DE60133321T2

DE60133321T2 - Methoden zur Detektion des mecA Gens beim methicillin-resistenten Staphylococcus Aureus

Info

Publication number: DE60133321T2
Application number: DE60133321T
Authority: DE
Inventors: Toshiki Taya; Takahiko Ishiguro; Juichi Saito
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2000-05-29
Filing date: 2001-05-29
Publication date: 2009-03-05
Anticipated expiration: 2021-05-30
Also published as: EP1160333A3; EP1160333A2; US7297517B2; DE60133321D1; US20020098492A1; EP1512756A3; EP1512756B1; EP1512756A2

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Oligonucleotide und ein Verfahren zum Nachweisen von methicillinresistentem Staphylococcus aureus (MRSA) bei der klinischen Untersuchung. Die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Oligonucleotide sind als Reagenzien für die genetische Diagnose, welche Verfahren wie Spaltung, Amplifikation und Nachweis von RNA oder DNA einbezieht, und als Reagenzien zur Hemmung der reversen Transkription oder Translation der RNA brauchbar. Insbesondere sind die Sequenzen der in der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Oligonucleotide für Reagenzien oder dergleichen zur quantitativen Bestimmung und Diagnose von MRSA brauchbar.
Stand der Technik
MRSA ist ein resistenter Stamm von Staphylococcus aureus, welcher Resistenz gegen β-Lactamase-resistente Penicilline, einschließlich Methicillin, aufweist, welche stabil gegen β-Lactamase sind, die von Staphylococcus aureus gebildet wird. MRSA ist ein bedeutender Erreger bei den nosokomialen Infektionen, und Stämme davon, welche eine leichte Resistenz sogar gegen Vancomycin, einem wirksamen therapeutischen Arzneistoff gegen den resistenten Stamm, aufweisen, wurden auch nachgewiesen. MRSA verursacht wegen des Mangels an einem wirksamen antimikrobiellen Arzneistoff dagegen erhebliche Probleme bei der medizinischen Versorgung. So ist sein genauer und rascher Nachweis bei der klinischen Untersuchung ein wichtiges Thema bei der Diagnose und Behandlung.
Staphylococcus aureus produziert allgemein vier Typen von Zellwand-bildenden Proteinen PBPs (Penicillin-bindende Proteine), näml. PBP-1 bis PBP-4, jedoch war gefunden worden, dass MRSA auch einen neuen Typ von PBP, bezeichnet als PBP-2', produziert. Dieser PBP-Typ ist ein spezifisches Protein mit schwacher Affinität gegen β-Lactamantibiotika, und ist bekannt, eine zentrale Funktion bei der Toleranz dieses Organismus zu haben. Die Sequenz des mecA-Gens, das PBP-2' codiert, ist bekannt (FEBS Lett., 221, 167–171, 1987, usw.). Daher wurden Hybrid isierungsverfahren gesucht, welche eine zum mecA-Gen spezifische Gensonde verwenden, um MRSA nachzuweisen und zu identifizieren.
Wie vorstehend erwähnt, weisen diese Verfahren Probleme im Hinblick auf ihre Geschwindigkeit auf, obwohl Versuche gemacht wurden, MRSA auf Genniveau nachzuweisen, da die Präparation einer Probe das Züchten der Bakterien erfordert, die aus einer Patientenprobe erhalten werden. Da der Nachweis und die Identifizierung von MRSA eine lange Züchtungsdauer erfordert und es schwierig ist, rasch eine Spurenmenge des mecA-Gens in einer Probe nachzuweisen, gibt es einen Bedarf für die Entwicklung eines rasch und hoch empfindlichen Nachweisverfahrens auf dem Gebiet der klinischen Diagnose. Außerdem gibt es auch einen Bedarf, ein automatisiertes Untersuchungsgerät zu entwickeln, um die Untersuchungen zu vereinfachen.
Um den hoch empfindlichen Nachweis auszuführen, ist es vorzuziehen, den Nachweis nach Amplifizieren einer spezifischen Sequenz in dem nachzuweisenden und zu identifizierenden Gen oder in RNA, die von diesem Gen abgeleitet ist (nachstehend als „Zielnucleinsäure" bezeichnet), durchzuführen.
Wenn die Zielnucleinsäure DNA ist, ist das Verfahren der Polymerasekettenreaktion (PCR) als Amplifikationsverfahren bekannt. Dieses Verfahren amplifiziert eine spezifische Sequenz durch Wiederholung eines Zyklus mit Hitzedenaturierung, Primer-Anlagerung und Verlängerungsreaktionen in Gegenwart eines Paars von Primern, die komplementär und homolog zu beiden Enden der spezifischen Sequenz in der Ziel-DNA sind, sowie einer hitzebeständigen DNA-Polymerase. Zu dieser Zeit werden Oligonucleotide, die hoch spezifisch zur spezifischen Sequenz sind, benötigt, um die spezifische Sequenz durch die PCR zu amplifizieren. Außerdem werden Oligonucleotide benötigt, die hoch spezifisch zu der Ziel-DNA sind, um diesen Nachweis und diese Identifizierung mit hoher Empfindlichkeit auszuführen. Weiter ist es auch notwendig, die optimale Kombination jener Oligonucleotide zu bestimmen. Daher wurden Versuche gemacht, um das mecA-Gen, das auf der chromosomalen DNA von Staphylococcus aureus liegt, durch PCR unter Verwendung spezifischer Oligonucleotidsequenzen nachzuweisen.
Jedoch ist es notwendig, die aus einer Patientenprobe erhaltenen Bakterien zu züchten, um die Probe zu präparieren. Daher gibt es wie in dem vorstehend erwähnten Hybridisierungsverfahren ein Problem hinsichtlich der Geschwindigkeit. Zusätzlich gibt es auch ein Problem im Hinblick auf die klinische Bedeutung, da der Nachweis des mecA-Gens, das auf der chromosomalen DNA liegt, nicht wirklich zu einer Identifizierung der Expression von PBP-2' führt. Weiter erfordert das PCR-Verfahren ein kompliziertes Verfahren, welches die Wiederholung von rascher Erhöhung und Erniedrigung der Temperatur einschließt, was seine Automatisierung verhindert.
Andererseits gibt es zusätzlich zum RT-PCR-Verfahren das bekannte NASBA-Verfahren und das bekannte 3SR-Verfahren als Amplifikationsverfahren in den Fällen, wo die Zielnucleinsäure RNA ist, wobei die spezifische Sequenz durch die gemeinsame Aktion der reversen Transkriptase und RNA-Polymerase amplifiziert wird. Diese Verfahren schließen eine Kettenreaktion ein, wobei ein Promotorsequenz-enthaltender Primer für eine spezifische Sequenz in der Ziel-RNA, eine reverse Transkriptase und Ribonuclease H verwendet werden, um doppelsträngige DNA zu synthetisieren, welche die Promotorsequenz enthält, und diese doppelsträngige DNA wird als Template für die RNA-Polymerase-katalysierte Synthese von RNA, welche die spezifische Sequenz enthält, verwendet, während die RNA wiederum ein Template für die Synthese der doppelsträngigen DNA wird, welche die Promotorsequenz enthält. Das NASBA-Verfahren und das 3SR-Verfahren können die Nucleinsäureamplifikation bei einer konstanten Temperatur durchführen und gelten daher als Verfahren, die für die Automation geeignet sind. In dieser Situation kann die Gegenwart des mecA-Gens sowie seiner vorhandenen Menge zum Beispiel durch qualitative oder quantitative Bestimmung einer PBP-2' codierenden mRNA gemessen werden. Da diese mRNA ein Gen ist, von welchem PBP-2' exprimiert wird, zeigt sie sich außerdem in einer Menge, die viel größer ist als die Kopienzahl des mecA-Gens, das auf der chromosomalen DNA liegt. So kann das mecA-Gen ohne Züchtung der Bakterien aus einer Probe nachgewiesen werden, was dieses Verfahren für die rasche Diagnose brauchbar macht. Zu dieser Zeit wird bei der Amplifikation der vorstehenden spezifischen Sequenz durch das NASBA-Verfahren oder dergleichen ein Oligonucleotid mit hoher Spezifität zu der vorstehenden spezifischen Sequenz benötigt. Außerdem wird ein Oligonucleotid benötigt, das eine hohe Spezifität zu der Ziel-RNA hat, um den Nachweis und die Identifizierung mit hoher Empfindlichkeit durchzuführen. Daher wurde ein Versuch gemacht, um das mecA-Gen, das auf der chromosomalen DNA von Staphylococcus aureus liegt, durch das NASBA-Verfahren unter Verwendung spezifischer Oligonucleotidsequenzen nachzuweisen. Jedoch bildet die Ziel-RNA eine intramolekulare Struktur, welche die Bindung des Primers hemmt und die Reaktionseffizienz verringern kann, da das NASBA-Verfahren oder dergleichen die Amplifikationsreaktion bei relativ niedriger Temperatur (zum Beispiel 41°C) durchführt. Infolgedessen wurde ein Verfahren der Hitzedenaturierung der Ziel-RNA vor der Amplifikationsreaktion benötigt, um die intramolekulare Struktur der Ziel-RNA abzubauen, um dadurch die Primerbindungseffizienz zu verbessern. Zusätzlich wird sogar in dem Fall, wo der Nachweis der RNA bei einer niedrigen Temperatur ausgeführt wird, ein Oligonucleotid benötigt, das in der Lage ist, an RNA zu binden, welche die vorstehend erwähnte intramolekulare Struktur gebildet hat.
Daher ist die erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Oligonucleotide, die bei der spezifischen Spaltung, Amplifikation oder dergleichen brauchbar sind, sowie einen hoch empfindlichen Nachweis und Identifizierung des mecA-Gens, das das Zellwand-bildende Protein PBP-2' codiert, das von MRSA produziert wird, oder der von dem Gen abgeleiteten RNA bereitzustellen. Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung Oligonucleotidsequenzen bereit, die in einem Arzneimittel zur Hemmung der reversen Transkription oder Translation der RNA brauchbar sind.
Die zweite Auflage der vorliegenden Erfindung ist, eine bevorzugte Kombination der Oligonucleotide bereitzustellen, die bei der spezifischen Amplifikation der von dem mecA-Gen abgeleiteten RNA, welches das Zellwand-bildende Protein PBP-2' codiert, welches von methicillinresistentem Staphylococcus aureus produziert wird, bei einer relativ niedrigen Temperatur (z. B. 41°C), sowie für den hoch empfindlichen Nachweis und die Identifizierung davon brauchbar ist.
Die erste der vorstehenden Aufgaben wird mit einem Oligonucleotid für die Spaltung, den Nachweis oder die Amplifikation des mecA-Gens, einem Gen-Element von methicillinresistentem Staphylococcus aureus (MRSA), oder der von dem Gen abgeleiteten RNA, wobei das Oligonucleotid in der Lage ist, spezifisch an das mecA-Gen oder an die davon abgeleitete RNA zu binden, und mindestens 10 zusammenhängende Basen von einer der als SEQ ID No. 1 bis 17 aufgeführten Sequenzen umfasst, oder einem Oligonucleotid, das zu dem Oligonucleotid komplementär ist, erreicht.
Nach einer Ausführungsform wird die erste Aufgabe durch ein Oligonucleotid erreicht, wie vorstehend erwähnt, wobei das Oligonucleotid ein Oligonucleotidprimer für die DNA-Verlängerungsreaktion ist.
Nach einer Ausführungsform wird die erste Aufgabe durch ein Oligonucleotid erreicht, wie vorstehend erwähnt, wobei das Oligonucleotid eine Oligonucleotid-Sonde ist, von der ein Teil mit einem nachweisbaren Marker modifiziert oder markiert ist.
Nach einer Ausführungsform wird die erste Aufgabe durch ein Oligonucleotid erreicht, wie vorstehend erwähnt, wobei das Oligonucleotid ein synthetisches Oligonucleotid ist, bei dem ein Teil seiner Base(n) ohne Verminderung der Funktion des Oligonucleotids als Oligonucleotid-Sonde modifiziert ist (sind).
Die Oligonucleotide der Erfindung, welche fertig gestellt wurden, um die erste Aufgabe zu erreichen, sind Oligonucleotide, die auf eine spezifische Weise komplementär an die Regionen der Ziel-RNA, die frei von intramolekularer Struktur sind, bei der vorgenannten RNA-Amplifikation binden, und sie sind in der Lage, spezifisch an die Ziel-RNA ohne die vorstehend beschriebene Hitzedenaturierung zu binden. Auf diese Weise stellt die vorliegende Erfindung Oligonucleotide bereit, die an die Regionen, die frei von intramolekularer Struktur sind, der RNA, die von dem mecA-Gen, das PBP-2' codiert, abgeleitet ist, bei einer relativ niedrigen und konstanten Temperatur (35–50°C und vorzugsweise 41°C) binden und für die spezifische Spaltung, Amplifikation, Nachweis oder dergleichen des mecA-Gens brauchbar sind. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung Oligonucleotide, welche rasch und hoch empfindlich einen Nachweis durch ihre Verwendung als Oligonucleotidprimer zum Amplifizieren der vorstehenden Ziel-DNA mit PCR, als Oligonucleotidprimer zum Amplifizieren der vorstehenden Ziel-RNA mit NASBA oder dergleichen und als Oligonucleotid-Sonde zum Nachweisen der Zielnucleinsäure ohne oder nach diesen Amplifikationen erreichen. In diesem Zusammenhang wurden neulich Entwicklungen von neuen, chemisch synthetisierten Substanzen, welche nicht die Funktion einer Oligonucleotid-Sonde vermindern würden, eine komplementäre Sequenz auf der Grundlage von Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin (oder Uracil) zu erkennen, ausgeführt, um die Technik des genetischen Nachweises zu verbessern. Ein Beispiel solcher Substanzen beinhaltet die Peptidnucleinsäure (PNA), bei der das Zucker- und Phosphorsäuregerüst, welches die Gerüststruktur der Nucleinsäure DNA bereitstellt, durch ein Polyamidgerüst ersetzt wurde. So werden auch Oligonucleotide, welche durch eine Substanz wie PNA zu einem Ausmaß modifiziert wurden, der nicht die Funktion der Basensequenz-Erkennung vermindern würde, in die nachweisenden Sonden der vorliegenden Erfindung einbezogen.
SEQ ID NO. 1 bis 17 veranschaulichen die Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung, die bei der Spaltung, der Amplifikation, dem Nachweis oder dergleichen der von dem mecA-Gen abgeleiteten RNA brauchbar sind. In diesem Zusammenhang beinhaltet die von dem mecA-Gen abgeleitete RNA auch RNA, die unter Verwendung dieser Gene als Templates gebildet wurde. Obwohl jedes der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung die gesamte Basensequenz von einer der SEQ ID No. 1 bis 17 einschließen kann, können diese Oligonucleotide Oligonucleotide mit mindestens 10 zusammenhängenden Basen der beschriebenen Sequenzen sein, da eine Folge von 10 Basen für die spezifische Bindung an das mecA-Gen geeignet ist, und können auch ihre komplementären Oligonucleotide sein.
Die Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung können zum Beispiel als Oligonucleotidprimer für die Nucleinsäureamplifikation verwendet werden. Wenn ein Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren unter Verwendung des Oligonucleotids der vorliegenden Erfindung als Primer ausgeführt wird, kann nur die Ziel-Nucleinsäure, und zwar mecA, amplifiziert werden. Obwohl Beispiele von Amplifikationsverfahren PCR, LCR, NASBA und 3SR beinhalten, sind Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren, die bei einer konstanten Temperatur ausgeführt werden können, wie LCR, NASBA und 3SR besonders vorzuziehen. MRSA kann durch Nachweis des Amplifikationsprodukts durch verschiedene Verfahren nachgewiesen werden. In diesem Fall kann eines der vorstehenden Oligonucleotide außer das bei der Amplifikation verwendeten Oligonucleotid als Sonde verwendet werden, und das Fragment der amplifizierten spezifischen Sequenz kann durch Elektrophorese oder dergleichen bestätigt werden.
Die Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung können als Sonden durch zum Beispiel Modifizierung von Teilen oder deren Markierung mit einem nachweisbaren Marker verwendet werden. Beim Nachweisen der Ziel-Nucleinsäure kann das Oligonucleotid der vorliegenden Erfindung, das mit dem nachweisbaren Marker markiert ist, mit einer einzelsträngigen Ziel-Nucleinsäure hybridisiert werden, wonach die hybridisierte Sonde durch den Marker nachgewiesen werden kann. Der Markernachweis kann durch ein für den besonderen Marker geeignetes Verfahren und zum Beispiel bei Verwendung eines interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffs zur Markierung des Oligonucleotids, eines Farbstoffs mit dem Vermögen, erhöhte Fluoreszenzintensität durch Interkalation in der doppelsträngigen Nucleinsäure mit der Zielnucleinsäure aufzuweisen, ausgeführt werden, und die Oligonucleotid-Sonde kann verwendet werden, um den einfachen Nachweis von nur der hybridisierten Sonde ohne Entfernung der Sonde, die nicht mit der Zielnucleinsäure hybridisiert hat, zu ermöglichen. Bei Verwendung eines allgemeinen Fluoreszenzfarbstoffs als Marker kann der Marker nach Entfernen der Sonde, die nicht mit der Zielnucleinsäure hybridisiert hat, nachgewiesen werden. Für den Nachweis wird die Zielnucleinsäure in der Probe vorzugsweise zu einer nachweisbaren Menge durch ein Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren wie das PCR-, NASBA- oder 3SR-Verfahren amplifiziert, unter welchen die isothermen Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren wie das NASBA- und 3SR-Verfahren am meisten vorzuziehen sind. Beim Einbau der Nucleotid-markierten Sonde in der Reaktionslösung während der Amplifikation ist es besonders vorzuziehen, die Sonde durch zum Beispiel Hinzufügen von Glykolsäure an das 3'-Ende zu modifizieren, so dass die Sonde nicht als Nucleotidprimer fungieren wird.
Die Erfindung nach Anspruch 1, welche fertig gestellt wurde, um die zweite Aufgabe zu erreichen, betrifft ein Nachweisverfahren, das einen RNA-Amplifikationsprozess verwendet, mit den Schritten: Bilden einer cDNA mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase unter Verwendung einer spezifischen Sequenz einer von einem mecA-Gen abgeleiteten RNA, einem Gen-Element von MRSA, die in einer Probe als Template vorliegt, mit einem ersten Primer mit einer Sequenz, die zu der spezifischen Sequenz homolog ist, und einem zweiten Primer mit einer Sequenz, die zu der spezifischen Sequenz komplementär ist, wobei der erste oder der zweite Primer eine Sequenz hat, an deren 5'-Region die RNA-Polymerase-Promotorsequenz angelagert ist, wodurch ein RNA-DNA Doppelstrang entsteht; Digerieren der RNA des RNA-DNA-Doppelstrangs mit Ribonuclease H zu einer einzelsträngigen DNA; und anschließendes Bilden einer doppelsträngigen DNA, die eine Promotorsequenz enthält, die eine Transkription der RNA-Sequenz ermöglicht, oder einer RNA, die eine zu der RNA-Sequenz komplementäre Sequenz umfasst, mit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase unter Verwendung der einzelsträngigen DNA als Template, wobei die doppelsträngige DNA in Gegenwart einer RNA-Polymerase ein RNA-Transkriptionsprodukt bildet und das RNA-Transkriptionsprodukt anschließend als Template für die Bildung einer einzelsträngigen DNA mit der RNA-abhängigen DNA-Polymerase verwendet wird; dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonucleotid der SEQ ID No. 18 als erster Primer verwendet wird und das Oligonucleotid einer der Sequenzen SEQ ID No. 19 bis 21 als zweiter Primer verwendet wird, oder das Oligonucleotid der SEQ ID No. 22 als erster Primer verwendet wird und das Oligonucleotid der SEQ ID No. 23 oder 24 als zweiter Primer verwendet wird, oder das Oligonucleotid der SEQ ID No. 25 als erster Primer verwendet wird und das Oligonucleotid der SEQ ID No. 23 oder 24 als zweiter Primer verwendet wird.
Die Erfindung nach Anspruch 2, welche fertig gestellt wurde, um die vorgenannte Aufgabe zu erreichen, betrifft das Nachweisverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Primer ein Oligonucleotid mit mindestens zehn zusammenhängenden Basen der Sequenz von SEQ ID No. 18, 22 oder 25 ist.
Die Erfindung nach Anspruch 3, welche fertig gestellt wurde, um die vorgenannte Aufgabe zu erreichen, betrifft das Nachweisverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Primer ein Oligonucleotid mit mindestens zehn zusammenhängenden Basen der Sequenz von SEQ ID No. 19, 20, 21, 23 oder 24 ist.
Die Erfindung nach Anspruch 4, welche fertig gestellt wurde, um die vorgenannte Aufgabe zu erreichen, betrifft ein Nachweisverfahren für einen methicillinresistenten Staphylococcus aureus (MRSA) mit den Schritten: Durchführen des RNA-Amplifikationsprozesses nach Anspruch 1 in Gegenwart einer Oligonucleotid-Sonde, die mit einem interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, wobei die Sequenz der Sonde zu mindestens einem Teil des RNA-Transkriptionsprodukts komplementär ist und eine komplementäre Bindung der Sonde an das RNA-Transkriptionsprodukt zu einer Änderung des Fluoreszenzvermögen gegenüber einer Situation führt, wo eine Komplexbildung fehlt; und anschließendes Messen der Fluoreszenzintensität der Reaktionslösung.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Kombination von Oligonucleotiden für das Amplifizieren und Nachweisen der vom mecA-Gen von methicillinresistentem Staphylococcus aureus abgeleiteten RNA bei einer relativ niedrigen und konstanten Temperatur (35–50°C und vorzugsweise 41°C) bereit. Und zwar stellt die vorliegende Erfindung eine Kombination eines Oligonucleotidprimers für die Amplifikation der vom mecA-Gen abgeleiteten RNA und eine Oligonucleotid-Sonde für den Nachweis bereit und stellt dadurch unter Verwendung der Kombination ein einfaches, rasch und hoch empfindliches Nachweisverfahren des mecA-Gens und einen Nachweiskit für klinische Untersuchung oder dergleichen bereit.
In einer Art zur Ausführung der vorliegenden Erfindung bindet ein zweiter Primer (eine Sequenz, die zu der Region des 3'-Endes einer spezifischen Sequenz der Ziel-RNA komplementär ist) komplementär an die spezifische Sequenz der vom mecA-Gen von methicillinresistentem Staphylococcus aureus abgeleiteten RNA, die in einer Probe als Template vorliegt, und cDNA wird durch eine Verlängerungsreaktion mit RNA-abhängiger DNA-Polymerase zur Bildung eines RNA-DNA-Doppelstrang gebildet, wonach die RNA des RNA-DNA-Doppelstrangs mit Ribonuclease H digeriert wird, um eine einzelsträngige DNA zu bilden. Als nächstes bindet der erste Primer (eine Sequenz, die homolog zu der Region des 5'-Endes der Ziel-RNA ist und die RNA-Polymerase-Promotorsequenz, angelagert an dem 5'-Ende, enthält) komplementär an die einzelsträngige DNA, um unter Verwendung der DNA-abhängigen DNA-Polymerase eine doppelsträngige DNA mit einer Promotorsequenz zu bilden, welche die Transkription der RNA mit einer zu der Ziel-RNA homologen Sequenz ermöglicht. Die doppelsträngige DNA wird anschließend für die Amplifikation des RNA-Transkriptionsprodukts mit der zu der Ziel-RNA-Sequenz homologen Sequenz in Gegenwart der RNA-Polymerase verwendet. Die vorliegende Erfindung ist so durch die Verwendung eines Oligonucleotids der SEQ ID No. 18, 22 oder 25 für den ersten Primer und eines Oligonucleotids der SEQ ID No. 19, 20, 21, 23 oder 24 für den zweiten Primer gekennzeichnet. Obwohl der erste und der zweite Primer von gesamter Länge ihrer jeweiligen Sequenzen sein können, können auch Kombinationen von Oligonucleotiden mit mindestens 10 zusammenhängenden Basen innerhalb jeder Sequenz verwendet werden.
In dem vorstehenden Modus der vorliegenden Erfindung muss die Ziel-RNA am 5'-Ende der spezifischen Sequenz gespalten werden. Das Verfahren der Spaltung der Ziel-RNA ist vorzugsweise ein Verfahren, bei dem ein Oligonucleotid (spaltendes Oligonucleotid) mit einer Sequenz, die zu einer das 5'-Ende der spezifischen Sequenz überlappenden und dazu benachbarten Region komplementär ist, hinzugefügt wird, wodurch es die Ziel-RNA mit Ribonuclease H oder dergleichen spaltet. Das 3'-Ende des spaltenden Oligonucleotids wird vorzugsweise durch Aminierung behandelt, um es zum Beispiel daran zu hindern, als Oligonucleotidprimer zu fungieren.
In dem vorstehenden Modus der vorliegenden Erfindung wird der Amplifikationsprozess vorzugsweise in Gegenwart einer Oligonucleotid-Sonde (nachweisende Oligonucleotid-Sonde) ausgeführt, die mit einem interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff mit einer mindestens zu einem Teil des RNA-Transkriptionsprodukts komplementären Sequenz markiert ist. Die komplementäre Bindung der Sonde an das RNA-Transkriptionsprodukt führt zu einer Änderung in dem Fluoreszenzvermögen, verglichen zu einer Situation, wo die Komplexbildung fehlt, so dass die Fluoreszenzintensität der Reaktionslösung gemessen werden kann. Wenn eine markierte Oligonucleotid-Sonde während des Amplifikationsprozesses eingebaut wird, ist es zusätzlich besonders vorzuziehen, die Sonde durch zum Beispiel Hinzufügen von Glykolsäure an das 3'-Ende zu modifizieren, um sie daran zu hindern, als Primer bei der Verlängerungsreaktion zu fungieren. Beispiele von Oligonucleotiden, die für die Oligonucleotid-Sonde zum Nachweis verwendet werden können, beinhalten die in SEQ ID No. 20 oder 29 beschriebenen Sequenzen.
In einem anderen Modus zur Ausführung der vorliegenden Erfindung bindet ein zweiter Primer (eine Sequenz, die zu der Ziel-RNA komplementär ist und die an der 5'-Region angelagerte RNA-Polymerase-Promotorsequenz enthält) komplementär an die spezifische Sequenz der vom mecA-Gen von methicillinresistentem Staphylococcus aureus abgeleiteten RNA, die in einer Probe als Template vorliegt, und die cDNA wird durch die Verlängerungsreaktion mit der RNA-abhängigen DNA-Polymerase, wobei sich ein RNA-DNA-Doppelstrang bildet, erzeugt, wonach die RNA des RNA-DNA-Doppelstrangs mit Ribonuclease H digeriert wird, um eine einzelsträngige DNA zu bilden. Als nächstes bindet der erste Primer (eine Sequenz, die homolog zu der Region des 5'-Endes der Ziel-RNA ist) komplementär an die einzelsträngige DNA, um unter Verwendung der DNA-abhängigen DNA-Polymerase eine doppelsträngige DNA mit einem Promotor zu bilden, welcher die Transkription der RNA mit einer zu der Ziel-RNA-Sequenz komplementären Sequenz ermöglicht. Die doppelsträngige DNA wird anschließend für die Amplifikation des RNA-Transkriptionsprodukts mit der zu der Ziel-RNA-Sequenz komplementären Sequenz in Gegenwart der RNA-Polymerase verwendet. Die vorliegende Erfindung wird so durch die Verwendung eines Oligonucleotids der SEQ ID No. 18, 22 oder 25 für den ersten Primer und eines Oligonucleotids der SEQ ID No. 19, 20, 21, 23 oder 24 für den zweiten Primer gekennzeichnet. Obwohl der erste und der zweite Primer von gesamter Länge ihrer jeweiligen Sequenzen sein können, können auch Kombinationen von Oligonucleotides mit mindestens 10 zusammenhängenden Basen innerhalb jeder Sequenz verwendet werden.
In dem vorstehenden Modus der vorliegenden Erfindung wird der Amplifikationsprozess vorzugsweise in Gegenwart einer Oligonucleotid-Sonde (nachweisende Oligonucleotid-Sonde), die mit einem interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff mit einer zu mindestens einem Teil des RNA-Transkriptionsprodukts komplementären Sequenz markiert ist, ausgeführt. Die komplementäre Bindung der Sonde an das RNA-Transkriptionsprodukt führt zu einer Änderung in dem Fluoreszenzvermögen, verglichen mit einer Situation, wo die Komplexbindung fehlt, so dass die Fluoreszenzintensität der Reaktionslösung gemessen werden kann. Wenn eine markierte Oligonucleotid-Sonde während des Amplifikationsprozesses eingebaut wird, ist es zusätzlich besonders vorzuziehen, die Sonde durch zum Beispiel Hinzufügen von Glykolsäure an das 3'-Ende zu modifizieren, um sie zu hindern, als Primer bei der Verlängerungsreaktion zu fungieren. Beispiele von Oligonucleotiden, die für die Oligonucleotid-Sonde zum Nachweis verwendet werden können, beinhalten die zu den in SEQ ID No. 20 oder 29 beschriebenen Sequenzen komplementären Sequenzen.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 ist eine Aufnahme (schwarz und weiß invertiert), welche den Zustand eines Oligonucleotids zeigt und welche eine Elektrophorese-Abbildung einer 7 M Harnstoff-5% Polyacrylamid-Gelelektrophorese für eine Probe nach Durchführung eines Bindungstests an mecA-RNA bei 41°C unter Verwendung von Oligonucleotiden veranschaulicht, die für eine Region der PBP-2' codierenden mecA-RNA, die frei von der intramolekularen Struktur ist, entworfen sind. Bei dieser Figur ist die Spur M der RNA-Marker und die Spuren 1 bis 25 sind die Zahlen der Oligonucleotidlösungen, die in Beispiel 1 angezeigt werden. Spur 26 stellt den Fall ohne Verwendung eines Oligonucleotids dar.
2 veranschaulicht die Ergebnisse der Durchführung einer RNA-Amplifikationsreaktion mit verschiedenen Kombinationen der Primer in Beispiel 2. In dieser Figur stellt P den Fall dar, wo eine RNA-Probe einer anfänglichen RNA-Menge von 10⁵ Kopien/30 μl verwendet wird, und N stellt den Fall dar, wo nur das Verdünnungsmittel anstatt einer RNA-Probe verwendet wird. Zusätzlich zeigt die Spur M den Molekulargewichtsmarker an, während 1 bis 15 die Zahlen der Kombinationen von Primer und Sonde in Beispiel 2 anzeigen.
3 veranschaulicht die chemischen Strukturen der Teile des interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffs der Oligonucleotide, die mit dem in Beispiel 3 verwendeten interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. B₁–B₃ stellen Nucleinsäurebasen dar.
4 veranschaulicht die Beziehung zwischen der Reaktionszeit und der Fluoreszenz-Steigerungsrate. 1 und 2 stellen die Zahlen der Kombinationen der Primer und Sonden in Beispiel 3 dar. In den Diagrammen stellt P für die Kombination 1 den Fall dar, wo eine RNA-Probe einer anfänglichen RNA-Menge von 10⁶ Kopien/30 μl verwendet wird und für die Kombination 2 stellt P den Fall dar, wo eine RNA-Probe einer anfänglichen RNA-Menge von 10⁴ Kopien/30 μl verwendet wird. N stellt den Fall dar, wo nur das Verdünnungsmittel anstatt einer RNA-Probe verwendet wird.
5 veranschaulicht ein Diagramm, das einen Anstieg in der Fluoreszenzsteigerungsrate in Bezug auf die Reaktionszeit und die RNA-Bildung bei anfänglichen RNA-Mengen zeigt, welche von 10⁴ Kopien/30 μl bis zu 10 Kopien/30 μl reichen, wie in Beispiel 4 gemessen wird. Nega zeigt die Verwendung von nur dem Verdünnungsmittel anstatt einer RNA-Probe an.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun ausführlicher anhand von Beispielen erklärt werden, wobei es selbstverständlich ist, dass die Erfindung nicht auf diese Beispiele begrenzt ist.
Beispiel 1
Die spezifische Bindung der Oligonucleotide der Erfindung an die mecA-RNA bei 41°C wurde untersucht. Die mecA-RNA ist eine synthetisierte und gereinigte RNA, die durch in vitro-Transkription unter Verwendung doppelsträngiger DNA, welche die mecA-RNA-Basensequenz als Template enthält, erhalten wird.
Zuerst wurde eine Probe einer Standard-RNA (2016-mer) mit den Basen Nr. 1 bis 2013 der von PBP-2' abgeleiteten mecA-RNA (die Nummerierung der RNA-Basensequenz ist gemäß Matsubashi et al., FERS Lett., 221, 167–171 (1987)) durch Ultraviolett-Absorption bei 260 nm quantitativ bestimmt und anschließend mit einem RNA-Verdünnungsmittel (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0.1 mM EDTA, 0,5 E/μl RNase-Inhibitor) auf 2,0 × 10^–12 Mol/μl verdünnt.
Als nächstes wurden die folgenden Zusammensetzungen in PCR-Röhrchen von 0.5 ml-Volumina (GeneAmp Thin-Walled Reaction^TM Tubes; Perkin-Elmer Co., Ltd.) verteilt.
0,90 μl 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8.6)
0,20 μl 1 M Magnesiumchlorid
0,67 μl 2 M Kaliumchlorid
0,15 μl 0.1 M DTT
0,33 μl 119 E/μl RNase-Inhibitor
9,95 μl destilliertes Wasser
0,6 μl 2 pMol/μl mecA-RNA-Probe
1,2 μl 1.0 μM Oligonucleotidlösung
In diesem Zusammenhang wurde eine der nachstehend nummerierten Oligonucleotidlösungen als Oligonucleotidlösung verwendet.

1. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 241 bis 261 der mecA-RNA komplementär ist (SEQ ID No. 1)
2. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 264 bis 283 der mecA-RNA komplementär ist (SEQ ID No. 2)
3. Oligonucleotid, das zu der Basen Nr. 296 bis 315 der mecA-RNA komplementär ist (SEQ ID No. 3)
4. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 349 bis 368 der mecA-RNA komplementär ist (SEQ ID No. 4)
5. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 402 bis 421 der mecA-RNA komplementär ist
6. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 425 bis 444 der mecA-RNA komplementär ist
7. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 456 bis 475 der mecA-RNA komplementär ist (SEQ ID No. 5)
8. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 499 bis 480 der mecA-RNA komplementär ist
9. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 551 bis 532 der mecA-RNA komplementär ist (SEQ ID No. 6)
10. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 556 bis 575 der mecA-RNA komplementär ist (SEQ ID No. 7)
11. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 581 bis 600 der mecA-RNA komplementär ist (Oligonucleotid von der 16. bis zur 35. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 8 gezeigten Sequenz)
12. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 606 bis 625 der mecA-RNA komplementär ist
13. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 672 bis 691 der mecA-RNA komplementär ist (SEQ ID No. 9)
14. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 941 bis 961 der mecA-RNA komplementär ist (SEQ ID No. 10)
15. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 967 bis 986 der mecA-RNA komplementär ist (SEQ ID No. 11)
16. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 1134 bis 1153 der mecA-RNA komplementär ist (SEQ ID No. 12)
17. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 1154 bis 1173 der mecA-RNA komplementär ist (SEQ ID No. 13)
18. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 1221 bis 1240 der mecA-RNA komplementär ist (SEQ ID No. 14)
19. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 1656 bis 1675 der mecA-RNA komplementär ist (SEQ ID No. 15)
20. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 1701 bis 1720 der mecA-RNA komplementär ist (SEQ ID No. 16)
21. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 1852 bis 1871 der mecA-RNA komplementär ist
22. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 1906 bis 1925 der mecA-RNA komplementär ist
23. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 596 bis 615 der mecA-RNA komplementär ist (das Oligonucleotid der 1. bis zur 20. Base von dem 5'-Ende der in SEQ ID No. 8 gezeigten Sequenz)
24. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 557 bis 615 der mecA-RNA komplementär ist (SEQ ID No. 8)
25. Oligonucleotid, das zu den Basen Nr. 1087 bis 1100 der mecA-RNA komplementär ist (SEQ ID No. 17)

Die Reaktionslösungen wurden anschließend 5 Minuten bei 41°C inkubiert, 1 μl AMV-Rtase (Takara Shuzo Co., Ltd.; AMV-Rtase ist ein Enzym, das die RNA der DNA/RNA-Doppelstränge spaltet) wurde zugegeben und das PCR-Röhrchen wurde 15 Minuten bei 41°C inkubiert.
Eine Polyacrylamidgelelektrophorese (Acrylamidkonzentration: 5%, Harnstoff: 7 M) wurde durchgeführt, um die gespaltenen Fragmente nach der Reaktion zu bestätigen. Die Färbung nach der Elektrophorese wurde mit einem kommerziell erhältlichen Farbstoff (SYBR Green II^TM (Takara Shuzo Co., Ltd)) ausgeführt. Nach Bindung des Oligonucleotids an die spezifische Stelle der Ziel-RNA wird die RNA der DNA/RNA-Doppelstränge durch die Ribonuclease H-Aktivität der AMV-Rtase, welche die Beobachtung von spezifischen Banden ermöglicht, gespalten.
Die Ergebnisse der Elektrophorese werden in 1 gezeigt. In Bezug auf die in jeder Spur neu erscheinenden Banden, werden in den Spuren, wo zwei Banden als Ergebnis einer spezifischen Spaltung mit einem des verwendeten Oligonucleotids beobachtet werden konnten, die Banden mit kürzerer Länge mit Pfeilen angezeigt. Zusätzlich sind die Banden, welche signifikante unspezifische Spaltung aufweisen, eingekreist. Unter den vorstehenden Oligonucleotiden zeigten nur die Oligonucleotidlösungen, welche SEQ ID No. 1 bis 17 und SEQ ID No. 8 enthielten, charakteristische, gespaltetene Banden ohne signifikante unspezifische Spaltung, was zeigt, dass jedes dieser Oligonucleotide bei 41°C stark an die mecA-RNA bindet.
Ergebnisse
Wie vorstehend erklärt, sind die Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung Oligonucleotide, die komplementär an RNA, die von dem PBP-2' codierenden mecA-Gen abgeleitet ist, sogar unter Bedingungen von relativ niedriger und konstanter Temperatur (35–50°C, vorzugsweise 41°C) binden, welche dazu neigen, eine intramolekulare Struktur in der RNA zu bilden und die Bindung von Primern und Sonden dazu zu verhindern. Die spezifische Bindung der Oligonucleotide ist daher ohne Hitzedenaturierung der Ziel-RNA möglich. Die Oligonucleotide der Erfindung sind so als Oligonucleotide für die Spaltung, Amplifikation, den Nachweis oder dergleichen der mecA-RNA, einem Gen-Element von MRSA, brauchbar, d. h. als Oligonucleotidprimer oder Oligonucleotid-Sonden, die bei RNA-Amplifikationsverfahren zu verwenden sind.
Darüber hinaus sind die Oligonucleotide der Erfindung auch für die Amplifikation und den Nachweis des mecA-Gens eindeutig brauchbar. Die zu den vorstehend erwähnten Oligonucleotiden komplementären Oligonucleotide sind auch für die Amplifikation von doppelsträngiger DNA durch das PCR-Verfahren oder für den Nachweis von durch die reverse Transkription von RNA erhaltene cDNA brauchbar.
Die Oligonucleotide der Erfindung werden nicht auf die spezifisch aufgeführten Basensequenzen (20-Mer) begrenzt, und sie können Oligonucleotide mit mindestens 10 oder mehr zusammenhängenden Basen innerhalb jener Sequenzen sein. Dies ist aus der Tatsache ersichtlich, dass 10-mer-Basensequenzen ausreichend sind, um die angemessene Spezifität der Primer oder Sonden zu den Zielnucleinsäuren unter einer relativ niedrigen Temperaturbedingung (vorzugsweise bei 41°C) zu gewährleisten.
Beispiel 2
Die spezifische Amplifikation der Ziel-RNA wurde unter Verwendung einer Kombination von Oligonucleotidprimern nach der vorliegenden Erfindung ausgeführt. Die mecA-RNA ist eine synthetisierte und gereinigte RNA, die durch in vitro-Transkription unter Verwendung doppelsträngiger DNA, welche die mecA-RNA-Basensequenz als Template enthält, erhalten wird.

(1) Eine Probe einer Standard-RNA (2016-Mer) mit den Basen Nr. 1 bis 2013 der von PBP-2' abgeleiteten mecA-RNA (die Nummerierung der RNA-Basensequenz ist gemäß Matsubashi et al., FEBS Lett., 221, 167–171 (1987)) wurde durch Ultraviolett-Absorption bei 260 nm quantitativ bestimmt und anschließend mit einem RNA-Verdünnungsmittel (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0.1 mM EDTA, 0.5 E/μl RNase-Inhibitor) auf 1,0 × 10⁴ Kopien/2.5 μl verdünnt.

In der Kontrolltestgruppe wurde nur das Verdünnungsmittel verwendet (Nega).

(2) 23,3 μl einer Reaktionsflüssigkeit mit der nachstehend angezeigten Zusammensetzung wurden in PCR-Röhrchen von 0,5 ml Volumen (Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes; Perkin-Elmer) verteilt, gefolgt durch die Zugabe von 2,5 μl der vorstehenden RNA-Probe.

Zusammensetzung der Reaktionsflüssigkeit (die Konzentrationen beziehen sich auf die Endkonzentrationen in dem Reaktionssystem nach Zugabe der Enzymlösung)
60,0 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8.6)
13,0 mM Magnesiumchlorid
90,0 mM Kaliumchlorid
1,0 mM DTT
je 0,25 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP
je 3,0 mM ATP, GTP und UTP
2,25 mM GTP
3,6 mM ITP
je 1,0 μM erster und zweiter Primer
0,16 μM einer spaltenden Oligonucleotid-Sonde
(das Oligonucleotid zur Spaltung der Ziel-RNA an einer Position, an die der erste Primer binden kann; das 3'-Ende davon ist aminiert)
39 E Ribonuclease-Inhibitor (Takara Shuzo)
15,0% DMSO
Destilliertes Wasser zur Volumeneinstellung
Eine der nachstehend nummerierten Kombinationen wurde für die Kombination des ersten Primers, des zweiten Primers und der spaltenden Sonde verwendet.

1. In Bezug auf den ersten Primer das Oligonucleotid der 4. bis zur 15. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 18 gezeigten Sequenz, wobei die in SEQ ID No. 30 gezeigte Promotorsequenz der T7-Polymerase an sein 5'-Ende hinzugefügt wird; in Bezug auf den zweiten Primer das in SEQ ID No. 19 gezeigte Oligonucleotid; und in Bezug auf die spaltende Sonde das in SEQ ID No. 26 gezeigte Oligonucleotid.
2. In Bezug auf den ersten Primer das Oligonucleotid der 4. bis 15. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 18 gezeigten Sequenz, wobei die in SEQ ID No. 30 gezeigte Promotorsequenz der T7-Polymerase an sein 5'-Ende hinzugefügt wird; in Bezug auf den zweiten Primer das in SEQ ID No. 20 gezeigte Oligonucleotid; und in Bezug auf die spaltende Sonde das in SEQ ID No. 26 gezeigte Oligonucleotid.
3. In Bezug auf den ersten Primer das Oligonucleotid der 4. bis 15. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 18 gezeigten Sequenz, wobei die in SEQ ID No. 30 gezeigte Promotorsequenz der T7-Polymerase an sein 5'-Ende hinzugefügt wird; in Bezug auf den zweiten Primer das in SEQ ID No. 21 gezeigte Oligonucleotid; und in Bezug auf die spaltende Sonde das in SEQ ID No. 26 gezeigte Oligonucleotid.
4. In Bezug auf den ersten Primer das Oligonucleotid der 4. bis 28. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 18 gezeigten Sequenz, wobei die in SEQ ID No. 30 gezeigte Promotorsequenz der T7-Polymerase an sein 5'-Ende hinzugefügt wird; in Bezug auf den zweiten Primer das in SEQ ID No. 20 gezeigte Oligonucleotid; und in Bezug auf die spaltende Sonde das in SEQ ID No. 26 gezeigte Oligonucleotid.
5. In Bezug auf den ersten Primer das Oligonucleotid der 4. bis 28. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 18 gezeigten Sequenz, wobei die in SEQ ID No. 30 gezeigte Promotorsequenz der T7-Polymerase an sein 5'-Ende hinzugefügt wird; in Bezug auf den zweiten Primer das in SEQ ID No. 21 gezeigte Oligonucleotid; und in Bezug auf die spaltende Sonde das in SEQ ID No. 26 gezeigte Oligonucleotid.
6. In Bezug auf den ersten Primer, das Oligonucleotid der 1. bis 25. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 18 gezeigten Sequenz, wobei die in SEQ ID No. 30 gezeigte Promotorsequenz der T7-Polymerase an sein 5'-Ende hinzugefügt wird; in Bezug auf den zweiten Primer das in SEQ ID No. 20 gezeigte Oligonucleotid; und in Bezug auf die spaltende Sonde das in SEQ ID No. 26 gezeigte Oligonucleotid.
7. In Bezug auf den ersten Primer, das Oligonucleotid der 1. bis 25. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 18 gezeigten Sequenz, wobei die in SEQ ID No. 30 gezeigte Promotorsequenz der T7-Polymerase an sein 5'-Ende hinzugefügt wird; in Bezug auf den zweiten Primer das in SEQ ID No. 21 gezeigte Oligonucleotid; und in Bezug auf die spaltende Sonde das in SEQ ID No. 26 gezeigte Oligonucleotid.
8. In Bezug auf den ersten Primer das Oligonucleotid der 4. bis 28. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 22 gezeigten Sequenz, wobei die in SEQ ID No. 30 gezeigte Promotorsequenz der T7-Polymerase an sein 5'-Ende hinzugefügt wird; in Bezug auf den zweiten Primer das in SEQ ID No. 23 gezeigte Oligonucleotid; und in Bezug auf die spaltende Sonde das in SEQ ID No. 27 gezeigte Oligonucleotid.
9. In Bezug auf den ersten Primer das Oligonucleotid der 4. bis 28. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 22 gezeigten Sequenz, wobei die in SEQ ID No. 30 gezeigte Promotorsequenz der T7-Polymerase an sein 5'-Ende hinzugefügt wird; in Bezug auf den zweiten Primer das in SEQ ID No. 24 gezeigte Oligonucleotid; und in Bezug auf die spaltende Sonde das in SEQ ID No. 27 gezeigte Oligonucleotid.
10. In Bezug auf den ersten Primer das Oligonucleotid der 1. bis 25. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 22 gezeigten Sequenz, wobei die in SEQ ID No. 30 gezeigte Promotorsequenz der T7-Polymerase an sein 5'-Ende hinzugefügt wird; in Bezug auf den zweiten Primer das in SEQ ID No. 23 gezeigte Oligonucleotid; und in Bezug auf die spaltende Sonde das in SEQ ID No. 27 gezeigte Oligonucleotid.
11. In Bezug auf den ersten Primer das Oligonucleotid der 1. bis 25. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 22 gezeigten Sequenz, wobei die in SEQ ID No. 30 gezeigte Promotorsequenz der T7-Polymerase an sein 5'-Ende hinzugefügt wird; in Bezug auf den zweiten Primer das in SEQ ID No. 24 gezeigte Oligonucleotid; und in Bezug auf die spaltende Sonde, das in SEQ ID No. 27 gezeigte Oligonucleotid.
12. In Bezug auf den ersten Primer das Oligonucleotid der 4. bis 28. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 25 gezeigten Sequenz, wobei die in SEQ ID No. 30 gezeigte Promotorsequenz der T7-Polymerase an sein 5'-Ende hinzugefügt wird; in Bezug auf den zweiten Primer das in SEQ ID No. 23 gezeigte Oligonucleotid; und in Bezug auf die spaltende Sonde das in SEQ ID No. 28 gezeigte Oligonucleotid.
13. In Bezug auf den ersten Primer das Oligonucleotid der 4. bis 28. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 25 gezeigten Sequenz, wobei die in SEQ ID No. 30 gezeigte Promotorsequenz der T7-Polymerase an sein 5'-Ende hinzugefügt wird; in Bezug auf den zweiten Primer das in SEQ ID No. 24 gezeigte Oligonucleotid; und in Bezug auf die spaltende Sonde das in SEQ ID No. 28 gezeigte Oligonucleotid.
14. In Bezug auf den ersten Primer das Oligonucleotid der 1. bis 25. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 25 gezeigten Sequenz, wobei die in SEQ ID No. 30 gezeigte Promotorsequenz der T7-Polymerase an sein 5'-Ende hinzugefügt wird; in Bezug auf den zweiten Primer das in SEQ ID No. 23 gezeigte Oligonucleotid; und in Bezug auf die spaltende Sonde das in SEQ ID No. 28 gezeigte Oligonucleotid.
15. In Bezug auf den ersten Primer das Oligonucleotid der 1. bis 25. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 25 gezeigten Sequenz, wobei die in SEQ ID No. 30 gezeigte Promotorsequenz der T7-Polymerase an sein 5'-Ende hinzugefügt wird; in Bezug auf den zweiten Primer das in SEQ ID No. 24 gezeigte Oligonucleotid; und in Bezug auf die spaltende Sonde das in SEQ ID No. 28 gezeigte Oligonucleotid.

(3) Nach Inkubieren der vorstehenden Reaktionslösungen für 5 Minuten bei 41°C wurden 4.2 μl Enzymflüssigkeit, welche die folgenden Zusammensetzung hat und 2 Minuten bei 41°C vorinkubiert wurde, hinzugegeben.

Die Zusammensetzung der Enzymflüssigkeit (Endkonzentrationen während der Reaktion)
1.7% Sorbit
8 Einheiten reverse AMV-Transkriptase (Takara Shuzo)
142 Einheiten T7-RNA-Polymerase (Gibco)
3 μg Rinderserumalbumin
Destilliertes Wasser zur Volumeneinstellung

(4) Danach wurden die PCR-Röhrchen 90 Minuten bei 41°C inkubiert, und anschließend wurden die spezifischen Amplifikationsprodukte durch Elektrophorese unter Verwendung eines 4%igen Agarosegels analysiert.
(5) Ein kommerziell erhältlicher Farbstoff (SYBR Green II^TM: Takara Shuzo) wurde für die Färbung nach der Elektrophorese verwendet.

Die Ergebnisse der Elektrophorese werden in 2 (schwarz und weiß invertierte Aufnahme) gezeigt. Für alle Kombinationen wurden spezifische RNA-Amplifikationsprodukte (mit Pfeilen angezeigt) in den Systemen erhalten, zu denen die mecA-RNA hinzugefügt wurde. Auf Grundlage dieses Befunds wurde gezeigt, dass diese Kombinationen der Oligonucleotidprimer bei der Amplifikation und beim Nachweis der vom mecA-Gen von methicillinresistentem Staphylococcus aureus abgeleiteten RNA brauchbar sind.
Beispiel 3
Unter Verwendung der Kombination der Oligonucleotidprimer nach der vorliegenden Erfindung wurde die Möglichkeit des spezifischen Nachweises der mecA-RNA, der Ziel-RNA, bestätigt.

(1) Eine Probe einer Standard-RNA (2016-mer) mit den Basen Nr. 1 bis 2013 der von PBP-2' abgeleiteten mecA-RNA (die Nummerierung der RNA-Basensequenz ist gemäß Matsubashi et al., FERS Lett., 221, 167–171 (1987)) wurde durch Ultraviolett-Absorption bei 260 nm quantitativ bestimmt und anschließend mit einem RNA-Verdünnungsmittel (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,1 mM EDTA, 0.5 E/μl RNase-Inhibitor) auf 1,0 × 10⁶ Kopien/2,5 μl oder 1,0 × 10⁴ Kopien/2,5 μl verdünnt. In der Kontrolltestgruppe wurde nur das Verdünnungsmittel verwendet (Nega).
(2) 23.3 μl einer Reaktionsflüssigkeit mit der nachstehend angezeigten Zusammensetzung wurden in PCR-Röhrchen von 0,5 ml Volumen (Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes; Perkin-Elmer) verteilt, gefolgt durch die Zugabe von 2,5 μl der vorstehenden RNA-Probe (mecA-RNA).

Die Zusammensetzung der Reaktionsflüssigkeit (die Konzentrationen beziehen sich auf die Endkonzentrationen in dem Reaktionssystem nach Zugabe der Enzymlösung)
60,0 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,6)
13,0 mM Magnesiumchlorid
90,0 mM Kaliumchlorid
1,0 mM DTT
je 0,25 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP
je 3,0 mM ATP, GTP und UTP
2,25 mM GTP
3,6 mM ITP
1,0 μM erster Oligonucleotidprimer
1,0 μM zweiter Oligonucleotidprimer
0,16 μM spaltende Oligonucleotid-Sonde
(das Oligonucleotid zur Spaltung der Ziel-RNA an einer Position, an die der erste Primer binden kann; sein 3'-Ende ist aminiert)
25,0 nM Oligonucleotid-Sonde für den Nachweis, die mit einem interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff markiert ist (3) (MRSH-YO; ihr 3'-Ende ist mit Glykolsäure modifiziert)
39 E Ribonuclease-Inhibitor (Takara Shuzo)
15,0% DMSO
Destilliertes Wasser zur Volumeneinstellung
Eine der nachstehend nummerierten Kombinationen wurde für die Kombination der Primer und der Sonde verwendet.

1. In Bezug auf ersten Primer das Oligonucleotid der 4. bis zur 15. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 18 gezeigten Sequenz, wobei die in SEQ ID No. 30 gezeigte Promotorsequenz der T7-Polymerase an sein 5'-Ende hinzugefügt wird; in Bezug auf den zweiten Primer das in SEQ ID No. 19 gezeigte Oligonucleotid; und in Bezug auf die spaltende Sonde das in SEQ ID No. 26 gezeigte Oligonucleotid und in Bezug auf die Sonde für den Nachweis das in SEQ ID No. 20 gezeigte Oligonucleotid.
2. In Bezug auf den ersten Primer das Oligonucleotid der 1. bis zur 25. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 25 gezeigten Sequenz, wobei die in SEQ ID No. 30 gezeigte Promotorsequenz der T7-Polymerase an sein 5'-Ende hinzugefügt wird; in Bezug auf den zweiten Primer das in SEQ ID No. 24 gezeigte Oligonucleotid; in Bezug auf die spaltende Sonde das in SEQ ID No. 28 gezeigte Oligonucleotid und in Bezug auf die nachweisende Sonde das in SEQ ID No. 29 gezeigte Oligonucleotid.

(3) Nach Inkubieren der vorstehenden Reaktionslösung für 4 Minuten bei 41°C wurden 4.2 μl Enzymflüssigkeit, welche die folgende Zusammensetzung hat und die 2 Minuten bei 41°C vorinkubiert wurde, zugegeben.

Die Zusammensetzung der Enzymflüssigkeit (Endkonzentrationen während der Reaktion)
1,7% Sorbit
8 Einheiten reverse AMV-Transkriptase (Takara Shuzo)
142 Einheiten T7-RNA-Polymerase (Gibco)
3 μg Rinderserumalbumin
Destilliertes Wasser zur Volumeneinstellung

(4) Als nächstes wurde unter Verwendung eines temperaturregelbaren Fluoreszenz-Spektralfotometers, das in der Lage ist, PCR-Röhrchen direkt zu messen, die periodische Messung der Fluoreszenzintensität der bei 41°C inkubierten Reaktionslösung mit einer Anregungswellenlänge von 470 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 510 nm ausgeführt. 4 zeigt die periodischen Änderungen in dem Fluoreszenzintensitätsverhältnis (Fluoreszenzintensität bei vorgegebener Zeit/Fluoreszenzintensität des Hintergrunds) der Probe, wobei das Enzym bei 0 Minuten zugegeben wurde. Die RNA-Probenkonzentrationen für Kombination 1 waren 10⁶ Kopien/30 μl und für Kombination 2 10⁴ Kopien/30 μl.

In dem System, in dem die mecA-RNA zu der Ziel-RNA hinzugefügt wurde, wurde spezifische Fluoreszenzsensibilisierung erhalten. Auf Grundlage dieses Befunds wurde gezeigt, dass die Kombination von Oligonucleotiden der vorliegenden Erfindung in der Lage ist, die vom mecA-Gen abgeleitete RNA spezifisch zu amplifizieren und nachzuweisen.
Beispiel 4
Eine Kombination der Oligonucleotidprimer nach der Erfindung wurde für den spezifischen Nachweis von unterschiedlichen anfänglichen Kopienzahlen der Ziel-RNA verwendet.

(1) Eine Probe einer Standard-RNA (2016-mer) mit den Basen Nr. 1 bis 2013 der von PBP-2' abgeleiteten mecA-RNA (die Nummerierung der RNA-Basensequenz ist gemäß Matsubashi et al. FERS Lett., 221, 167–171 (1987)) wurde durch Ultraviolett-Absorption bei 260 nm quantitativ bestimmt und anschließend mit einem RNA-Verdünnungsmittel (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM EDTA, 0.5 E/μl RNase- Inhibitor, 5.0 mM DTT) auf Konzentrationen verdünnt, welche von 1.0 × 10⁴ Kopien/2.5 μl bis 10 Kopien/2.5 μl reichen. In der Kontrolltestgruppe wurde nur das Verdünnungsmittel verwendet (Nega).
(2) 23.3 μl einer Reaktionsflüssigkeit mit der nachstehend angezeigten Zusammensetzung wurden in PCR-Röhrchen von 0.5 ml Volumen (Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes; Perkin-Elmer) verteilt, gefolgt durch Zugabe von 2.5 μl der vorstehenden RNA-Probe (mecA-RNA).

Die Zusammensetzung der Reaktionsflüssigkeit (die Konzentrationen beziehen sich auf die Endkonzentrationen in dem Reaktionssystem nach Zugabe der Enzymlösung)
60,0 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,6)
13,0 mM Magnesiumchlorid
90,0 mM Kaliumchlorid
1,0 mM DTT
je 0,25 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP
je 3,0 mM ATP, CTP und UTP
2,25 mM GTP
3,6 mM ITP
1,0 μM erster Primer (Oligonucleotid der 4. bis zur 28. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 25 gezeigten Sequenz, wobei die in SEQ ID No. 30 gezeigte Promotorsequenz der T7-Polymerase an sein 5'-Ende hinzugefügt wird)
1,0 μM zweiter Oligonucleotidprimer (Oligonucleotid der 1. bis zur 18. Base vom 5'-Ende der in SEQ ID No. 23 gezeigten Sequenz)
0,16 μM spaltende Oligonucleotid-Sonde (SEQ ID No. 28: Oligonucleotid zur Spaltung der Ziel-RNA an einer Position, an die der erste Primer binden kann, wobei sein 3'-Ende aminiert ist)
25,0 nM Oligonucleotid-Sonde für den Nachweis, die mit einem interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff markiert ist (3) (MRSH-YO; ihre Oligonucleotidsequenz wird in SEQ ID No. 29 gezeigt, und ihr 3'-Ende ist mit Glykolsäure modifiziert)
39 E Ribonuclease-Inhibitor (Takara Shuzo)
15,0% DMSO
Destilliertes Wasser zur Volumeneinstellung

(4) Als nächstes wurde unter Verwendung eines temperaturregelbaren Fluoreszenz-Spektralfotometers, das in der Lage ist, PCR-Röhrchen direkt zu messen, die periodische Messung der Fluoreszenzintensität der bei 41°C inkubierten Reaktionslösung mit einer Anregungswellenlänge von 470 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 510 nm ausgeführt. 5 zeigt die periodischen Änderungen in dem Fluoreszenzintensitätsverhältnis (Fluoreszenzintensität bei vorgegebener Zeit/Fluoreszenzintensität des Hintergrunds) der Probe, wobei das Enzym bei 0 Minuten zugegeben wurde. Die RNA-Probenkonzentrationen waren 10 Kopien/30 μl bis 10⁴ Kopien/30 μl.

Ein von der Anfangskonzentration der Ziel-RNA abhängiges Fluoreszenzprofil wurde von 5 erhalten, welches anzeigt, dass es möglich ist, die in unbekannten Proben vorhandene Menge der vom mecA-Gen abgeleiteten RNA zu messen.
Ergebnisse
Wie vorstehend erklärt wurde, ist die vorliegende Erfindung als Kombinationen von Oligonucleotidprimer und Oligonucleotid-Sonden brauchbar, welche spezifisch an die vom mecA-Gen, das PBP-2' codiert, abgeleitete RNA binden und rasch die Ziel-RNA sogar unter relativ niedrigen und konstanten Temperaturbedingungen (35–50°C und vorzugsweise 41°C), bei denen die RNA in einer Probe eine intramolekulare Struktur bilden würde, welche die Bindung des Primers und der Sonde hemmt, amplifizieren und nachweisen.
Zusätzlich zu dem Vorstehenden sind die Kombinationen der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung nicht nur für die mecA-RNA brauchbar, sondern auch als komplementäre Sequenzen der vorstehenden Oligonucleotide zum Nachweisen der cDNA, die durch reverse Transkription der RNA erhalten wird.
Die Basenlängen der Oligonucleotide in den Kombinationen der vorliegenden Erfindung sind nicht auf konkret beschriebene Längen begrenzt, sondern beinhalten eher Oligonucleotide mit mindestens 10 zusammenhängenden Basen innerhalb dieser Sequenzen. Dies geht eindeutig aus der Tatsache hervor, dass eine Basensequenz von etwa 10-mer angemessen ist, um die Spezifität von Primer oder Sonde für eine Zielnucleinsäure unter relativ niedrigen Temperaturbedingungen (vorzugsweise 41°C) zu gewährleisten. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nachweisverfahren, das einen RNA-Amplifikationsprozess verwendet, mit den Schritten: Bilden einer cDNA mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase unter Verwendung einer spezifischen Sequenz einer von einem mecA-Gen abgeleiteten RNA, ein Gen-Element von methicillinresistentem Staphylococcus aureus, die in einer Probe als Template vorliegt, mit einem ersten Primer mit einer Sequenz, die zu der spezifischen Sequenz homolog ist, und einem zweiten Primer mit einer Sequenz, die zu der spezifischen Sequenz. komplementär ist, wobei der erste oder der zweite Primer eine Sequenz hat, an deren 5'-Region die RNA-Polymerase-Promotorsequenz angelagert ist, wodurch ein RNA-DNA-Doppelstrang entsteht; Digerieren der RNA des RNA-DNA-Doppelstrangs mit Ribonuclease H zu einer einzelsträngigen DNA; und anschließendes Bilden einer doppelsträngigen DNA, die einer Promotorsequenz enthält, die eine Transkription der RNA-Sequenz ermöglicht, oder einer zu der RNA-Sequenz komplementären RNA mit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase unter Verwendung der einzelsträngigen DNA als Template, wobei die doppelsträngige DNA in Gegenwart einer RNA-Polymerase ein RNA-Transkriptionsprodukt bildet und das RNA-Transkriptionsprodukt anschließend als Template für die Bildung einer einzelsträngigen DNA mit der RNA-abhängigen DNA-Polymerase verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonucleotid der SEQ ID No. 18 als erster Primer verwendet wird und das Oligonucleotid einer der Sequenzen SEQ ID No. 19 bis 21 als zweiter Primer verwendet wird, oder das Oligonucleotid der SEQ ID No. 22 als erster Primer verwendet wird und das Oligonucleotid der SEQ ID No. 23 oder 24 als zweiter Primer verwendet wird, oder das Oligonucleotid der SEQ ID No. 25 als erster Primer verwendet wird und das Oligonucleotid der SEQ ID No. 23 oder 24 als zweiter Primer verwendet wird.
Nachweisverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Primer ein Oligonucleotid mit mindestens zehn zusammenhängenden Basen der SEQ ID No. 18, 22 oder 25 ist.
Nachweisverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Primer ein Oligonucleotid mit mindestens zehn zusammenhängenden Basen der SEQ ID No. 19, 20, 21, 23 oder 24 ist.
Nachweisverfahren für einen methicillinresistenten Staphylococcus aureus mit den Schritten: Durchführen des RNA-Amplifikationsprozesses nach Anspruch 1 in Gegenwart einer Oligonucleotid-Probe, die mit einem interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, wobei die Sequenz der Probe zu mindestens einem Teil des RNA-Transkriptionsprodukts komplementär ist und eine komplementäre Bindung der Probe an das RNA-Transkriptionsprodukt zu einer Änderung des Fluoreszenzvermögens gegenüber einer Situation führt, wo eine Komplexbildung fehlt; und anschließendes Messen der Fluoreszenzintensität der Reaktionslösung.