 ml) i odparowano do suchości. Dodano pirydyny (10 ml), a następnie chlorku 4,4'-dimetoksytritylu (900 mg, 2,3 mmola, 4,5 równ.) i trietyloaminy (280 mg, 2,76 mmola, 4,0 równ.) i mieszano w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu przez 5 godzin. Dodano wody (0,5 ml) i mieszano przez 20 minut. Mieszaninę rozdzielono pomiędzy eter i wodę (po 20 ml) i fazę wodną ponownie ekstrahowano eterem (20 ml). Ekstrakty połączono i przemyto wodą (20 ml), wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i odparowano. Materiał oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym (5 g, stosując 0,7-2,5% metanol w chlorku metylenu) i otrzymano 5'-O-DMT-N6-bis-orto-nitrobenzylo-2'-dezoksyadenozynę (121 mg, 33%).
Etap 2: Sukcynylowanie
5'-O-DMT-N6-bis-orto-nitrobenzylo-2'-dezoksyadenozynę (121 mg, 0,145 mmola) wysuszono przez odparowanie z bezwodną pirydyną (2 razy, 3 ml). Dodano pirydyny (3 ml), bezwodnika bursztynowego (58 mg, 0,58 mmola, 4 równ.) i DMAP (11 mg, ilość katalityczna) i roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 dni. Roztwór odparowano pod próżnią, pozostałość rozdzielono pomiędzy chlorek metylenu (10 ml) i bufor - cytrynian sodu (0,1 M, pH 5,0, 10 ml). Fazę organiczną wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i odparowano do suchości. Surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym (2 g, stosując EtOAc: CH2Cl2:TEA, 32:67:1, 10 ml, a następnie MeOH' CH2G2, 3:97, 25 mil)' Otrzymano 3'-O-bursztynian 5'-O-DMT-N6-bis-ortonitrobenzylo-2'-dezoksyadenozyny w postaci bladożółtej piany (138 mg, 99,5%).
Etap 3:Derywatyzowanie CPG
LCAA-CPG przemyte kwasem wytworzono jak w przykładzie I.
Sprzęganie modyfikowanego nukleozydowego produktu przejściowego z przemytym kwasem CPG prowadzono następująco. 3'-O-bursztynian 5'-O-DMT-N6-bis-ortonitrobenzylo-2'-dezoksyadenozyny (37 mg, 0,04 mmola) w szklanej fiolce koloru bursztynowego potraktowano TEA (16 l) i odparowano. Do otrzymanej pozostałości dodano bezwodnej pirydyny (1,5 ml), TEA (2 pl), DMAP (2,4 mg), EDC (76 mg, 0,04) i LCAA-CPG przemytego kwasem (200 mg) i całość mieszano w mieszarce obrotowej przez 3 dni w temperaturze pokojowej. CPG odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem i dokładnie przemyto izopropanolem, następnie chlorkiem metylenu, wysuszono na powietrzu, po czym w ciągu 1 godziny wysuszono pod próżnią. Blokowanie derywatyzowanego CPG prowadzono, jak opisano w przykładzie I.
Przykład V
Amplifikacja przy użyciu zmodyfikowanych starterów-wpływ położenia zmodyfikowanego nukleotydu
W celu wykazania wpływu zmodyfikowanych starterów na tworzenie się dimeru starterów, przeprowadzono porównanie amplifikacji RNA HIV-1 przy użyciu starterów zmodyfikowanych i niemodyfikowanych. Oprócz tego, w celu oceny wpływu położenia zmodyfikowanego nukleotydu na zmniejszenie ilości dimeru starterów, amplifikację przeprowadzono przy użyciu różnych zmodyfikowanych starterów górnych, które różniły się jedynie położeniem zmodyfikowanej zasady.
Docelowy kwas nukleinowy
Matryce RNA HIV-1 syntetyzowano przy użyciu wektora transkrypcyjnego RNA HIV-1, jak opisano w publikacji Mulder i in., 1994, J. Clin. Microbiol. 32(2).292-300.
190 142
Startery
Amplifikację przeprowadzono przy użyciu starterów zmodyfikowanych i niemodyfikowanych. Sekwencje nukleotydowe starterów niemodyfikowanych przedstawiono poniżej, w kierunku od 5' do 3'. Starter górny RAR1032MB (Identyfikator Sekw. nr 1) i starter dolny RAR1033MB (Identyfikator Sekw. nr 2), amplifikowały produkt wielkości 175 bp odpowiadający pozycjom nukleotydowym od 2956 do 3130 sekwencji HIV-1 szczepu referencyjnego HXB2 (GenBank nr K03455).
Startery amplifikacji HIV-1
Starter Identyf. Sekwencia
Sekw. nr
RAR1032MB 1 CAATGAGACACCAGGAATTAGATATCAGTACAA
RAR1033MB 2 CCCTAAATCAGATCCTACATATAAGTCATCCA
Oznaczenia powyższych starterów dotyczą starterów niemodyfikowanych. Niemodyfikowane startery biotynylowano na końcu 5'. Zmodyfikowane startery syntetyzowano, jak to opisano w przykładzie I i obejmowały one tę samą sekwencję nukleotydową co startery niemodyfikowane, ale zawierały benzylowaną adenozynę w końcowej pozycji 3' albo w pozycji o jeden albo trzy nukleotydy powyżej końca 3'. Zmodyfikowane postaci starterów oznaczono jak niżej.
Zmodyfikowane startery amplifikacji HIV-1
| Starter Identyf. | Położenie zmodyfikowanego nukleotydu |
| Sekw. nr | |
| RAR1032MBA1 1 | koniec 3' |
| RAR1032MBA2 1 | 1 od końca 3' |
| RAR1032MBA4 1 | 3 od końca 3' |
| RAR1033MBA1 2 | komec 3' |
| Amplifikacja |
Amplifikację przeprowadzono w 100 pl mieszaniny reakcyjnej zawierającej·
100 kopii matrycy RNA HIV mM buforu Tricine (pH 8,33),
110 mM KOAc,
300 pM każdego spośród dATP, dCTP i dGTP, pM dTTP,
500 pM dUTP, pl M każdego ze starterów,
3, 5 mM Mn(OAc)2,
13% gliceryny, jednostek polimerazy DNA Z05*, i jednostki UNG**.
* opisana w patencie USA nr 5,455,170 ** wytwarzany i opracowany przez Hoffmann-La Roche i sprzedawany przez Perkin Eimer, Norwalk, CT.
Amplifikację metodą cyklicznej zmiany temperatury przeprowadzono na urządzeniu TC480 DNA thermal cycler (Perkin Eimer, Norwalk, CT) stosując poniższy profil temperatury inkubacja wstępna - 45°C przez 4 minuty; odwrotna transkrypcja - 60°C przez 20 minut;
cykli: denaturacja w 94°C przez 45 sekund, annealing/wydłużanie w 60°C przez 45 sekund; wydłużanie końcowe - 60°C przez 7 minut;
przechowywanie po reakcji - 10°C do momentu analizy (przez krótki czas).
Wykrywanie amplifikowanego produktu
Obecność amplifikowanego produktu wykrywano przez elektroforezę na zelu jak to opisano niżej. Produkty reakcji frakcjonowano przy użyciu zelu agarozowego (100 ml 3% NuSieve i 0,5% SeaChem) i 1X TBE (0,089 M Tris, 0,089 M kwas borny, 0,0025 M sól sodowa
190 142
EDTA) jako bufora. W celu zabarwienia jakiegokolwiek obecnego DNA dodano bromku etydyny (0,5 pg/ml). Elektroforezę przeprowadzono przy napięciu 100 wolt przez około godzinę. Prążki Dna zabarwionego bromkiem etydyny uwidaczniano stosując naświetlanie UV.
Wyniki
Wyniki analizy elektroforezy na zelu przedstawiono na figurze 1 Numer ścieżki odpowiadający każdej z amplifikacji z użyciem kombinacji niemodyfikowanego i modyfikowanego startera przedstawiono w poniższej tablicy. Prążki odpowiadające zamierzonemu produktowi HIV wskazano na figurze strzałką. Inne prążki w zelu odpowiadały nieswoistym produktom amplifikacji, w szczególności dimerowi starterów.
Startery Ścieżka nr
Górny Dolyy
RARH033MB 1
RARU 033MB 2
RARU 033MB 3
RARU 033MB 4
RARU033MBA 1 5
RARU003MBA 1 6
RAR^nMBAl 7
JA^RB^^ł^M^lByl l 8
RAR1002MB
RAR1002MBA1
RAR1002MBA2
RAR1002MBA4
RAR1032MB
RAR1032MBA1
RAR1002MBA2
RAR1032MBA4
Ponieważ tworzenie dimeru starterów współzawodniczy z tworzeniem zamierzonego produktu amplifikacji, zmniejszenie ilości dimeru starterów powoduje zwykle równoczesny wzrost ilości zamierzonego produktu. Tak wiec, wpływ zmodyfikowanych starterów można zauważyć przez porównanie ilości wytworzonego dimeru starterów w porównaniu z ilością wytworzoną z użyciem starterów niemodyfikowanych i przez porównanie ilości wytworzonego zamierzonego produktu z ilością wytworzoną z użyciem starterów niemodyfikowanych.
Porównanie wyników uzyskanych przy użyciu dwóch starterów niemodyfikowanych (ścieżka 1) z wynikami uzyskanymi ze starterem zmodyfikowanym na końcu 0' (ścieżki 2 i 5) oraz wynikami z użyciem dwóch starterów zmodyfikowanych na końcach 0' (ścieżka 6) wskazuje, ze zmniejszenie ilości dimeru starterów uzyskano stosując albo jeden albo dwa startery zmodyfikowane. W amplifikacjach z użyciem pojedynczego startera zmodyfikowanego na końcu 0' obserwowano niewielką różnicę w ilości dimeru starterów, w zależności od tego, który starter zmodyfikowano. Zastosowanie dwóch starterów zmodyfikowanych (ścieżka 6) powodowało większe zmniejszenie ilości dimeru starterów i wykrywalne zwiększenie ilości amplifikowanej sekwencji docelowej.
Wpływ położenia zmodyfikowanego nukleotydu można zauważyć w ścieżkach 6-8. Zmniejszenie ilości dimeru starterów uzyskane przy użyciu startera zmodyfikowanego w nukleotydzie sąsiadującym z nukleotydem końca 0' (ścieżka 7) było równoważne z uzyskanym przy użyciu startera zmodyfikowanego na końcu 0' (ścieżka 6), podczas gdy poprawa uzyskana przy użyciu startera zmodyfikowanego w nukleotydzie położonym trzy zasady powyżej końca 0' (ścieżka 8) była nieco niższa.
Przykład VI
Dalsze amplifikację przy użyciu zmodyfikowanych starterów - Wpływ położenia zmodyfikowanego nukleotydu
W celu dalszego wykazania wpływu zmodyfikowanych starterów na tworzenie dimeru starterów, przeprowadzono porównanie amplifikacji RNA HCV przy użyciu starterów zmodyfikowanych i niemodyfikowanych, zasadniczo jak to opisano wyżej. Amplifikację przeprowadzono przy użyciu trzech różnych zmodyfikowanych starterów dolnych, które różniły się jedynie położeniem zmodyfikowanej zasady.
Docelowy kwas nukleinowy
Matryce RNA HCV syntetyzowano przy użyciu wektora transkrypcyjnego RNA HCV jak to opisano w publikacji Younga i in., 1990, J. Glin. Microbiol. 01 ( 4):882-886.
190 142
Startery
Amplifikację przeprowadzono przy użyciu starterów zmodyfikowanych i niemodyfikowanych. Sekwencje nukleotydowe starterów niemodyfikowanych przedstawiono poniżej, w kierunku od 5' do 3'. Starter górny ST280A (Identyfikator Sekw. nr 3) i starter dolny ST778AA (Identyfikator Sekw. nr 4), amplifikowały produkt wielkości 240 bp z nie ulegającego translacji regionu 5' genomu HCV.
Startery amplifikacji CV
Starter Identyf. Sekwencja
Sekw. nr
GCAG/AGAGCGTCTAGCCATGGCGTTA
GCAAGACCCCTATCAGGCAGTACCACAA
ST280A 3
ST778AA 4
Oznaczenia powyższych starterów dotyczą starterów niemodyfikowanych. Zmodyfikowane startery syntetyzowano, jak to opisano w przykładzie I i obejmowały one tę samą sekwencję nukleotydową co startery niemodyfikowane, ale zawierały benzylowaną adenozynę w pozycji 3' albo w pozycji o jeden albo trzy nukleotydy powyżej końca 3'. Zmodyfikowane postaci starterów oznaczono jak niżej.
Zmodyfikowane startery amplifikacji HCV
Starter Identyf. Położenie zmodyfikowanego nukleotydu
Sekw. nr
ST280ABA1 3
ST778AABA1 4
ST778AABA2 4
ST778AABA4 4 koniec 3' koniec 3' od końca 3' 3 od końca 3'
Amplifikacja i analiza
Amplifikację przeprowadzono zasadniczo jak to opisano w przykładzie III, ale przy użyciu 100 kopii matrycy RNA HCV. Analizę na zelu amplifikowanego produktu przeprowadzono zasadniczo jak to opisano w przykładzie III.
Wyniki
Wyniki analizy elektroforezy na żelu przedstawiono na figurze 2. Numer ścieżki odpowiadający każdej z amplifikacji z użyciem kombinacji niemodyfikowanego i modyfikowanego startera przedstawiono w poniższej tabeli. Prążki odpowiadające zamierzonemu produktowi HCV wskazano na figurze strzałką. Inne prążki w zelu odpowiadały nieswoistym produktom amplifikacji, w szczególności dimerowi starterów.
| Startery | Ścieżka nr | |
| Górny | Dolny | |
| ST280A | ST778AA | 1 |
| ST280A | ST778AABA1 | 2 |
| ST280A | ST778AAIBA2 | 3 |
| ST280ABA | ST778AABA4 | 4 |
| ST280ABA1 | ST778AA | 5 |
| ST280ABA1 | 6 | |
| ST280ABA1 | ST778AAB3A2 | 7 |
| ST280ABA1 | ST778AABA4 | 8 |
Ponieważ tworzenie dimeru starterów współzawodniczy z tworzeniem zamierzonego produktu amplifikacji, zmniejszenie ilości dimeru starterów powoduje zwykle równoczesny wzrost ilości zamierzonego produktu. Tak więc, wpływ zmodyfikowanych starterów można zauważyć przez porównanie ilości wytworzonego dimeru starterów w porównaniu z ilością wytworzoną z użyciem starterów niemodyfikowanych i przez porównanie ilości wytworzonego zamierzonego produktu z ilością wytworzoną z użyciem starterów niemodyfikowanych.
Uzyskane wyniki były podobne do uzyskanych z amplifikacji HIV opisanych w poprzednim przykładzie, ale w amplifikacjach HCV wzrost ilości zamierzonego produktu był wyraźniejszy niż w amplifikacjach HIV. Porównanie wyników uzyskanych przy użyciu dwóch starterów niemodyfikowanych (ścieżka 1), z wynikami uzyskanymi z pojedynczym starterem
190 142 zmodyfikowanym na końcu 3' (ścieżki 2 i 5) oraz wynikami z użyciem dwóch starterów zmodyfikowanych na końcach 3' (ścieżka 6) wskazują, ze zmniejszenie ilości dimeru starterów uzyskano stosując albo jeden albo dwa startery zmodyfikowane. Zastosowanie dwóch starterów zmodyfikowanych (ścieżka 6) powodowało większy spadek ilości dimeru starterów i znaczący wzrost ilości amplifikowanej sekwencji docelowej. Podobnie jak w poprzednim przykładzie, zaobserwowano niewielką różnicę w zmniejszeniu tworzenia dimerów startera w amplifikacjach z użyciem pojedynczego startera zmodyfikowanego na końcu 3', co zalezało od tego, który starter zmodyfikowano.
Wpływ położenia zmodyfikowanego nukleotydu można zauważyć w ścieżkach 6-8. Zasadniczo równoważne wyniki uzyskano przy użyciu startera zmodyfikowanego w 3' końcowym nukleotydzie (ścieżka 6), w nukleotydzie sąsiadującym z nukleotydem końca 3' (ścieżka 7) i w nukleotydzie położonym trzy zasady powyżej końca 3' (ścieżka 8). Wyniki te wskazują, ze grupa modyfikująca może być przyłączona do dowolnego spośród czterech nukleotydów końca 3' startera.
Przykład 7
Amplifikację przy użyciu modyfikowanych starterów wpływ grupy modyfikującej
W celu dalszego wykazania wpływu modyfikowanych starterów na tworzenie się dimeru starterów i wykazania alternatywnych modyfikacji startera, przeprowadzono porównanie amplifikacji RNA HCV przy użyciu modyfikowanych i niemodyfikowanych starterów, przy czym startery były modyfikowane przez dodanie od jednego do trzech grup modyfikujących: grupy benzylowej, nitrobenzylowej i metylowej.
Wyniki amplifikacji analizowano dwiema różnymi metodami. W jednym zestawie porównań, badano obecność dimerów startera przez analizę produktów reakcji metodą elektroforezy na zelu. W drugim zestawie porównań, tworzenie dimeru starterów śledzono podczas amplifikacji stosując opisaną wyżej metodę kinetycznej PCR.
Docelowy kwas nukleinowy
Matryce RNA HCV syntetyzowano przy użyciu wektora transkrypcyjnego RNA HCV jak to opisano w Young i in., 1993, J. Clin. Microbiol. 31(4):882-886.
Startery
Amplifikację przeprowadzono przy użyciu starterów zmodyfikowanych i niemodyfikowanych. Zmodyfikowane startery obejmowały tę samą sekwencje nukleotydową co startery memodyfikowane, ale adenozynę w pozycji 3' miały zmodyfikowaną przez dodanie grupy metylowej, benzylowej albo nitrobenzylowej. Startery syntetyzowano, jak to opisano w poprzednich przykładach. Zmodyfikowane postaci starterów oznaczono jak niżej.
Starter Identyf. Modyfikacja zasady 3'
Sekw. nr
ST280A 3
ST778AMEA1 3
ST778ABA1 3
ST778ANBA1 3
ST778AA 4
ST778AAMEA 4
ST778AABA1 4
ST778AANBA1 4 niemodyiikowaina metyl benzyl ntrrobenzyl nn^n^<^<^jfi^l^<^v^i^iaa meyyl benzyl nirrobenzyl
Reakcje amplifikacji
Amplifikację przeprowadzono w 100 pl mieszaniny reakcyjnej zawierającej: 0, 20 albo 200 kopii matrycy RNA hCv 50 mM buforu Tricine pH 8,3,
110 mM KOAc,
3,5 mM Mn(OAc)2,
300 pM każdego spośród dATP, dCTP i dGTP, pM dTTP,
500 pM dUTP,
250 nM każdego ze starterów,
190 142 jednostek rTth* jednostki UNG*, i
13% gliceryny. .
* wytwarzana i opracowana przez Hoffmann-La Roche i sprzedawana przez Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Amplifikację metodą cyklicznej zmiany temperatury przeprowadzono na urządzeniu GeneAmp® PCR System 9600 thermal cycler (Perkin Elmer, Norwalk, CT) stosując poniższy profil temperatury:
inkubacja wstępna - 45°C przez 4 minuty; odwrotna transkrypcja - 60°C przez 24 minut;
cykli: denaturacja w 94°C przez 30 sekund, annealing/wydłużanie w 60°C przez 30 sekund; wydłużanie końcowe - 60°C przez 7 minut; przechowywanie po reakcji - 4°C Wykrywanie amplifikowanego produktu
A. Elektroforeza na żelu
Obecność amplifikowanego produktu wykrywano przez elektroforezę na zelu agarozowym w następujący sposób. Produkty reakcji frakcjonowano na zelu agarozowym (100 ml 3% NuSieve, 0,5% SeaChem i 0,5 pg/ml bromku etydyny) i 1X TBE (0,089 M Tris, 0,089 M kwas bomy, 0,0025 M EDTA disodu) jako buforze. Elektroforezę przeprowadzono przy napięciu 100 wolt przez około godzinę. Prążki DNA zabarwionego bromkiem etydyny uwidaczniano stosując naświetlanie UV.
B. Wykrywanie kinetyczną PCR
W kinetycznej PCR opisanej wyżej, barwnik interkalujący, taki jak bromek etydyny, który fluoryzuje silniej po lntetkalacji w dwuniciowym DNA, dodawany jest do PCR. Wzrost ilości dwuniciowego DNA podczas amplifikacji śledzony jest przez pomiar fluorescencji barwnika podczas reakcji. Ponieważ metoda kinetycznej PCR mierzy jedynie wzrost całkowitej ilości dwuniciowego DNA, tworzenie produktów amplifikacji nieswoistej nie jest mierzone niezależnie. W celu zmierzenia występowania amplifikacji nieswoistej spowodowanej amplifikacją dimeru starterów niezależną od matrycy, reakcje przeprowadzono bez matrycy kwasu nukleinowego. W takich reakcjach bez matrycy, jakikolwiek wzrost ilości dwuniciowego DNA można przypisać tworzeniu niezależnych od matrycy produktów amplifikacji nieswoistej
Warunki reakcji kinetycznej PCR były jak opisano wyżej, z takim wyjątkiem, ze do mieszaniny reakcyjnej dodano bromku etydyny w stężeniu 1 g/ml. Reakcje śledzono przez pomiar fluorescencji mieszaniny reakcyjnej jak to opisano w EP 640828.
Pomiary fluorescencji normalizowano przez podzielenie przez wynik początkowego pomiaru fluorescencji uzyskanego podczas wczesnego cyklu reakcji, gdy fluorescencja pomiędzy cyklami była względnie stała. Dla początkowego pomiaru fluorescencji liczba cykli była taka sama dla wszystkich porównywanych reakcji, tak ze pomiary odpowiadały wzrostowi względem tego samego cyklu reakcji. W większości reakcji, gdy przeprowadzono wystarczającą liczbę cykli, czasami można było stwierdzić dimery starterów. Wpływ zmodyfikowanych starterów można było zaobserwować przez porównanie liczby cykli przeprowadzonych do wytworzenia się dimeru starterów, o ile w ogóle się tworzyły.
Wyniki
Wyniki analizy przez elektroforezę na zelu pokazano na figurze 3. Numery ścieżek odpowiadające każdej z amplifikacji z użyciem starterów niemodyfikowanych i trzech rodzajów modyfikowanych oraz 200, 20 albo 0 kopii RNA HCV pokazano w tabeli (numery ścieżek są liczone od lewej do prawej: ścieżki 1-30 są w górnej połowie zelu; ścieżki 31-60 są w dolnej połowie zelu). Oprócz tego, w ścieżkach 1 i 31 są wzorce ciężaru cząsteczkowego (DNA PhiX174RF trawiony Haelll, New England Biolabs, Beverly, MA), zaś w ścieżkach 30 i 60 (Superladdedow, drabinka 20 bp, Gen Sura, Del Mar, CA). Prążki odpowiadające zamierzonemu swoistemu produktowi są zaznaczone na figurze strzałkami (-230 bp). Inne prążki w zelu odpowiadają produktowi amplifikacji nieswoistej, w szczególności, dimerowi starterów.
190 142
Numery ścieżek wyników amplifikacji pokazanych na figurze 3
| Matryca | Starter | Ścieżki |
| 200 | niemodyfikowany | 2-5 |
| 200 | metylowany | 6-9 |
| 200 | benzylowany | 10-13 |
| 200 | nitrobenzylowany | 14-17 |
| 20 | niemodyfikowany | 18-21 |
| 20 | metylowany | 22-25 |
| 20 | benzylowany | 26-29 |
| 20 | nitrobenzylowany | 32-35 |
| 0 | niemodyfikowany | 36-41 |
| 0 | metylowany | 42-47 |
| 0 | benzylowany | 48-53 |
| 0 | nitrobenzylowany | 54-59 |
Wyniki wskazują, ze amplifikacja przy użyciu zmodyfikowanych starterów powoduje powstanie większej ilości amplifikowanego kwasu nukleinowego HCV, niz amplifikację przy użyciu starterów niemodyfikowanych. Oprócz tego, amplifikacja przy użyciu modyfikowanych starterów powodowała zmniejszenie ilości dimeru starterów w porównaniu z amplifikacjami przy użyciu starterów niemodyfikowanych.
W teście kinetycznej PGR, fluorescencję mierzono podczas reakcji. Tempo wzrostu fluorescencji po jej wzroście było wykrywalne jako niemal takie same we wszystkich reakcjach, jak widać z kształtu krzywej uzyskanej przez wykreślenie fluorescencji w stosunku do liczby cykli (nie pokazano). Wskazuje to, ze modyfikowane startery nie hamowały w wykrywalny sposób wydajności każdego z etapów amplifikacji po początkowym etapie amplifikacji. Reakcje różniły się istotnie jeżeli chodzi o liczbę przeprowadzonych cykli do momentu wykrywalnego wzrostu fluorescencji.
W celu zmierzenia różnic pomiędzy reakcjami, wyniki wyrażano w kategoriach liczby cykli amplifikacji przeprowadzonych zanim fluorescencja przekroczyła arbitralny poziom fluorescencji (AFL). AFL wybrano w pobliżu podstawowego poziomu fluorescencji, ale powyżej zakresu losowych fluktuacji mierzonej fluorescencji, tak, ze kinetyka reakcji mierzona była podczas geometrycznej fazy wzrostu amplifikacji. Gromadzenie się amplifikowanego produktu w późniejszych cyklach hamuje reakcję i ewentualnie prowadzi do plateau reakcji.
Wyniki kinetycznej PCR podsumowano w tabeli poniżej. Każda wartość dla amplifikacji 20 albo 200 kopii matrycy docelowej stanowi średnią pięciu powtórzeń amplifikacji, z wyjątkiem amplifikacji z użyciem starterów benzylowanych i 20 kopii docelowych, które pokazują średnią ośmiu powtórzeń.
Dwie spośród ośmiu powtórzeń amplifikacji przy użyciu starterów benzylowanych bez obecności sekwencji docelowej nie powodowało tworzenia dimeru starterów pod koniec 46 cykli. Przedstawiono średnią pozostałych sześciu amplifikacji, która stanowi średnią ustaloną na tworzenie dimeru starterów. Średnia uwarunkowana nie jest porównywalna z innymi przedstawionymi wartościami z powodu usunięcia danych
Cykle do osiągnięcia AFL
Liczba kopii
Starter_0_2__200
| niemodyfikowany | 35 | 36 | 34 |
| metyl | 39 | 38 | 36 |
| nitrobenzyl | 43 | 40 | 37 |
| benzyl | (43*1 | 41 | 37 |
* 2/8 wykazywały tworzenie dimeru starterów
Dane wskazują, ze zmodyfikowane startery opóźniają amplifikację docelowego kwasu nukleinowego, w taki sposób, ze AFL jest osiągany w kilka cykli później. Opóźnienie nie odpowiada zmniejszeniu końcowego uzysku swoistego produktu amplifikacji. Wszystkie amplifikacje docelowego kwasu nukleinowego osiągały plateau w ciągu 46 cykli zastosowanych
190 142 w doświadczeniu i, jak wykazano odpowiednimi danymi z analizy przez elektroforezę na zelu, końcowy uzysk był zwiększony przy użyciu modyfikowanych starterów.
Dane wskazują, ze opóźnienie tworzenia dimeru starterów było istotnie większe niż opóźnienie amplifikacji sekwencji docelowej. Korzystny wpływ starterów jest jeszcze lepiej obserwowany przez porównanie amplifikacji bez sekwencji docelowej z amplifikacją 200 kopii matrycy. Stosując modyfikowane startery, wzrost fluorescencji AFL następował tylko o jeden cykl później w amplifikacji bez sekwencji docelowej co wskazuje, ze amplifikacja sekwencji docelowej jest trudna do rozróżnienia od tworzenia dimeru starterów. W przeciwieństwie do tego, stosując startery modyfikowane, wzrost fluorescencji z powodu dimeru starterów zachodził przynajmniej o trzy cykle później zaś przy użyciu starterów benzylowanych zachodził o 6 cykli później, jeżeli w ogóle występował. Tak więc, amplifikację sekwencji docelowej można było wykryć i odróżnić od tworzenia dimeru starterów.
Przy porównaniu amplifikacji bez sekwencji docelowej i amplifikacji 20 kopii matrycy, wpływ modyfikowanych starterów wykazywał ten sam wzorzec większego opóźnienia w początku tworzenia dimeru starterów, niż opóźnienie amplifikacji sekwencji docelowej. Stosując niemodyfikowane startery, 20 kopii matrycy nie można było wykryć. Stosując startery nitrobenzylowane i benzylowane, tworzenie dimeru starterów było opóźnione wystarczająco aby umożliwić wykrycie w tym układzie 20 kopii matrycy.
Dane ze śledzenia fluorescencji na każdym z etapów amplifikacji (dane nie pokazane) wskazywały ze, ogólnie, opóźnienie tworzenia dimeru starterów było wystarczające do zapobieżenia tworzenia dimeru starterów od osiągnięcia poziomu plateau w ciągu 46 cykli. Tak więc, modyfikowane startery opóźniają tworzenie dimeru starterów wystarczająco, aby amplifikacja sekwencji docelowej była zakończona, zaś reakcja przerwana zanim wytworzy się istotna ilość dimeru starterów.
Przykład VIII
Startery fotolabilne
W celu pokazania zastosowania starterów zmodyfikowanych fotolabilnie, przeprowadzono amplifikację RNA HCV stosując zarówno startery modyfikowane jak i niemodyfikowane. Startery modyfikowane modyfikowano przez przyłączenie jednej albo dwóch grup nitrobenzylowych do aminy egzocyklicznej adeniny końca 3'.
Startery amplifikacji
Startery syntetyzowano jak to opisano w przykładzie IV.
Oznaczenia zastosowanych starterów pokazano poniżej.
| Starter | Identyf. Sekw. nr | Modyfikacja zasady 3' |
| ST280A | 3 | niemodyfikowana |
| 15239 | 3 | |
| 15241 | 3 | mononitrobenzyl |
| ST778AA | 4 | niemodyfikowana |
| 15240 | 4 | bis-nitrobenzyl |
| 15242 | 4 | mononitro benzyl |
Reakcje amplifikacji
Dla każdej pary starterów, przeprowadzono reakcje przy użyciu szeregu rozcieńczeń początkowego stężenia sekwencji docelowej. Przeprowadzono dwa panele reakcji, obejmujące wszystkie kombinacje par starterów i stężeń sekwencji docelowej, z których każda zawierała daną parę starterów i stężenie sekwencji docelowej, w powtórzeniu. Amplifikację przeprowadzono w 100 pl mieszaniny reakcyjnej zawierającej następujące reagenty:
0, 10, 102, 103, 104, albo 105kopii matrycy RNA HCV mM buforu Tricine, mM KOAc, mM Mn(OAc)2,
200 pM każdego spośród dATP, dCTP, dGTP, dTTP
200 pM dUTP,
250 nM każdego ze starterów,
190 142 jednostek rTth* jednostki UNG*, i 8% gliceryny.
* wytwarzana i opracowana przez Hoffmann-La Roche i sprzedawana przez Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Amplifikację metodą cyklicznej zmiany temperatury przeprowadzono na urządzeniu GeneAmp® PCR System 9600 thermal cycler (Perkin Elmer, Norwalk, CT) stosując poniższy profil temperatury· inkubacja wstępna - 50°C przez 5 minut; odwrotna transkrypcja - 60°C przez 30 minut; początkowa denaturacja - 95°C przez 1 minutę;
cykle - denaturacja w 95°C przez 15 sekund, annealing/wydłuzanie w 60°C przez 20 sekund;
cykli: denaturacja w 90°C przez 15 sekund, annealing/wydłużanie w 60°C przez 20 sekund;
wydłużanie końcowe - 72°C przez 10 minut.
Stosowano polerowane zatyczki do probówek (Perkin Elmer, Norwalk, CT). Po podniesieniu temperatury reakcji do 60°C w etapie odwrotnej transkrypcji, podgrzewaną pokrywę zdjęto z bloku urządzenia do PCR i przykryto część probówek folią aluminiową (kompletny zestaw powtórzonych reakcji). Pozostałą połowę naświetlono stosując ręczną lampę UV emitującą przy długości fali równej 302 nm (UVP model UYM-57, UVP Products, San Gabriel, CA) przez dziesięć minut. Następnie ponownie założono ogrzewaną pokrywę i prowadzono dalej amplifikację.
Wyniki
Wyniki amplifikacji analizowano przez elektroforezę na zelu jak to opisano wyżej. Wyniki pokazano na figurze 4. Na zelu zaznaczono startery i liczbę kopii sekwencji docelowej zastosowanej w każdej z reakcji (pokazano wykładnik dziesiętny liczby kopii). Na figurze zaznaczono prążki odpowiadające zamierzonemu produktowi. Inne prążki w zelu odpowiadały produktowi amplifikacji nieswoistej, w szczególności dimerowi starterów.
Porównanie z napromieniowanym UV zestawem reakcji wykazało, ze zastosowanie modyfikowanych starterów powoduje istotne zmniejszenie ilości dimeru starterów, zwłaszcza przy nielicznych kopiach.
Porównanie nienaświetlonego zestawu reakcji wykazało, ze zastosowanie starterów bisnitrobenzylowanych powoduje całkowite zahamowanie amplifikacji, jak oczekiwano. Amplifikacje przy użyciu starterów mononitrobenzylowanych nie tylko dawały produkt, ale wykazywały istotne zmniejszenie ilości dimeru starterów, co jest zgodne z wynikami uzyskanymi w poprzednim przykładzie.
Przykład IX
Amplifikację przy użyciu starterów modyfikowanych p-tert-butylobenzylem
Przykład ten opisuje amplifikację RNA HCV przy użyciu starterów modyfikowanych grupami p-tert-butylobenzylowymi.
Docelowy kwas nukleinowy
Matryce RNA HCV syntetyzowano przy użyciu wektora transkrypcyjnego RNA HCV jak to opisano w publikacji Young i in., 1993, J. Glin. Microbiol. 31(4):882-886.
Startery
Amplifikację przeprowadzono przy użyciu starterów syntetyzowanych według przykładu II. Sekwencje nukleotydowe starterów niemodyfikowanych przedstawiono poniżej w kierunku od 5' do 3'. Stosowane startery były modyfikowanymi wersjami startera górnego ST280A (Identyfikator Sekw. nr 3) i startera dolnego ST778AA (Identyfikator Sekw nr 4). Modyfikowane formy starterów oznaczono jak poniżej.
190 142
Modyfikowane startery amplifikacji HCV
Pozycja modyfikowanego
Identyf. Sekw. nr
Starter
ST280ATBU
ST778AATBU nukleotydu koniec 3' koniec 3'
Amplifikacja i analiza
Amplifikację przeprowadzono w 100 pl mieszaniny reakcyjnej zawierającej:
20, 5, 2,5, 2 albo 0 kopii matrycy RNA HCV mM bufor Tricine (pH 8,33),
110 mM KOAc,
300 pM każdego spośród dATP, dCTP i dGTP, pM dTTP,
500 pM dUTP, nM każdego ze starterów,
3,5 mM Mn(OAc)2,
13% gliceryny jednostek polimerazy DNA rTth*, i jednostek UNG*.
* wytwarzana i opracowana przez Hoffmann-La Roche i sprzedawana przez Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Amplifikację metodą cyklicznej zmiany temperatury przeprowadzono na urządzeniu TC480 dNa thermal cycler (Perkin Elmer, Norwalk, CT) stosując poniższy profil temperatury:
inkubacja wstępna - 45°C przez 12 minut; inaktywacja uNg - 90°C przez 30 sekund; odwrotna transkrypcja - 60°C przez 20 minut;
cykli: denaturacja w 94°C przez 45 sekund, annealing/wydłużanie w 60°C przez 70 sekund; wydłużanie końcowe - 60°C przez 7 minut; przechowywanie po reakcji - 10°C do analizy (przez krótki czas)
Produkty amplifikacji analizowano przez elektroforezę na zelu, jak to opisano wyżej. Wyniki
Amplifikację przeprowadzono na każdej liczbie sekwencji docelowej w następujących powtórzeniach: 3 amplifikację przeprowadzono stosując 20 kopii matrycy docelowej, 3 amplifikację przeprowadzono stosując 5 kopii matrycy docelowej, 2 amplifikację przeprowadzono stosując 2,5 kopii matrycy docelowej, 1 amplifikację przeprowadzono stosując 2 kopie matrycy docelowej i 23 amplifikację przeprowadzono nie stosując matrycy docelowej. Wszystkie amplifikację pozytywne spowodowały powstanie na zelu pojedynczego prążka o oczekiwanej wielkości. Żadna z amplifikacji nie spowodowała powstania dimeru starterów albo innych produktów amplifikacji nieswoistej.
Wyniki można porównać z wynikami w przykładzie VI, w którym tę samą sekwencję HCV amplifikowano stosując tę samą sekwencję starterów. Porównanie wyników z wynikami z przykładu VI wskazuje, ze amplifikację przy użyciu starterów modyfikowanych p-tert-butylobenzylem były istotnie poprawione w porównaniu z odpowiednimi amplifikacjami przeprowadzonymi ze starterami niemodyfi kowanymi.
Przeprowadzono dodatkowe doświadczenia, w których RNA HIV-1 amplifikowano stosując startery modyfikowane p-tert-butylobenzylem opisane w przykładzie V, powyżej. Amplifikacje przeprowadzono zasadniczo jak to opisano powyżej. Podobnie jak w układzie HCV, wszystkie pozytywne amplifikację z matrycą HIV-1 powodowały powstanie na zelu pojedynczego prążka oczekiwanej wielkości i żadna z amplifikacji nie spowodowała powstania dimeru starterów albo innego produktu amplifikacji nieswoistej.
Te dodatkowe wyniki można porównać z uzyskanymi w przykładzie V, w którym stosowano tę samą sekwencję docelową HIV i tę samą sekwencję starterów. Porównanie tych wyników z wynikami z przykładu V wskazuje, ze amplifikację z użyciem starterów modyfi190 142 kowanych p-tert-butylobenzylem były istotnie lepsze niż odpowiednie amplifikację przeprowadzone ze starterami niemodyfikowanymi.
Przykład X
Amplifikacja DNA mykobakterii
Przykład ten opisuje porównanie amplifikacji DNA mykobakterii, przeprowadzone przy użyciu starterów modyfikowanych i niemodyfikowanych. Zastosowano zarówno startery zmodyfikowano przez dodanie grupy benzylowej do nukleotydu końca 3', jak i startery zmodyfikowane przez dodanie do nukleotydu końca 3' grupy p-tert-butylobenzylowej. Reakcje z użyciem starterów niemodyfikowanych przeprowadzono zasadniczo jak to opisano w publikacji Tevere i in., 1996, J. Clin. Microbiol. 34(4):918-923. Amplifikację przeprowadzono stosując próbki plwociny, do których dodano DNA mykobakterii w znanych stężeniach w celu naśladowania zakażonych próbek klinicznych. Dodatkowe amplifikację przeprowadzono przy użyciu DNA mykobakterii, oraz z użyciem wolnych od DNA próbek kontrolnych.
Preparatyka próbek
Uprzednio wykazano, ze próbki plwociny są negatywne pod względem mykobakterii przy użyciu mikroskopii, po czym hodowle upłynniano i odkażano N-acetylo-cysteino-NaOH, metodą zalecaną przez CDC (Kent i Kubica, 1985, Public Health Mycobacteriology - A guide for the level III laboratory, US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control, Atlanta, załączone tu jako odnośnik).
Upłynnioną plwocinę (100 pl) dodawano do 500 pl odczynnika Respiratory Specimen Wash Reagent (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1% (obj./obj.) Triton Χ-100, 0,05% NaNa, pH 8,0) i odwirowano przez 10 minut przy 12500 x g. Każdy z osadów zawieszono w 100 pl reagentu do lizy (0,05 N NaOH, 1% (obj./obj'.) Triton Χ-100, 1 mM EDTA, 0,05% NaNs) i inkubowano przez 45 minut w 60°C. Lizaty neutralizowano 100 pl reagentu neutralizującego (0,2 M Tris-HCl, 8 mM MgCl2, 0,05% NaNj, pH 7,5).
Pulowane lizaty plwociny wytworzono przez połączenie 80 pl każdego z dwóch osobnych lizatów plwociny. Do każdego z 8 spulowanych lizatów plwociny (160 pl każdy) dodano 15 pl roztworu wyjściowego DNA (2 kopie/(pl w mieszaninie 1:1 reagentów do lizy i neutralizacji) oczyszczonego z hodowli M. tuberculosis.
Próbki zawierające oczyszczone DNA mykobakterii (bez plwociny) w znanym stężeniu, wytworzono przez dodanie 10 pl roztworu wyjściowego DNA do 100 pl mieszaniny reagentów do lizy i neutralizacji w stosunku 1:1.
Próbki kontroli negatywnej (bez DNA) składały się z mieszaniny 100 pl reagentu do lizy i 100 pl reagentu neutralizującego.
Startery amplifikacji
Amplifikację przeprowadzono przy użyciu starterów posiadających następujące sekwencje nukleotydowe:
Startery Sekwencje
KY18 (Identyfikator Sekw. 5'-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3' nr 5)
KY436 (Identyfikator Sekw. 5'-TAACACATGCAAGTCGAACGGAAA-3' nr 6)
KY75 (Identyfikator Sekw. 5 '-GCCCGTATCGCCCGCACGCTCACA-3' nr 7)
Poniższe pary starterów, zawierające wskazaną grupę modyfikującą przyłączoną do zasady końca 3', zastosowano w amplifikacjach. Wszystkie startery modyfikowane syntetyzowano jak to opisano w poprzednich przykładach. Wszystkie startery biotynylowano na końcu 5'.
| Para starterów | Sekwencie starterów | Modyfikacja |
| A | KY18 Ildentyf.Sekw . nr 5 ) | niemodyftfowwty |
| KY75 (Identyf. Sekw. nr 7) | niemodyftkowany | |
| B | KY436 Idln^tyT. Sekw . nr (5 8 | benzylownzy |
| KY75 (Identyf. Sekw. nr 7) | benzylownzy | |
| C | KYY436 (Identff. Sekw. nr 6 ) | p-t-el-h utylobenzyy |
| KY75 (Identyf. Sekw. nr 7) | p-terrtbutylobenzyl |
190 142
Amplifikacja
Dla każdej próbki przeprowadzono amplifikację stosując parę starterów niemodyfikowanych KY18 (Identyfikator Sekw. nr 5) i KY75 (Identyfikator Sekw. nr 7) i parę starterów zmodyfikowanych KY436 (Identyfikator Sekw. nr 6) i KY75 (Identyfikator Sekw. nr 7).
Amplifikację przeprowadzono w 100 pl mieszaniny reakcyjnej, zawierającej 50 pl jednej z trzech próbek opisanych wyżej i 50 pl 2X mieszaniny reakcyjnej, zawierającej:
100 mM Tris-HCl, pH 8.9,
500 nM każdego startera;
200 pM każdego dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dUTP)
20% obj/obj.) gliceryny;
jednostek polimerazy DNA Amplitaq(*, jednostek AmpErase (*.
* wytwarzana i opracowana przez Hoffmann-La Roche i sprzedawana przez Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Amplifikację metodą cyklicznej zmiany temperatury przeprowadzono na urządzeniu GeneAmp® PCR System 9600 thermal cycler (Perkin Elmer, Norwalk, CT) stosując poniższy profil temperatury:
inkubacja wstępna - 50°C przez 5 minut;
cykle - denaturacja w 98°C przez 20 sekund, annealing w 62°C przez 20 sekund, wydłużanie w 72°C przez 45 sekund, cykli - denaturacja w 94°C przez 20 sekund, annealing w 62°C przez 20 sekund, wydłużanie w 72°C przez 45 sekund;
wydłużanie końcowe - 72°C przez 12 godzin (w przybliżeniu przez noc).
Produkty amplifikacji obrazowano przez elektroforezę na zelu 2% Nusieve®, 0,5% agarozy i barwienie bromkiem etydyny.
Wyniki
Wyniki analizy elektroforetycznej pokazano na figurze 5. Dla każdej próbki, produkty amplifikacji przeprowadzonej na starterach niemodyfikowanych (zaznaczone „A”) oraz starterach modyfikowanych (zaznaczone „B” albo „C”) puszczono na sąsiadujących ścieżkach. Prążki odpowiadające zamierzonej sekwencji docelowej mykobakterii zaznaczono strzałkami. Inne prążki odpowiadały produktom amplifikacji nieswoistej; najmniejszy prążek w zelu odpowiadał dimerowi starterów. Ścieżki zaznaczone „M” zawierały wzorzec ciężaru cząsteczkowego (produkt trawienia DNA PhiX174 Haelll).
Amplifikację oczyszczonego DNA mykobakterii z zastosowaniem starterów niemodyfikowanych, prowadziły do tworzenia się dimerów startera. Zastosowanie pary starterów modyfikowanych zwiększało ilość zamierzonej sekwencji i zasadniczo eliminowało tworzenie wykrywalnego dimeru starterów.
W przeciwieństwie do amplifikacji czystego DNA, przy użyciu niemodyfikowanych starterów, obecność lizatu plwociny w reakcji amplifikacji zmniejszała wydajność i zwiększała tworzenie się produktów amplifikacji nieswoistej, jak to wykazano obecnością niezależnego prążka produktu. Wzrost ilości produktów nieswoistej amplifikacji DNA nie jest zaskakujący, ponieważ lizat plwociny zawiera znaczącą ilość ludzkiego DNA, który nie był obecny w amplifikacjach oczyszczonego DNA mykobakterii. Zastosowanie startera niemodyfikowanego w amplifikacji przeprowadzonej w obecności plwociny powodowało również istotny wzrost ilości zamierzonego produktu wytworzonego ogólnie i zmniejszenie amplifikacji nieswoistej.
Przykład XI
Dodatkowa synteza starterów modyfikowanych grupą benzylową
Startery modyfikowane dodatkiem grupy benzylowej do końcowej cytozyny zsyntetyzowano zasadniczo jak opisano w przy kładzie I, ale stosowano N4-acetylo, N4-benzylo-5'-O-DMT-2'-dezDksycytydynę związaną z LCAA-CPG, wytworzonąjak opisano poniżej.
190 142
Etap 1: Synteza N4-benzylo-2'-dezoksycytydyny
Do chlorowodorku 2'-dezoksycytydyny (5,28 g, 20 mmoli, U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH) dodano benzyloaminy (20 ml) i mieszaninę ogrzewano w temperaturze 150°C przez 0 godziny w atmosferze argonu. Roztwór zatężono pod próżnią i otrzymano lepki żółty olej, który rozdzielono pomiędzy wodę (100 ml) i octan etylu (100 ml). Fazę wodną przemyto octanem etylu (100 ml) i oddzielono. Fazę wodną zatężono pod próżnią i otrzymano żółty syrop (10 g), który oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na zelu krzemionkowym, stosując jako eluent mieszaninę chlorek metylenu:metanol, 15:1. Otrzymano żądany produkt (5,8 g, 91,5%) w postaci bezbarwnego syropu.
Etap 2: Synteza N4-acetylo, N4-benzylo-2'-dezoksycytydyny
N4-benzylo-2'-dezoksycytydynę (2,5 g, 7,9 mmola) rozpuszczono w 15 ml suchego dimetyloformamidu (15 ml), dodano bezwodnika octowego (8 g, 79 mmoli, 10 równ.) i mieszaninę mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalnik i nadmiar bezwodnika octowego odparowano pod próżnią. Produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na zelu krzemionkowym, stosując jako eluent mieszaninę chlorek metylenu:metanol, 20:1, i otrzymano związek tytułowy (1,0 g, 48%). Związek był wysoce higroskopijny i przechowywano go w warunkach zabezpieczających przed pochłanianiem wilgoci w temperaturze -20°C.
Etap 0: Synteza N4-acetylo, N4-benzylo, 5'-O-DMT-2'-dezoksycytydyny
N4-acetylo,N4-benzylo-2'-dezoksycytydynę (76 mg, 0,2 mmola) rozpuszczono w 1 ml suchej pirydyny i dodano DMT-Cl (122 mg, 0,2 mmola, 1,0 równ.). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 0 godziny. Analizą TLC wykazała jeszcze obecność materiału wyjściowego, tak więc dodano następną porcję DMT-Cl (61 mg, 0,5 równ.) i wytworzoną mieszaninę mieszano jeszcze przez 1 godzinę, po czym TLC wykazała zakończenie reakcji. Reakcję przerwano dodatkiem 15 ml roztworu solanki i fazę wodną ekstrahowano chlorkiem metylenu (3x15 ml). Połączoną warstwę organiczną przemyto solanką. (2x15 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik odparowano i mieszaninę oczyszczono metodą chromatografii na zelu krzemionkowym, stosując mieszaninę chlorek metylenu:metanol, 50:1. Otrzymano N4-acetylo, N4-benzylo, 5'-O-DMT-2'-de^ź^ok^:^yOytydynę' (96 mg, wydajność 65%).
Etap 4: Sukcynylowanie
N4-acetylo,N4-benzylo, 5'-O-DMT-2'-dezoksycytydynę (96 mg, 0,10 mmola) rozpuszczono w 2 ml suchej pirydyny. Dodano bezwodnika bursztynowego (100 mg, 1,0 mmola) i dimetyloaminopirydyny (20 mg) i wytworzoną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 0 dni. Rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość odparowano z toluenem (3x10 ml). W celu rozpuszczenia pozostałości dodano chloroformu (50 ml) (aby wspomóc rozpuszczanie stosowano ultradźwięki). Warstwę chloroformową przemyto solanką (0 x 15 ml) i wodą (1 x 15 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowano rozpuszczalnik i otrzymano 108 mg czystego 0'-O-bursztynianu N4-acetylo, N4-benzylo, 5'-O-DMT-2'-dezoksycvtydyny (wydajność 97%).
Etap 5: Wytwarzanie 0'-O-bursztynianu N4-acetylo,N4-benzylo, 5'-O-DMT-2'-dezoksycytydyny związanego z LCAA-CPG
Aktywowane CPG wytworzono, jak następuje. LCAA-CPG (1,0 g, LCA00500C, CPG Inc., Fairfield, NJ) potraktowano kwasem trichlorooctowym w chlorku metylenu (0%, 10 ml) i całość mieszano w wyparce obrotowej (wyparka obrotowa Buchi, Flawil, Szwajcaria) (brak próżni) przez 4 godziny. Rozpuszczalnik odsączono i CPG przemyto kolejno mieszaniną trietyloamina:etylodiizopropyloamina, 9:1 β x 5 ml), chlorkiem metylenu (3x10 ml) i eterem (3x10 ml), po czym wysuszono pod próżnią.
Sprzęganie modyfikowanego nukleozydowego produktu przejściowego z CPG przemytym kwasem prowadzono w następujący sposób. Do 1 g aktywowanego LCAA-CPG dodano 0'-O-bursztynia^u N4-acetylo, N4-benzylo, 5'-O-DMT-2'-dezoksycytydyny (108 mg, 0,10 mmola), wytworzonego jak opisano powyżej, dimetyloaminopirydyny (20 mg) i 5 ml suchej pirydyny Mieszaninę reakcyjną mieszano w wyparce obrotowej (brak próżni) przez 0 dni. Supernatant
190 142 odsączono, a sprzęzony LCAA-CPG przemyto kolejno pirydyną (3x5 ml), chlorkiem metylenu (3 x 10 ml) i eterem (3x10 ml), po czym wysuszono pod próżnią.
Blokowanie LCAA-CPG związanego z 3'-O-bursztynianem N-acetylo,N-benzylo, 5'-O-DMT-2'-dezoksycytydyny prowadzono w następujący sposób. Do derywatyzowanego CPG dodano blokującego odczynnika Cap A (THĘ/!lutydyna/Ac2O, 8:1:1, reagenty do syntezy DNA, Glen Research, Sterling, VA) i B (10% N-metyloimidazol w THF, Glen Research) i mieszaninę reakcyjną mieszano w wyparce obrotowej (brak próżni) przez noc. Roztwór odsączono, a sprzęzony LCAA-CPG przemyto kolejno pirydyną (3x5 ml), chlorkiem metylenu (3x10 ml), THF (3 x 10 ml) i eterem (3x10 ml), po czym wysuszono pod próżnią.
Zdolność do sprzęgania derywatyzowanego LCAA-CPG określono traktując 5 mg produktu 3% kwasem trichlorooctowym w chlorku metylenu, a ilość uwolnionego jonu dimetoksytritylokarboniowego mierzono metodą spektroskopii UV. Ilość pochodnej nukleozydowej związanej z LCAA-CPG wynosiła 19,5 pmola/g.
Przykład XII
Zestaw do amplifikacji
Przykład ten opisuje zestaw do amplifikacji RNA HCV przy uzyciu modyfikowanych starterów według wynalazku w warunkach reakcji opisanych w przykładzie VII.
Składniki zestawu opisano poniżej
A. Mieszanina podstawowa: jedna probówka zawierająca 0,5 ml następującego roztworu:
100 mM buforu Tricine pH 8,3,
240 mM K(OAc),
1000 μΜ dUTP,
600 μΜ każdego spośród dATP, dCTP i dGTP,
100 μΜ dTTP, 26% gliceryny
0,5 μΜ każdego z modyfikowanych starterów, jednostki UNG* jednostek polimerazy DNA rTth*,
0,05% azydek sodu dodany jako konserwant.
* wytwarzana i opracowana przez Hoffmann-La Roche i sprzedawana przez Perkin Elmer, Norwalk, CT.
B. Roztwór manganu: jedna probówka zawierająca 100 μΐ 350 mM Mn(OAc)2 z 0,05% azydkiem sodu jako konserwant.
C. Instrukcja
Do zastosowania powyzszego zestawu, 40 μΐ próbki wytworzonej jak to opisano w przykładzie VII, łączy się z 50 μΐ mieszaniny podstawowej 10 μΐ roztworu manganu tworząc 100 μΐ mieszaniny reakcyjnej. Amplifikację prowadzi się w sposób opisany w przykładzie VII.
Powyższy zestaw dostarcza jedynie składników niezbędnych do przeprowadzenia amplifikacji według przykładu VII. Jednakże, należy rozumieć, ze dodatkowe składniki mogą być zapakowane wraz z powyższymi składnikami zapewniając alternatywne konfiguracje zestawu. Ponadto, należy rozumieć, ze składniki mogą być dostarczone w różnych ilościach i/lub stężeniach wraz z odpowiednią zmianą protokołu zestawu.
190 142
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(1) ZGŁASZAJĄCY:
(A) NAZWA: HOFFMANN-LA ROCHE AG (b) ULICA: Grenzacherstrasse 124 (c) MIASTO: Bazylea (D) STAN: BS (E) KRAJ: Szwajcaria (F) KOD: CH-4070 (G) TELEFON: 061-6882511 (H) TELEFAKS: 061-6881395 (I) TELEKS: 962292/965542 hlr ch (ii) TYTUŁ WYNALAZKU:
(iii) LICZBA SEKWENCJI: 7 (iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) RODZAJ NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: Apple Macintosh (C) SYSTEM OPERACYJNY: System 7.1 (Macintosh) (D) OPROGRAMOWANIE: WORD 5.1 (vi) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 60-041127 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 20.03.97 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR 1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR
CAAT GAGACACCAGGAAT TAGATAT CAGTACAA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR 2 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 32 pary zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR
CCCTAAATCAGATCCTACATATAAGTCATCCA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR 3 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR
GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA
1:
2:
j:
190 142 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR 4 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 28 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW,
GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR 5 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW,
CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR 6 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR S EKW.
TAACACATGCAAGTCGAACGGAAA 24 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR 7 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW.
GCCCGTATCGCCCGCACGCTCACA
NR 4: 28
NR 5: 23
NR 6·
NR 7:
190 142 fttóaaca»
Fig. 2
5 6 7 8
190 142
Fig. 3
U = startery niemodyfikowane M = startery metylowane B = startery benzylowane NB = startery nitrobenzylowane
190 142
Fig.4
Zestaw napromieniowany
U IB IM
5533221100 5533221100 553322110 ·-·
Log 053221100 553322 1100553322110
U I B IM
Zestaw nie napromieniowany
U = niemodyfikowane ST778AA/ST280A
B = modyfikowane bis-nitrobenzylem 1S239/1524O M = modyfikowane mononitrobenzylem 15241/15242
190 142
Fig. 5
·»·*-—w»—····*»-»·»·-·-* !»
Kontrole negatywne
DNA ΛΑ tb
M = wzorzec ciężaru cząsteczkowego
A = amplifikację z KY18/KY75
B = amplifikację z benzylo-KY436/benzylo-KY75
C = amplifikację z p-terf-butylobenzylo-KY463/ p-ier/-butylobenzylo-KV75
190 142
Fig. 6
Synteza derywatyzowanego dA CPG
DMTO
X=chlorow(ec HÓ
N6-derywatyzowany dA-CPG
.0
COZH
190 142
5·—S1—Ν—3' wzór 1
Τ
5— S— Ν—S2—3' wzór 2
FŁ—C— R H wzór 3
wzór 5
wzór 6
190 142
S wzór 7 “Ό wzór 8
wzór 11 wzór 12
CH
wzór 13
190 142
Fig. 1
2 3 4 5 6 7 8
Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz Cena 6,00 zł
Claims (10)
- Zastrzeżenia patentowe1. Oligonukleotyd o wzorze ogólnym 1 lub 2, w którym Si oznacza pierwszą sekwencję nukleotydów o długości pomiędzy 5 i 50 nukleotydów;S2 oznacza drugą sekwencję o długości 1-3 nukleotydów;N oznacza nukleotyd, który zawiera zasadę purynową lub pirymidynową zawierającą egzocykliczną aminę;R oznacza grupę modyfikującą, jest związany kowalencyjnie z N poprzez egzocykliczną aminę i przedstawiony wzorem 3, w którym R1 i R2 niezależnie oznaczają wodór, grupę C1-C10 alkilową, grupę alkoksylową, grupę fenylową, grupę fenoksylową, podstawioną grupę fenylową, grupę naftylową lub podstawioną grupę naftylową.
- 2. Oligonuldeotyd według zastrz. 1, w którym R oznacza grupę 2-naftylometylową; grupę benzylową; albo podstawioną grupę benzylową.
- 3. Oligonukleotyd według zastrz. 1 albo 2, W którym R oznacza podstawioną grupę benzylową o wzorze 4, w którym R3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę C1-C 6 alkilową, grupę metoksylową lub grupę nitrową.
- 4. Oligonukleotyd według zastrz. 1, w którym R3 oznacza rozgałęzioną lub prostą grupę C1-C4 alkilową, grupę metoksylową lub grupę nitrową.
- 5. Oligonukleotyd według zastrz. 3 albo 4, w którym R3 jest przyłączony w pozycji para.
- 6. Oligonukleotyd według zastrz. 1, w którym N oznacza adenozynę.
- 7. Oligonukleotyd według zastrz. 1, w którym R jest wybrany z grupy obejmującej benzyl, p-metylobenzyl, p-tert-butylobenzyl, p-metoksybenzyl, o-nitrobenzyl i 2-naftylometyl.
- 8. Sposób amplifikowania sekwencji docelowej kwasu nukleinowego, znamienny tym, ze obejmuje prowadzenie reakcji amplifikacji z zastosowaniem co najmniej jednego oligonukleotydu określonego w zastrz. 1.
- 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że polega na reakcji łańcuchowej polimerazy.
- 10. Zestaw do prowadzenia reakcji amplifikacji kwasu nukleinowego, znamienny tym, ze zawiera oligonukleotyd określony w zastrz. 1.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4112797P | 1997-03-20 | 1997-03-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL325439A1 PL325439A1 (en) | 1998-09-28 |
| PL190142B1 true PL190142B1 (pl) | 2005-11-30 |
Family
ID=21914898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL98325439A PL190142B1 (pl) | 1997-03-20 | 1998-03-19 | Oligonukleotyd, sposób amplifikowania sekwencji docelowej kwasu nukleinowego i zestaw do przeprowadzenia reakcji amplifikacji kwasu nukleinowego |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6001611A (pl) |
| EP (1) | EP0866071B1 (pl) |
| JP (1) | JP2966389B2 (pl) |
| KR (1) | KR100292997B1 (pl) |
| CN (1) | CN1065873C (pl) |
| AT (1) | ATE280177T1 (pl) |
| AU (1) | AU712448B2 (pl) |
| BR (1) | BR9801878B1 (pl) |
| CA (1) | CA2229766C (pl) |
| CZ (1) | CZ291525B6 (pl) |
| DE (1) | DE69827060T2 (pl) |
| DK (1) | DK0866071T3 (pl) |
| ES (1) | ES2230631T3 (pl) |
| HK (1) | HK1012192A1 (pl) |
| HU (1) | HU223669B1 (pl) |
| IL (1) | IL123694A (pl) |
| NO (1) | NO322136B1 (pl) |
| PL (1) | PL190142B1 (pl) |
| RU (1) | RU2159248C2 (pl) |
| TW (1) | TW567188B (pl) |
| UA (1) | UA49843C2 (pl) |
Families Citing this family (181)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6200757B1 (en) * | 1999-01-19 | 2001-03-13 | Dade Behring Inc. | Method for controlling the extension of an oligonucleotide |
| US6509157B1 (en) * | 1999-11-05 | 2003-01-21 | Roche Molecular Systems, Inc | 3 blocked nucleic acid amplification primers |
| PL202358B1 (pl) | 1999-11-17 | 2009-06-30 | Roche Diagnostics Gmbh | Sposób wytwarzania kompozycji magnetycznych cząstek szklanych, magnetyczne cząstki szklane, kompozycja magnetycznych cząstek szklanych, zawiesina z magnetycznymi cząstkami szklanymi, probówka z kompozycją lub zawiesiną magnetycznych cząstek szklanych, zestaw części z tą probówką, zastosowanie kompozycji, zawiesiny i zestawu zawierających magnetyczne cząstki szklane, sposób izolowania materiału biologicznego |
| ATE312204T1 (de) | 1999-12-15 | 2005-12-15 | Gen Probe Inc | Methoden und zusammensetzungen zur detektion von spezies des mycobacterium avium-komplexes |
| EP1242633B1 (en) * | 1999-12-17 | 2011-01-12 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid amplification and detection of mycobacterium species |
| US6664081B2 (en) * | 1999-12-17 | 2003-12-16 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid amplification and detection of mycobacterium species |
| US7205129B1 (en) | 2000-02-28 | 2007-04-17 | Qiagen Gmbh | Method for reducing artifacts in nucleic acid amplification |
| WO2001075139A1 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-11 | Biolink Partners, Inc. | Reversible chemical modification of nucleic acids and improved method for nucleic acid hybridization |
| US6548251B1 (en) * | 2000-09-05 | 2003-04-15 | Fidelity Systems, Inc. | Inhibition of molecular and biological processes using modified oligonucleotides |
| US20020031777A1 (en) * | 2000-09-08 | 2002-03-14 | Linda Starr-Spires | Ultra yield amplification reaction |
| WO2002029003A2 (en) | 2000-10-06 | 2002-04-11 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding dna and rna |
| US9708358B2 (en) | 2000-10-06 | 2017-07-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding DNA and RNA |
| DE60115811T2 (de) * | 2000-10-25 | 2006-08-03 | Roche Diagnostics Gmbh | Amplifizierung unter Verwendung von modifizierten Primern |
| US6986992B2 (en) * | 2001-03-30 | 2006-01-17 | Amersham Biosciences Ab | P450 single nucleotide polymorphism biochip analysis |
| US6905827B2 (en) | 2001-06-08 | 2005-06-14 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases |
| US7026121B1 (en) | 2001-06-08 | 2006-04-11 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US7235358B2 (en) | 2001-06-08 | 2007-06-26 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| WO2002101041A1 (fr) * | 2001-06-12 | 2002-12-19 | Takara Bio Inc. | Procede d'amplification de l'acide nucleique et procede de detection du polymorphisme des nucleotides a l'aide d'un analogue de nucleotide |
| US20030096277A1 (en) * | 2001-08-30 | 2003-05-22 | Xiangning Chen | Allele specific PCR for genotyping |
| US6617137B2 (en) | 2001-10-15 | 2003-09-09 | Molecular Staging Inc. | Method of amplifying whole genomes without subjecting the genome to denaturing conditions |
| US7297485B2 (en) * | 2001-10-15 | 2007-11-20 | Qiagen Gmbh | Method for nucleic acid amplification that results in low amplification bias |
| US7211382B2 (en) * | 2002-04-09 | 2007-05-01 | Orchid Cellmark Inc. | Primer extension using modified nucleotides |
| JP4457001B2 (ja) * | 2002-05-31 | 2010-04-28 | セクレタリー・デパートメント・オブ・アトミック・エナジー | ドナー／アクセプター部分が相補鎖上となる標的核酸検出のｍｅｔ／ｆｒｅｔに基づく方法 |
| US7955795B2 (en) | 2003-06-06 | 2011-06-07 | Qiagen Gmbh | Method of whole genome amplification with reduced artifact production |
| US9487823B2 (en) | 2002-12-20 | 2016-11-08 | Qiagen Gmbh | Nucleic acid amplification |
| KR20070121853A (ko) * | 2003-03-31 | 2007-12-27 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 일본 뇌염 바이러스 혈청군의 구성원을 포함하는, 특정플라비바이러스 검출용 조성물 및 방법 |
| WO2004094986A2 (en) | 2003-04-16 | 2004-11-04 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
| US7892745B2 (en) | 2003-04-24 | 2011-02-22 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US7408051B2 (en) | 2004-04-14 | 2008-08-05 | Applera Corporation | Modified oligonucleotides and applications thereof |
| US7517978B1 (en) | 2004-04-14 | 2009-04-14 | Applied Biosystems, Llc | Modified oligonucleotides and applications thereof |
| US7939251B2 (en) | 2004-05-06 | 2011-05-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | SENP1 as a marker for cancer |
| WO2006006722A1 (ja) | 2004-07-13 | 2006-01-19 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | 細胞機能の調節方法 |
| WO2006029184A2 (en) * | 2004-09-08 | 2006-03-16 | Expression Diagnostics, Inc. | Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders |
| EP1809765A2 (en) * | 2004-11-04 | 2007-07-25 | Roche Diagnostics GmbH | Classification of acute myeloid leukemia |
| US7842794B2 (en) | 2004-12-17 | 2010-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Reagents and methods for detecting Neisseria gonorrhoeae |
| DE602005018840D1 (de) * | 2005-04-14 | 2010-02-25 | Applied Biosystems Llc | 3'-modifizierte oligonukleotide mit pseudoisocytosin-nukleobasenderivaten sowie deren anwendungen als primer oder sonden |
| US7465561B2 (en) | 2005-06-30 | 2008-12-16 | Roche Molecular Systems, Inc. | Probes and methods for hepatitis C virus typing using single probe analysis |
| US10081839B2 (en) | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US11111543B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US10083273B2 (en) | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US11111544B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US9424392B2 (en) | 2005-11-26 | 2016-08-23 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| EP2032714B1 (en) * | 2006-06-01 | 2011-03-16 | TriLink BioTechnologies | Chemically modified oligonucleotide primers for nucleic acid amplification |
| US20080009007A1 (en) * | 2006-06-16 | 2008-01-10 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Controlled initiation of primer extension |
| ATE538216T1 (de) * | 2006-07-31 | 2012-01-15 | Wanli Bi | Nukleinsäureverstärkung mithilfe eines reversibel modifizierten oligonukleotids |
| US9045522B2 (en) | 2006-07-31 | 2015-06-02 | Wanli Bi | Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide |
| US7993832B2 (en) | 2006-08-14 | 2011-08-09 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders |
| WO2008140484A2 (en) | 2006-11-09 | 2008-11-20 | Xdx, Inc. | Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus |
| GB2457402B (en) | 2006-12-01 | 2011-10-19 | Univ Columbia | Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators |
| US7893227B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-02-22 | Lasergen, Inc. | 3′-OH unblocked nucleotides and nucleosides base modified with non-cleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing |
| US7897737B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-03-01 | Lasergen, Inc. | 3′-OH unblocked, nucleotides and nucleosides, base modified with photocleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing |
| US9938641B2 (en) | 2006-12-18 | 2018-04-10 | Fluidigm Corporation | Selection of aptamers based on geometry |
| EP2574681B1 (en) | 2007-03-28 | 2016-03-23 | Signal Diagnostics | System and method for high resolution analysis of nucleic acids to detect sequence variations |
| US8460874B2 (en) | 2007-07-03 | 2013-06-11 | Genaphora Ltd. | Use of RNA/DNA chimeric primers for improved nucleic acid amplification reactions |
| WO2009021054A2 (en) | 2007-08-06 | 2009-02-12 | Orion Genomics Llc | Novel single nucleotide polymorphisms and combinations of novel and known polymorphisms for determining the allele-specific expression of the igf2 gene |
| CA2639416C (en) | 2007-09-11 | 2019-12-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Diagnostic test for susceptibility to b-raf kinase inhibitors |
| ES2460896T3 (es) * | 2007-10-04 | 2014-05-14 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Amplificación de ácido nucleico |
| US20100086914A1 (en) * | 2008-10-03 | 2010-04-08 | Roche Molecular Systems, Inc. | High resolution, high throughput hla genotyping by clonal sequencing |
| EP4310194A2 (en) | 2007-10-19 | 2024-01-24 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis |
| US9115163B2 (en) | 2007-10-19 | 2015-08-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | DNA sequence with non-fluorescent nucleotide reversible terminators and cleavable label modified nucleotide terminators |
| DE102008005667A1 (de) | 2008-01-19 | 2009-07-30 | Olfert Landt | Basenmodifizierte Primeroligomere für die Multiplex-RT-PCR |
| US8911948B2 (en) * | 2008-04-30 | 2014-12-16 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| EP2644707B1 (en) | 2008-04-30 | 2015-06-03 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase-H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| KR101677772B1 (ko) | 2008-06-11 | 2016-11-18 | 레이저젠, 인코퍼레이티드 | 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 그리고 시퀀싱에서의 이들의 이용 방법 |
| CA2731991C (en) | 2008-08-04 | 2021-06-08 | Gene Security Network, Inc. | Methods for allele calling and ploidy calling |
| WO2010046067A1 (en) * | 2008-10-20 | 2010-04-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Improved allele-specific amplification |
| US10669574B2 (en) | 2008-11-18 | 2020-06-02 | XCR Diagnostics, Inc. | DNA amplification technology |
| US8206929B2 (en) * | 2009-01-07 | 2012-06-26 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid amplification with allele-specific suppression of sequence variants |
| CA2751758A1 (en) | 2009-02-11 | 2010-08-19 | Orion Genomics Llc | Combinations of polymorphisms for determining allele-specific expression of igf2 |
| US8409802B2 (en) | 2009-08-14 | 2013-04-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Format of probes to detect nucleic acid differences |
| ES2640776T3 (es) | 2009-09-30 | 2017-11-06 | Natera, Inc. | Métodos para denominar de forma no invasiva ploidía prenatal |
| US9238832B2 (en) * | 2009-12-11 | 2016-01-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids |
| US8614071B2 (en) | 2009-12-11 | 2013-12-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | Preferential amplification of mRNA over DNA using chemically modified primers |
| WO2011128096A1 (en) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment |
| US11332785B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11332793B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US20190010543A1 (en) | 2010-05-18 | 2019-01-10 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11408031B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-08-09 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
| US11339429B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| AU2011255641A1 (en) | 2010-05-18 | 2012-12-06 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11326208B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-10 | Natera, Inc. | Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA |
| US9677118B2 (en) | 2014-04-21 | 2017-06-13 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11939634B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-03-26 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11322224B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-03 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US10316362B2 (en) | 2010-05-18 | 2019-06-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| EP2576837B1 (en) | 2010-06-04 | 2017-09-06 | Chronix Biomedical | Prostate cancer associated circulating nucleic acid biomarkers |
| WO2012038049A2 (en) | 2010-09-22 | 2012-03-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Amplification of distant nucleic acid targets using engineered primers |
| US20120142908A1 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-07 | Berry And Associates, Inc. | Compounds for the synthetic introduction of n-alkyl nucleosides into dna oligonucleotides |
| ES2770342T3 (es) | 2010-12-22 | 2020-07-01 | Natera Inc | Procedimientos para pruebas prenatales no invasivas de paternidad |
| US20120164641A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Roche Molecular Systems, Inc. | Methods and Compositions for Detecting Mutation in the Human Epidermal Growth Factor Receptor Gene |
| CA2824387C (en) | 2011-02-09 | 2019-09-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| WO2012135053A2 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Rnase h-based assays utilizing modified rna monomers |
| WO2012162429A2 (en) | 2011-05-23 | 2012-11-29 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Dna sequencing by synthesis using raman and infrared spectroscopy detection |
| US9034581B2 (en) | 2011-05-26 | 2015-05-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Staphylococcus aureus |
| US20140303008A1 (en) | 2011-10-21 | 2014-10-09 | Chronix Biomedical | Colorectal cancer associated circulating nucleic acid biomarkers |
| ES2413566B1 (es) | 2011-12-14 | 2014-05-20 | Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud | Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y pronóstico de la hipoacusia neurosensorial. |
| US9115394B2 (en) | 2011-12-22 | 2015-08-25 | Roche Molecular Systems, Inc. | Methods and reagents for reducing non-specific amplification |
| KR101545848B1 (ko) * | 2012-04-09 | 2015-08-21 | (주)바이오니아 | 핵산중합효소로 핵산을 검출하는데 사용되는 고민감도 핵산준비방법 |
| CN110343673B (zh) | 2012-06-14 | 2024-04-05 | 生命技术公司 | 用于聚合酶链式反应(pcr)的新型组合物、方法和试剂盒 |
| US9982313B2 (en) | 2012-08-17 | 2018-05-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of herpes simplex virus 1 and 2 |
| EP2722399A1 (en) | 2012-10-18 | 2014-04-23 | Roche Diagniostics GmbH | Method for preventing high molecular weight products during amplification |
| US9382581B2 (en) | 2012-12-13 | 2016-07-05 | Roche Molecular Systems, Inc. | Primers with modified phosphate and base in allele-specific PCR |
| WO2014093825A1 (en) | 2012-12-14 | 2014-06-19 | Chronix Biomedical | Personalized biomarkers for cancer |
| US9828629B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-11-28 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid target identification by structure based probe cleavage |
| US10648026B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-05-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Raman cluster tagged molecules for biological imaging |
| EP3004388B2 (en) | 2013-05-29 | 2023-05-31 | Chronix Biomedical | Detection and quantification of donor cell-free dna in the circulation of organ transplant recipients |
| CN107318267B (zh) | 2013-08-12 | 2021-08-17 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于治疗补体相关的病症的组合物和方法 |
| US10577655B2 (en) | 2013-09-27 | 2020-03-03 | Natera, Inc. | Cell free DNA diagnostic testing standards |
| US10262755B2 (en) | 2014-04-21 | 2019-04-16 | Natera, Inc. | Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments |
| US9499870B2 (en) | 2013-09-27 | 2016-11-22 | Natera, Inc. | Cell free DNA diagnostic testing standards |
| RU2016117929A (ru) | 2013-10-09 | 2017-11-15 | Флюоресентрик, Инк. | Мультиплексные зонды |
| CA2923706C (en) | 2013-10-09 | 2020-08-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods and compositions for detecting mutation in the human ezh2 gene |
| WO2015066341A2 (en) | 2013-10-30 | 2015-05-07 | Green Life Biotech, Llc | Pathogenesis quantification systems and treatment methods for citrus greening blight |
| US10072288B2 (en) | 2013-11-11 | 2018-09-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Detecting single nucleotide polymorphism using overlapped primer and melting probe |
| US9637791B2 (en) | 2013-12-20 | 2017-05-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Multiplexed nucleic acid target identification by strucutre based probe cleavage |
| MX2016010237A (es) | 2014-02-08 | 2017-04-27 | Genentech Inc | Metodos de tratamiento de enfermedad de alzheimer. |
| RU2717641C2 (ru) | 2014-04-21 | 2020-03-24 | Натера, Инк. | Обнаружение мутаций и плоидности в хромосомных сегментах |
| EP3201361B1 (en) | 2014-10-01 | 2020-02-12 | Chronix Biomedical | Methods of quantifying cell-free dna |
| US9745618B2 (en) | 2014-11-19 | 2017-08-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Photoblocked probes and methods for sequential detection of nucleic acids |
| US9920381B2 (en) * | 2014-12-02 | 2018-03-20 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detecting MECC-containing methicillin-resistant Staphylococcus aureus |
| US9909169B2 (en) | 2014-12-17 | 2018-03-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids using blocking oligonucleotides for wild type suppression |
| US10006910B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-06-26 | Agilome, Inc. | Chemically-sensitive field effect transistors, systems, and methods for manufacturing and using the same |
| US9859394B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-01-02 | Agilome, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
| US9857328B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-01-02 | Agilome, Inc. | Chemically-sensitive field effect transistors, systems and methods for manufacturing and using the same |
| WO2016100049A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | Edico Genome Corporation | Chemically-sensitive field effect transistor |
| US9618474B2 (en) | 2014-12-18 | 2017-04-11 | Edico Genome, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
| US10020300B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-07-10 | Agilome, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
| ES2961374T3 (es) | 2015-04-24 | 2024-03-11 | Atila Biosystems Incorporated | Amplificación con cebadores de composición de nucleótidos limitada |
| WO2016183106A1 (en) | 2015-05-11 | 2016-11-17 | Natera, Inc. | Methods and compositions for determining ploidy |
| US9970062B2 (en) * | 2015-08-06 | 2018-05-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of mycobacterium tuberculosis |
| US9382582B1 (en) * | 2015-08-25 | 2016-07-05 | Tracy Hayden | Methods, compositions and kits for enriching for a minor template amplification product in a mixed template amplification reaction |
| LT3402880T (lt) | 2016-01-15 | 2024-03-12 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Termofiliniai dnr polimerazės mutantai |
| CN108779500B (zh) | 2016-03-11 | 2022-12-13 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测寨卡病毒的组合物和方法 |
| WO2017169119A1 (ja) * | 2016-03-30 | 2017-10-05 | 大研医器株式会社 | 変異プライマーの設計方法 |
| JP6681804B2 (ja) * | 2016-03-30 | 2020-04-15 | 大研医器株式会社 | 変異プライマーの設計方法 |
| EP3459115A4 (en) | 2016-05-16 | 2020-04-08 | Agilome, Inc. | GRAPHEN-FET DEVICES, SYSTEMS AND METHODS FOR USE THEREOF FOR SEQUENCING NUCLEIC ACIDS |
| ES2874259T3 (es) * | 2016-05-27 | 2021-11-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Composiciones y procedimientos para la detección de Trichomonas vaginalis |
| US10612101B2 (en) * | 2016-05-27 | 2020-04-07 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Mycoplasma genitalium |
| US10934597B2 (en) * | 2016-05-27 | 2021-03-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of trichomonas vaginalis |
| US20170356025A1 (en) | 2016-06-14 | 2017-12-14 | Roche Molecular Systems, Inc. | Internal control probes for improving pcr assay performance |
| US10443095B2 (en) | 2016-08-02 | 2019-10-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Helper oligonucleotide for improved efficiency of amplification and detection/quantitation of nucleic acids |
| US11485996B2 (en) | 2016-10-04 | 2022-11-01 | Natera, Inc. | Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing |
| US10793923B2 (en) | 2016-11-09 | 2020-10-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of BK virus |
| US20190284618A1 (en) | 2016-11-10 | 2019-09-19 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of neisseria gonorrhoeae |
| EP3538668A4 (en) | 2016-11-10 | 2020-08-26 | Talis Biomedical Corporation | POLYNUCLEOTIDES FOR AMPLIFICATION AND DETECTION OF CHLAMYDIA TRACHOMATIS |
| US10011870B2 (en) | 2016-12-07 | 2018-07-03 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
| US20190211377A1 (en) | 2016-12-22 | 2019-07-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Cobra probes to detect a marker for epidemic ribotypes of clostridium difficile |
| EP3585889A1 (en) | 2017-02-21 | 2020-01-01 | Natera, Inc. | Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids |
| WO2019002178A1 (en) | 2017-06-26 | 2019-01-03 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | DNA MUTANTS THERMOPHILIC POLYMERASES |
| US10760137B2 (en) | 2017-07-18 | 2020-09-01 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Babesia |
| KR102380264B1 (ko) * | 2017-08-31 | 2022-03-29 | 주식회사 씨젠 | 다이머-형성 프라이머 쌍을 이용한 구성요소의 성능 평가 |
| WO2019063661A1 (en) | 2017-09-29 | 2019-04-04 | Roche Diagnostics Gmbh | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DETECTION OF TRICHOMONAS VAGINALIS |
| EP3768832B1 (en) | 2018-03-21 | 2023-11-29 | F. Hoffmann-La Roche AG | Dna polymerases for efficient and effective incorporation of methylated-dntps |
| US10450616B1 (en) | 2018-05-09 | 2019-10-22 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis |
| EP3814531A4 (en) | 2018-06-29 | 2022-04-06 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR DELIVERING MOLECULES AND COMPLEXES TO REACTION SITES |
| US11525159B2 (en) | 2018-07-03 | 2022-12-13 | Natera, Inc. | Methods for detection of donor-derived cell-free DNA |
| WO2020092134A1 (en) * | 2018-10-29 | 2020-05-07 | Cepheid | Exponential base-3 nucleic acid amplification with reduced amplification time using nested overlapping primers |
| US20220017973A1 (en) | 2018-12-03 | 2022-01-20 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of candida auris |
| KR102141312B1 (ko) * | 2019-04-19 | 2020-08-04 | 주식회사 제노헬릭스 | 짧은 RNA-primed 제노 센서 모듈 증폭 기반 짧은 RNA 탐지 기법 |
| WO2020221915A1 (en) | 2019-05-02 | 2020-11-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | UTILIZATION OF dITP FOR PREFERENTIAL/SELECTIVE AMPLIFICATION OF RNA VERSUS DNA TARGETS BASED ON STRAND-SEPARATION TEMPERATURE |
| EP3966351A1 (en) | 2019-05-07 | 2022-03-16 | F. Hoffmann-La Roche AG | Compositions and methods for detection of neisseria gonorroheae |
| US10954572B2 (en) | 2019-07-25 | 2021-03-23 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of Neisseria gonorrhoeae |
| WO2021013972A1 (en) | 2019-07-25 | 2021-01-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detection of epstein barr virus (ebv) |
| CN114286866A (zh) | 2019-08-27 | 2022-04-05 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于扩增和检测包括从cccDNA转录的HBV RNA在内的乙型肝炎病毒RNA的组合物和方法 |
| US11441167B2 (en) | 2019-11-20 | 2022-09-13 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for rapid identification and phenotypic antimicrobial susceptibility testing of bacteria and fungi |
| US11891662B2 (en) | 2019-12-02 | 2024-02-06 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for amplification and detection of human beta actin |
| EP4081666A2 (en) | 2019-12-27 | 2022-11-02 | F. Hoffmann-La Roche AG | Compositions and methods for detecting methicillin-resistant staphylococcus aureus |
| WO2021136752A1 (en) | 2019-12-31 | 2021-07-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Quantitative pcr screening of inducible prophage from bacterial isolates |
| KR20220152205A (ko) | 2020-03-09 | 2022-11-15 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(sars-cov-2), 인플루엔자 a 및 인플루엔자 b를 검출하기 위한 조성물 및 방법 |
| JP2023536962A (ja) | 2020-08-06 | 2023-08-30 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ｓａｒｓ－２）、インフルエンザａ及びインフルエンザｂの検出のための組成物及び方法 |
| JP2023552546A (ja) | 2020-12-04 | 2023-12-18 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | マラリアを検出するための組成物および方法 |
| US20220205020A1 (en) | 2020-12-30 | 2022-06-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of bacteria and fungi associated with bacterial and candida vaginosis |
| CN116806268A (zh) | 2021-02-05 | 2023-09-26 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测人副流感病毒1-4(hpiv 1-4)的组合物和方法 |
| US20220290221A1 (en) | 2021-03-15 | 2022-09-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) variants having spike protein mutations |
| JP2024517835A (ja) | 2021-05-06 | 2024-04-23 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 二重標的アッセイによりデルタ型肝炎ウイルスを検出するための組成物及び方法 |
| WO2023079032A1 (en) | 2021-11-05 | 2023-05-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detection of malaria |
| WO2023089186A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detecting vana and/or vanb genes associated with multidrug resistance |
| WO2023104812A1 (en) | 2021-12-09 | 2023-06-15 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Mass based detection of pcr amplicons |
| WO2024003260A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detecting lymphogranuloma venereum (lgv) serovars of chlamydia trachomatis |
| WO2024018485A1 (en) * | 2022-07-18 | 2024-01-25 | Haystackanalytics Private Limited | Methods and systems for detection and identification of pathogens and antibiotic resistance genes |
| WO2024042042A1 (en) | 2022-08-24 | 2024-02-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detecting monkeypox virus |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4711955A (en) * | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
| US5256549A (en) * | 1986-03-28 | 1993-10-26 | Chiron Corporation | Purification of synthetic oligomers |
| US5459255A (en) * | 1990-01-11 | 1995-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-2 substituted purines |
| DK0540693T3 (da) * | 1990-07-24 | 1999-09-13 | Hoffmann La Roche | Reduktion af ikke-specifik amplifikation under in vitro-nukleinsyreamplifikation under anvendelse af modificerede nukleinsy |
| US5338671A (en) * | 1992-10-07 | 1994-08-16 | Eastman Kodak Company | DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody |
| ATE155467T1 (de) * | 1993-03-30 | 1997-08-15 | Sanofi Sa | Acyclische nucleosid analoge und sie enthaltende oligonucleotidsequenzen |
| US5599662A (en) * | 1995-02-17 | 1997-02-04 | Hoffmann-La Roche Inc. | Oliconucleotide primers and probes for the detection of HIV-1 |
| US5837442A (en) * | 1995-11-29 | 1998-11-17 | Roche Molecular Systems, Inc. | Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid |
-
1998
- 1998-03-12 DK DK98104461T patent/DK0866071T3/da active
- 1998-03-12 AT AT98104461T patent/ATE280177T1/de active
- 1998-03-12 ES ES98104461T patent/ES2230631T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 DE DE69827060T patent/DE69827060T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 EP EP98104461A patent/EP0866071B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-13 AU AU58404/98A patent/AU712448B2/en not_active Expired
- 1998-03-16 US US09/039,866 patent/US6001611A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-16 IL IL12369498A patent/IL123694A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-03-16 HU HU9800581A patent/HU223669B1/hu active IP Right Grant
- 1998-03-18 CA CA002229766A patent/CA2229766C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-19 CZ CZ1998841A patent/CZ291525B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-03-19 NO NO19981239A patent/NO322136B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-03-19 UA UA98031382A patent/UA49843C2/uk unknown
- 1998-03-19 CN CN98105627A patent/CN1065873C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-19 RU RU98105786/04A patent/RU2159248C2/ru active
- 1998-03-19 PL PL98325439A patent/PL190142B1/pl unknown
- 1998-03-20 JP JP10090641A patent/JP2966389B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-20 BR BRPI9801878-7A patent/BR9801878B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-03-20 KR KR1019980009644A patent/KR100292997B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 TW TW087104213A patent/TW567188B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-12-15 HK HK98113390A patent/HK1012192A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL190142B1 (pl) | Oligonukleotyd, sposób amplifikowania sekwencji docelowej kwasu nukleinowego i zestaw do przeprowadzenia reakcji amplifikacji kwasu nukleinowego | |
| JP3789817B2 (ja) | Ｐｎａ−ｄｎａキメラプローブを用いたテンプレート依存型ライゲーション | |
| US7541165B2 (en) | Molecular detection systems utilizing reiterative oligonucleotide synthesis | |
| CA2329135C (en) | Hybridization and mismatch discrimination using oligonucleotides conjugated to minor groove binders | |
| JP2004505988A (ja) | プリン−２，６−ジアミンのピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグを含有する核酸結合性化合物およびそれらの使用 | |
| US6509157B1 (en) | 3 blocked nucleic acid amplification primers | |
| JP2006525022A (ja) | 反復オリゴヌクレオチド合成を利用する分子検出システム | |
| JP2013518598A (ja) | ランダム化配列を含むプライマー及び特異的プライマーを用いる核酸の等温増幅並びにその使用 | |
| JP2002291490A (ja) | 修飾プライマーを使用する増幅 | |
| JP2002527523A (ja) | 機能付与したピリミジン誘導体 | |
| US6312897B1 (en) | Template-directed interference footprinting of protein-adenine contacts | |
| JP2017533733A (ja) | ハイブリダイゼーションプローブおよび方法 | |
| MXPA98002007A (en) | Cebers modify | |
| Wooddell | Topology of yeast RNA polymerase II transcription elongation complexes studied by protein-DNA photoaffinity cross-linking | |
| McGuire | Synthesis and studies of modified nucleotides and oligonucleotides |