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Diese
Erfindung betrifft das Gebiet der Enzymreaktionen zur Amplifizierung
von Nukleinsäuresequenzen. Insbesondere betrifft die Erfindung
Mittel und Methoden zur Verwendung in der Multiplex-RT-PCR.
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Die
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine Methode, um Nukleinsäuren
zu amplifizieren, nachzuweisen und in der Menge zu bestimmen.
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Klassische
PCR-Methoden weisen Sequenzen aus Desoxyribonukleinsäure
(DNA) nach; Ribonukleinsäuresequenzen (RNA) müssen
durch eine so genannte reverse Transkription (RT) in DNA umgeschrieben werden,
bevor Sie mittels PCR vervielfältigt werden können.
Der Gesamtprozess von RT und PCR wird als RT-PCR bezeichnet. Die
Umschreibung in DNA erfolgt mit Hilfe RNA-abhängiger DNA
Polymerasen (Reversen Transkriptasen). Die am häufigsten
verwendeten RT Enzyme sind die aus Moloney murine leukemia virus
(MMLV) und avian myeloblastosis virus (AMV).
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Sowohl
PCR wie RT-PCR werden heute vielfach zum Nachweis und zur Quantifizierung
von pathogenen Organismen verwendet. Darunter stellen RNA-Viren
eine wichtige Gruppe dar.
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Ein
weiterer wichtiger Anwendungsbereich der RT-PCR im Bereich der Forschung
und der medizinischen Diagnostik ist der Nachweis und die Quantifizierung
von mRNA nicht-viralen Ursprungs. Die Transkriptionsaktivität
von Zellen kann mit ihrem Status beispielsweise hinsichtlich ihrer
Differenzierung oder als Folge einer medikamentösen Behandlung
oder mit einem Krankheitsbild korrelieren. Ein Beispiel dafür
ist die Amplifizierung chimärer mRNA-Transkripte zum Nachweis
von chromosomalen Translokationen bei bestimmten Leukämieerkrankungen.
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Die
Transkripte werden in einer quantitativen RT-PCR bestimmt, üblicherweise
verglichen mit der Menge des Transkriptes eines statusunabhängig
exprimierten Referenzgenes (Housekeeping Gen).
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Für
den Nachweis von Krankheitserregern wird bevorzugt eine Kontrollreaktion
mitgeführt, die in einer zweiten PCR besteht, um im Falle,
dass das Testergebnis bezüglich des Erregernachweises negativ
ist, nachzuweisen, dass die Reaktionsbedingungen geeignet gewesen
wären, ein PCR-Produkt in der Probe zu generieren (Interne
PCR Kontrolle, IPC).
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Auch
für Analysen der Transkriptionsaktivität von Zellen
wird immer eine Kontroll-PCR durchgeführt, entweder zur
Kontrolle der PCR Bedingungen, oder im Falle der Quantifizierung
zum Vergleich des Ergebnisses mit einem Mengenstandard.
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Am
elegantesten ist die Durchführung der in den vorstehenden
Absätzen beschriebenen Kontrollen in demselben Reaktionsansatz;
man spricht dabei von einer Duplex-PCR. Soweit mehr Kontrollen oder
Primer für weitere Zielsequenzen anwesend sind, bezeichnet
man solche Reaktionen allgemein als Multiplex-PCR.
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Die
RT-PCR kann in zwei Schritten (2-step RT-PCR) oder in einem gemeinsamen
Schritt (1-step RT-PCR) durchgeführt werden. Reverse Transkriptase
und DNA Polymerase haben bei unterschiedlichen Konzentrationen von
Salzen und Hilfsstoffen (Pufferbedingungen) sowie unterschiedlichen
Temperaturen optimale Reaktionsbedingungen. Daher wird die gemeinsame
Reaktion (1-step) immer einen Kompromiss darstellen, der mit einer
Verringerung der Effektivität einer oder beider Reaktionen
einhergeht. Das kann sich sowohl auf die Spezifität wie
die Prozessivität der beiden Reaktionsschritte auswirken.
Dennoch wird die gemeinsame Reaktion in der Praxis bevorzugt, weil
sie erheblich weniger manuelle Arbeitsschritte erfordert, also besser
automatisierbar und naturgemäß schneller durchzuführen
ist und die Gefahr einer Kontaminierung der Probe verringert wird.
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Die
bevorzugte Einschrittreaktion hat aufgrund der geringeren Prozessivität
der DNA Polymerase häufig eine schlechtere Sensitivität
und/oder erfordert mehr Thermozyklen. Der Unterschied kann hinsichtlich
der Sensitivität der Methode im Nachweis kleiner Mengen
von RNA mehrere Größenordnungen betragen. Dies kann
experimentell gezeigt werden, indem man die Nachweisgrenze für
eine DNA-PCR auf einer DNA-Zielsequenz mit und ohne den RT-Schritt
vergleicht.
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In
der RT-PCR werden häufig Gemische von Primern verwendet,
zum Beispiel um verschiede Gen- oder Virusvarianten gleichzeitig
zu detektieren, in jedem Falle aber für die Amplifkation
der mitgeführten Kontrolle oder Referenz PCR. PCR-Reaktionen,
in welchen mehr als ein Primerpaar anwesend ist, werden als Multiplex-Reaktionen,
Multiplex-PCR oder gegebenenfalls Multiplex-RT-PCR bezeichnet. Insbesondere
wird der Zusatz „Multiplex" verwendet, wenn drei, vier
oder noch mehr Primerpaare anwesend sind.
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Es
wurde beobachtet, dass in vielen Fällen eine Multiplex-Reaktion
auch bei Vorliegen von geeigneten Matrixsequenzen in der Reaktionslösung
nicht zum erwarteten Ergebnis führt (falsch-negatives Ergebnis), wenn
die Anzahl der in der Reaktion verwendeten Primer erhöht
wird. Manchmal reicht schon ein dritter Primer, um die DNA-Amplifikation
zu unterbinden. Nach den Erfahrungen der Erfinder sind viele der
publizierten Multiplex-Methoden Ergebnis eines aufwendigen Suchens
von geeigneten Primern durch Versuch und Irrtum.
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Eine
schlüssige Untersuchung der Gründe für
dieses Versagen von vielen Multiplex-Primermischungen bei der RT-PCR
ist unseres Wissens bisher nicht veröffentlicht worden. Ältere
Untersuchungen zum Phänomen der sog. „Primer-Dimer"-Bildung
bei konventioneller PCR liegen vor, ebenso Lösungsansätze
dazu.
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Die
EP 0 866 071 A2 zeigt
modifizierte Primer, die der Vermeidung von Primer-Dimer-Bildung
während der Startphase der PCR abhelfen sollen. Diese Primer
weisen an einem Aminostickstoff der Base eine Modifikation auf.
In der genannten Schrift wird die Vermutung geäußert,
dass dem Mechanismus der Verhinderung von Dimeren eine Minderung
der Hybridisierungsfähigkeit der Primer zugrunde liegt.
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Die
EP 1 201 768 A2 zeigt
ebenfalls modifizierte Primer analog der
EP 0 866 071 A2 ; hierbei
sind die Primer durch chemische Modifikationen der endständigen
Zuckermoleküle verändert und dienen wiederum der Vermeidung
von Dimeren bei konventioneller PCR.
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Die
EP 1 147 230 B1 zeigt
die Verwendung von modifizierten Primern zur Vermeidung nicht-spezifischer
Amplifikation bei PCR. Die Schrift zeigt eine weit reichende Definition
von Modifizierung, welche durch konkrete Beispiele belegt wird,
die sich auf die Modifizierung der Sauerstoffatome, vor allem des
3'-O der Ribose, sowie die Heteroatome der Basen beziehen. Weiterhin
sind Modifikationen durch kommerziell erhältliche Basen,
welche chemische Gruppen aufweisen, erwähnt, konkret Biotin,
Fluorescin und Digitoxin.
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Die
US 6,548,251 B1 zeigt
Modifikationen der Oligomersequenz, die der Verhinderung unspezifischer Bindung
bei der PCR dienen sollen.
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Ein
der nachstehend beschriebenen Erfindung zugrunde liegendes Problem
ist die Erhöhung der Sensitivität eines RT-PCR-Ansatzes.
Ein weiteres der nachstehend beschriebenen Erfindung zugrunde liegendes Problem
ist es, eine generell anwendbare Methode zur Verfügung
zu stellen, mit welcher komplexe Gemische von Primern für
Multiplex-Reaktionen erhalten werden, die die selektive Amplifikation
der von den enthaltenen Primerpaaren detektierten Sequenzen erlauben.
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Ausgehend
vom dargelegten Stand der Technik ist es Aufgabe der hier beschriebenen
Erfindung, Mittel und Verfahren zur Verfügung zu stellen,
mit deren Hilfe die Durchführung von Multiplex-RT-PCR erleichtert wird
und komplexe Primergemische zuverlässig verwendbar macht.
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Diese
Aufgabe wird durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche
gelöst.
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Gemäß den
im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung vorgenommenen Untersuchungen liegt
der mangelnden Effizienz von RT-PCR mit komplexen Primermischungen
höchstwahrscheinlich eine DNA-abhängige Polymeraseaktivität
der Reversen Transkriptase zugrunde, die dieses Enzym als Nebenaktivität
zeigt. Die Primer lagern sich bei den relativ niedrigen Reaktionstemperaturen
während des RT Schrittes aneinander und werden an ihren
3'-Enden verlängert, auch wenn sie nicht genau zueinander
passen. Die entstehenden Primer-Dimere hybridisieren nicht mehr
mit genügender Selektivität auf der zu amplifizierenden Ziel-DNA
und dienen damit nicht mehr als Primer für die Zielsequenz.
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Grundlage
der erfindungsgemäßen Lösung ist die
Hemmung der RT-abhängigen DNA-abhängigen DNA-Polymeraseaktivität
der RNA-abhängigen reversen Transkriptase. Sowohl in der
Zielstellung bezüglich des inhibierten Moleküls,
als auch in der Wahl der Methodik unterscheidet sich der hier vorgestellte
erfinderische Ansatz wesentlich von aus dem Stand der Technik bekannten
Verfahren. Während in den zitierten Schriften die Zielstellung
eine Verringerung der Basenpaarung bei fehlerhaften Hybridbindungen
zwischen nicht-kanonischen Basenpaaren ist, ist in der vorliegenden
Erfindung eine Hemmung der RT-abhängigen Primer-Dimer-Bildung
durch Inhibition der RT das Ziel.
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Auf
der Suche nach geeigneten Reaktionsbedingungen für komplexe
Multiplex-Reaktionsbedingungen wurde überraschenderweise
gefunden, dass bestimmte chemische Modifikationen der Basen die
Affinität der Primer für das RT Enzym vermindern,
ohne ihre Aktivität als Primer in der PCR Amplifikation
nennenswert zu beeinträchtigen.
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Kern
der vorliegenden Erfindung sind Primer, die in der Nähe
des 3'-Endes modifizierte Basen aufweisen, welche als Modifikation
einen räumlich großen organischen Rest tragen,
sowie die Verwendung solcher Primer in Multiplex-RT-PCR-Reaktionen.
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Als „erfindungsgemäße
Wirkung" wird in der vorliegenden Beschreibung eine veränderte
Wirkung von erfindungsgemäß modifizierten Primer-Oligodesoxynucleotiden
in der RT-PCR, verglichen mit unmodifizierten Primern, bezeichnet.
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Diese „erfindungsgemäße
Wirkung" kann in einer Erhöhung des Niveaus der relativen
Fluoreszenz in der Sättigungsphase einer Reaktion relativ
zu einem verglichenen, unmodifizierten Primer für eine
gegebene Menge an Templatmolekülen bei ansonsten unveränderten
Reaktionsbedingungen bestehen. Weiter kann als „erfindungsgemäße
Wirkung" auch eine Erniedrigung der Reaktionszyklen vor Erreichen
des Schwellwertes (ct), bei dem eine Reaktion als positiv beurteilt
wird, bezeichnet werden. Ebenfalls kann die „erfindungsgemäße Wirkung"
in einer Verbesserung der Reaktion nach vorgenannten Kriterien bei
Anwesenheit verschiedener konkurrierender oder nicht-konkurrierender
Primer in der Reaktionsmischung, oder in einer Kombination aller vorstehend
genannten Kriterien, bestehen.
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Die
nähere Untersuchung zeigte, dass die erfindungsgemäße
Wirkung sich einstellt, wenn die Modifikation einen bestimmten Abstand
von der Base und eine bestimmte Größe hat.
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Die
Modifikation der Basen erfolgt bevorzugt durch Einbau derivatisierter
Phosphoamiditbasen. Kommerziell erhältlich sind hierbei
Modifikationen am C-6- oder C5-Kohlenstoffatom von Pyrimidinbase-Phosphoamiditbausteinen.
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Ein
einfacher aliphatischer Rest mit Aminofunktion, wie er C-6-Kohlenstoffatom
von Pyrimidinbase-Phosphoamiditbausteinen käuflich erhältlich
ist („Aminolinker", siehe z. B. Glen Research Corporation,
Virginia, USA, Produkt 10-1039-90) (Formel (1))
oder andere
aliphatische Gruppen, die an die 5-Position einer Desoxy-Thymidinbase
angehängt wurden, zeigen keine Wirkung. Primern mit Basen
am oder in der Nähe des 3'-Endes, die mit kleineren Heterozyklen
wie zum Beispiel Methylorange (2) modifiziert wurden, zeigen hingegen
eine erfindungsgemäße Wirkung. (Glen
Research Corporation, Virginia, USA, Produkt 10-1058-95) (2)
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Beispielhaft
sind dafür Oligodesoxyribonucleosidprimer, in denen Kettenglieder
auf Basis der in den Formeln (1) oder (3) bis (5) gezeigten Verbindungen
am 3' Ende oder in Nähe des 3'-Endes des Primers bei der
Synthese eingebaut wurden, wobei die in den Formeln (3) bis (5)
gezeigten Verbindungen durch organische Reste umfassend mindestens
10 Kohlenstoff- und/oder Heteroatome modifiziert sind. Bevorzugte
Modifikationen von Basen des Primers sind solche in der 5-Position
des Pyrimidinrings oder in der 8-Position des Purinrings.
(Glen
Research Corporation, Produkt 10-1019-90; Cytosin) (3)
(Glen
Research Nr. 10-1089-90; Adenosin) (4)
(Glen
Research Nr. 10-1099-90; Guanosin) (5)
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Bevorzugt
sind Modifikationen durch organische Reste, welche ein aliphatisches
Verbindungsmolekül (Linker) bestehend aus zwei bis 10 Kohlenstoff-
oder Heteroatomen sowie einen organischen Rest umfassend mindestens
10 Kohlenstoff- und/oder Heteroatome, bevorzugt einen oder mehrere
Fünf- oder Sechsringsysteme aufweisen. Ganz besonders bevorzugt
sind Modifikationen mit Linkern zwischen 3 und 6 Atomen und Ringsystemen
aus drei oder mehr Ringen.
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Erfindungsgemäß sind
auch weitere, dem Fachmann ohne erfinderische Tätigkeit
zugängliche Basenmodifikationen durch andere als die in
den Beispielen verwendeten Brückenmoleküle, und
Modifikationen an anderen als den genannten Positionen der Basen.
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Die
Stärke der erfindungsgemäßen Wirkung
ist von der Art und Größe der Modifikation abhängig.
Die genannten Aminolinker ohne weitere ankondensierte Gruppen zeigen
wenig Wirkung. Bei Modifikation der genannten Basen mit kleineren
Heterozyklen wie zum Beispiel Methylorange (Glen Research Produkt-Nr. 10-1058-95)
zeigt sich bereits eine Erhöhung der Signalintensität
bzw. eine Verringerung der notwendigen Zyklenzahl in der RT-PCR
unter Referenzbedingungen, die aber noch verbessert werden kann.
Systeme, die aus mindestens drei Ringen bestehen und die über
ein Brückenmolekül (Linker) mit der Base verbunden
sind, zeigen den erfindungsgemäßen Effekt. Die
Farbstoffe Carboxy-Fluorescein, Tetramethylrhodamin (TAMRA), das Rhodamin
LightCycler Red640 aber auch das kleinere Methylenblau zeigen alle
den erfindungsgemäßen Effekt.
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Bevorzugt
sind dabei kurze aliphatische Brücken oder „Linker"
von einem bis zwanzig, insbesondere von zwei oder vier bis dreizehn,
weiter bevorzugt von zwei oder drei Kohlenstoffatomen bis acht Kohlenstoff- und
Heteroatomen in der direkten Kette zwischen dem erfindungsgemäß an
die Base gekoppelten Ringsystem und der Base; ganz besonders bevorzugt
ist die Acrylimido-aminoethylbrücke zwischen Base und Modifikation, welche
die Verbrückung über sieben Atome herstellt. Werden
dieselben Farbstoffe über einen dreizehn Atome enthaltenen
Linker an die Base gekoppelt, zeigt sich ein geringerer Effekt,
welcher für die jeweilige Problemstellung immer noch ausreichen
kann.
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Bevorzugt
sind Modifikationen durch zwei bis sechs Ringsysteme enthaltene
Moleküle, insbesondere bevorzugt sind Modifikationen durch
drei oder vier 5-6-Kohlenstoffe oder Heteroatome enthaltene kondensierte
oder durch Brücken verbundene Ringsysteme, bevorzugt aromatische
Ringsysteme. Wesentlich größere Gruppen hingegen
blockieren die Primer in der PCR Amplifikation, vermutlich durch
Wechselwirkungen mit der DNA Polymerase.
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Insbesondere
bevorzugt sind Modifikationen durch Farbstoffe wie Methylenblau,
Fluorescein, TAMRA, Methylorange, welche sich alle durch ihre Größe
von zwei bis fünf Sechsringe, entweder kondensiert oder durch
rotationsfähige Achsen miteinander verbunden, auszeichnen.
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Modifiziert
werden kann grundsätzlich jede Base innerhalb eines Primers.
Eine relative Nähe zum 3'-Ende des Primers ist vorteilhaft.
Bevorzugt sind dabei die Basen in Position –1 bis –6
vom 3'-Ende aus gesehen (die Base, welche das 3'-Ende bildet, wäre
gemäß dieser Nomenklatur die Nr. 0). Erfindungsgemäß wird nach
Experimenten der Erfinder der vorliegenden Erfindung der erfinderische
Effekt auch noch bei der Modifikation der Base an Position –14
beobachtet. Der erfinderische Effekt nimmt dabei mit wachsender
Entfernung vom 3'-Terminus ab, so dass prinzipiell die Wahl einer
3'-nahen Base als Trägerin der Modifikation angezeigt ist;
es mag aber Gründe in der Sequenz oder anderen Motivationen
geben, die modifizierte Base weiter in die Sequenz zu schieben.
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Am
meisten bevorzugt ist die Verwendung einer modifizierten Base in
der Position –1.
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Ein
Primermolekül zur Verwendung in einem Verfahren gemäß der
vorliegenden Erfindung hat eine Länge von 5 bis 50 Basenpaaren.
Bevorzugt sind Primer mit 8 bis 40, insbesondere mit 15 bis 30 Basenpaaren Länge.
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In
den Beispielen werden bevorzugt die natürlich vorkommenden
Basenbausteine zur Herstellung der erfindungsgemäßen
Primer verwendet. Synthetische Basenanaloga wie Locked Nucleic Acid,
Peptide Nucleic Acid oder andere Analoga, welche nicht-natürlich
vorkommende Rückgratgruppen als Analoga der natürlich vorkommenden
Zucker der DNA verwenden, kommen auch zur Verwirklichung der Erfindung
in Betracht.
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Gemäß einer
Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Primergemische
zur Diagnose viraler Erkrankungen bereitgestellt. Insbesondere hat
sich die Erfindung als zweckmäßig zur Herstellung
von Primern und Analyse-Fertigmischungen („Kits") zur Diagnose
von Influenza, besonders im Zusammenhang mit der zur Zeit wachsenden
Bedeutung des H5N1-Subtyps, sowie von HIV und HCV erwiesen. Weiterhin
sinnvoll ist insbesondere der Einsatz der vorliegenden Erfindung
bei der Primerherstellung zur Diagnose der eingangs erwähnten
viralen Erkrankungen.
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Gemäß einer
Ausführungsform der Erfindung werden RNA-Viren, insbesondere
Retroviren, darunter HIV, Coronaviren, darunter der Erreger von
SARS sowie tiermedizinisch wichtiger Erkrankungen, Rhabdoviren,
darunter das Tollwutvirus, Picornaviren, darunter der Erreger der
Kinderlähmung, Filoviren, darunter die Erreger von haemorrhagischem
Fieber wie Ebola und Marburg-Virus, Flaviviren (Hepatitis C, Gelbfieber, Dengue),
Reoviren wie die Viren der klassischen Erkältung sowie
Rotavirus, Influenzaviren oder der Erreger von Mumps, einzeln oder
in Kombination durch Multiplex-RT-PCR detektiert.
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Weiterhin
kann gemäß Ausführungsform der Erfindung
auch pathgen-spezifische mRNA von Viren allgemein, auch von DNA
Viren, sowie von Bakterien oder Parasiten durch Multiplex-RT-PCR
erfolgen, insbesondere um die Aktivität oder das Potential
der Erreger, eine Infektion auszulösen, zu ermitteln.
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Gemäß einer
Ausführungsform der Erfindung werden Reaktionsgemische
zur Verfügung gestellt, welche mehrere zur Detektion von
viraler oder anderer Target-RNA in einer Probe geeignete Primerpaare
enthalten. Reaktionsgemisch zur Detektion von viraler RNA im Sinne
der vorliegenden Erfindung sind also Gemische von verschiedenen
zur Multiplex-RT-PCR geeigneten Primerpaaren.
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Gemäß einer
Ausführungsform der Erfindung enthalten solche Reaktionsgemische
verschiedene synthetische Oligodesoxynucleotidverbindungen als Primer,
wobei mindestens eine, bevorzugter Weise mehrere oder alle der synthetischen
Oligodesoxynucleotidverbindungen durch die Formel
beschreibbar sind, wobei
- – SeqA, SeqB und SeqC für
Sequenzen natürlich vorkommender Desoxyribonucleotidbausteine
oder deren synthetische Analoga stehen, wobei damit auch eine Mischung
von Desoxyribonucleotidbausteinen und deren synthetischen Analoga
erfasst sein soll,
- – n die Ziffer 0 bis drei, vorzugsweise 0 oder 1 bedeutet,
- – SeqA eine Länge von 0 bis 40 Basenpaare
annehmen kann,
- – Wiederholungen von SeqB für n > 1 verschiedene Sequenzen
und Längen von 1 bis 25 Basenpaaren innerhalb einer Oligodesoxynucleotidverbindung
annehmen können,
- – SeqC eine Länge von 0 bis 20 Basenpaare,
vorzugsweise 1 bis 12 Basenpaare annehmen kann,
- – N1 ein an einem den Sechsring der Pyrimidinbasen
oder den Fünfring der Purinbasen konstituierenden Atom
modifizierter natürlicher Basenbaustein oder ein synthetisches
Basenanalogon ist,
- – R1 und R2 ein mit N1 kovalent, vorzugsweise durch
eine aliphatische Brücke, verbundener Molekülrest umfassend
mindestens zehn Atome des Atomgewichts zwölf und schwerer,
vorzugsweise umfassend mindestens zwei bis fünf aromatische
Ringe bedeutet.
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Bevorzugt
sind Reaktionsmischungen und Verfahren, in welchen mindestens drei
verschiedene synthetische Oligodesoxynucleotidverbindungen als Primer
eingesetzt werden, noch bevorzugter solche, in denen mindestens
vier verschiedene synthetische Oligodesoxynucleotidverbindungen
als Primer zur Amplifikation mindestens zwei verschiedener Nukleinsäuresequenzen
eingesetzt werden.
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Bevorzugt
ist als RT die Reverse Transkriptase aus Moloney murine leukemia
virus (MMLV) oder avian myeloblastosis virus (AMV).
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Die
erfindungsgemäß eingesetzten synthetischen Oligodesoxynucleotidverbindungen
haben eine Länge von 8 bis 30 Basenpaaren. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform hat SeqC eine Länge
von 1 bis 10 Basenpaaren und n ist gleich 0.
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Die
Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher
charakterisiert.
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Beispiele
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(1) Influenza H5N1 Amplifikation H5 Gen
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Herstellung der Primermoleküle
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Primer
wurden an der mit XT bezeichneten Position mit einer aminomodifizierten
dThymidinbase mit C2 Linker, C6 Linker, mit einer dT-Fluorescein
oder einem dT-C6-Dabcyl (alle vorstehenden Modifikationen bezogen
von Glen Research) oder einem dT-BBQ (Berry & Associates Inc., Dexter, MI, USA)
auf einem Syntheseautomaten Expedite 8900 mit Standardzyklus und
Standard Phosphoramiditen bezogen von Proligo LLC, Boulder, CO,
USA, ohne Abspaltung der terminalen Trityl-Gruppe synthetisiert
und über Nacht bei 55°C in konzentriertem Ammoniak
entschützt, über NAP-10 Sephadex Gelfiltrationssäulen
(GE Healthcare) vom Ammoniak befreit und über eine Oligo-R3
HPLC Säule (Perseptive Biosystems Inc., Framingham MA,
USA) und nach Entfernung der Tritylgruppe (60% Essigsäure
oder 3% Triflouressigsäure) über einer SourceQ
Säule (Amersham Pharmacia Biosciences) in 10 mM NaOH gereinigt.
Für die Herstellung der estermodifizierten Primer wurden
die gereinigten aminomodifizierten Primer in 50% DMSO mit dem NHS-Ester
(TAMRA-NHS, emp Biotech GmbH, Berlin; LightCycler Red 640, Roche
Diagnostics; Methylenblau-NHS, emp Biotech) gekoppelt. Die Produkte
wurden per HPLC und Gelfiltration gereinigt. System
1
System
2
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Modifikation
der reversen Primer A, R an der vorletzten (n – 1) Position
mit:
dT-C2-Amin; dT-C6-Amin; dT-C2-Fluorescein; dT-C2-TAMRA;
dT-C2-LC Red 640; dT-C2-Methylenblau; dT-C6-Methylorange (Dabcyl);
dT-C6-Fluorescein; dT-C6-TAMRA (6-Carboxytetramethylrhodamin); dT-C6-LC Red
640; dT-C6-Methylenblau; dT-C2-BBQ.
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Der
Reaktionsansatz bestand aus einem 1-step RT Gemisch, bestehend aus
einem FastStart DNA Master (Roche Diagnostics) für die
DNA Amplifikation, der mit 0.2 u Transcriptor reverser Transcriptase
(Roche Diagnostics) versetzt war. Es wurden 10 pmol Primer (0,5 μM)
und 3 pmol Hybridisierungssonden (0,15 μM) in einem Volumen
von 20 μl eingesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für
10 min inkubiert, 10 min bei 95°C denaturiert und dann
55 Zyklen je 2 sec 95°C, 10 sec 55°C und 10 sec
72°C in einem LightCycler 2.0 Instrument (Roche Diagnostics)
durchgeführt. Als Target diente eine Verdünnungsreihe
eines Plasmides mit der Zielsequenz (GenExpress GmbH, Berlin).
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(2) Variation der Position (Verschiebung
der Primer über die modifizierte Position)
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Forward
Primer TH5S und verschiedene reverse Primer, bei denen dieselbe
Base modifiziert ist (dT-Fluorescein), so daß die modifizierte
Base 2 bis 5 Basen vom 3'-Terminus entfernt ist. Bestimmt wurde
der ct Wert (threshold) und das Niveau der relativen Fluoreszenz
in der Sättigungsphase für zwei Targetkonzentrationen,
die 1000 und 100 Genomäquivalenten entsprechen. Referenz
war die Sequenz mit einer Modifikation an der zweiten Position (TH5xA).
Die relative Fluoreszenz war zwei bis sechs mal so hoch wie für
den jeweiligen unmodifizierten Primer für das Target mit
1000 Kopien; die Reaktion gab für das Target mit 100 Kopien
für zwei unmodifizierte Primer gar kein Signal.
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Forward
Primer TH5S und verschiedene reverse Primer, bei denen dieselbe
Base modifiziert ist (dT-Fluorescein), so daß die modifizierte
Base 2 bis 7 Basen vom 3'-Terminus entfernt ist. Bestimmt wurde
der ct Wert (threshold) und das Niveau der relativen Fluoreszenz
in der Sättigungsphase für zwei Targetkonzentrationen,
die 1000 und 100 Genomäquivalenten entsprechen. Referenz
war die Sequenz mit einer Modifikation an der zweiten Position (TH5xR).
Die relative Fluoreszenz war zwei bis drei mal so hoch wie für
den jeweiligen unmodifizierten Primer für dasselbe Target.
Die Primer mit der Modifikation an Position –2 und –6
hatten einen früheren ct Wert.
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(3) Variation der Position in einer Sequenz
(R):
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Forward
Primer TH5S und reverser Primer TH5_R mit intern modifizierten dT
Basen an unterschiedlichen Positionen von –2 bis –14.
Alle modifizierten Primer zeigen für das Target mit 1000
Kopien ein ungefähr 50% höheres Signal als die
modifizierte Referenz und ein 50% bis 450% höheres Signal
für das Target mit 100 Kopien; der doppelt modifizierte
Primer THG5xR** zeigt hier ein 550% höheres Signal. Die
ct Werte waren für alle modifizierten Primer um 2 Zyklen
geringer.
Influenza
H5N1 Amplifikation N1 Gen
Amplifikation
HIV-1 gag Genregion
Amplifikation
HCV 5-UTR Region
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Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der
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werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - EP 0866071
A2 [0015, 0016]
- - EP 1201768 A2 [0016]
- - EP 1147230 B1 [0017]
- - US 6548251 B1 [0018]
(Glen Research Nr. 10-1089-90; Adenosin) (4)
(Glen Research Nr. 10-1099-90; Guanosin) (5)
Amplifikation HIV-1 gag Genregion
Amplifikation HCV 5-UTR Region
